CN106800594A - 小麦太谷核不育基因ms2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小麦太谷核不育基因ms2及其应用。本发明提供的蛋白质，命名为ms2蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性不育和/或致死相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明提供了具有致死作用的ms2蛋白及其编码基因，用花药特异性启动子或花药特异性启动子驱动ms2基因在出发植物中表达，可以获得具有雄性不育表型的转基因植物。本发明对于植物育种具有重大价值。

Description

小麦太谷核不育基因ms2及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小麦太谷核不育基因ms2及其应用。
背景技术
植物雄性不育是一种常见的自然现象。雄性不育在农业生产上有着十分广泛的用途，包括杂种优势的利用，轮回选择育种等，因此具有巨大的经济价值。雄性不育通常受基因控制，按不育的显隐性可分为显性不育突变与隐性不育突变两大类，其中显性核不育突变更为少见，目前还没有显性核不育基因被图位克隆的报道，因此还不清楚其败育产生的机制。
小麦是我国的主要粮食作物，在小麦中已鉴定并命名的核不育基因有17个。ms1为隐性不育基因，位于4BS染色体上，它有7个等位基因。ms2(也有写作Ms2)，即太谷核不育基因，显性核不育基因，位于4DS染色体上。ms3，显性核不育基因，位于5AS染色体上。ms4，显性核不育基因，位于4DS染色体上，根据与着丝粒之间的重组距离判断ms4不同于ms2。ms5，位于3A染色体上。光温敏核不育基因wptms1(5B)、wptms2(2B)、wtms1(2B)分别位于5B、2B和2B染色体上。显性核不育基因Ms1376和在杂交小麦中不育基因Shw尚未被定位。上述基因均尚未被克隆。
太谷核不育小麦是我国科技人员高忠丽1972年在小麦高代品系繁殖田中发现的单显性核基因天然突变体，其特点是雄性败育稳定、彻底、异交结实率高，稳定性好，不受环境条件影响，是世界上发现的第一个小麦显性核不育材料，在国内外引起了很大的影响，被称为我国的“国宝”，严禁对外交换与提供。1980年，中国农业科学院作物科学研究所的王琳清、邓景阳先生将控制太谷核不育小麦性状的基因分别命名为223、Tal。1986年该所的刘秉华先生等利用端体分析等方法将Tal定位到小麦4D染色体的短臂上距着丝点31.16个交换单位，同年国际小麦遗传组织正式给予的基因符号为ms2。太谷核不育小麦是进行轮回选择育种的非常有价值的育种材料。自太谷核不育材料发现以来，我国成立了太谷核不育轮回选择育种协作组，育成了一批优良小麦新品种。刘秉华等(1991)利用我国特有的矮秆资源矮变一号(携带的矮秆基因为Rht10)与太谷核不育小麦做杂交，培育了矮败小麦。在矮败小麦中，矮秆基因Rht10与不育基因ms2紧密连锁，因此，矮败小麦是具有矮秆基因标记的太谷核不育小麦，它继承了太谷核不育小麦雄性败育彻底、不育性稳定、异交结实率高的优点，克服了太谷核不育小麦早期育性难于鉴定的困难，同时也避免了轮选群体株高渐升的弊端，是理想的轮回选择工具。利用矮败小麦，刘秉华先生创立了矮败小麦轮回选择技术，构建矮败小麦高效育种平台，利用矮败小麦可以使数十个甚至上千个亲本的基因进行大规模的反复重组，并不断优化，进而使群体得到改良，极大地提高育种效率。矮败小麦创制以来，利用矮败小麦高效育种方法育成国家或省级审定新品种42个，累计推广1.85亿亩，累计增产小麦56亿公斤，创造了巨大的社会效益和经济效益。“矮败小麦及其高效育种方法的创建与应用”获2010年国家科技进步一等奖。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦太谷核不育基因ms2及其应用。
本发明提供的蛋白质，获自矮败小麦，命名为ms2蛋白，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性不育和/或致死相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1 标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述ms2蛋白的基因(命名为ms2基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性不育和/或致死相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物植物雄性不育和/或致死相关蛋白的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述ms2基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
