JP6899779B2 - コムギ雄性不稔遺伝子ｗｍｓおよびその葯特異的発現プロモーターならびにそれらの使用 - Google Patents

Description

（関連出願）
本願は、２０１５年６月４日に出願された中国特許出願第２０１５１０３０３８１７．０号の優先権を主張するものであり、上記出願の主題はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

（技術分野）
本発明は、１つのコムギ雄性不稔（ＷＭＳ）遺伝子、その葯特異的遺伝子プロモーターおよびそれらの使用に関する。

植物の雄性不稔性を用いて、選択育種およびハイブリッド種子生産のための交配を容易にすることができる（Ｒａｏら，１９９０；Ｋｅｍｐｋｅｎ ａｎｄ Ｐｒｉｎｇ，１９９９；Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ，２０１２）。多くの作物種では、多数の雄性不稔系統が発見され、貴重な遺伝資源として保存されており、特にトウモロコシおよびコメなどの主要な穀類の雄性不稔系統の作製が多数試みられている。

Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｈｉ−Ｂｒｅｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社ではＳｅｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＳＰＴ）の開発が進められている（Ｗａｌｔｚ，２０１２）。トウモロコシでは、ＳＰＴ技術に雄性稔性の優性Ｍｓ４５遺伝子、雄性不稔性の劣性ｍｓ４５遺伝子および可視的選択マーカーのＤｓＲｅｄ２遺伝子を使用する。Ｍｓ４５遺伝子は葯特異的プロモーターによって調節されている。トウモロコシ維持系統ＤＰ−３２１３８−１（ｍｓ４５／ｍｓ４５、Ｍｓ４５−ＤｓＲｅｄ２／＿）は花粉供与体としての役割を果たし、これにより生じた非トランスジェニック雄性不稔トウモロコシ系統（ｍｓ４５／ｍｓ４５）は雌性近交親としてハイブリッド種子の作製に用いられる。トウモロコシの雄性不稔性に関する研究はほかにもあり、シトクロームＰ４５０様遺伝子（Ｍｓ２６）の変異誘発によってトウモロコシに雄性不稔性が生じる（Ｄｊｕｋａｎｏｖｉｃら，２０１３）。一方、標的遺伝子の葯特異的発現は、ほかの意図しないペナルティがない雄性不稔性を生じさせるのに極めて重要なものである。Ｌｕｏら（２００６）は、コメｃＤＮＡライブラリーの差次スクリーニングによってタペート組織特異的遺伝子ＲＴＳを発見した（Ｌｕｏら，２００６）。ＲＴＳ遺伝子は、減数分裂時にタペート組織に優勢発現を示し、この発現は開花前に消失する。Ｌｉｕら（２０１３）は、ハイスループットな発現プロファイリングによってコメの葯特異的脂質輸送タンパク質（ＯｓＬＴＰ６）遺伝子を同定した（Ｌｉｕら，２０１３）。一般に、雄性稔性／不稔性遺伝子の葯特異的発現は、ハイブリッド種子生産の際に不可欠な系統を導入するのに重要なものである。

哺乳動物をはじめとする真核生物では、ゲノム編集によって標的遺伝子の特異的改変が可能である（ＣｈｅｎｇおよびＡｌｐｅｒ，２０１４）。ごく最近では、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９がコムギ（Ｗａｎｇら，２０１４）およびオオムギ（Ｗｅｎｄｔら，２０１３；Ｇｕｒｕｓｈｉｄｚｅら，２０１４）で機能することが明らかにされている。したがって、ゲノム編集を用いて、付加価値生産物の作製に使用し得る標的特異的改変を穀類に導入することが可能である。

