BR112017025961B1 - Vetor compreendendo dna isolado e promotor de expressão específico de antera - Google Patents
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Abstract
GENE WMS DE MACHO-ESTERILIDADE DE TRIGO E SEU PROMOTOR DE EXPRESSÃO ESPECÍFICO DE ANTERA E USOS DOS MESMOS. A presente invenção proporciona um novo gene WMS que confere macho-esterilidade de trigo, o seu promotor de expressão específico de antera e usos dos mesmos. No trigo, um gene Ms2 bem conhecido que causa macho-esterilidade dominante tem sido amplamente aplicado na seleção recorrente na China. Uma abordagem de RNA- seq foi realizada para revelar o transcritoma específico de antera em um par de linhas isogênicas de Ms2, 'Lumai 15' e 'Lumai 15 + Ms2'. Como resultado, um gene WMS foi identificado mostrando expressão específica de antera no estágio inicial da meiose e apenas em trigo carregando o gene Ms2. A regulação do WMS poderia alterar a macho-fertilidade da planta. Verificou-se que o promotor de WMS compreende uma atividade específica de antera. Assim, a presente invenção pode ser usada para alcançar a expressão de genes específicos da antera, para desenvolver macho-esterilidade em várias espécies de plantas, para estabelecer a seleção recorrente em várias espécies de plantas e para auxiliar a produção de sementes híbridas.
Description
[001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido chinês N° 201510303817.0, depositado em 4 de junho de 2015, cujo objeto é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[002] A presente invenção refere-se a um gene de esterilidade masculina em trigo (WMS), o seu promotor de gene específico de antera e usos dos mesmos.
[003] A esterilidade masculina da planta pode ser usada para facilitar o cruzamento para a reprodução seletiva e a produção híbrida de sementes (Rao et al., 1990; Kempken e Pring, 1999; Mackenzie, 2012). Em muitas espécies de culturas, um grande número de cepas macho-estéreis foi descoberto e preservado como recursos genéticos valiosos, e há inúmeras tentativas de produzir cepas macho-estéreis, especialmente em grandes cultivos de cereais, tais como, milho e arroz.
[004] A Pioneer Hi-Bred International desenvolve a Tecnologia de Produção de Sementes (SPT) (Waltz, 2012). No milho, a tecnologia SPT integra o uso do gene Ms45 dominante para macho-fertilidade, o gene recessivo ms45 para esterilidade masculina, e o gene DsRed2 como marcador de seleção visual. O gene Ms45 é regulado por um promotor específico de antera. A linha de manutenção do milho DP- 32138-1 (ms45/ms45, Ms45-DsRed2/_) serve como um doador de pólen para produzir linhas de milho macho-estéreis não transgênicas (ms45/ms45), que são usadas como o precursor fêmea reproduzido para gerar sementes híbridas. Existem outros estudos sobre esterilidade masculina de milho; a mutagênese do gene do tipo citocromo P450 (Ms26) conduz à esterilidade masculina no milho (Djukanovic et al., 2013). Por outro lado, uma expressão específica de antera de genes alvo é crucial para criar esterilidade masculina livre de outra penalidade não intencional. Luo et al. (2006) verificou um RTS de gene específico de tapetum por triagem diferencial de bibliotecas de cDNA de arroz (Luo et al., 2006). O gene RTS exibe expressão predominante em tapetum durante a meiose e a expressão desaparece antes da antese. Liu et al. (2013) identificou um gene de proteína de transferência de lipídios específico de antera de arroz (OsLTP6) através de perfilamento expressional de alta produtividade (Liu et al., 2013). Em geral, a expressão específica de antera dos genes de macho fertilidade/esterilidade é importante para a introdução de linhas críticas para a produção de sementes híbridas.
[005] A edição do genoma permite a modificação específica de genes alvo em mamíferos e outros organismos eucarióticos (Cheng e Alper, 2014). Mais recentemente, a nuclease efetora tipo ativador de transcrição (TALEN) e as replicações palindrômicas curtas agrupadas e regularmente interespaçadas (CRISPR)/Cas9, são provadas como funcionais em trigo (Wang et al., 2014) e cevada (Wendt et al. , 2013; Gurushidze et al., 2014). Portanto, a edição do genoma pode ser usada para introduzir modificações específicas do alvo em culturas de cereais, que podem ser usadas para gerar produtos com valor agregado.
[006] O trigo macho-estéril gênico de Taigu (doravante denominado ‘Taigu’) é um mutante de trigo hexaplóide macho-estéril descoberto na China (Yang et al., 2009). Um único gene dominante Ms2 determina a esterilidade masculina em 'Taigu'. Quando o trigo 'Taigu' é cruzado com trigo hexaplóide macho-fértil, suas plantas F1 segregam a macho-fertilidade/esterilidade: plantas macho-férteis e plantas semi-macho-estéreis (Deng e Gao, 1982). Marcadores fenotípicos e moleculares (ananicar conferido por Rht-Dlc) foram desenvolvidos para o local Ms2 (Liu e Deng, 1986; Cao et al., 2009). Desde 1983, o trigo 'Taigu' tem sido usado como uma ferramenta para seleção recorrente na China. Até à data, centenas de linhas de trigo chinesas foram desenvolvidas para transportar o gene Ms2 ou o local Rht- DlclMs2 fortemente ligado (doravante denominado RMs2), denominado coletivamente “trigo Taigu”. Em 2010, quarenta e duas cultivares de trigo com resistência à doença, tolerância ao sal e à seca, ou desempenho de rendimento melhorada(o) foram liberados através da seleção recorrente com base em RMs2. De modo a manipular o gene Ms2 para um melhor sistema de produção, buscamos clonar o gene Ms2 usando a análise do transcritoma.
[007] A presente invenção proporciona um novo gene de esterilidade masculina de trigo (WMS), o seu promotor de gene e usos do mesmo.
[008] A presente invenção utilizou RNA-seq para caracterizar o transcritoma de antera de ‘Lumai 15’ e ‘Lumai 15 + Ms2’ (doravante LM15Ms2) no estágio inicial da meiose. Como resultado, identificou-se um gene WMS, que exibiu uma expressão específica de antera no estágio inicial da meiose e apenas no trigo que porta um gene Ms2 dominante. O gene WMS foi sugerido para ser envolvido na esterilidade masculina no trigo, e a manipulação do gene WMS em plantas pode alterar a fertilidade da planta. Além disso, pensou-se que o promotor de WMS compreende atividade específica de antera, o que é importante para alcançar a expressão de gene específica de antera. Assim, a presente invenção pode ser dita ser altamente valiosa quando usada como uma ferramenta para alcançar a expressão de gene específico de antera, para desenvolver esterilidade masculina em várias espécies de plantas, para estabelecer a seleção recorrente em várias espécies de plantas, e para auxiliar a produção de sementes. Especificamente, a presente invenção refere-se ao seguinte: [1] um DNA isolado de qualquer um dos seguintes (a) a (e): (a) um cDNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; (b) um DNA que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6; (d) um DNA que codifica uma proteína que é (i) funcionalmente equivalente a uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (ii) compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que um ou mais os aminoácidos são substituídos, eliminados, adicionados e/ou inseridos; e (e) um DNA que (i) codifica uma proteína que é funcionalmente equivalente à proteína que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 e (ii) hibridiza em condições rigorosas para o DNA que compreende as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1 e 6; [2] um DNA que codifica um RNA antissentido que é complementar ao produto de transcrição do DNA de SEQ ID NOs: 1 e 6; [3] um DNA que codifica um RNA que compreende atividade de ribozima que cliva especificamente o produto de transcrição do DNA de SEQ ID NOs: 1 e 6; [4] um DNA que codifica um RNA que regula por regulação negativa a expressão do DNA de SEQ ID NOs: 1 e 6 pelo efeito de cossupressão quando expressado em células de plantas; [5] um DNA que codifica um RNA que compreende uma característica que é dominante negativa para transcrições endógenas em células de plantas codificadas pelo DNA de [1]; ou um DNA que codifica uma proteína que compreende uma característica que é dominante negativa para uma proteína endógena em células de plantas codificadas pelo DNA de [1]; [6] um vetor que compreende um DNA de qualquer um de [1] a [5]; [7] uma célula de planta transformada à qual é introduzido um DNA de qualquer [1] a [5] ou o vetor de [6]; [8] uma planta transformada que compreende as células de plantas transformadas de [7]; [9] um clone ou uma prole de plantas transformadas das plantas transformadas de [8], uma vez que o clone ou a prole contenha as células de plantas transformadas de [7]; [10] uma semente, um tecido e um órgão das plantas transformadas de [8] ou [9], uma vez que contenha as células de plantas transformadas de [7]; [11] um DNA de qualquer um dos seguintes (a) a (c) que compreende atividade promotora específica de antera: (a) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5; (b) um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, em que um ou mais nucleotídeos são substituídos, eliminados, adicionados e/ou inseridos; e (c) um DNA que hibridiza sob condições rigorosas para o DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5; [12] um vetor que compreende o DNA de [11]; [13] uma célula de planta transformada compreendendo o DNA de [11] ou [12]; [14] uma planta transformada que compreende as células de plantas transformadas de [13]; [15] um clone ou uma prole de plantas transformadas das plantas transformadas de [14], uma vez que o clone ou a prole contenha as células de plantas transformadas de [13]; [16] uma semente, um tecido e um órgão das plantas transformadas de [14] ou [15], uma vez que contenha as células de plantas transformadas de [13]; [17] uma célula de planta geneticamente modificada gerada por edição de genoma e/ou mutagênese induzida em DNAs compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1 e 4, uma vez que essas modificações regulem a macho- fertilidade da planta; [18] uma planta geneticamente modificada que compreende as células de plantas geneticamente modificadas de [17]; um clone ou uma prole de planta das plantas geneticamente modificadas de [18], uma vez que o clone ou a prole contenha as células de plantas modificadas de [17]; e [20] uma semente, um tecido e um órgão das plantas geneticamente modificadas de [18] ou [19], uma vez que contenha as células de plantas modificadas de [17].
[009] A FIG. 1 representa genotipagem pelos marcadores WMS-EM e WMS-PM. Os painéis superiores representavam a genotipagem pelo marcador WMS-EM, os painéis inferiores de genotipagem pelo marcador WMS-PM; os painéis esquerdos foram genótipos de trigo comum (linhas precursoras) e clones BAC, os painéis direitos de genótipos de indivíduos F1 da combinação ‘LM15Ms2’/‘Lumai 15’. Nas plantas F1, foram apresentados seis planos representativos, incluindo três plantas macho-estéreis (SI, S2 e S3) e três plantas macho-férteis (FI, F2 e F3). As setas indicaram as bandas específicas que se segregavam com o traço de esterilidade masculina.