可用现有的植物表达载体构建含有ms2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用ms2基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子或组织特异性启动子(例如花粉特异性启动子)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用ms2基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植株。
所述重组表达载体具体可为重组质粒pGW-CUbi1390-ms2。
重组质粒pGW-CUbi1390-ms2的构建方法具体如下：
(1)以矮败小麦的花药的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；F1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGCAGGGCACCACAG-3’；R1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TCAACTTGAGAATGCTG-3’；
(2)使步骤(1)得到的PCR扩增产物与入门载体pDONRTM/Zeo发生BP反应，得到含有序列表的序列2所示双链DNA分子的重组质粒。
(3)取步骤(2)得到的重组质粒，使其与目标载体pGW-CUbi1390发生LR反应，得到在目标载体pGW-CUbi1390中插入序列表的序列2所示双链DNA分子的重组质粒，即为重组质粒pGW-CUbi1390-ms2。
目标载体pGW-CUbi1390的构建方法：用限制性内切酶PmlI酶切pCUbi1390载体，得到线性化载体；利用Vector Conversion System，将gateway cassete A(平端)连入线性化载体，得到目标载体pGW-CUbi1390。
本发明还保护所述ms2蛋白的应用，为如下(c1)至(c5)中的至少一种：
(c1)促使植物发生雄性不育；
(c2)致死植物组织；
(c3)致死植物花药；
(c4)致死植物花粉；
(c5)致死植物。
所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，例如Fielder小麦。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述ms2基因导入目的植物中，得到雄性不育的转基因植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，例如Fielder小麦。所述方法中，所述ms2基因由花药特异性启动子或花粉特异性启动子驱动表达。
本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将特异表达盒导入目的植物中，得到转基因植物；所述特异表达盒中，由组织特异性启动子驱动所述ms2基因的表达；所述转基因植物中，与所述组织特异性启动子对应的组织被致死。所述组织特异性启动子具体可为花药特异性启动子或花粉特异性启动子。所述转基因植物具体可为具有雄性不育表型的植物。所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为小麦，例如Fielder小麦。
本发明还保护所述ms2蛋白、所述ms2基因、所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系、所述重组菌或所述方法，在植物育种中的应用。所述植物育种的目的为培育雄性不育植物或特异组织被致死的植物。所述特异组织具体可为花药或花粉。
作为基因符号，ms2基因早就被提出来了，但其序列一直未被发现。本发明提供了具有致死作用的ms2蛋白及其编码基因，用花药特异性启动子或花药特异性启动子驱动ms2基因在出发植物中表达，可以获得具有雄性不育表型的转基因植物。本发明对于植物育种具有重大价值。
附图说明
图1为雄性可育单株和雄性不育单株花药的形态和开花时穗子形态。
图2为雄性可育单株和雄性不育单株花药发育减速分裂时期的显微结构。
