CN114277036A - 一种鸭茅春化基因DgPAPS4及其应用 - Google Patents

一种鸭茅春化基因DgPAPS4及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种鸭茅春化基因DgPAPS4及其应用，春化基因DgPAPS4，在植物中进行表达，以调节所述植物的开花时间，所述基因DgPAPS4包含选自下组的核苷酸序列：A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；B、与A所述序列互补的核苷酸序列，或具有70％以上同源性的核苷酸序列；C、编码序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；本发明还提供了含有春化基因DgPAPS4的表达载体，含有前述过表达载体的宿主细胞，以及春化基因DgPAPS4的用途。本发明提供的春化基因DgPAPS4能够通过调控春化途径相关基因的表达，从而促进具有春化作用的植物开花，有助于培育不同熟期的具有春化作用的植物品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速具有春化作用的植物品种的选育。

Description

一种鸭茅春化基因DgPAPS4及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种影响植物春化开花的基因，还涉及该基因编码的蛋白质，还涉及含有该基因的表达载体和宿主细胞，还涉及从植物DNA中克隆该基因引物组，还涉及该基因的用途。
背景技术
鸭茅(Dactylis glomerata L.)又名果园草(Orchardgrass)，属禾本科(Gramineae)早熟禾亚科(Pooideae)鸭茅属(Dactylis)，是一种世界范围内广泛栽培的多年生冷季型丛生牧草。鸭茅具有生长速度快，生物产量高，糖分含量高，耐荫性强和适应范围广等特点。作为经济价值排名前四的多年生牧草，鸭茅对于世界温带地区草食动物肉类和乳制品生产有重要意义。除作为优良的牧草外，鸭茅也是我国林下草地和人工草地重要的优良混播禾草之一，主要适合于西部退耕还草和草场建设，对退耕还林还草和林-草复合建植等具有重要的积极意义。鸭茅主要通过与苜蓿、三叶草等豆科牧草混播，建植高质量的混播草地。这就要求混播的各草种间开花期相一致，才能保证混播草地高产优质。
但鸭茅开花期变异大，在实际生产中缺少适宜开花期的鸭茅品种，严重限制了其在生产上的运用。虽然针对鸭茅开花期进行了多年的研究，但效果甚微。
发明内容
鉴于此，本发明目的之一在于提供一种能够通过调控春化途径相关基因。
本发明目的之二在于提供一种有鸭茅春化基因编码的蛋白质。
本发明目的之三在于提供一种用于克隆鸭茅春化基因的引物对。
本发明目的之四在于提供一种含有鸭茅春化基因的表达载体。
本发明目的之五在于提供一种含有鸭茅春化基因的宿主细胞。
本发明目的之六在于提供一种鸭茅春化基因的用途。
发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种鸭茅春化基因DgPAPS4，在植物中进行表达，以调节所述植物的开花时间，所述基因DgPAPS4包含选自下组的核苷酸序列：
A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；
B、与A所述序列互补的核苷酸序列，或具有70％以上同源性的核苷酸序列；
C、编码序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
根据本发明鸭茅春化基因DgPAPS4的一个实施方式，所述植物为具有春化作用的植物。
根据本发明鸭茅春化基因DgPAPS4的一个实施方式，所述植物包括鸭茅或拟南芥。
本发明还提供了一种由前述鸭茅春化基因DgPAPS4编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列选自序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种用于克隆鸭茅春化基因DgPAPS4的引物对，所述引物对的碱基序列如下：
上游引物F：5'-atggtaccatgacgacctctaataagccgatat-3'，