Ｔａｉｇｕ遺伝子雄性不稔コムギ（以降、「Ｔａｉｇｕ」と称する）は中国で発見された雄性不稔六倍体コムギ変異体である（Ｙａｎｇら，２００９）。「Ｔａｉｇｕ」では、単一の優性遺伝子Ｍｓ２が雄性不稔性を決定する。「Ｔａｉｇｕ」コムギと雄性稔性六倍体コムギを交配すると、そのＦ_１植物体は雄性稔性／不稔性に分離し、具体的には、半数が雄性稔性植物体になり、半数が雄性不稔性植物体になる（ＤｅｎｇおよびＧａｏ，１９８２）。Ｍｓ２遺伝子座については表現型（Ｒｈｔ−Ｄｌｃによって生じる矮化）および分子マーカーが開発されている（ＬｉｕおよびＤｅｎｇ，１９８６；Ｃａｏら，２００９）。１９８３年以来、中国では「Ｔａｉｇｕ」コムギが循環選抜のツールとして用いられている。これまでに、Ｍｓ２遺伝子または密に連鎖したＲｈｔ−Ｄｌｃ／Ｍｓ２遺伝子座（以降、ＲＭｓ２と称する）を保有する中国コムギが数百系統開発されており、「Ｔａｉｇｕコムギ」と総称される。２０１０年までに、ＲＭｓ２に基づく循環選抜によって耐病性、耐塩性および耐乾性または収量性が向上したコムギが４２品種発表されている。生産システムをさらに向上させるべくＭｓ２遺伝子を操作するため、本発明者らは、トランスクリプトーム解析を用いてＭｓ２遺伝子をクローン化することを目的とした。

本発明は、新規なコムギ雄性不稔（ＷＭＳ）遺伝子、その遺伝子プロモーターおよびそれらの使用を提供する。

本発明では、ＲＮＡ−ｓｅｑを用いて減数分裂の初期段階での「Ｌｕｍａｉ １５」および「Ｌｕｍａｉ １５＋Ｍｓ２」（以降、ＬＭ１５_Ｍｓ２）の葯トランスクリプトームの特徴を明らかにした。その結果、ＷＭＳ遺伝子が１つ同定され、その遺伝子は、優性Ｍｓ２遺伝子を保有するコムギにのみ減数分裂の初期段階で葯特異的発現を示した。このＷＭＳ遺伝子はコムギの雄性不稔性に関与することが示唆され、植物のＷＭＳ遺伝子を操作することによってその稔性を変化させ得る。さらに、ＷＭＳプロモーターは、葯特異的遺伝子発現を得るのに重要な葯特異的活性を備えるものと考えられた。したがって、本発明は、葯特異的遺伝子発現を得るツール、様々な植物種に雄性不稔性を発現させるツール、様々な植物種の循環選抜を確立するツールおよび種子生産を補助するツールとして用いると極めて有用であると考えられ得る。具体的には、本発明は以下のものに関連する：
［１］以下の（ａ）〜（ｅ）：（ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；（ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｄ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に等価であり、かつ（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含み、１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入されているタンパク質をコードする、ＤＮＡ；ならびに（ｅ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードし、かつ（ｉｉ）配列番号１および６のヌクレオチド配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡのいずれか１つの単離ＤＮＡ；