图3为雄性可育单株和雄性不育单株花药表面扫描电镜图。
图4为矮败小麦/中国春小麦近等基因系BAC文库插入片段脉冲电泳检测及插入片段频率分布图。
图5为太谷核不育基因区域物理图谱构建及比较分析。
图6为ms2基因在太谷核不育小麦近等基因系中的表达分析。
图7为ms2基因的结构示意图。
图8为实施例4中ms2基因的致死效应的结果；A：再生培养过程中的照片；B：PCR鉴定结果，泳道N代表以水为模板的空白对照。
图9为实施例5中ms2基因与雄性不育的关系的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
太谷核不育小麦：参考文献：邓景扬，高忠丽，小麦显性核不育基因的发现与利用-太谷核不育小麦鉴定总结，作物学报，1980，(2)：85-98；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
中国春小麦(Chinese Spring)：参考文献：P.Sourdille,T.Cadalen,H.Guyomarc'h,J.Snape,M.Perretant,G.Charmet,C.Boeuf,S.Bernard and M.Bernard.(2003)Anupdate of the Courtot×Chinese Spring intervarietal molecular marker linkage mapfor the QTL detection of agronomic traits in wheat.Theoretical and Applied Genetics106(3):530-538；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
矮败小麦：参考文献：刘秉华,杨丽.“矮败”小麦的选育及利用前景.科学通报,1991,36(4):306-308.；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
Fielder小麦(Triticumaestivum L.)：Yuji Ishida,Masako Tsunashima,YukohHiei,Toshihiko Komari；Wheat(Triticumaestivum L.)transformation using immature embryos.；Methods in Molecular Biology,Volume 1223,2015,pp 189-198；Editors:Kan Wang；Publisher:Springer,New York；doi:10.1007/978-1-4939-1695-5_15；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
BPII Enzyme mix为Life Technologies的产品，产品目录号为11789-020。LRII Enzyme mix为Life Technologies的产品,产品目录号为11791-020。Vector Conversion System为Life Technologies的产品,产品目录号为11828-019。入门载体pDONRTM/Zeo Vector为Life Technologies的产品，产品目录号为12535-035。大肠杆菌TOP10感受态细胞为北京全式金生物技术有限公司的产品。根癌农杆菌EHA105为北京华越洋生物科技有限公司的产品，产品目录号为GX0133-100。Zeocin即博来霉素。
pCUbi1390载体：参考文献：彭昊.利用T-DNA插入突变和RNA干扰技术研究水稻基因功能.中国农业科学院博士学位论文P43-44.2005；公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、近等基因系的获得
一、太谷核不育小麦/中国春近等基因系的获得
1、将太谷核不育小麦(母本)和中国春(父本)进行杂交，收获子代。
2、将步骤1收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
3、将步骤2收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
4、将步骤3收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
5、将步骤4收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