[0010] A FIG. 2 representa os clones BAC que portam o gene WMS/wms. P89 e P1076 derivaram do cromossomo 4D que porta um gene de wms recessivo; P204 e P1593 foram derivados do cromossomo 4D que porta um gene WMS dominante. A região com sombreamento cinza representa a matriz de expressão completa do gene WMS (por exemplo, SEQ ID NO: 4) na presente invenção. O tamanho do inserto de cada clone BAC está em escala.
[0011] A FIG. 3 representa a expressão específica de antera do gene WMS. A) RT-PCR foi realizada para detectar o cDNA de WMS em antera, gluma, folha, lema, pálea, pistilo, raiz e pedúnculo. B) qRT-PCR foi realizado para medir os níveis de cDNA de WMS em antera, GLP (gluma, lema e pálea), folha, pistilo e pedúnculo. A Actina foi incluída como controles em ambas as análises RT-PCR e qRT-PCR.
[0012] A FIG. 4 confirma a atividade específica de antera do promotor de WMS. A) Os plasmídeos foram preparados para estudar a atividade do promotor; O PC613 era um vetor de destino que porta o cassete GFP compatível com o gateway; O PC966 portou o cassete de expressão PWMS::GFP onde o PWMS representou o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5); PC976 portou uma cópia genômica do gene WMS (SEQ ID NO: 7); todos os três vetores tinham o mesmo esqueleto de plasmídeo de pCAMBIA1300. B) Expressão transiente da fluorescência GFP em anteras de trigo; as setas indicaram os sinais de fluorescência verde. C) A RT-PCR foi realizada para detectar o cDNA de WMS em antera, gluma, folha, lema, pálea, pistilo e pedúnculo na planta transgênica de trigo ‘JZ7-2’ (Tabela 3), que foi derivada da transformação genética com PC976; havia também dois controles, incluindo Antera 1 de ‘Lumai 15’ e Antera 2 de ‘Lumai 15 S2’ - Barra = 100 μm.
[0013] A FIG. 5 mostra a triagem TILLING e as anteras férteis das plantas M1 portando mutações induzidas no gene WMS dominante. A) A presença de um gene WMS dominante foi confirmada por análise de PCR usando WMS-FP12 e WMS-RP12 (painel superior); detecção TILLING da mutação de WMS usando iniciadores WMS-FP8 e WMS-RP8 em plantas M1 selecionadas (S: broto estéril; F: broto fértil; setas indicaram a banda digerida de CelI; painel inferior). B) Desenvolvimento de anteras férteis em M1 mutantes selecionados do gene WMS. ‘Lumai 15’ e ‘Lumai 15Ms2’ foram incluídos como controles. Barra = 1,5mm.
[0014] A FIG. 6 mostra a complementação genética do gene WMS dominante em_‘Bobwhite’. A) análise de PCR confirmou integração de genômica (BAR e WMS) e expressão de cDNA (WMS e Actina) na geração T0. B) Bioensaio baseado em SAR para resistência a herbicidas (painel superior; Barra = 2,5 mm); a expressão do cDNA de WMS causou um fenótipo macho-estéril em plantas transgênicas T0 para plantas (painel inferior; barra = 1,5 mm). ‘Bobwhite’ atuou como o controle de tipo selvagem.
[0015] A FIG. 7 mostra a complementação genética do gene WMS dominante em Brachypodium ‘Bd21-3’. A) análise de PCR confirmou integração genômica (BAR e WMS) e expressão de cDNA (WMS e Actina) na geração T0. B) Bioensaio baseado em SAR para resistência a herbicidas (painel superior; Barra = 2,5 mm); a expressão do cDNA de WMS causou um fenótipo macho- estéril em plantas transgênicas T0 para plantas (painel inferior, barra = 0,5 mm). O Brachypodium ‘Bd21-3’ foi incluído como o controle de tipo selvagem.
[0016] A presente invenção proporciona DNAs que codificam a proteína de WMS. A sequência de nucleotídeos do cDNA de WMS em ‘trigo Taigu’ é apresentada na SEQ ID NO: 1, a sequência de aminoácidos da proteína codificada pelo cDNA de WMS é apresentada na SEQ ID NO: 2, a sequência de nucleotídeos de comprimento completo incluindo promotor, fragmento transcritível e terminador do gene WMS em ‘trigo Taigu’ é apresentada na SEQ ID NO: 4, a sequência de nucleotídeos do promotor de WMS em ‘trigo Taigu’ é apresentada na SEQ ID NO: 5, e a sequência de nucleotídeos do fragmento transcritível do gene WMS em ‘trigo Taigu’ é apresentada na SEQ ID NO: 6.
[0017] A presente invenção compreende cDNA e DNA genômico que codificam a proteína de WMS. Um habilitado na técnica pode preparar o cDNA e o DNA genômico usando métodos convencionais. O cDNA pode ser preparado por: por exemplo, a) extrair o mRNA do ‘trigo Taigu’ (por exemplo, ‘LM15Ms2’); b) sintetizar cDNA usando o mRNA como modelo; c) amplificar o cDNA de WMS usando iniciadores de PCR específicos para o cDNA da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 1); d) clonagem do produto de PCR em vetores. Do mesmo modo, o DNA genômico pode ser preparado extraindo-o do ‘trigo Taigu’, construindo uma biblioteca genômica (onde BAC, cosmídeo, fosmídeo e tal podem ser usados como um vetor) e depois triando clones positivos usando fragmentos de DNA da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 4). O DNA genômico também pode ser preparado por clonagem baseada em PCR nos DNA da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 4).
[0018] A presente invenção inclui DNAs que codificam proteínas funcionalmente equivalentes à proteína de WMS a partir de trigo Taigu (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Aqui, “proteínas funcionalmente equivalentes à proteína de WMS do trigo Taigu’ significam proteínas alvo que compreendem uma função biológica ou bioquímica equivalente à proteína de WMS da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Os exemplos incluem a indução da esterilidade da planta. Para avaliar se um gene de teste pode induzir esterilidade masculina, ‘trigo Taigu’ pode ser mutageneizado através da mutagênese induzida por EMS como demonstrado no Exemplo 7, e os mutantes knockout e knockdown do gene de teste podem ser identificados por TILLING como demonstrado no Exemplo 8. A esterilidade masculina induzida pelo gene de teste pode ser validada usando complementação genética no trigo macho-fértil ‘Bobwhite’. Por exemplo, o alelo genômico de WMS (SEQ ID NO: 7) pode ser introduzido em ‘Bobwhite’ usando bombardeios biolísticos como demonstrado no Exemplo 9. Além disso, é viável a introdução do alelo genômico de WMS (SEQ ID NO: 7) na planta modelo Brachypodium usando transformação mediada por Agrobacterium como demonstrado no Exemplo 10. Os fenótipos de plantas resultantes podem ser analisados.
[0019] Outro exemplo de tal função é a expressão específica de antera, que é caracterizada por expressão predominante na antera que é pelo menos cinco vezes ou mais, de preferência dez vezes ou mais, e mais preferencialmente 15 vezes ou mais do que a sua expressão em outros tecidos listados no Exemplo 5. Para avaliar se um gene de teste é especificamente transcrito na antera de uma planta, os RNAm podem ser extraídos de vários tipos de tecidos de plantas e o cDNA será sintetizado a partir desses mRNAs. A PCR quantitativa de transcrição reversa (qRT-PCR) pode ser usada para medir a quantidade de cDNA do gene de teste em diferentes tipos de tecidos de plantas como demonstrado no Exemplo 5.
[0020] Os DNA que codificam proteínas funcionalmente equivalentes à proteína de WMS (SEQ ID NO: 2) são preferencialmente derivados de monocotiledôneas, mais preferencialmente de Gramíneas, e mais preferencialmente de espécies de Triticeae. Tais DNAs incluem, por exemplo, alelos, homólogos, variantes, derivados e mutantes da presente invenção (SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 6), que codificam uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, em que um ou mais aminoácidos são substituídos, excluídos, adicionados ou inseridos.
[0021] A edição do genoma pode ser usada para submeter a knockout genes alvo em plantas e animais (Cheng e Alper, 2014). Uma série de técnicas de edição de genoma que envolvem a nuclease de zinco-dedo (ZFNs), a nuclease efetora (TALEN) do ativador da transcrição (TALEN) e as repetições palindrômicas curtas agrupadas, regularmente interespaçadas (CRISPR) foram utilizadas com sucesso no trigo (Shan et al., 2014; Wang et al., 2014) e cevada (Wendt et al., 2013; Gurushidze et al., 2014). A edição do genoma normalmente leva à eliminação ou inserção de base única ou de múltiplas bases na região alvo interessada, e aqueles que ocorreram entre os éxons de codificação podem causar alteração de aminoácidos ou truncamento de proteínas (Wang et al., 2014). Enquanto um DNA derivado da edição do genoma codifica uma proteína funcionalmente equivalente a uma proteína de WMS natural (SEQ ID NO: 2), que o DNA pode ser incluído como um DNA da presente invenção, mesmo que a proteína de WMS introduzida inclua uma ou mais substituições, eliminações, adições ou inserções de aminoácidos. Os DNAs da presente invenção também incluem mutantes conservadores em que os nucleotídeos são mutados sem resultar em mutação da sequência de aminoácidos da proteína (mutações conservativas).
[0022] Para os habilitados na técnica, é viável modificar o gene WMS e os seus homólogos da presente invenção (SEQ ID NOs: 1 e 6) usando a edição do genoma. Além disso, é viável introduzir a mutação alvo por meio de mutagênese induzida ou pela triagem de germoplasmas naturais. Por exemplo, Slade et al. (2005) desenvolveu uma população de mutantes induzida por EMS de trigo e, em seguida, mutações alvo identificadas com sucesso no uso do método de alvejamento de lesões locais induzidas em genomas (TILLING) (Slade et al., 2005). Além disso, o grupamento de germoplasma evolui com grande quantidade de mutações espontâneas, é viável identificar a mutação alvo na coleta de germoplasma usando Ecotilling (Till et al., 2006). Para os habilitados na técnica, é fácil desenvolver populações de mutantes de plantas e depois identificar mutações no DNA (SEQ ID NOs: 1 e 6) da presente invenção. Ao mesmo tempo, é fácil identificar as mutações espontâneas do DNA (SEQ ID NOs: 1 e 6) da presente invenção em grupamentos de germoplasma ou linhas/cultivares de reprodução. Por conseguinte, a presente invenção também abrange: (a) usar edição de genoma, mutagênese induzida e triagem natural para gerar células de planta que a(s) mutação(ões) no DNA (SEQ ID NOs: 1 e 6) da presente invenção; (b) uma planta que porta o tipo de células de plantas de (a); (c) um clone ou um pole de planta do tipo de plantas de (b), uma vez que eles contenham o tipo de células de plantas de (a); (d) uma semente, um tecido e um órgão de clone ou prole em (b) e (c), uma vez que eles contenham o tipo de célula em (a).