［２］配列番号１および６のＤＮＡの転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡ；
［３］配列番号１および６のＤＮＡの転写産物を特異的に切断するリボザイム活性を備えたＲＮＡをコードするＤＮＡ；
［４］植物細胞内で発現すると共抑制作用によって配列番号１および６のＤＮＡの発現をダウンレギュレートするＲＮＡをコードするＤＮＡ；
［５］［１］のＤＮＡがコードする植物細胞内の内因性転写産物にドミナントネガティブな特徴を備えたＲＮＡをコードするＤＮＡ；または［１］のＤＮＡがコードする植物細胞内の内因性タンパク質にドミナントネガティブな特徴を備えたタンパク質をコードするＤＮＡ；
［６］［１］〜［５］のいずれか１つのＤＮＡを含むベクター；
［７］［１］〜［５］のいずれか１つのＤＮＡまたは［６］のベクターが導入されている形質転換植物細胞；
［８］［７］の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体；
［９］［８］の形質転換植物体の形質転換植物体クローンまたは形質転換植物体子孫であって、［７］の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体クローンまたは形質転換植物体子孫；
［１０］［７］の形質転換植物細胞を含む［８］または［９］の形質転換植物体由来の種子、組織および器官；
［１１］以下の（ａ）〜（ｃ）：（ａ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；（ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列を含み、１つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加および／または挿入されているＤＮＡ；ならびに（ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡのいずれか１つのＤＮＡであって、葯特異的プロモーター活性を備えた、ＤＮＡ；
［１２］［１１］のＤＮＡを含むベクター；
［１３］［１１］または［１２］のＤＮＡを含む形質転換植物細胞；
［１４］［１３］の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体；
［１５］［１４］の形質転換植物体の形質転換植物体クローンまたは形質転換植物体子孫であって、［１３］の形質転換植物細胞を含む形質転換植物体クローンまたは形質転換植物体子孫；
［１６］［１３］の形質転換植物細胞を含む［１４］または［１５］の形質転換植物体由来の種子、組織および器官；
［１７］配列番号１および４のヌクレオチド配列を含むＤＮＡに対するゲノム編集ならびに／あるいは変異誘発誘導によって作製した遺伝子改変植物細胞であって、上記の改変が植物の雄性稔性を調節する遺伝子改変植物細胞；
［１８］［１７］の遺伝子改変植物細胞を含む遺伝子改変植物体；
［１９］［１８］の遺伝子改変植物体の植物体クローンまたは植物体子孫であって、［１７］の改変植物細胞を含む植物体クローンまたは植物体子孫；ならびに
［２０］［１７］の改変植物細胞を含む［１８］または［１９］の遺伝子改変植物体由来の種子、組織および器官。