6、将步骤5收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
7、将步骤6收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
8、将步骤7收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
9、将步骤8收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
10、将步骤9收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代。
11、将步骤10收获的子代中的雄性不育株(母本)和中国春(父本)进行回交，收获子代(该子代群体即为太谷核不育小麦/中国春近等基因系)。
二、其他近等基因系的获得
采用不同的父本和/或母本，其他同步骤一。
实施例2、花药发育的形态及显微和电镜结构观察
在太谷核不育小麦/中国春近等基因系植株的旗叶抽出后，分别采集雄性可育单株和雄性不育单株的不同长度的小麦幼穗，利用体式显微镜观察花药发育不同时期的形态。照片见图1。在幼穗小于3cm时(花药由花药原基逐渐分化出五层细胞)，雄性不育株和雄性可育株的小穗中花药的形态相似，无明显差异。在3.2cm幼穗中(花药五层细胞已分化完全，花粉母细胞进入减数分裂前期)，雄性不育株和雄性可育株的花药的颜色、花药大小表现出差异。在4.5cm幼穗中(花粉母细胞即将完成减数分裂)，雄性不育株和雄性可育株的花药的颜色、花药大小差异更加明显，雄性可育株花药继续发育，而雄性不育株花药的大小不再变化。在10cm幼穗中(花药中小孢子发育成熟)，雄性可育株花药即将成熟开裂，雄性不育株花药已经完全干瘪退化。散粉时，观察雄性不育株和雄性可育株成熟的穗子和花药，可以看出雄性不育株的穗子蓬松、颖壳保持张开、没有花药，雄性可育株开花正常、花丝伸长好、花药正常散粉、散粉后颖壳闭合。
分别取太谷核不育小麦/中国春近等基因系中的雄性可育单株和雄性不育单株，对生长至不同长度的小穗进行固定，观察花药在不同发育时期半薄切片的结果。照片见图2(A-E：可育单株；F-J：不育单株；A，F：细线期；B，G：双线期；C，H：减数分裂I中期；D，I：二分体；E，J：单核液泡化中期；Bar＝50μM)。当花药发育至减数分裂I前期时(图2A、2B、2F、2G)，雄性可育株和雄性不育株的花药在结构上没有区别，雄性不育株的花药同样可以正常分化出表皮、药室内壁、中层、绒毡层和花粉母细胞五层细胞，雄性可育株和雄性不育株的花药的各层细胞发育都没有明显差异。当花药发育至减数分裂I中期时(图2C、2H)：雄性可育株的花药中花粉母细胞形成纺锤体，染色体排列于赤道面上，细胞沿纺锤体两极延伸，其余四层细胞结构完整排列整齐；雄性不育株的花药的结构形态则产生了明显异常，花粉母细胞的形状不规则，纺锤体虽然形成但是结构不清晰，中层细胞提前退化，从这一时期开始不育花药的发育明显受到了影响。当花药发育至减数分裂I末期即二分体时期时(图2D、2I)：雄性可育株花药花粉母细胞形成二分体，其余四层细胞结构均完整；雄性不育株花药的各层细胞已经发生了剧烈的变异，大部分二分体细胞逐渐解体，中层细胞消失，表皮、药室内壁、绒毡层的细胞向药室内塌陷，雄性不育株花药无法完成减数分裂过程。当雄性可育株花药发育至单核小孢子时期时(2E)，雄性不育株花药的花粉母细胞连同中层以及绒毡层都已经逐渐退化消失(2J)，只剩下萎缩在一起的药室内壁和表皮。
分别取太谷核不育小麦/中国春近等基因系中的雄性可育单株和雄性不育单株，对来自4-6cm幼穗的花药表面进行电镜扫描观察。照片见图3(A，C:4cm可育幼穗的花药；E，G:4cm可育幼穗的花药表面的局部放大；B，D:6cm不育幼穗的花药；F，H:6cm不育幼穗的花药表面的局部放大)。来自4cm幼穗的雄性不育株花药比雄性可育株花药略小，但是花药外壁结构并无明显差异。来自6cm幼穗的雄性可育株与雄性不育株花药大小以及外壁结构有明显差异，雄性可育株花药长度约为雄性不育株花药的2倍，并且花药外壁有大量角质累积，雄性不育株花药外壁仍光滑。
实施例3、太谷核不育基因(ms2基因)的发现过程
一、以矮败小麦/中国春近等基因系为材料构建BAC文库。