[0023] Outros métodos para a preparação de DNA que codificam proteínas funcionalmente equivalentes à proteína de WMS (SEQ ID NO: 2) incluem reação em cadeia da polimerase (PCR) (Saiki et al., 1985; Hemsley et al., 1989; Landt et al., 1990), tecnologia de DNA recombinante e síntese de gene artificial (Kosuri e Church, 2014), que são bem conhecidos dos habilitados na técnica. Isto é, é uma experimentação de rotina para um habilitado na técnica isolar DNAs altamente homólogos ao gene WMS de trigo ou outras plantas usando iniciadores de PCR que se hibridizam especificamente com uma sequência de nucleotídeos do gene WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6), ou usando um fragmento do gene WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6) como um problema para triar bibliotecas de DNA e cDNA. DNAs, que são isolados usando tecnologia de PCR, tecnologia de DNA recombinante, síntese de gene artificial e tal, e que codificam proteínas funcionalmente equivalentes à proteína de WMS (SEQ ID NO: 2), também estão incluídos nos DNAs da presente invenção. No nível de aminoácidos, pensa-se que os DNA assim isolados são altamente homólogos à sequência de aminoácidos da proteína de WMS (SEQ ID NO: 2). Alta homologia significa identidade de sequência, em toda a sequência de aminoácidos, de pelo menos 50% ou mais, de preferência 70% ou mais, e mais preferencialmente 90% ou mais (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, e 99% ou mais).
[0024] A identidade da sequência de aminoácidos e nucleotídeos pode ser determinada usando o algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990; Karlin e Altschul, 1993). Com base nesse algoritmo, os programas chamados BLASTN, BLASTP, BLASTX, TBLASTN e TBLASTX foram introduzidos (Korf et al., 2003). BLASTN busca uma base de dados de nucleotídeos usando uma consulta de nucleotídeos; BLASTP busca uma base de dados de proteínas usando uma busca de proteína; BLASTX busca a base de dados de proteínas usando uma consulta de nucleotídeo traduzida; TBLASTN busca a base de dados de nucleotídeos traduzido usando uma consulta de proteína; TBLASTX busca a base de dados de nucleotídeos traduzida usando uma consulta de nucleotídeos traduzida. As etapas fundamentais desses métodos de análise estão disponíveis publicamente (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
[0025] A triagem das bibliotecas de DNA genômico ou cDNA pode usar a tecnologia Southern Bloting (Southern, 1975). A Southern Bloting envolve duas grandes etapas. A primeira etapa é afixar os fragmentos de DNA à membrana de nitrocelulose ou náilon e a segunda etapa é realizar a hibridização entre o DNA e o fragmento de DNA problemático rotulado afixado à membrana. Durante a lavagem, é necessário ajustar a severidade de lavagem controlando a temperatura, o teor de sal e o tempo. A severidade aumenta juntamente com a redução do teor de sal no tempão SCC (20x, 10x, 6x, 2x, 1x, 0,5x, 0,2x 0,1x), o aumento de temperatura (42°C, 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C) e o aumento do tempo de lavagem (1 min, 2 min, 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 30 min). Na presente invenção, a ‘alta severidade’ indica que uma etapa de lavagem será realizada em tampão SCC diluído (£1x), sob alta temperatura (> 55°C) e por duração prolongada (> 10 min).
[0026] Para aplicação, também se pensa que os DNAs (SEQ ID NOs: 1 e 6) que codificam a proteína de WMS da presente invenção são úteis na concessão de esterilidade a plantas macho-férteis. Em outras palavras, pensa-se que a esterilidade pode ser concedida a plantas macho-férteis inserindo um DNA (SEQ ID NOs: 1 e 6) que codifica a proteína de WMS da presente invenção em um vetor adequado, introduzindo esse vetor em células de plantas que são capazes para formar plantas macho-férteis, regenerando as células de plantas recombinantes resultantes, e depois reproduzindo as plantas transgênicas que compreendem a característica da esterilidade masculina. Uma vez que as plantas macho- estéreis não podem autopolinizar, é necessário mantê-las usando pólens de outras plantas macho-férteis. Por outro lado, também se pensa que os DNAs (SEQ ID NOs: 1 e 6) que codificam a proteína de WMS da presente invenção são úteis na concessão de fertilidade a plantas macho-férteis conferidas pelo gene WMS. Em outras palavras, pensa-se que a fertilidade pode ser concedida a plantas macho-férteis inserindo o RNA antissentido (asRNA) e/ou o RNA do tipo grampo para cabelo (hpRNA) do DNA (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína de WMS da presente invenção em um vetor adequado, introduzindo este vetor em células de plantas que são capazes de formar plantas macho-férteis, e depois regenerando as células de plantas recombinantes resultantes. Uma vez que as variedades macho-estéreis não podem se autopolinizar, tentar mantê-las é difícil, mesmo quando essas variedades compreendem traços desejáveis. No entanto, se a fertilidade pode ser recuperada usando o gene antissentido e/ou o RNA tipo grampo para cabelo do DNA (SEQ ID NOs: 1 e 6) que codifica a proteína de WMS, a autopolinização torna-se possível, assim como a manutenção de traços desejáveis.
[0027] Os ácidos nucleicos antissentido regulam a expressão gênica alvo através de interferências transcricionais, mascaramento de RNA, mecanismos dependentes de RNA de cadeia dupla (dsrNA) e remodelação da cromatina (Lapidot e Pilpel, 2006). As sequências antissentido usadas na presente invenção podem inibir a expressão de um gene alvo por qualquer das ações acima. Como uma forma de realização, uma sequência antissentido projetada para ser complementar a uma região não traduzida próxima à extremidade 5’ do mRNA de um gene será eficaz na inibição da tradução desse gene. No entanto, uma sequência complementar a uma região de codificação, ou a uma região não traduzida na extremidade 3’ também pode ser usada. Desta forma, os DNAs compreendendo sequências antissentido das regiões traduzidas de gene, bem como regiões não traduzidas, são incluídos nos DNAs antissentidos que podem ser usados para o DNA (SEQ ID NO: 1) da presente invenção. Um DNA antissentido para ser usado aqui é ligado a jusante de um promotor apropriado, tal como o promotor de ubiquitina de milho (Ubi) (Christensen et al., 1992) ou o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) e uma sequência compreendendo um sinal de terminação de transcrição é, de preferência, ligada à extremidade 3’ do DNA. Os DNA assim preparados podem ser introduzidos em uma planta desejada usando métodos conhecidos. As sequências de DNA antissentido são preferencialmente sequências complementares a um gene endógeno, ou uma parte das mesmas da planta a ser transformada, mas não precisam ser perfeitamente complementares, desde que possam inibir eficazmente a expressão gênica. O RNA transcrito é, de preferência, 90% ou mais, e mais preferencialmente 95% ou mais (por exemplo, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais) complementar aos produtos transcritos do gene alvo. A fim de inibir eficazmente a expressão gênica alvo usando uma sequência antissentido, um DNA antissentido deve compreender pelo menos 15 nucleotídeos ou mais, de preferência 100 nucleotídeos ou mais, e ainda mais preferencialmente 500 nucleotídeos ou mais. Os DNAs antissentido a serem usados são geralmente menores que 5 kb e, de preferência, menores que 2,5 kb de comprimento.
[0028] A supressão da expressão de genes endógenos também pode ser realizada usando o DNA que codifica o gene alvo (Hammond et al., 2001; Paddison et al., 2002). Para expressar o hpRNA em células de plantas, uma matriz de DNA projetada para formar RNA tipo grampo para cabelo ou a interferência de RNA (RNAi) de avanço pode ser ligada a uma sequência promotora, tal como, o promotor Ubi e uma sequência de terminação da transcrição. Ao usar a tecnologia hpRNA ou RNAi, os produtos de transcrição dos genes alvo da presente invenção podem ser especificamente regulados por regulagem negativa, e a expressão gênica pode ser suprimida.
[0029] A supressão da expressão de genes endógenos também pode ser conseguida por cossupressão resultante da transformação com um DNA que compreende uma sequência idêntica ou semelhante a uma sequência do gene alvo (Smyth, 1997; Ketting and Plasterk, 2000). O termo “cossupressão” refere-se ao fenômeno de supressão da expressão tanto do gene exógeno introduzido como do gene endógeno alvo quando um gene que compreende uma sequência idêntica ou semelhante ao gene endógeno alvo é introduzido nas plantas por transformação. Por exemplo, para obter uma planta em que o gene WMS é cossuprimido, as plantas de interesse são transformadas com um vetor de DNA construído para expressar o gene WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6), ou um DNA que compreende uma sequência semelhante, e plantas com esterilidade masculina suprimida em comparação com plantas de tipo selvagem são selecionadas das plantas assim obtidas. Os genes a serem usados para a cossupressão não devem ser completamente idênticos ao gene alvo, no entanto, devem compreender identidade de sequência de pelo menos 70% ou mais, de preferência 80% ou mais, mais preferencialmente 90% ou mais (por exemplo, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais). A identidade de sequência pode ser determinada usando um método acima descrito.
[0030] Além disso, a supressão da expressão de genes endógenos na presente invenção também pode ser conseguida transformando uma planta com um gene que compreende características que são negativas dominantes para o gene alvo. Um gene que compreende características negativas dominantes é um gene que, quando expressado, compreende a função de eliminar ou reduzir a atividade de um gene endógeno original da planta. Em Brachypodium, microRNA (miRNA) miR5200 cliva o mRNA do gene do tempo de floração FT, e a sobrexpressão de miR5200 atrasa o tempo de floração em Brachypodium (Wu et al., 2013). Alguns miRNA ou RNA de interferência pequeno (siRNA) podem alvejar para WMS e seus homólogos. Também é possível projetar microRNA artificial (amiRNA) que alveja ao WMS e seus homólogos. Coletivamente, é possível manipular a produção de amiRNA, miRNA e RNAsi eficaz para regular o acúmulo de mRNA de WMS e seus homólogos de modo a controlar a macho-fertilidade da planta.