ＷＭＳ−ＥＭマーカーおよびＷＭＳ−ＰＭマーカーによる遺伝子型同定を示す図である。上側パネルにＷＭＳ−ＥＭマーカーによる遺伝子型同定を示し、下側パネルにＷＭＳ−ＰＭマーカーによる遺伝子型同定を示した；左側のパネルは普通コムギ（親系統）およびＢＡＣクローンの遺伝子型であり、右側のパネルは「ＬＭ１５_Ｍｓ２」／「Ｌｕｍａｉ １５」の組合せによるＦ_１個体の遺伝子型であった。Ｆ_１植物体のうち、雄性不稔性植物体３体（Ｓ１、Ｓ２およびＳ３）および雄性稔性植物体３体（Ｆ１、Ｆ２およびＦ３）を含めた代表的な植物体６体を示した。雄性不稔性形質とともに分離した特異的バンドを矢印で示した。 ＷＭＳ／ｗｍｓ遺伝子を保有するＢＡＣクローンを示す図である。Ｐ８９およびＰ１０７６は劣性ｗｍｓ遺伝子を保有する４Ｄ染色体に由来するものであり；Ｐ２０４およびＰ１５９３は優性ＷＭＳ遺伝子を保有する４Ｄ染色体に由来するものである。灰色の影を付けた領域は本発明のＷＭＳ遺伝子（例えば、配列番号４）の全発現マトリックスを表す。各ＢＡＣクローンの挿入サイズは一定の尺度に応じたものである。 ＷＭＳ遺伝子の葯特異的発現を示す図である。Ａ）ＲＴ−ＰＣＲを実施して葯、苞穎、葉、外穎、内穎、雌ずい、根および茎のＷＭＳ ｃＤＮＡを検出した。Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲを実施して葯、ＧＬＰ（苞穎、外穎および内穎）、葉、雌ずいおよび茎のＷＭＳのｃＤＮＡレベルを測定した。ＲＴ−ＰＣＲ解析およびｑＲＴ−ＰＣＲ解析にはともに、対照としてアクチンを含めた。 ＷＭＳプロモーターの葯特異的活性を確認する図である。Ａ）プラスミドを調製してプロモーター活性を試験した；ＰＣ６１３はゲートウェイ適合性ＧＦＰカセットを保有するデスティネーションベクターであった；ＰＣ９６６はＰ_ＷＭＳ：：ＧＦＰ発現カセットを保有し、Ｐ_ＷＭＳはＷＭＳプロモーター（配列番号５）を表した；ＰＣ９７６はＷＭＳ遺伝子（配列番号７）のゲノムコピーを保有するものであった；ベクターは３種類とも同じプラスミド骨格ｐＣＡＭＢＩＡ１３００を有していた。Ｂ）コムギ葯でのＧＦＰ蛍光の一過性発現；緑色蛍光シグナルを矢印で示した。Ｃ）ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＰＣ９７６による遺伝子形質転換によって得られたコムギトランスジェニック植物体「ＪＺ７−２」（表３）の葯、苞穎、葉、外穎、内穎、雌ずいおよび茎のＷＭＳ ｃＤＮＡを検出した；「Ｌｕｍａｉ １５」の葯１および「Ｌｕｍａｉ １５_Ｍｓ２」の葯２を含む２つの対照も含めた。バーは１００μｍである。 優性ＷＭＳ遺伝子に誘導変異を保有するＭ_１植物体のＴＩＬＬＩＮＧスクリーニングおよび稔性葯を示す図である。Ａ）ＷＭＳ−ＦＰ１２およびＷＭＳ−ＲＰ１２を用いたＰＣＲ解析によって優性ＷＭＳ遺伝子の存在を確認した（上パネル）；選択したＭ_１植物体にプライマーＷＭＳ−ＦＰ８およびＷＭＳ−ＲＰ８を用いたＷＭＳ変異のＴＩＬＬＩＮＧ検出（Ｓ：不稔性分げつ枝；Ｆ：稔性分げつ枝；ＣｅｌＩ消化バンドを矢印で示した；下パネル）。Ｂ）選択したＷＭＳ遺伝子のＭ_１変異体における稔性葯の発達。対照として「Ｌｕｍａｉ １５」および「Ｌｕｍａｉ １５_Ｍｓ２」を含めた。バーは１．５ｍｍである。 「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」における優性ＷＭＳ遺伝子の遺伝的相補性を示す図である。Ａ）ＰＣＲ解析によりＴ_０世代のゲノム組込み（ＢＡＲおよびＷＭＳ）およびｃＤＮＡ発現（ＷＭＳおよびアクチン）を確認した。Ｂ）除草剤耐性に関するＢＡＲベースのバイオアッセイ（上パネル；バーは２．５ｍｍである）；ＷＭＳ ｃＤＮＡの発現によってトランスジェニックＴ_０植物体に雄性不稔性の表現型が生じた（下パネル；バーは１．５ｍｍである）。「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」は野生型対照としての役割を果たした。 ヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）「Ｂｄ２１−３」における優性ＷＭＳ遺伝子の遺伝的相補性を示す図である。Ａ）ＰＣＲ解析によりＴ_０世代のゲノム組込み（ＢＡＲおよびＷＭＳ）およびｃＤＮＡ発現（ＷＭＳおよびアクチン）を確認した。Ｂ）除草剤耐性に関するＢＡＲベースのバイオアッセイ（上パネル；バーは２．５ｍｍである）；ＷＭＳ ｃＤＮＡの発現によってトランスジェニックＴ_０植物体に雄性不稔性の表現型が生じた（下パネル；バーは０．５ｍｍである）。ヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）「Ｂｄ２１−３」を野生型対照として含めた。