将矮败小麦/中国春小麦近等基因系的种子置于湿润的滤纸上，并于培养皿内萌发，萌发的种子播种于营养土中，生长一周后喷洒50ppm的赤霉酸(GA3)处理幼苗，一周后即可区分出矮秆植株和高秆植株。当幼苗生长到三周后，取矮秆植株幼苗迅速用液氮冷冻，保存于超低温冰箱中备用。提取高质量大片段基因组DNA，经HindIII部分酶切、100-400kb的DNA片段选择、电洗脱、DNA与载体pIndigo BAC-5(Epicentre,BACH095H)的连接、连接产物的电转化(将2μl连接产物与18-20μl Gibco BRL公司的ElectroMax DH10BTM感受态细胞混匀，加入到经过处理的电转化杯中进行，采用Gibco BRL公司的Cell-Porator ElectroporationSystem进行转化)、电击，结束后将垫片中的感受态细胞取出，加入1ml SOC培养基中，于37℃，225rpm下复苏1小时，取适量复苏液涂布于含有12.5μg/ml的氯霉素(CMR)、14μg/mlIPTG和60μg/ml X-gal的LB固体选择培养基(X/I/C)表面，于37℃培养24-36小时。利用所建立的高效BAC文库转化体系将上述连接液进行大量转化。转化后每250μl SOC复苏液涂一块平板，以使其生长的克隆数在2500左右。用LB液体选择培养基将菌落全部冲洗下来，混匀后加甘油使其终浓度达到15％制成BAC混合池。总共收集了497个BAC混合池。矮败/中国春近等基因系BAC文库约有1945460个BAC克隆，平均插入片段为118Kb(见图4；图4中，A为BAC文库插入片段脉冲电泳检测，M为Lamda ladder PFG Marker，Vector为带有HindIII克隆位点的pIndigoBAC-5；图4中，B为BAC文库插入片段频率分布图)，覆盖小麦基因组的大约12.7倍。
利用PCR方法，依据小麦与水稻和短柄草共线性关系，选择目标基因区域内的基因，设计4D特异的引物，用于BAC文库的筛选。构建BAC shotgun文库和BAC亚克隆测序。利用BigDyeTerminator V3.1Cycle Sequencing Kit，在ABI3730XL测序仪上进行测序(AppliedBiosystems,Foster,CA)。每个BAC测10倍以上的覆盖率，用Lasergene suite 7.1中的SeqMan软件(DNASTAR,Madison,AL)对序列进行组装。
二、太谷核不育基因(ms2基因)的克隆
1、在目标基因区域开发新的分子标记
基因图位克隆的关键是不断寻找在遗传距离上逐渐靠近目标基因的分子标记。太谷核不育基因位于小麦4DS染色体上，该染色体在小麦中多态性最低，因此开发新的分子标记逼近ms2基因的难度非常大。主要是通过与水稻、短柄草、粗山羊草D基因组序列比对分析、BAC文库筛选及BAC亚克隆测序、目标区段基因及基因间的PCR扩增测序、太谷核不育近等基因系RNA-Seq测序的方法，开发SSR、ISBP、SNP等分子标记来逼近目标基因。
2、太谷核不育基因区域物理图谱的构建及候选基因确定
利用目标基因两侧的分子标记S1102和S1277比对水稻和短柄草基因组序列，将目标基因锁定在水稻第9染色体22660725bp-22719930bp,(即在59.2kb区间内，该区间共有17个基因)，对应短柄草的43385015-43444531bp(即在59.5kb区间内，该区间共有14个基因，这一区段对应粗山羊草D基因组高密度遗传图第4染色体bin2-bin5之间的scaffold)。利用上述共线性区段内的水稻、短柄草基因序列，比对粗山羊草D基因组的序列草图获得scaffold序列，利用所获得的scaffold序列开发了707对SSR引物，其中Am3近等基因系可育池和不育池之间具有多态性引物79个。利用这些SSR标记对Am3近等基因系群体的重组单株进行检测，将ms2基因锁定在5个scaffold序列的区段之内，其中M3和M7标记与ms2基因之间的遗传距离为0，为进一步逼近ms2基因，进一步扩大群体以重组单株数目表示标记逼近目标基因的情况(见图5)。在Am3大群体中2-0-1重组的标记位于D基因组的3个scaffold中(S7071、S118155、S80695)，对应六倍小麦矮败中国春的BAC E18和N6。再结合中国春各条染色体的测序结果(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)，共在2-0-1重组区段的序列内预测出20余个基因。将这些基因比对太谷核不育小麦近等基因系转录组数据库，发现在目标区域内的20多个预测基因中只有1个基因表达量存在显著差异。
利用RT-PCR和Real-time PCR对该基因在太谷核不育小麦/中国春近等基因系、太谷核不育小麦/豫麦18近等基因系、太谷核不育小麦/偃展1号近等基因系及太谷核不育小麦/郑麦98近等基因系的雄性可育株与雄性不育株花药中的表达量差异进行进一步的验证，该基因在雄性可育株花药中几乎不表达，在雄性不育株花药中高表达(见图6：A-D:RT-PCR结果；E-H:Real-time PCR结果；1：雄性可育株花药；2：雄性不育株花药；A,E:太谷核不育小麦/中国春近等基因系；B,F:太谷核不育小麦/豫麦18近等基因系；C,G:太谷核不育小麦/偃展1号近等基因系；D,H:太谷核不育小麦/郑麦98近等基因系)，因此推测该基因即为ms2基因。