[0031] Os vetores que podem ser usados na transformação de células de plantas não são particularmente limitados desde que possam expressar o gene inserido nas células de plantas. Por exemplo, os vetores que compreendem promotores para expressar genes em tecidos de plantas específicos (por exemplo, o promotor da presente invenção como SEQ ID NO: 5) e promotores para genes que expressam constitutivamente em células de plantas (por exemplo, o promotor Ubi), podem ser usados. Além disso, os vetores que compreendem um promotor que é ativado na indução por um estímulo externo, também podem ser usados. Aqui, “células de plantas” compreendem várias formas de células de plantas, por exemplo, células de cultura em suspensão, protoplastos, seções de plantas e calos, de várias espécies de plantas.
[0032] Um vetor pode ser introduzido numa célula de planta usando vários métodos conhecidos dos habilitados na técnica, tais como, métodos de polietilenoglicol, métodos de eletroporação, métodos mediados por Agrobacterium, e métodos de bombardeamento de partículas. A regeneração de plantas de células de plantas transformadas também é possível usando métodos conhecidos pelos habilitados na técnica, de acordo com o tipo de células de plantas. Em plantas, por exemplo, muitas técnicas para a produção de plantas recombinantes já estão estabelecidas, e são amplamente usadas no campo da presente invenção. Estes métodos incluem o método para a introdução de genes em protoplastos usando polietileno glicol e depois plantas regeneradoras, o método para a introdução de genes em protoplastos usando pulso elétrico e depois plantas regeneradoras, o método para a introdução direta de genes em células usando o método de bombardeamento de partículas e, em seguida, plantas regeneradoras, e o método para a introdução de genes via Agrobacterium e depois plantas regeneradoras. Estes métodos podem ser adequadamente usados na presente invenção.
[0033] Uma vez que as plantas transformantes, nas quais o genoma de um DNA da presente invenção foi inserido, são obtidas, é possível obter prole destas plantas por reprodução sexuada ou assexuada. A partir dessas plantas, suas proles, ou seus clones, materiais reprodutivos podem ser obtidos (sementes, calos, protoplastos, etc.). Usando esses materiais, essas plantas podem ser produzidas em massa. A presente invenção compreende células de plantas introduzidas com DNAs cobertos pela presente invenção, plantas que compreendem as células, proles ou clones dessas plantas, e os materiais reprodutivos dessas plantas, suas proles e seus clones. Portanto, a presente invenção abrange: (a) células de plantas transgênicas que portam DNA da presente invenção; (b) uma planta que porta o tipo de células de plantas de (a); (c) um clone de planta ou uma prole do tipo de plantas de (b), uma vez que eles contenham o tipo de células de plantas de (a); (d) uma semente, um tecido e um órgão de clone ou prole em (b) e (c), uma vez que eles contenham o tipo de célula em (a).
[0034] Espera-se que a fertilidade/esterilidade das plantas produzidas desta forma seja diferente das plantas de tipo selvagem. Por exemplo, o trigo ‘Bobwhite’ é macho- fértil, mas a expressão do DNA (por exemplo, SEQ ID NO: 4) confere esterilidade masculina a Bobwhite transgênico. Por outro lado, uma vez que a expressão de DNA (por exemplo, SEQ ID NO: 4) em trigo Taigu tenha sido suprimida, pela introdução de DNA antissentido ou semelhante, são pensados para serem investidos com macho-fertilidade. Em plantas, os métodos da presente invenção podem ser usados para regular fertilidade/esterilidade de modo a suprimir a autopolinização e forçar a polinização cruzada, concedendo assim a valiosa característica do vigor híbrido.
[0035] A presente invenção apresenta DNA compreendendo atividade promotora específica de antera. Um exemplo deste tipo de DNA é um DNA genômico (SEQ ID NO: 4) a montante do códon de partida no DNA (SEQ ID NO: 5) que codifica a proteína de WMS na presente invenção. Os DNA promotores da presente invenção incluem DNAs altamente homólogos à sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 5, desde que compreendam atividade promotora específica de antera. Um exemplo destes tipos de DNA é um DNA com atividade promotora específica de antera, compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5, em que um ou mais nucleotídeos são substituídos, eliminados, adicionados ou inseridos. Os promotores de DNA da presente invenção são preferencialmente derivados de monocotiledôneas, mais preferencialmente, derivados de Gramíneas, e mais preferencialmente, derivados de espécies de Triticeae. No entanto, desde que compreendam a função promotora específica de antera, a sua derivação não é particularmente limitada.
[0036] Os DNAs de codificação de proteína de WMS acima da presente invenção podem ser usados para isolar DNAs compreendendo atividade promotora específica de antera. Por exemplo, os DNA genômicos a montante de um DNA que codifica a proteína de WMS da presente invenção podem ser adquiridos usando um DNA (SEQ ID NO: 6) da presente invenção, ou uma parte do mesmo, como uma sonda para triar uma biblioteca de DNA genômico. Uma vez que esses DNAs genômicos a montante são considerados para compreender atividade promotora específica de antera, eles têm alto valor industrial quando usados para expressar especificamente genes arbitrários na antera. ‘Um gene arbitrário’ significa um DNA cuja transcrição pode ser induzida por um promotor de DNA (SEQ ID NO: 5) da presente invenção. ‘Um gene arbitrário’ pode ser qualquer fragmento codificante e não codificante de DNA, dos quais os DNA não codificantes podem compreender a atividade de ribozima, ou podem ser usados para gerar amiRNA, RNAs, RNAm, miRNA, siRNA e assim por diante. Este fragmento de DNA apresentará um padrão de expressão específico de antera sob o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5). Além disso, uma vez que os DNA codifiquem a proteína de WMS da presente invenção são expressados especificamente em anteras de plantas, eles também são considerados como marcadores para identificar o tecido de antera em dissecções florais inteiras.
[0037] Podem também ser obtidos DNAs altamente homólogos à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 usando técnicas de PCR (Saiki et al., 1985), tecnologia de DNA recombinante, e síntese de genes artificiais (Kosuri e Church, 2014). Por exemplo, usando um DNA que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou uma parte do mesmo como um modelo, e usando oligonucleotídeos que se hibridizam especificamente com uma molécula de DNA (SEQ ID NO: 5) como iniciadores de PCR, os DNA altamente homólogos à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 pode ser isolada de trigo e outras espécies de plantas.
[0038] Os métodos bem conhecidos dos habilitados na técnica podem ser usados para preparar este tipo de DNA. Por exemplo, as técnicas de edição do genoma, que são bem conhecidas na técnica (Cheng e Alper, 2014), podem ser usadas para a introdução de mutações incluindo uma ou mais substituições, eliminações, adições ou inserções de bases em DNA que compreende a sequência nucleotídica de SEQ ID NO: 5. As mutações também podem ser introduzidas usando mutagênese direcionada ao sítio, mutagênese induzida por radiação/mutagene, e métodos de PCR (Saiki et al., 1985; Hemsley et al., 1989; Landt et al., 1990).
[0039] Os ensaios repórteres conhecidos que usam genes repórter, ou tais podem ser usados para investigar se os DNA preparados ou não como descritos acima compreendem atividade promotora específica de antera. O gene repórter não é particularmente limitado, desde que sua expressão possa ser detectada. Por exemplo, os genes repórteres geralmente usados pelos habilitados na técnica incluem o gene da luciferase (LUC), o gene da b-glucuronidase (GUS) e o gene da fluorescência verde (GFP), etc. O nível de expressão do gene repórter pode ser determinado usando métodos conhecidos dos habilitados na técnica, de acordo com o tipo de gene repórter. Por exemplo, o nível de expressão do gene da luciferase como repórter pode ser determinado medindo a fluorescência de um composto fluorescente, causada pela ação catalítica do produto de expressão do gene da luciferase. O nível de expressão do gene da GUS pode ser determinado analisando a coloração de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β- glucuronídeo (X-Gluc) ou a luminescência de glucuronídeo (ICN), causada pela ação catalítica do produto de expressão do gene da GUS. O nível de expressão do gene da GFP pode ser determinado medindo a fluorescência devido à proteína do GFP.
[0040] Os DNA promotores da presente invenção podem ser usados para expressar um gene arbitrário de uma maneira específica de antera por: por exemplo, (a) construir um vetor compreendendo um DNA promotor da presente invenção; (b) ligar operacionalmente o gene arbitrário a jusante do DNA promotor da presente invenção nesse vetor de (a); (c) gerar células de plantas transgênicas portadoras do promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) ou o vetor de (b); e (d) obter plantas transgênicas contendo células de plantas transgênicas de (c). “Ligação operável” significa ligar um gene arbitrário a um DNA promotor da presente invenção de modo que possa ser expressado em resposta à ativação do DNA promotor da presente invenção. Uma vez que o DNA promotor da presente invenção compreende uma atividade alta específica de antera, é preferível que os genes arbitrários sejam genes que possam ser particularmente expressados na antera. Por exemplo, o WMS da presente invenção que se refere a esterilidade/fertilidade de trigo pode ser usado adequadamente. Técnicas gerais de engenharia genética podem ser usadas para construir um vetor compreendendo um DNA promotor da presente invenção. Não existe uma limitação particular quanto às células da planta nas quais o vetor é introduzido. Os métodos acima mencionados, conhecidos pelos habilitados na técnica, podem ser usados para introduzir vetores para células de plantas, para regenerar células de plantas transformadas em plantas, etc.
[0041] Por conseguinte, a presente invenção abrange: (a) células de plantas geneticamente modificadas com os DNA promotores cobertos pela presente invenção; (b) plantas compreendendo o tipo de células de (a); (c) a prole ou os clones das plantas de (b), uma vez que contenha o tipo de células de (a); (d) uma semente, um tecido e um órgão de clone ou prole em (b) e (c), uma vez que eles contenham o tipo de célula em (a).
[0042] Para os habilitados na técnica, é viável modificar o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) e sua sequência homóloga usando edição de genoma, introduzir mutação(ões) no promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) e sua sequência homóloga usando mutagênese, ou identificar a mutação espontânea natural no promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) e sua sequência homóloga. Portanto, a presente invenção abrange: (a) células de plantas geneticamente modificadas com variação no promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) obtidas por edição de genoma, mutagênese e triagem natural; (b) plantas compreendendo o tipo de células de (a); (c) a prole ou os clones das plantas de (b), uma vez que contenham o tipo de células de (a); (d) uma semente, um tecido e um órgão de clone ou prole em (b) e (c), uma vez que eles contenham o tipo de célula em (a).