（発明の詳細な説明）
本発明は、ＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。「Ｔａｉｇｕコムギ」のＷＭＳ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は配列番号１で表され、ＷＭＳ ｃＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２で表され、「Ｔａｉｇｕコムギ」のＷＭＳ遺伝子のプロモーター、転写可能なフラグメントおよびターミネーターを含む完全長ヌクレオチド配列は配列番号４で表され、「Ｔａｉｇｕコムギ」のＷＭＳプロモーターのヌクレオチド配列は配列番号５で表され、「Ｔａｉｇｕコムギ」のＷＭＳ遺伝子の転写可能なフラグメントのヌクレオチド配列は配列番号６で表される。

本発明は、ＷＭＳタンパク質をコードするｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む。当業者は、従来の方法を用いてこのｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを調製することができる。例えば、ａ）「Ｔａｉｇｕコムギ」（例えば、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」）からｍＲＮＡを抽出し；ｂ）そのｍＲＮＡを鋳型に用いてｃＤＮＡを合成し；ｃ）本発明のｃＤＮＡ（例えば、配列番号１）に特異的なＰＣＲプライマーを用いてＷＭＳ ｃＤＮＡを増幅し；ｄ）そのＰＣＲ産物をベクターにクローン化することによってｃＤＮＡを調製することができる。同様に、「Ｔａｉｇｕコムギ」からゲノムＤＮＡを抽出し、ゲノムライブラリーを構築し（この場合、ＢＡＣ、コスミド、フォスミドなどをベクターとして使用することができる）、次いで、本発明のＤＮＡフラグメント（例えば、配列番号４）を用いて陽性クローンをスクリーニングすることによってゲノムＤＮＡを調製することができる。このほか、本発明のＤＮＡ（例えば、配列番号４）に対するＰＣＲによるクローン化によってゲノムＤＮＡを調製することができる。

本発明は、Ｔａｉｇｕコムギ由来のＷＭＳタンパク質（例えば、配列番号２）と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。本明細書では、「Ｔａｉｇｕコムギ由来のＷＭＳタンパク質と機能的に等価なタンパク質」は、本発明のＷＭＳタンパク質（例えば、配列番号２）と等価な生物学的機能または生化学的機能を備えた標的タンパク質を意味する。実施例には植物不稔性の誘導が含まれる。被験遺伝子が雄性不稔性を誘導することができるかどうかを評価するには、実施例７に示すように、ＥＭＳ誘導性変異誘発によって「Ｔａｉｇｕコムギ」に変異を誘発することができ、実施例８に示すように、ＴＩＬＬＩＮＧによって被験遺伝子のノックアウト変異体およびノックダウン変異体を同定することができる。被験遺伝子によって誘導された雄性不稔性は、雄性稔性コムギ「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」の遺伝的相補性を用いて検証することができる。例えば、実施例９に示すように、微粒子銃による撃込みを用いてＷＭＳのゲノム対立遺伝子（配列番号７）を「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」に導入することができる。さらに、実施例１０に示すように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介する形質転換を用いて、ＷＭＳのゲノム対立遺伝子（配列番号７）をモデル植物のヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）に導入することが実行可能である。得られた植物体の表現型を解析することができる。

このような機能の例としてほかにも葯特異的発現があり、これは、葯での発現が実施例５に挙げるほかの組織の少なくとも５倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは１５倍以上という優勢発現を特徴とするものである。被験遺伝子が植物の葯で特異的に転写されるかどうかを評価するために、様々な種類の植物組織からｍＲＮＡを抽出することができ、そのｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。実施例５に示すように、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて様々な種類の植物組織の被験遺伝子のｃＤＮＡ量を測定することができる。

ＷＭＳタンパク質（配列番号２）と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡは、好ましくは単子葉植物、より好ましくはイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、最も好ましくはコムギ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）の種に由来するものである。このようなＤＮＡとしては、例えば、配列番号２のアミノ酸配列を含み１つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加または挿入されたタンパク質をコードする本発明（配列番号１または配列番号６）の対立遺伝子、相同体、バリアント、誘導体および変異体が挙げられる。