3、太谷核不育基因的序列与结构分析
ms2基因的开放阅读框如序列表的序列2所示(882bp)，编码序列表的序列1所示的蛋白质(由293个氨基酸残基组成)。
ms2基因全长为4078bp，由8个外显子组成，基因结构如图7所示(方框代表外显子，实线代表内含子)。ms2基因与粗山羊草基因序列同源性为99％，与乌拉尔图小麦基因序列的同源性为89％。虽然ms2与乌拉尔图小麦对应的基因序列有较高的相似性，但预测出的基因编码区差异很大，编码的蛋白相似性很低。通过与NCBI数据中的DNA与蛋白序列的比对分析，ms2基因序列及其编码的蛋白序列与其他物种的基因及蛋白均既没有同源性，也不含有保守的结构域，是一个特殊结构的基因。
实施例4、ms2基因的致死效应
一、重组质粒pGW-CUbi1390-ms2的构建
1、attB引物设计
设计并合成如下引物：
F1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT ATGGCAGGGCACCACAG-3’；
R1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT TCAACTTGAGAATGCTG-3’。
F1中的下划线标注attB1重组位点，R1中的下划线标注attB2重组位点。
2、提取矮败小麦的花药的总RNA并反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。经测序，PCR扩增产物中，attB1重组位点和attB2重组位点之间的核苷酸如序列表的序列2所示。
4、进行BP反应，得到BP反应产物。
BP反应体系：步骤3得到的PCR扩增产物25ng、入门载体pDONRTM/Zeo 40ng、BPII Enzyme mix 0.3μL，加灭菌ddH2O补足体系至2.5μL。
BP反应程序：25℃反应10h。
5、将2.5μL步骤4得到的BP反应产物加入到30μL大肠杆菌TOP10感受态细胞液中，冰浴15min，42℃热激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μL SOC培养基，在37℃、225rpm条件下复苏50min，得到复苏液；将复苏液均匀涂布于含30μg/mL博来霉素的LB固体培养基表面，37℃倒置培养过夜。入门载体pDONRTM/Zeo自身带有致死基因，携带入门载体pDONRTM/Zeo的重组菌不能在培养基上生存，通过BP反应目标基因片段会取代致死基因，所以在培养基上生存的重组菌即为含有序列表的序列2所示的目标基因的入门克隆(entry clone)。
6、取步骤5得到的入门克隆，提取质粒并进行双向测序验证，测序验证所用引物为入门载体pDONRTM/Zeo通用引物，序列如下：
M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’；
M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
经测序验证正确的具有序列表的序列2所示的双链DNA分子的重组质粒命名为入门质粒。
7、进行LR反应，得到LR反应产物。
目标载体pGW-CUbi1390的构建：用限制性内切酶PmlI(平末端酶)酶切pCUbi1390载体，得到线性化载体；利用Vector Conversion System，将gateway cassete A(平端)连入线性化载体(具体的方法为Vector Conversion System标准流程，可从Life Technologies主页下载)，得到目标载体pGW-CUbi1390。
LR反应体系：入门质粒25ng、目标载体pGW-CUbi139040ng、LRIIEnzyme mix 0.3μL，加灭菌ddH2O补足体系至2.5μL。
LR反应程序：25℃反应10h。
8、将2.5μL步骤7得到的LR反应产物加入30μL大肠杆菌TOP10感受态细胞液中，冰浴15min，42℃热激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μL SOC培养基，在37℃、225rpm条件下复苏50min，得到复苏液；将复苏液均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基表面，37℃倒置培养过夜。目标载体pGW-CUbi1390自身带有致死基因，携带目标载体pGW-CUbi1390的重组菌不能在培养基上生存，通过LR反应目标基因片段会取代致死基因，所以在培养基上生存的重组菌即为含有序列表的序列2所示的目标基因的目标克隆(Destiantion clone)。