下游引物R：5'-atcgctagcctacaaactaatgcatggccatttc-3'。
本发明还提供了一种含有鸭茅春化基因DgPAPS4的表达载体，所述全长鸭茅春化基因DgPAPS4被插入载体pCambia1300，其中包含CaMV 35S启动子，获得过表达载体pCambia1300-35S-DgPAPS4。
本发明还提供了一种含有前述过表达载体的宿主细胞，将所述过表达载体pCambia1300-35S-DgPAPS4转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。
本发明还提供了一种前述鸭茅春化基因DgPAPS4的用途，用于培育不同熟期的鸭茅新品种。
与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
a)本发明提供的鸭茅春化基因DgPAPS4能够通过调控春化途径相关基因的表达，从而促进具有春化作用的植物开花，有助于培育不同熟期的具有春化作用的植物品种，同时降低育种工作量、缩小育种规模、缩短育种年限、提高育种效率，加速具有春化作用的植物品种的选育。
b)鸭茅开花是一个有复杂调控网络控制的性状，目前对于鸭茅开花期调控的分子机理不是很清楚，在鸭茅分子辅助育种中很难对相关基因及位点进行应用。其次，在鸭茅中还没有通过功能分析验证能够调控鸭茅开花的基因。目前仅通过转录组、QTL定位等对鸭茅开花期相关基因及位点进行挖掘定位，以至于在鸭茅分子育种进程缓慢。本发明基于全基因组重亚硫酸盐测序结合转录组测序结果，发现一个受DNA甲基化调控的基因DgAGL20，并通过进一步研究，发现该基因上游调控基因DgPAPS4，转基因结果表明，转基因材料中AtAGL20的表达受到DgPAPS4的调控，通过对调控基因DgPAPS4的开发应用，有助于培育不同熟期的鸭茅新品种，缩短育种年限。
附图说明
图1是DgAGL20启动子甲基化水平对比图。
图2是DgAGL20的DMR区域。
图3是DgAGL20在鸭茅不同春化时期的表达对比图。
图4是DgPAPS4在鸭茅不同春化时期的表达对比图。
图5是甲基促进剂和抑制剂处理鸭茅的表型(A)及鸭茅DgAGL20的表达对比图(B)。
图6是转DgPAPS4基因拟南芥的表型对比图(A)，开花时间对比图(B)及拟南芥中AtAGL20的在拟南芥不同春化阶段的相对表达量对比图(C)，McrBC-qPCR分析拟南芥AtAGL20启动子区域甲基化水平，qPCR信号越高甲基化水平越低(D)。。
具体实施方式
下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。在本实施方式中，没有做特别说明技术手段均采用现有技术手段。
实施例1
本实施例描述了一种能够在鸭茅中进行表达，以调节鸭茅的开花时间的春化基因DgPAPS4。该春化基因DgPAPS4包含选自下组的核苷酸序列：
A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。
B、与A所述序列互补的核苷酸序列。或具有70％以上同源性的核苷酸序列，例如80％以上同源性的核苷酸序列，90％以上同源性的核苷酸序列，95％以上同源性的核苷酸序列。
C、编码序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
实施例2
本实施例描述了一种蛋白质，其氨基酸序列如Seq ID NO.2所示。该序列是由实施例1中鸭茅春化基因DgPAPS4(A)编码得到。
实施例3
本实施例描述了用于克隆鸭茅春化基因PAPS4的引物对，所述引物对的碱基序列分别为序列表Seq ID NO.3所示的上游引物F：5'-atggtaccatgacgacctctaataagccgatat-3'，序列表Seq ID NO.4所示的下游引物R：5'-atcgctagcctacaaactaatgcatggccatttc-3'。利用该引物对，可以从鸭茅的DNA中提取到序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。
实施例4
本实施例描述了一种鸭茅春化基因DgPAPS4的用途，通过对春化基因DgPAPS4的序列进行部分或全部敲出、改造、同种异株基因转移等在遗传育种工作的运用，培育不同熟期的鸭茅新品种。
实施例5