[0043] Em resumo, a presente invenção contém o gene WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6), homólogos de WMS e o seu promotor (por exemplo, SEQ ID NO: 5). Outra expressão específica do gene WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6) é capaz de conceder as plantas macho-férteis regulares com esterilidade masculina. Ao suprimir a expressão gênica WMS nas plantas, é possível conceder às plantas esterilizadas masculinas comuns à característica da macho-fertilidade. Além disso, uma vez que se pensa que o promotor do gene WMS compreende uma atividade específica de antera, é útil expressar genes arbitrários de uma maneira específica de antera. Como esperado, a aplicação do WMS (SEQ ID NOs: 1 e 6), seus homólogos e seus promotores (por exemplo, SEQ ID NO: 5) irão avançar bastante para a reprodução de plantas e indústria de sementes.
[0044] Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita usando Exemplos, mas não deve ser interpretado como limitado a isso.
[0045] A presente invenção baseou-se em um par de linhas de trigo isogênicas Ms2 ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2’, que foram desenvolvidas pela Shandong Agricultural Universtiy. As plantas de trigo foram mantidas em estufa sob fotoperíodo de 16h (105 μmol m-2 s-1) com temperatura no dia de 25-30°C e temperatura à noite de 15-20°C. A água, produtos químicos regulares e hormônios das plantas foram de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA) e Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA), meios de cultura de tecidos de planta de PhytoTechnology Laboratories (Overland Park, KS, EUA), meio de crescimento microbiano de BD (Becton, Dickinson e Company, Franklin Lakes, NJ, EUA) e antibióticos da Gold Biotechnology (St. Louis, MO, EUA). Os iniciadores de PCR da presente invenção estão listados na Tabela 1. Tabela 1: Iniciadores de PCR usados na presente invenção
Nota: Para facilitar a clonagem de genes, o sítio da enzima de restrição NotI foi incluído no iniciador de PCR WMS-FP11, e o sítio de Ascl foram adicionados ao iniciador de PCR WMS- FP11. Os sítios de enzimas de restrição foram destacados usando sublinhados. *Os iniciadores RT-PCR Actina-FP1 e Actina-RP1 trabalharam em amostras de cDNA de trigo e Brachypodium.
[0046] A sequenciação de RNA (RNA-seq) envolve sequenciação direta de cDNAs usando tecnologias de sequenciação de DNA de alto rendimento (Nagalakshmi et al., 2001). Uma abordagem RNA-seq foi realizada para revelar o transcritoma específico de antera em um par de linhas isogênicas Ms2, ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2’. A distância da aurícula entre as folhas bandeira e as penúltimas foi usada como critério para a seleção de anteras na fase de desenvolvimento similar. Anteras, pistilos e folhas bandeira foram coletadas de forma separada a partir de um pedúnculo principal ou broto no qual uma distância auricular atingiu quatro centímetros. Para anteras, foram preparadas três replicações para ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2’, respectivamente. Para os pistilos, três replicações foram preparadas agrupando igual quantidade de tecidos de ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2’, bem como para folhas bandeira. Os RNAs totais foram extraídos usando o método Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA) e submetidos para RNA-seq proporcionados pela Berry Genomics Company (Pequim, China).
[0047] As bibliotecas de sequenciação foram preparadas para um tamanho médio de inserto de 500 pb. O sequenciamento de extremidade emparelhada (PE) foi realizado para duas faixas de leituras de 125 bases emparelhadas em HiSeq2500 (Illumina, San Diego, EUA). Os dados brutos foram pré-processados usando Trimmomatic (Bolger et al., 2014), e os dados limpos foram adquiridos após a eliminação do adaptador, bases de baixa qualidade (metade ou mais bases de uma leitura com um valor de qualidade Q £ 3) e bases desconhecidas (bases desconhecidas de uma leitura > 3%). A compilação de transcritoma de novo de dados limpos foi realizada usando Trinity (Haas et al., 2013). A abundância de transcrição foi estimada usando RSEM (Li e Dewey, 2011), e os transcritos/genes expressados diferencialmente foram identificados usando o programa Edger (Robinson et al., 2010). Em geral, muitos genes foram associados com maior expressão em anteras de ‘LM15Ms2’ do que em anteras de ‘Lumai 15’. Em particular, um gene desconhecido (SEQ ID NO: 1) mostrou expressão específica em, mas indetectável, em ‘Lumai 15’, que teve a hipótese de conferir esterilidade masculina de trigo (WMS) em ‘LM15Ms2’. O gene desconhecido, agora designado como WMS, foi escolhido para análise funcional.
[0048] Os RNAs totais de anteras de ‘LM15Ms2’, uma alíquota de RNAs submetidos para RNA-seq, foram usados para preparar cDNAs usando o Kit de Síntese de cDNA de Primeiro Filamento RevertAid (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA). As extremidades de cDNA 5’ e 3’ do gene WMS (SEQ ID NO: 1) foram identificadas a partir de ‘LM15Ms2’ por RACE PCR usando o kit de Amplificação SMETer RACE cDNA (Clontech Laboratories, Mountain View, CA, EUA). O RACE PCR 5’ envolveu o uso de dois iniciadores WMS, WMS-FP1 e WMS-FP2, onde WMS- FP2 foi aninhado no WMS-FP1. A sequenciação dos produtos de RACE PCR de 5’ e 3’ validou o estado de comprimento total do gene WMS compilado durante a análise RNA-seq. Por conseguinte, um cDNA de comprimento total de WMS foi clonado a partir de ‘LM15Ms2’ usando os iniciadores de WMS, WMS-FP3 e WMS-FP3, que concordaram com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1. O cDNA de 1.485 pb contém um quadro de leitura aberta de 882- bp (ORF). Dois códons de parada no quadro na extremidade 5’ do cDNA propuseram que o ORF previsto seja confiável. Na presente invenção, a região a montante adjacente ao códon de partida previsto foi considerada como o promotor do gene WMS.
[0049] Foi construída uma biblioteca de cromossomo artificial bacteriano (BAC) para ‘LM15Ms2’ usando protocolos padrão (Luo and Wing, 2003; Shi et al., 2011). Em resumo, o DNA genômico de alto peso molecular (HMW) foi extraído de tecidos foliares, parcialmente digerido usando a enzima de restrição HindIII, e separado em agarose a 1% por eletroforese em gel de campo pulsado (PFGE); fragmentos de DNA na faixa de 100-300kb foram recuperados do gel de agarose, resselecionados por execução de PFGE novamente, ligados no vetor BAC pIndigoBAC536-S que foi aberto por HindIII e desfosforilados; o produto de ligação foi transformado nas células resistentes ao Fago DH10B T1 de E coli (Invitrogene, Carlsbad, CA, EUA); os transformantes foram selecionados em meio LB com 12,5 mg/L de cloranfenicol, 80 mg/L de X-gal, 100 mg/L de IPTG; as colônias brancas foram colhidas individualmente em placas de microtitulação de 384 poços.
[0050] Como resultado, 706.176 clones de BAC foram colhidos e arranjados em 1.839 placas de 384 poços (Tabela 2). O teste de qualidade em 337 clones de BAC selecionados aleatoriamente revelou um tamanho médio de inserto de 124,6 kb e uma taxa vazia de 0,50%. Portanto, a biblioteca BAC ‘LM15Ms2’ representou uma cobertura de 5,5 vezes do genoma do trigo (~ 16 Gb). Tabela 2: A biblioteca BAC de trigo ‘LM15Ms2’
[0051] Foi desenvolvido um procedimento de triagem baseado em PCR para a biblioteca BAC ‘LM15Ms2’. A biblioteca BAC foi primeiro duplicada inoculando um novo conjunto de placas de 384 poços, foi preparado um grupamento de plasmídeos primário a partir da cultura de cada placa duplicada usando o Kit Miniprep de DNA ZR BAC (Zymo Research Corporation, Irvine, CA, EUA) e um grupamento de superplasmídeo foi feito grupando a quantidade igual de DNA plasmídico a partir de dez grupamentos primários de pladmídeo. No total, foram preparados 1.839 grupamentos primários de plasmídeos e foram feitos 184 grupamentos de superplasmídeos.
[0052] Para triar a biblioteca BAC, foram projetados múltiplos iniciadores de PCR correspondente com a sequência de cDNA do gene WMS (SEQ ID NO: 1), e então foram testados se eles funcionariam em DNAs genômicos de ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2 ‘. Como resultado, WMS-FP4 e WMS-RP4 amplificaram um único fragmento em ‘Lumai 15’, mas dois fragmentos em ‘LM15MS2’, onde o fragmento maior de ‘LM15Ms2’ correu para o mesmo nível em gel de agarose a 1% como o fragmento de ‘Lumai 15’ (Figura 1). Aparentemente, o fragmento menor era específico para ‘LM15Ms2’, mais provável da região Ms2, o que leva à esterilidade masculina no ‘trigo Taigu’. De fato, o fragmento menor cossegregado com esterilidade masculina em uma grande população de segregação (cerca de 5.000 plantas), para o qual as sementes foram colhidas das plantas macho- férteis de ‘LM15AMs2’ que foram polinizadas por grãos de pólen das plantas macho-férteis de ‘Lumai 15’, e a população segregou aproximadamente metade macho-fértil e metade macho- estéril. Portanto, um marcador de PCR derivado de éxon, WMS- EM, foi desenvolvido usando os iniciadores WMS-FP4 e WMS- RP4.