ゲノム編集を用いて植物および動物の標的遺伝子をノックアウトすることができる（ＣｈｅｎｇおよびＡｌｐｅｒ，２０１４）。ゲノム編集技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびクラスター化され等間隔にスペーサーが入った短い回文型の反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）を含めた多数のものがコムギ（Ｓｈａｎら，２０１４；Ｗａｎｇら，２０１４）およびオオムギ（Ｗｅｎｄｔら，２０１３；Ｇｕｒｕｓｈｉｄｚｅら，２０１４）に用いられ成功を収めている。通常、ゲノム編集によって目的とする標的領域に単一または複数の塩基の欠失または挿入が起こり、これがコードエキソンで起こるとアミノ酸の変化またはタンパク質の短縮が引き起こされ得る（Ｗａｎｇら，２０１４）。導入されたＷＭＳタンパク質が１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、付加または挿入を含むものであっても、ゲノム編集で得られたＤＮＡが天然のＷＭＳタンパク質（配列番号２）と機能的に等価なタンパク質をコードする限り、そのＤＮＡは本発明のＤＮＡに含まれ得る。本発明のＤＮＡにはほかにも、タンパク質のアミノ酸配列の変異を生じることなくヌクレオチドが変異（保存的変異）した保存的変異体が含まれる。

当業者には、ゲノム編集を用いて本発明のＷＭＳ遺伝子およびその相同体（配列番号１および６）を改変することが実行可能である。さらに、変異誘発の誘導または天然の生殖質スクリーニングによって標的変異を導入することが実行可能である。例えば、Ｓｌａｄｅら（２００５）は、コムギＥＭＳ誘導性変異体集団を開発し、次いで、標的化によりゲノム内に局所的損傷を誘導する方法（ＴＩＬＬＩＮＧ）を用いて標的変異を同定することに成功した（Ｓｌａｄｅら，２００５）。さらに、生殖質プールは大量の自発的変異によって進化し、Ｅｃｏｔｉｌｌｉｎｇを用いて生殖質収集物中の標的変異を同定することが実行可能である（Ｔｉｌｌら，２００６）。当業者には、植物変異体集団を開発し、次いで本発明のＤＮＡ（配列番号１および６）内の標的変異を同定することは容易である。同時に、生殖質プールまたは育種系統／品種中の本発明のＤＮＡ（配列番号１および６）の自発的変異を同定することは容易である。したがって、本発明はほかにも、（ａ）ゲノム編集、変異誘発誘導および天然のスクリーニングを用いて、本発明のＤＮＡ（配列番号１および６）上に変異（１つまたは複数）を有する植物細胞を作製すること；（ｂ）（ａ）のタイプの植物細胞を保有する植物体；（ｃ）（ａ）のタイプの植物細胞を含む（ｂ）のタイプの植物体の植物体クローンまたは植物体子孫；（ｄ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）および（ｃ）のクローンまたは子孫由来の種子、組織および器官を包含する。

ＷＭＳタンパク質（配列番号２）と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡを調製する方法としてほかにも、当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｉｋｉら，１９８５；Ｈｅｍｓｌｅｙら，１９８９；Ｌａｎｄｔら，１９９０）、組換えＤＮＡ技術および人工遺伝子合成（ＫｏｓｕｒｉおよびＣｈｕｒｃｈ，２０１４）が挙げられる。つまり、ＷＭＳ遺伝子（配列番号１および６）のヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズするＰＣＲプライマーを使用することによって、またはＷＭＳ遺伝子（配列番号１および６）のフラグメントをプローブに用いてＤＮＡおよびｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、コムギをはじめとする植物からＷＭＳ遺伝子と相同性の高いＤＮＡを単離することは、当業者には日常的な実験である。ほかにも、ＰＣＲ技術、組換えＤＮＡ技術、人工遺伝子合成などを用いて単離され、ＷＭＳタンパク質（配列番号２）と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡが本発明のＤＮＡに含まれる。アミノ酸レベルでは、このようにして単離されたＤＮＡはＷＭＳタンパク質（配列番号２）のアミノ酸配列と相同性が高いものと考えられる。相同性が高いとは、アミノ酸配列全体にわたる配列同一性が少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、最も好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％またはそれ以上）であることを意味する。