本实施例进一步描述了鸭茅春化基因DgPAPS4的获取过程，以及同步描述了含有鸭茅春化基因PAPS4的表达载体、含有所述表达载体的宿主细胞。本实施例中，DgPAPS4的序列为序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。具体过程如下。
1、鸭茅测序材料制备。
鸭茅二倍体品系2006-1通过分蘖进行繁殖，每份2个分蘖，将鸭茅材料移栽后在白天10小时/夜间14小时，温度22℃的短日照进行生长一个月。将在短日照条件下生长一个月的鸭茅植株转移到植物生长箱进行春化处理，春化处理条件为白天10小时/夜间14小时，温度4℃的低温短日照条件下生长8周，分别在转移至低温前取样(未春化NV)，低温处理4周(V4)，低温处理8周(V8)，进行取样，用于后续转录组和全基因组重亚硫酸盐测序。
2、鸭茅全基因组重亚硫酸盐测序。
使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法从V0、V4和V8的鸭茅叶片中提取基因组DNA。然后制备亚硫酸氢盐测序文库。样品在广州基迪奥公司使用Illumina HiSeqTM2500平台进行测序。简而言之，通过超声处理(Covaris，Massachusetts，USA)将1μg基因组DNA片段化为100～300bp，并使用MiniElute PCR纯化试剂盒(QIAGEN，MD，USA)进行纯化。将片段化的DNA末端配对，添加“A”并连接接头。按照制造商的说明，使用Methylation-Gold试剂盒(ZYMO，CA，USA)转换接头连接的片段。最后，转化的DNA片段由广州基迪奥公司进行PCR扩增和使用Illumina NovaSeq6000平台测序。
3、全基因组重亚硫酸盐测序数据分析
去除了包含接头、低质量(q≤20)和poly-N读数的双端测序读数。使用BSMAP软件(v2.90)将每个样本的clean data reads与https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝Dactylis披露的鸭茅参考基因组进行比对，参数为默认设置。使用BSMAP软件(v2.90)鉴定胞嘧啶甲基化(mC)，并根据mC/(mC+non-mC)计算全基因组甲基化水平。此外，根据每100bp的平均化水平计算计算基因及其侧翼2-kb区域的甲基化水平。根据下列标准使用methylkit tool(v1.10.0)鉴定了两个样品之间的差异甲基化区域(DMR)：(1)平均甲基化水平差异倍数>2；(2)Pearson’s卡方检验系数P≤0.05；(3)DMR的长度大小介于40bp～10kb；(4)相邻甲基化位点之间的距离小于200bp；(5)每个甲基化胞嘧啶有4个以上的reads覆盖，每个胞嘧啶有10个以上的reads覆盖；(6)至少一个样本中有5个以上的甲基化胞嘧啶。经过分析，参见图1，图1示出了鸭茅中AGL20启动子CHH甲基化水平，在V0-V4比较组中发现一个与开花基因DgAGL20相重叠的DMR，其甲基化水平显著上升；参见图2，图2为鸭茅春化不同春化阶段AGL20启动子甲基化水平的IGV图，DG3C00078为开花基因DgAGL20，图2中A框显示区域为启动子差异甲基化区域。
4、转录组测序。
用于全基因组甲基化测序(WGBS)的12株个体植物被合并为三个独立的生物学重复，每个重复包含四个个体。按照制造商的方案，使用Trizol试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从鸭茅中分离总RNA。RNA-seq文库、PCR扩增及使用Illumina HiSeq4000测序由广州基迪奥公司进行。为了获得高质量的clean data，使用fastp(v0.18.0)去除包含适配器、poly-N读数和低质量碱基(q≤20)的reads。然后通过HISAT2(v2.2.4)将cleandata映射到鸭茅基因组，参数为：“-rna-strandness RF”和其他参数设置为默认值。StringTie(v1.3.1)用于组装映射读取。String Tie将基因表达水平计算为FPKM(每百万碱基片段数)。参见图3，图3为鸭茅AGL20在不同春化阶段的表达量，通过转录组数据，对AGL20的表达进行分析，发现其在V4样品中的表达水平显著高于V0。结合全基因重亚硫酸盐测序数据，推测AGL20的表达水平可能受到甲基化调控。进一步对转录组数据分析发现，参见图4，图4示出了鸭茅不同春化阶段DgPAPS4的表达量，DgPAPS4与DgAGL20在春化前期具有相同的表达模式，而且DgPAPS4是RdDM途径相关的一个基因，其在春化前期的表达模式与甲基化变化一直，说明DgPAPS4可能通过甲基化参与了DgAGL20的调控。发明人对该基因进行了进一步分析研究。