[0053] O marcador WMS-EM foi usado para triar os grupamentos de superplasmídeos e, em seguida, os grupamentos primários de plasmídeos da biblioteca BAC ‘LM15Ms2’. Uma vez que um grupamento principal foi identificado, o clone BAC seria determinado usando a PCR de 384 poços. No total, recuperaram-se três clones BAC (Figura 2), incluindo um clone que fornece um produto de PCR menor e dois clones que geram um produto de PCR maior. Muito provavelmente, os clones de BAC (P89 e P1076) que produzem um produto de PCR maior foram gerados a partir do cromossomo em 4D que não possui o gene Ms2 dominante, enquanto que o clone BAC (PI 593) que produzia um produto de PCR menor foi gerado a partir do cromossomo 4D portando o gene Ms2 dominante (FIG. 1). O marcador WMS-EM de P1593 estava completamente ligado à esterilidade masculina, sugerindo um gene WMS dominante em PI 593, enquanto que o marcador WMS-EM de P89/P1076 não apresentava associação apertada com a esterilidade masculina, sugerindo um gene wms recessivo em P89/P1076. Todos os três clones BAC foram escolhidos para sequenciação de próxima geração proporcionados pela Berry Genomics Company. Os dados de sequência brutos foram pré-processados pela eliminação de adaptadores, bases de baixa qualidade (metade ou mais bases de uma leitura com um valor de qualidade Q £ 5) e bases desconhecidas (bases desconhecidas de uma leitura > 10%). Vector BAC (pIndigoBAC536-S) e DNA genômico de E. coli. foi descontaminado usando a ferramenta de correspondência cruzada do pacote Phrap (Ewing et al., 1998). A compilação de novo de dados limpos foi realizada para diferentes tamanhos de K-mero (21-91) pelo programa ABySS 1.5.2 (Simpson et al., 2009). Um valor de K-mero de 41 foi escolhido para a compilação de sequências, o que corresponde ao melhor valor N50. A análise de sequências revelou que P89 e P1076 compartilhavam um fragmento idêntico de 54,056 pb, representando o mesmo cromossomo, mas eram polimorfismos substanciais entre P89/P1076 e P1593. De acordo com o cDNA de WMS (SEQ ID NO: 1), os três BACs continham uma região transcritável completa do gene WMS/wms, o cDNA de WMS previsto de P1593 era idêntico à sequência de neucleotídeos de SEQ ID NO: 1, mas havia onze polimorfismos de neucleotídeos únicos (SNPs) entre o cDNA de wms previsto de P89/P1076 e a sequência de neucleotídeos de SEQ ID NO:1. Na comparação, o gene wms em P89 e P1076 estava completo com a informação de sequência do promotor (SEQ ID NO: 3), mas o gene WMS no PI 593 estava incompleto porque situou-se em um BAC e conduzindo a um promotor incompleto (FIG. 2).
[0054] Por conseguinte, os iniciadores de PCR múltiplos foram projetados para se corresponderem o promotor wms (SEQ ID NO: 3), e foram então testados se funcionariam em DNAs genômicos de ‘Lumai 15’ e ‘LM15Ms2’. Como resultado, WMS-FP5 e WMS-RP5 amplificaram duas bandas em ‘Lumai 15’, mas três bandas em ‘LM15Ms2’, onde o fragmento menor de ‘LM15Ms2’ correu para o mesmo nível em gel de agarose a 1% como o fragmento de ‘Lumai 15’ (FIG. 1). Aparentemente, o fragmento maior era específico para ‘LM15Ms2’. Por conseguinte, um marcador de PCR derivado do promotor, WMS- PM, foi desenvolvido usando os iniciadores WMS-FP5 e WMS- RP5. O marcador WMS-PM foi usado para triar a biblioteca BAC ‘LM15Ms2’. Foi identificado um clone adicional de BAC P204 (FIGS. 1 e 2), que foi derivado do cromossomo 4D com o gene Ms2 dominante. Novamente, o clone P204 de BAC foi sequenciado e compilado, que compartilhou uma sobreposição de l. 212 pb com o clone P593 de BAC. Em comparação, o gene WMS (SEQ ID NO: 3) é de 8.657 pb, mas a sequência correspondente do gene WMS é de 10.592 pb (SEQ ID NO: 4), a diferença de tamanho é principalmente devido às inserções do transposon no promotor de WMS.
[0055] A PCR de transcrição reversa (RT-PCR) e a qRT- PCR foram usadas para medir o nível de mRNA do gene WMS em cada tecido de trigo. A RT-PCR envolveu o uso de dois iniciadores de WMS, WMS-FP6 e WMS-RP6 e dois iniciadores, Actina-FPl e Actina-RP1, para o controle de Actina. O qRT- PCR envolveu o uso de dois outros iniciadores de WMS, WMS- FP7 e WMS-RP7 e dois iniciadores, Actina-FP2 e Actina-RP2, para o controle de Actina (Fu et al., 2007). O gene WMS foi especificamente expressado em anteras de trigo, mas não em outros tecidos, tais como, gluma, folha, lema, pálea, pistilo, raiz e pedúnculo (Figura 3A); os níveis de mRNA de WMS na antera foram 100 vezes mais proeminentes do que em qualquer outro tecido testado (Figura 3B).
[0056] A região do DNA a montante do códon de partida previsto foi analisada comparando-se estes do WMS dominante e do wms recessivo. Para recuperar um promotor funcional, considera-se um fragmento relativamente longo (2 a 4 kb) para genes de plantas, especialmente aqueles genes desconhecidos. Na presente invenção, um fragmento de 3502 pb (SEQ ID NO: 3) foi considerado como o promotor do gene wms recessivo em ‘Lumai 15’. A região correspondente do gene WMS dominante de ‘LM15Ms2’ foi de 5578 pb (SEQ ID NO: 4). Os promotores selecionados de WMS e wms compartilharam bases idênticas de 2414 pb na extremidade 5’, mas o restante 1088 pb do promotor wms apresentou variações substanciais quando comparado ao restante 3164 pb do promotor de WMS. O aumento de tamanho no promotor de WMS foi causado principalmente por duas inserções de transposon de 275 pb e 179 lbp, respectivamente. Presumivelmente, pensou-se que a região a montante de 5578 pb do gene WMS compreende a atividade específica de antera.
[0057] Para verificar a atividade específica de antera do promotor de WMS (SEQ ID NO: 5), foram preparadas duas construções de expressão de plantas, incluindo o vetor de destino PC613 e a construção repórter GFP PC966 (PWMS::GFP) (Figura 4A), aqui PWMS representa o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5). O gene GFP em PC613 e PC966 foi derivado de pGWB4 (Nakagawa et al., 2007). Tanto PC613 como PC966 tinham o mesmo esqueleto de plasmídeo de pCAMBIA1300. O ligante de DNA entre PWMS e GFP foi 5’- TAGGGAGAGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATCATG-3’, as bases 5’ TAGGGAG foram derivadas da extremidade do promotor de WMS, e o ATG de extremidade 3’ suporte o códon de partida de GFP. PC613 e PC966 foram bombardeados em diferentes origens florais (lema, pálea, pistilo e antera) como instruído no Exemplo 9. A fluorescência GFP foi observada sob microscópio de fluorescência estéreo três dias pós- bombardeio. Os sinais GFP foram detectados em tecidos bombardeados com a construção PC966 (PWMS::GFP), especialmente em antera, mas não em tecidos bombardeados com a construção PC613. Portanto, o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) na inovação atual tem atividade promotora e pode promover a expressão GFP em antera.
[0058] Para realizar a complementação genética (Exemplo 9) e para validar a função do promotor de WMS (SEQ ID NO: 5), o alelo genômico WMS (SEQ ID NO: 7) foi clonado e usado para montar uma construção de expressão de planta PC976 (Figura 4A). A construção do vetor e o bombardeamento de partículas foram realizados como ilustrado no Exemplo 9. PC966 e PC976 usaram o fragmento idêntico do promotor de WMS (SEQ ID NO: 5). A expressão específica do tecido do gene WMS foi documentada na linha de trigo transgênico ‘JZ7-2’ (Tabela 3), que envolveu o uso dos iniciadores de WMS, WMS-FP6 e WMS-RP6 e os iniciadores Actina, Actina-FP1 e Actina-RP1. Como resultado, o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) da inovação atual conferiu a expressão específica de antera do gene WMS, mas não em outros tecidos, incluindo folha, pedúnculo, gluma, lema, pálea e pistilo (Figura 4C). Em conclusão, o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) possui uma atividade de expressão específica de antera.
[0059] Por conseguinte, é viável montar um cassete de expressão contendo o promotor de WMS (SEQ ID NO: 5) e um gene alvo. O cassete de expressão, uma vez introduzido em plantas (tais como, cultivos, madeiras, vegetais e flores), conferirá a expressão específica de antera do gene alvo. Isso será importante para gerar esterilidade masculina e outros traços importantes nas plantas.
[0060] Desenvolvimento da população de EMS de ‘Lumai 15Ms2’, contendo 1.200 plantas M1 positivas para WMS, foi criado usando a solução de 87,4 μM de metanossulfonato de etila (EMS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Em resumo, cada 400 sementes (Mo) do cruzamento ‘LM15Ms2’/’Lumai 15’ foram embebidas em 100 ml de 87,4 μM de EMS (0,9% em água, v/v) e foram incubadas em um agitador de que corre a 150 rpm e abaixo de 25°C para 10 h. Após o tratamento com EMS, as sementes foram lavadas sob água corrente em temperatura ambiente por 4 h. As sementes M1 mistageneizadas foram fixadas em papéis úmidos e mantidas em uma caixa plástica (comprimento x largura x altura = 40cm x 30cm x 20cm) cobertas por envoltório plástico e depois incubadas sob 25°C e fotoperíodo 16h para 8d.
[0061] Plântulas vigorosas com raízes foram transplantadas para o solo e mantidas em uma sala fria sob 4°C e 12 horas de fotoperíodo para 6w. As plantas de M1 vernalizadas foram então mantidas em uma estufa sob 25°C e fotoperíodo de 16h. Em estufa, apenas as plantas que portam de um gene WMS dominante foram mantidas, mas as que não possuíam o WMS dominante foram descartadas, o que gerou uma população mutante incluindo plantas M1 contendo 1.200 WMS.
[0062] Devido à presença de um gene WMS dominante, todas as 1200 plantas M1 que contêm WMS são supostamente macho-estéreis. No entanto, algumas mutações no gene WMS são pensadas para abolir sua função, causando uma característica macho-fértil. Portanto, as características da macho- fertilidade/ esterilidade foram investigadas em todas os picos das 1200 plantas contendo WMS. Dos 3138 picos inspecionados, vinte picos exibiram fenótipos macho-férteis, caracterizados por antera regular, dispersão de pólen, e fixação de sementes (Figura 5).
[0063] O DNA genômico foi preparado a partir da folha bandeira associada ao pedúnculo principal das plantas M1 usando o método de Sarkosyl (Yuan et al., 2012). As concentrações de DNA foram medidas utilizando um espectrofotômetro Nanodrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA) e normalizadas para 100 μl-1. A quantidade igual de DNAs foi agrupada em quatro vezes e organizada em formato de 96 poços. As amostras de DNA também foram preparadas a partir das folhas bandeira de pedúnculos principais ou brotos que produziram pontas macho-férteis. Cada um destes DNAs foi agrupado duas vezes com a mesma quantidade de DNA genômico do tipo selvagem ‘LM15Ms2’.