9、取步骤8得到的目标克隆，提取质粒并进行双向测序验证，测序验证所用引物为pGW-CUbi1390载体插入片段两端启动子区及终止区引物，序列如下：
Pubi：5’-TTTGTCGATGCTCACCCTG-3’；
Tnos：5’-TTGCCAAATGTTTGAACGA-3’。
将经测序验证正确的具有序列表的序列2所示的双链DNA分子的重组质粒命名为pGW-CUbi1390-ms2。重组质粒pGW-CUbi1390-ms2中，由玉米Ubiquitin启动子(组成型启动子)驱动ms2基因超表达。
二、重组质粒pGW-CUbi1390-gus的构建
用序列表的序列3所示的gus基因代替序列表的序列2所示的ms2基因，其他同步骤一，得到重组质粒pGW-CUbi1390-gus。
三、转ms2基因试验
采用PureWheat方法进行农杆菌介导的小麦遗传转化(Yuji Ishida,Masako Tsunashima,YukohHiei,Toshihiko KomariWheat(Triticumaestivum L.)transformation usingimmature embryos.Methods in Molecular Biology,Volume 1223,2015,pp 189-198；Editors:Kan Wang；Publisher:Springer,New York；doi:10.1007/978-1-4939-1695-5_15)，将重组质粒pGW-CUbi1390-ms2导入Fielder小麦的胚性愈伤组织，具体步骤如下：
1、将重组质粒pGW-CUbi1390-ms2导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
2、Fielder小麦开花15天后，取种子，用1％次氯酸钠水溶液消毒10分钟后取幼胚。
3、完成步骤2后，取幼胚，在步骤1得到的重组农杆菌的菌悬液中室温浸泡5min。
4、完成步骤3后，取幼胚，23℃、黑暗条件下共培养5天。
5、完成步骤4后，取幼胚，25℃、黑暗条件下恢复培养5天。
6、完成步骤5后，取幼胚，先置于25℃、黑暗条件下筛选14天，再置于25℃、黑暗条件下筛选21天。筛选采用草铵膦进行，第一次筛选的草铵膦浓度为5mg/L，第二次筛选的草铵膦浓度为10mg/L。此时，愈伤组织增殖，开始形成幼芽。
8、完成步骤7后，取具有幼芽的幼胚，25℃、光照(68μmol/m2/s)条件下进行再生培养。发现所有幼芽均不能继续生长，导致不能获得再生幼苗。照片见图8A的左图。
9、取步骤8中不能继续生长的幼芽，提取总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR鉴定，以检测ms2基因的表达情况。采用Tubulin基因为内参基因(用于检测内参基因的引物对由F3和R3组成)。PCR鉴定的部分结果见图8B的泳道1至3(泳道1至3代表不同的幼芽)。不能继续生长的幼芽中均具有ms2基因的表达。
F2：5’-CTGCTGCATCCGACTAACTATC-3’；
R2：5’-TGAGAATACTGTCCACCAAACTC-3’。
F3：5’-TGAGGACTGGTGCTTACCGC-3’；
R3：5’-GCACCATCAAACCTCAGGGA-3’。
结果表明，ms2基因具有致死效应。
四、转Gus基因试验
用重组质粒pGW-CUbi1390-gus代替重组质粒pGW-CUbi1390-ms2，步骤1至8同步骤三的步骤1至8。进行步骤8的再生培养时，所有幼芽均能继续生长并获得再生植株。照片见图8B的右图。
9、取步骤8中能继续生长的幼芽，提取总RNA并反转录为cDNA,以cDNA为模板，采用F2和R2组成的引物对进行PCR鉴定，以检测ms2基因的表达情况。采用Tubulin基因为内参基因(用于检测内参基因的引物对由F3和R3组成)。结果见图8B的泳道4。能继续生长的幼芽中均不具有ms2基因的表达。
实施例5、ms2基因与雄性不育的关系
由于矮败小麦中的矮杆基因和太谷核不育基因紧密连锁，矮败小麦本身的后代中所有矮杆植株的花药均败育，不能产生花粉自交结实。为了再次验证确实是ms2基因的超表达引起了花药的败育，进行EMS诱变的实验，具体步骤如下：
一、配制溶液