5、鸭茅春化过程中甲基化水平验证。
将鸭茅植株无性系种植于4℃短光照(8h/16h，昼/夜)的生长室中进行春化处理。在处理中，将500μM DNA甲基化促进剂三氟甲磺酸甲酯(MTFMS)(TCI,T2029)和抑制剂zebularine(Zeb)(Selleck,S71130)溶解在含有0.05％Silwet L-77(Solarbio,S9430)的ddH2O中并直接喷洒在鸭茅的叶子上。用含有0.05％Silwet L-77的ddH2O处理的鸭茅植物用作对照(Mock)。所有处理每2d喷1次，直至春化处理完成，每次处理至少10株。使用
Figure BDA0003456038140000052
EvaGreen 2X qPCR Master Mix进行qRT-PCR对DgAGL20在各处理中的表达情况进行分析。
表1 qRT-PCR反应体系表
Figure BDA0003456038140000051
引物为：
序列表Seq ID NO.5所示的上游引物DgAGL20-F:5'-agctgttgcgggagaacttaga-3'，
序列表Seq ID NO.6所示的下游引物DgAGL20-R:5'-tcgccgttcctcctcctcat-3'，
内参引物：
序列表Seq ID NO.7所示的上游引物DgGAPDH-F:5'-tctgaccgttagacttgagaagg-3'，
序列表Seq ID NO.8所示的下游引物DgGAPDH-R:5'-cttgagcttaccctcagactcct-3'。
通过分析发现在甲基促进剂处理的样品中，参见图5，DgAGL20表达水平在春化4周时显著高于对照和甲基抑制剂处理的材料，表明DgAGL20的表达受到超甲基化促进。图5为鸭茅春化过程中甲基促进剂(MTFMS)和抑制剂(Zeb)处理实验结果；图5中A为鸭茅处理后在温暖(22℃)长日照(16h光照/8h黑暗)下生长20天的表型；B为不同处理鸭茅中AGL20的表达量。具体来说，图5是甲基促进剂和抑制剂处理后鸭茅的表型对比图和鸭茅DgAGL20的表达量对比图，图中各处理分别为：V4M：春化处理4周的对照，V4Zeb：春化处理4周+甲基抑制剂Zeb处理，V4MTFMS：春化处理4周+甲基促进剂MTFMS处理。
6、鸭茅DgPAPS4基因转拟南芥过表达株系的构建及开花时间统计。
全长的DgDgPAPS4被插入载体pCambia1300，其中包含CaMV35S启动子。为了产生过表达DgPAPS4的转基因植物，使用带有pCambia1300-35S-DgPAPS4的根癌农杆菌菌株EHA105进行转化。花序浸渍法用于拟南芥转化。纯合系(T3代)用于进一步功能验证。对于拟南芥春化处理，种子在1/2MS平板上发芽，直到出现第一对莲座叶，将幼苗从平板转移到土壤中。随后，植物在长日照条件下(16h/8h，光/暗，22℃)预生长10d，然后在短日照条件(8h/16h，光/暗)、4℃下春化处理4周，春化处理后恢复到长日照条件(16h/8h，亮/暗，22℃)。开花时间计算为冷处理后开花的天数，从将植物移至22℃到抽薹，但不包括预生长或在寒冷中度过的时间(图6A，B)。WT表示拟南芥Col-0野生型，OE1、OE3、OE4分别表示三个过表达DgPAPS4的拟南芥株系。使用
Figure BDA0003456038140000061