[0064] O DNA genômico total foi extraído usando o método de Sarkosyl (Yuan et al., 2012). Para todas as plantas, utilizou-se um segmento de folha bandeira (3-5 cm de comprimento) do broto primário para preparar amostras de DNA independentes. A concentração de DNA foi medida pelo espectrofotômetro ND2000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, EUA) e foi ajustada para 100 ng/μl usando ddH2O. Todas as quatro amostras de DNA foram agrupadas e armazenadas em placas de 96 poços. Para os vinte brotos/pontas que apresentavam fenótipo macho-fértil, suas folhas bandeira foram coletadas para preparar amostras de DNA independentes. Uma vez que um pico macho-fértil passou a ser um broto primário, em vez disso, foi usada uma amostra de DNA do pico primário. Cada DNA de um pico macho-fértil foi então agrupado igualmente com o DNA de tipo selvagem ‘LMl5Ms2’, e armazenado em uma placa de 96 poços também.
[0065] Uma abordagem modificada de TILLING (Uauy et al., 2009) foi usada para detectar mutações induzidas do gene WMS. O método de detecção de poliacrilamida envolve uma abordagem de triagem em duas etapas. A primeira triagem de PCR envolve duas reações de PCR: 1) uma PCR de longo alcance foi realizada para amplificar o alelo WMS em todas os grupamentos de DNA usando o kit KOD FX (Toyobo Co., Osaka, Japão); a PCR envolveu o uso dos iniciadores de PCR seletivos, WMS-FP8 e WMS-RP10; a PCR foi realizada em misturas de 50 μl contendo tampão de PCR 1x (KOD-Plus-Neo), MgSO4 a 1,5 mM, cada dNTP a 0,2 mM, cada iniciador a 0,2 μM, 200 ng de DNA genômico, 1U de Taq polimerase (KOD-Plus-Neo) , e ddH2O; as reações de PCR foram realizadas sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 2 min, seguido de 35 ciclos de 98°C por 10 s, 60°C por 30 s e 68°C por 6 min, e uma extensão final a 68°C por 10 min; o produto de PCR foi diluído 500 vezes usando ddH2O e depois usado como modelo para a próxima PCR; 2) a segunda PCR foi realizada em misturas de 25 μs contendo tampão de PCR 1 x (MgCl2 a 1,5 mM, cada dNTP a 0,2 mM, Promega, Madison, EUA), cada iniciador a 0,2 μm, modelo de DNA de 2 μs do produto de PCR diluído, 1U de Taq polimerase (Promega) e ddH2O; o modelo 5922bp foi dividido em três fragmentos para amplificação: o primeiro fragmento amplificado com WMS-FP8 e WMS-RP8, o segundo fragmento amplificado com WMS-FP9 e WMS-RP9 e o terceiro fragmento amplificado com WMS-FP10 e WMS-RP10; as reações de PCR foram realizadas sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 94°C por 5 min, seguido de 35 ciclos (94°C por 30 s, 61°C por 30 s, 72°C por 90 s) e um final extensão a 72°C por 10 min. Uma etapa de desnaturação e reanelamento está incluído no final da reação de PCR (99°C por 10 min, 90 ciclos de 72°C por 20 s, diminuindo 0,3°C por ciclo) para permitir a formação de heteroduplexes se uma mutação estiver presente no agrupamento.
[0066] Após a etapa de reanelamento, o produto de PCR foi digerido com extrato de suco de aipo (CJE) que foi obtido usando o protocolo descrito por Till et al. (Till et al., 2006). A quantidade de CJE para digestão com heteroduplex foi otimizada como sugerido por Uauy et al. (Uauy et al., 2009). A reação CJE incluiu: 14 μl de produto de PCR, 1 μl de CJE, 2 μl de tampão de digestão 10 x (Till et al., 2006) e 3 μl de ddH2O para um volume final de 20 μl. A digestão foi realizada a 45°C por 30 min e parou imediatamente adicionando 5 μl de EDTA (75mM) por amostra e misturando-se completamente. Foram adicionados cinco microlitros de corante de carga de azul de bromofenol (6x) e cerca de 24 μl de mistura de reação foram carregados m um gel de poliacrilamida a 3% (proporção de Acrilamida: bis de 19:1). Os grupamentos positivos foram identificados pela detecção de produtos de PCR clivados cujo tamanho combinado era comparável ao produto de PCR intacto. Quanto aos grupamentos de DNA duplicados, a presença de uma banda de PCR clivada indicou que há uma mutação pontual no modelo de PCR da amostra de DNA selecionada. Quanto aos grupamentos de DNA quadriplicados, uma banda de PCR clivada indicou que uma amostra de DNA do agrupamento de DNA identificado deve portar uma mutação pontua no modelo de PCR, que pode ser identificado na segunda triagem.
[0067] A segunda triagem foi realizada para determinar qual DNA individual no grupamento de DNA quádruplo realmente porta a mutação. Cada DNA individual foi então agrupado duas vezes com a mesma quantidade de DNA genômico do tipo selvagem ‘LM15Ms2’; estes dois grupamentos de DNA foram triados para produtos clivados conforme descoberto na primeira triagem.
[0068] Para elucidar a mudança de base, foi realizada uma PCR regular no DNA individual selecionado; o produto de PCR foi sequenciado para revelar a mutação pontual (FIG. 5). Para os picos M1 macho-férteis, as mutações pontuais identificadas foram novamente confirmadas nas plantas M2.
[0069] A triagem TILLING revelou 35 mutantes entre 1200 brotos primários, enquanto havia oito mutantes entre os 20 brotos macho-férteis (Figura 5). De acordo com brotos primários, a taxa de mutação do gene WMS é de cerca de 2,92%. No entanto, para os 20 brotos macho-férteis, havia, na verdade, oito brotos com mutações detectáveis, e os 12 brotos provavelmente não apresentavam mutações no gene WMS. Dado um estado independente entre WMS e macho-fertilidade (hipótese de H0), a taxa de mutação da população (2,92%) seria usada para calcular os valores esperados para mutação e não mutação entre 20 brotos macho-férteis, que são 0,58 e 19,42, respectivamente. No entanto, o teste de bondade de ajuste do qui-quadrado rejeitou a hipótese nula (x2 = 97,13, df = 1, P = 6,49E-23). Portanto, o gene WMS provavelmente determinará a esterilidade masculina no trigo Taigu.
[0070] De modo a realizar a complementação genética, um fragmento genômico de 10.592 pb (SEQ ID NO: 7) do gene WMS foi clonado a partir de ‘LM15Ms2’ usando o kit KOD FX e dois iniciadores de PCR específicos WMS-FP11 e WMS-RP11. Após a clonagem do produto de PCR para os vetores de entrada e de destino, preparou-se uma construção de expressão de planta (PC976), que portou um marcador de seleção de BAR (Figura 4A). Os clones BAC portando o gene WMS foram obtidos na presente invenção. Será conveniente clonar o gene WMS (SEQ ID NO: 7) a partir de clones BAC da presente invenção. Para aqueles que estão interessados na clonagem direta do trigo Taigu, uma PCR reversa (Vasl et al., 2004) facilitará a amplificação do gene WMS de comprimento total (SEQ ID NO: 7).
[0071] Os protocolos para a cultura de tecidos e o bombardeamento biolístico do trigo foram adaptados de estudos anteriores (Weeks et al., 1993, Lv et al., 2014). Os cariopses imaturos do cultivar de T. aestivum ‘Bobwhite’ foram colhidos duas semanas após a antítese, esterilizados com etanol a 70% (v/v) contendo Tween 20 a 0,05% (v/v) por 5 min, depois com alvejante Clorox a 20% (v/v) suplementado com Tween 20 a 0,05% (v/v) por 15 minutos e lavado 3-5 vezes usando água destilada estéril. Os embriões imaturos (cerca de 1 mm de comprimento) foram isolados dos cariopses esterilizados, colocados com o escutelo voltado para cima no meio de dissecção (4,3 g/L de base MS, 40 g/L de maltose, 0,5 mg/L de tiamina-HCl, L-asparagina a 0,15 g/L, 2 mg/L de 2,4-D, 0,78 mg/L de CuSO4, 2,5 g/L de Phytagel, pH 5,8) e manteve-se por 4-6 dias a 22-23°C no escuro. Os embriões imaturos foram então tratados por quatro horas nos meios de potencial osmótico alto (4,3 g/L de base MS, 40 g/L de maltose, 171,15 g/L de sacarose, 0,5 mg/L de tiamina-HCl, 0,15 g/L de L-asparagina, 2 mg/L de 2,4-D, 0,78 mg/L de CuSO4, 2,5 g/L de Phytagel, pH 5,8) e submetido a bombardeio biolístico. Vinte horas após o bombardeamento, os embriões imaturos foram transferidos para meios de recuperação (o mesmo que os meios de dissecação), mantidos por 2 semanas a 22-23°C no escuro. Os calos derivados de embriões foram movidos para o meio de regeneração (um meio de dissecção suplementado com 0,1 mg/L de 6-BA e 3 mg/L de bialaphos) e mantidos por duas semanas na câmara de crescimento (22-23°C, 16 h de luz/8 h escuro, intensidade de luz de 25 μmol m-2 s- 1). Os rebentos regenerados (2-3 cm) foram transferidos para o meio de enraizamento (meio de dissecação de meia resistência suplementado com 3 mg/L de bialaphos) e mantidos sob a mesma condição ambiental quanto à regeneração. Rebentos vigorosos com raízes bem desenvolvidas foram estabelecidos no solo na estufa.
[0072] O bombardeio biolístico foi realizado usando o Sistema de Dispensação de Partículas PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories, EUA). Para preparar três bombardeamentos, 2 mg de microcarreadores (partículas de ouro de 0,6 μm de diâmetro, Bio-Rad, EUA) foram medidos em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, esterilizados por mistura com 35 μl de etanol puro, recuperados por centrifugação (12.000 rpm por 5 s) e removendo o sobrenadante, rinsados em 200 μl de água destilada estéril gelada, e coletado por centrifugação e remoção do sobrenadante. Os microcarreadores pré-tratados foram recolocados em suspensão em 245 μl de água estéril pré-resfriada de contendo 20 μg de DNA plasmídico, e combinados com outros 250 μl de CaCl2 pré-resfriado (2,5 M). Onde necessário, as soluções nas etapas anteriores foram completamente misturadas por pipetagem. A suspensão microcarreadora foi então suprida com uma solução de 50 μl de espermidina pré-resfriada (1,45%, v/v) e misturada imediatamente por vórtice na sala fria (4°C) por 15-20 min. Os microcarreadores revestidos com plasmídeo foram recuperados por centrifugação (12.000 rpm por 10 s) e seguidos pela remoção do sobrenadante e, finalmente, recolocados em suspensão em 36 μl de etanol puro. Para cada bombardeio, 10 μl da suspensão de ouro foram carregados para o centro de um disco de macrocarreador (Bio-Rad), seco em ar na cabertura de fluxo laminar e colocado no conjunto de lançamento do microcarreador sob os discos de ruptura de 1.100 psi (7,58 MPa). Sessenta embriões imaturos arranjados em um círculo de 3,5 cm de diâmetro foram colocados a 6 cm abaixo do conjunto de macrocarreador. O sistema PDS-1000/He foi operado de acordo com as instruções do fabricante. As condições de bombardeio foram de pressão de hélio de 1.300 psi (8,96 MPa) e vácuo de 25 mm Hg (3,33 kPa).