アミノ酸配列およびヌクレオチド配列の同一性はＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３）を用いて求めることができる。このアルゴリズムを土台として、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸと称されるプログラムが発表された（Ｋｏｒｆら，２００３）。ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチドクエリを用いてヌクレオチドデータベースを検索するものであり；ＢＬＡＳＴＰはタンパク質クエリを用いてタンパク質データベースを検索するものであり；ＢＬＡＳＴＸは翻訳ヌクレオチドクエリを用いてタンパク質データベースを検索するものであり；ＴＢＬＡＳＴＮはタンパク質クエリを用いて翻訳ヌクレオチドデータベースを検索するものであり；ＴＢＬＡＳＴＸは翻訳ヌクレオチドクエリを用いて翻訳ヌクレオチドデータベースを検索するものである。上記の解析については基本的な段階が公開されている（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。

ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにはサザンブロッティング法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５）を用い得る。サザンブロッティングには２つの主要な段階がある。第一段階は、ＤＮＡフラグメントをニトロセルロース膜またはナイロン膜に結合させることであり、第二段階は、標識したプローブＤＮＡと膜に結合させたＤＮＡフラグメントとの間でハイブリダイゼーションを実行することである。洗浄時、温度、塩類含有量および時間を制御することによって洗浄ストリンジェンシーを調節する必要がある。ＳＣＣ緩衝液の塩類含有量の減少（２０×、１０×、６×、２×、１×、０．５×、０．２×、０．１×）、温度の上昇（４２℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃）および洗浄時間の増大（１分、２分、５分、１０分、１５分、２０分、３０分）に伴ってストリンジェンシーが増大する。本発明では、「高ストリンジェンシー」は、洗浄段階を希薄ＳＣＣ緩衝液（１×以下）中、高温（５５℃以上）下で長時間（１０分以上）実施することを表す。

応用には、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１および６）は雄性稔性植物体に不稔性を付与するのにも有用であると考えられる。換言すれば、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１および６）を適切なベクターに挿入し、雄性稔性植物体を形成することが可能な植物細胞にこのベクターを導入し、得られた組換え植物細胞を再生させ、次いで雄性不稔性の特徴を備えたトランスジェニック植物体を繁殖させることによって、雄性稔性植物体に不稔性を付与することができると考えられる。雄性不稔性植物体は自家受粉できないため、ほかの雄性稔性植物体の花粉を用いてこれを維持する必要がある。一方、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１および６）は、ＷＭＳ遺伝子によって雄性不稔性植物体に稔性を付与するのにも有用であると考えられる。換言すれば、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１）のアンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）および／またはヘアピンＲＮＡ（ｈｐＲＮＡ）を適切なベクターに挿入し、雄性不稔性植物体を形成することが可能な植物細胞にこのベクターを導入し、次いで得られた組換え植物細胞を再生させることによって、雄性不稔性植物体に稔性を付与することができると考えられる。雄性不稔性変種は自家受粉できないため、望ましい形質を備えたものであっても、それを維持しようとするのは困難である。しかし、ＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号１および６）のアンチセンス遺伝子および／またはヘアピンＲＮＡを用いて稔性を取り戻すことができれば、自家受粉が可能となり、望ましい形質の維持も可能となる。