EvaGreen 2X qPCR Master Mix进行qRT-PCR对拟南芥AtAGL20表达量进行分析。使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法提取纯化4周拟南芥的DNA，并根据制造商的方案，500ng DNA被用于McrBC试剂盒(NEB，M0272)根据酶切4小时；McrBC酶在切割甲基化DNA位点的时候需要GTP的存在，以不加GTP的反应为阴性对照，酶切结束后通过qRT-PCR对拟南芥AtAGL20的启动子区域甲基化水平进行了分析。图6为DgPAPS4转基因拟南芥春化实验分析结果；其中，A为转基因拟南芥和野生型春化4周后在温暖(22℃)长日照(16h光照/8h黑暗)下生长的表型；B为转基因拟南芥和野生型春化后在在温暖(22℃)长日照(16h光照/8h黑暗)下开花时间统计；C为拟南芥中AGL20在不同春化阶段的表达量；D为McrBC-qPCR分析春化4周后拟南芥AGL20启动子区域甲基化水平，qPCR信号越高甲基化水平越低。
所用引物为：
序列表Seq ID NO.9所示的上游引物AtAGL20-F:5'-caagcagacaagtgactttctc-3'，
序列表Seq ID NO.10所示的下游引物AtAGL20-R:5'-gagctggcgaattcataaagtt-3'，
内参引物为：
序列表Seq ID NO.11所示的上游引物AtTUB2-F：5'-gccttgtacgatatttgcttcaggac-3'，
序列表Seq ID NO.12所示的下游引物AtTUB2-R:5'-cggaggtcagagttgagttgac-3',
用于McrBC-qPCR的引物：
序列表Seq ID NO.13所示的上游引物AtAGL20-F：5'-tcaaacattcggtgacgagtaagca-3',
序列表Seq ID NO.14所示的上游引物AtAGL20-R:5'-ggacgagcagattaagttggtggaa-3'。
分析后发现在春化处理后，其在转基因株系中的表达量显著高于野生型(图6C)。图6示出了转DgPAPS4基因拟南芥的表型，开花时间(开花时间为春化处理后转移至温暖长日照条件下开花的天数，不计春化处理的时间)、拟南芥AtAGL20的在拟南芥不同春化阶段的相对表达量及春化后拟南芥AtAGL20启动子区域的甲基化水平。其中，NV：未春化；V4W：春化4周。
实验证明，鸭茅DgPAPS4基因可以在春化中通过调节转基因材料中AtAGL20启动子区域的甲基化水平并进一步调控转基因材料中AtAGL20的表达，能够用于培育不同熟期的鸭茅新品种，缩短育种年限。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种鸭茅春化基因DgPAPS4，在植物中进行表达，以调节所述植物的开花时间，其特征在于，所述基因DgPAPS4包含选自下组的核苷酸序列：
A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；
B、与A所述序列互补的核苷酸序列，或具有70％以上同源性的核苷酸序列；
C、编码序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的鸭茅春化基因DgPAPS4，其特征在于，所述植物为具有春化作用的植物。
3.根据权利要求1所述的鸭茅春化基因DGPAPS4，其特征在于，所述植物包括鸭茅或拟南芥。
4.一种由权利要求1～3任一项所述的鸭茅春化基因DgPAPS4编码的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列选自序列表Seq ID NO.2所示的氨基酸序列。
5.一种用于克隆鸭茅春化基因DgPAPS4的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如下：
上游引物F：5'-atggtaccatgacgacctctaataagccgatat-3'，
下游引物R：5'-atcgctagcctacaaactaatgcatggccatttc-3'。
6.一种含有鸭茅春化基因DgPAPS4的表达载体，其特征在于，所述全长鸭茅春化基因DgPAPS4被插入载体pCambia1300，其中包含CaMV 35S启动子，获得过表达载体pCambia1300-35S-DgPAPS4。
7.一种含有权利要求6所述过表达载体的宿主细胞，其特征在于，将所述过表达载体pCambia1300-35S-DgPAPS4转入根癌农杆菌菌株，获得宿主细胞。
8.一种权利要求1所述鸭茅春化基因DgPAPS4的用途，其特征在于，用于培育不同熟期的鸭茅新品种。
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