[0073] No total, 2742 embriões de trigo imaturos foram bombardeados com a construção PC976, e cada uma de 26 plantas foram regeneradas de um embrião independente (Tabela 3). Em estufa, as plantas transgênicas putativas foram triadas inicialmente testando sua resistência a herbicida Finale® a 0,3% (v/v). No estágio da extensão do pedúnculo, todos os brotos (um broto pérola de folha, segmento de 3cm por folha) foram desafiados pela pintura de herbicidas. A sensibilidade do herbicida foi pesquisada cinco dias pós- pintura. A região pintada permaneceu verde e saudável em brotos resistentes a herbicidas, mas murchou em brotos sensíveis a herbicidas. Havia apenas cinco plantas que mostram resistência a herbicida (Fig. 6 e Tabela 3). No estágio de floração, três plantas eram macho-estéreis e duas delas eram também resistentes a herbicidas (Figura 6 e Tabela 3). A presença do marcador de seleção de BAR e o gene WMS foram então testados em plantas transgênicas putativas usando iniciadores de PCR BAR-FP1, BAR-RP1, WMS-FP8 e WMS- RP12. Sete plantas foram positivas para os genes BAR e WMS (Tabela 3). A RT-PCR foi usada para testar a transcrição de WMS em picos jovens, o que envolveu o uso de iniciadores WMS-FP6 e WMS-RP6 de PCR como para o gene WMS, e Actina-FPl e Actina-RP1 para o controle interno. O cDNA de WMS só foi detectado em três plantas transgênicas macho-estéreis (Figura 6). Em conclusão, a introdução do fragmento genômico WMS (SEQ ID NO: 7) e a expressão do cDNA de WMS (SEQ ID NO: 1) levaram à esterilidade masculina em trigo transgênico. Por conseguinte, a introdução do fragmento genômico WMS (SEQ ID NO: 7) ou o cDNA de WMS (SEQ ID NO: 1) sob um promotor aproximado em plantas férteis (tais como, culturas de cereais, madeiras, flores e vegetais) pode gerar plantas macho-transgênicas estéreis. Isso aumentará consideravelmente a seleção recorrente de plantas e a produção de sementes híbridas. Tabela 3; Plantas de trigo T0 transgênicas para o gene WMS
Nota: '+' indicou resistente a herbicida, positivo para gene BAR, positivo para gene WMS, positivo para cDNA de WMS e macho-estéril; '-' indicou suscetível a herbicida, negativo para gene BAR, negativo para gene WMS, negativo para cDNA WMS e macho fértil. As células com um símbolo ‘ + ’ foram destacadas com sombreamento cinza. O número de plantas positivas para cada traço investigado foi destacado nas linhas subtotais.
[0074] A presente invenção também validou a função do gene WMS na planta modelo Brachypodium. A construção de expressão de planta PC976 (Figura 4A) foi dispensada na cepa Agrobacterium ‘AGLl’ por eletroporação. As plantas Brachypodium transgênicas foram obtidas usando um protocolo mediado por Agrobacterium (Bragg et al., 2012).
[0075] Para preparar inóculos de bactérias, o Agrobacterium AGL1 que porta a construção PC976 foi submetido a faixas em meio sólido MG/L (5g/L de peptona, 2,5 g/L de extrato de levedura, 5g/L de NaCl, 5g/L de D-Manitol, 0,1g/L de MgSO4, 0,25 g/L de K2HPO4, 1,2 g/L de ácido L-glutâmico, 15 g/L de poder de Agar, pH 7,2) suplementados com antibióticos apropriados (50mg/L d canamicina, 100mg/L de carbenicilina e 40mg/L de rifampicina), incubados por dois dias a 28°C no escuro, colhidos por raspagem de colônias de Agrobacterium do meio MG/L e recolocados em suspensão para uma OD6600 de 0,6 no CIM líquido.
[0076] As sementes imaturas foram coletadas do acesso de B. distachyon ‘Bd21-3’ no estágio de enchimento de sementes, esterilizadas em alvejante Clorox® a 10% (v/v) suplementado com Triton X-100 a 0,1% (v/v) por 4 minutos, e rinsou 3 vezes com água estéril. Os embriões imaturos (0,30,7 mm de comprimento) foram isolados de sementes esterilizadas, colocados com o escutelo voltado para cima no meio de iniciação do calo (CIM: 4,43 g/L de base LS, 0,6 mg/L de GuSO4, 30 g/L de sacarose, 2,5mg/L de 2,4-D, 2g/L de Phytagel, pH 5,8) e incubados a 28°C no escuro. Quatro semanas depois, os calos tornaram-se visíveis devido à proliferação do escutelo; apenas os calos embriogênicos amarelados foram colhidos para a subcultura e a transformação mediada por Agrobacterium.
[0077] Os calos embriogênicos foram infectados por 5 minutos por submersão no inóculo de Agrobacterium fresco que continha acetosiringona a 200 μM e PE/F68 sinperônico a 0,1% (p/v), secos em papéis de filtro para remover a suspensão de inóculo livre, e incubados em três camadas de papel de filtro por 3 dias a 22°C no escuro. Após o cocultivo, os calos foram mantidos primeiro no meio CIM suplementado com 150 mg/L de timentina e 40 mg/L higromicina por uma semana a 28°C no escuro, e depois subcultivado por mais duas semanas. Calos vigorosos foram transferidos para o meio de regeneração (Bragg et al., 2012) (4,43g/L de base LS, 0.6mg/L de GuSO4, 30g/L de maltose, 0,2 mg/L de quinetina, 2g/L de Phytagel, pH 5,8) que continha 150 mg/L de timentina e 40 mg/L de higromicina, e manteve-se a 28°C em condições de LD (16 horas de luz/8 horas de escuro, intensidade de luz de 20 μmol m-2 s-1). Quando os brotos regenerados atingiram 1-2 cm, foram transferidos para o meio de enraizamento (Bragg et al., 2012) (base de MS com 4,42g/L de vitamina, 30g/L de sacarose, 2g/L de Phytagel, pH 5,8) que continha 150 mg/L de timentina e 40 mg/L de higromicina, e mantida na mesma condição que na etapa de regeneração. Uma vez que os rebentos regenerados desenvolveram raízes saudáveis (2-3 cm), eles foram estabelecidos no solo na estufa.
[0078] No total, 100 calos foram infectados pela cepa Agrobacterium ‘AGL1’ com PC976. Onze plantas foram recuperadas de oito calos independentes (Tabela 4). Em estufa, as plantas transgênicas putativas foram triadas inicialmente testando sua resistência a herbicida Finale® de 0,3% (v/v). No estágio de três folhas (ca. de 10 cm de altura), todos os brotos (um broto pérola de folha, segmento de 1cm por folha) foram desafiados pela pintura de herbicidas. A sensibilidade a herbicida foi pesquisada cinco dias pós-pintura. A região pintada permaneceu verde e saudável em brotos resistentes a herbicidas, mas murchou em brotos sensíveis a herbicidas. Havia dez plantas com resistência a herbicida (FIG. 7 e Tabela 4). No estágio de floração, dez plantas eram macho-estéreis e também eram resistentes a herbicidas (FIG. 7 e Tabela 4). A presença do marcador de seleção de BAR e o gene WMS foram então testados em plantas transgênicas putativas usando iniciadores de PCR BAR-FPl, BAR-RP1, WMS-FP8 e WMS-RP12. Todas as dez plantas foram positivas para os genes BAR e WMS (Tabela 4). A RT-PCR foi usada para testar a transcrição de WMS em picos jovens, o que envolveu o uso de iniciadores de PCR WMS-FP6 e WMS-RP6 como para o gene WMS, e Actina-FPl e Actina-RP1 para o controle interno. O cDNA de WMS foi detectado nas dez plantas transgênicas macho-estéreis (FIG. 7, Tabela 4). Tomados em conjunto, entre 11 plantas transgênicas putativas, dez plantas eram resistentes a herbicidas, positivas para transgenes BAR e WMS, positivas para o cDNA de WMS e macho- estéreis. Embora houvesse apenas uma planta sendo sensível a herbicida, sem transgenes BAR e WMS, negativas para o cDNA de WMS, e ser macho-férteis. Portanto, o fragmento genômico de WMS (SEQ ID NO: 7) é potente para induzir esterilidade masculina em Brachypodium.
[0079] Mais uma vez, a introdução do fragmento genômico de WMS (SEQ ID NO: 7) ou o cDNA de WMS (SEQ ID NO: 1) sob um promotor aproximado em plantas férteis (tais como, cultivos de cereais, madeiras, flores e vegetais) podem gerar plantas transgênicas macho-estéreis. Isso aumentará consideravelmente a seleção recorrente de plantas e a produção de sementes híbridas. Tabela 4: Plantas Transgênicas T0 de Brachypodium para gene WMS Nota: ‘+’ indicou resistente a herbicida, positivo para gene BAR, positivo para gene WMS, positivo para cDNA DE WMS, e macho-estéril; ‘-‘ indicou suscetível a herbicida, negativo para gene BAR, negativo para gene WMS, negativo para cDNA de WMS e macho-fértil. As células com um símbolo ‘+’ foram destacadas com sombreamento cinza. O número de plantas positivas para cada traço investigado foi destacado nas linhas subtotais. Referências: Altschul, S., Gish, W., Miller, W., Myers, E., and Lipman, D. (1990). Basic local alignment search tool. 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Claims (2)
1. Vetor compreendendo um DNA isolado caracterizado pelo fato do DNA isolado ser qualquer um dos seguintes (a) a (b): (a) um cDNA que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; e (b) um DNA que consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 6.
2. Vetor, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende adicionalmente um DNA que compreende atividade promotora específica de antera, em que o DNA consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5.
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