pH7.0磷酸缓冲液配制：取60ml溶液A和40ml溶液B混合，即pH7.0磷酸缓冲液；溶液A：磷酸氢二钠9.456克，加水至1000ml；溶液B：磷酸二氢钾9.07克，加水至1000ml。
0.6％EMS处理液配制：取24ml甲基磺酸乙酯，溶于4L pH7.0磷酸缓冲液。
0.8％EMS处理液配制：取32ml甲基磺酸乙酯，溶于4L pH7.0磷酸缓冲液。
二、EMS诱变
采用的种子为矮败小麦(母本)与中国春小麦(父本)的杂交种子。
1、取种子，用水室温浸泡12小时(2015年3月8日7:00至19:00)。
2、完成步骤1后，将种子分为三组，第一组的7200粒种子用0.6％EMS处理液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)，第二组的4300粒种子用0.8％EMS处理液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)，第三组的700粒种子用pH7.0磷酸缓冲液室温浸泡16小时(3月8日19：00至3月9日11:00)。
3、完成步骤2后，取种子，用水洗涤16小时。
4、完成步骤3后，播种，并于播种30天后进行出苗率统计。
第一组出苗4431株，致死率(100％-4431/7200)＝38.5％。
第二组出苗2214株，致死率(100％-2214/4300)＝48.5％。
第三组出苗700株，致死率＝0％。
5、对步骤4得到的7345株小麦进行花药形态的观察以及结实率的统计，发现多个矮杆植株能够长出含有花粉的花药，套袋后可自交结实。
第三组得到的700株小麦中的矮杆小麦的自交结实率为0。
第一组和第二组得到的6645株小麦中，368株矮杆小麦的自交结实率大于0(9株的自交结实率大于50％，54株的自交结实率达到20％-50％，64株的自交结实率在10％-20％之间，241株的自交结实率小于10％)，均在一定程度上恢复了雄性育性。
从第一组和第二组得到的6645株小麦中，随机取11株自交结实率大于0、花药形态正常的矮杆小麦，剥取花药，提取总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板检测ms2基因的表达水平(方法同实施例4的步骤三的9)。结果见图9。图9中，1至11代表6645株小麦中的11株自交结实率大于0、花药形态正常的矮杆小麦，12代表6645株小麦中的一株不育单株，13代表中国春小麦，14代表水。结果显示，11株育性恢复的矮杆小麦中均检测不到ms2基因的表达，说明当ms2基因不表达时小麦的雄性育性得以恢复。

Claims (10)

1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性不育和/或致死相关的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性不育和/或致死相关蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码植物植物雄性不育和/或致死相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质的应用，为如下(c1)至(c5)中的至少一种：
(c1)促使植物发生雄性不育；
(c2)致死植物组织；
(c3)致死植物花药；
(c4)致死植物花粉；
(c5)致死植物。
6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到雄性不育的转基因植物。
7.一种培育转基因植物的方法，是将特异表达盒导入目的植物中，得到转基因植物；所述特异表达盒中，由组织特异性启动子驱动权利要求2或3所述基因的表达；所述转基因植物中，与所述组织特异性启动子对应的组织被致死。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述组织特异性启动子为花药特异性启动子或花粉特异性启动子。
9.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，或权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌，或，权利要求6或7或8所述方法，在植物育种中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物育种的目的为培育雄性不育植物或特异组织被致死的植物。
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