アンチセンス核酸は、転写干渉、ＲＮＡマスキング、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）依存性機序およびクロマチン再構築を介して標的遺伝子の発現を調節する（ＬａｐｉｄｏｔおよびＰｉｌｐｅｌ，２００６）。本発明に使用するアンチセンス配列は、上記のいずれかの作用によって標的遺伝子の発現を阻害することができる。一実施形態として、ある遺伝子のｍＲＮＡの５’末端付近の非翻訳領域に相補的になるよう設計したアンチセンス配列には、その遺伝子の翻訳を阻害する効果がある。ただし、コード領域または３’末端非翻訳領域に相補的な配列を使用することもできる。このように、本発明のＤＮＡ（配列番号１）に対して使用することができるアンチセンスＤＮＡには、遺伝子の翻訳領域および非翻訳領域のアンチセンス配列を含むＤＮＡが含まれる。本明細書で使用するアンチセンスＤＮＡをトウモロコシユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーター（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら，１９９２）またはＷＭＳプロモーター（配列番号５）などのしかるべきプロモーターの下流に連結し、転写終止シグナルを含む配列を好ましくはＤＮＡの３’末端に連結する。このように既知の方法を用いて、調製したＤＮＡを所望の植物体に導入することができる。アンチセンスＤＮＡ配列は、形質転換する植物体の内在遺伝子またはその一部分に相補的な配列であるのが好ましいが、遺伝子発現を効果的に阻害することができる限り、完全に相補的なものである必要はない。転写ＲＮＡは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）相補的である。アンチセンス配列を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンスＤＮＡは、少なくとも１５ヌクレオチド以上、好ましくは１００ヌクレオチド以上、さらにより好ましくは５００ヌクレオチド以上含むべきである。使用するアンチセンスＤＮＡは一般に、長さが５ｋｂ未満、好ましくは２．５ｋｂ未満である。

このほか、標的遺伝子をコードするＤＮＡを用いて内在遺伝子発現の抑制を実施することができる（Ｈａｍｍｏｎｄら，２００１；Ｐａｄｄｉｓｏｎら，２００２）。植物細胞にｈｐＲＮＡを発現させるため、ヘアピンＲＮＡを形成するかＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を駆動するよう設計したＤＮＡマトリックスをＵｂｉプロモーターなどのプロモーター配列および転写終止配列に連結することができる。ｈｐＲＮＡ技術またはＲＮＡｉ技術を用いることによって、本発明の標的遺伝子の転写産物を特異的にダウンレギュレートすることができ、遺伝子発現を抑制することができる。

このほか、標的遺伝子配列と同一の配列または類似した配列を含むＤＮＡでの形質転換によって生じる共抑制により、内在遺伝子発現の抑制を達成し得る（Ｓｍｙｔｈ，１９９７；ＫｅｔｔｉｎｇおよびＰｌａｓｔｅｒｋ，２０００）。「共抑制」という用語は、標的内在遺伝子の配列と同一の配列または類似した配列を含む遺伝子を形質転換によって植物体に導入すると、導入外来遺伝子および標的内在遺伝子の両方の発現が抑制される現象を指す。例えば、ＷＭＳ遺伝子が共抑制された植物体を得るには、ＷＭＳ遺伝子（配列番号１および６）を発現するよう構築したベクターＤＮＡまたは類似した配列を含むＤＮＡで目的の植物体を形質転換し、このようにして得られた植物体から野生型植物よりも雄性不稔性が抑制された植物体を選択する。共抑制に使用する遺伝子は標的遺伝子と完全に同一なものでなくてもよいが、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上）の配列同一性を備えたものであるべきである。配列同一性は上記の方法を用いて求めることができる。

さらに、本発明の内在遺伝子発現の抑制は、標的遺伝子にドミナントネガティブな特徴を備えた遺伝子で植物体を形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブな特徴を備えた遺伝子とは、発現したときに植物体の本来の内在遺伝子の活性を消失または低下させる機能を備えた遺伝子のことである。ヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）ではマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）ｍｉＲ５２００が開花期遺伝子ＦＴのｍＲＮＡを切断し、ｍｉＲ５２００が過剰発現するとヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）の開花期が遅れる（Ｗｕら，２０１３）。ｍｉＲＮＡまたは低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）にはＷＭＳおよびその相同体を標的とし得るものがある。ＷＭＳおよびその相同体を標的とする人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を設計することも可能である。以上をまとめると、植物体の雄性稔性を制御するため、効果的なａｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡの産生を操作してＷＭＳおよびその相同体のｍＲＮＡ蓄積を調節することが可能である。

植物細胞の形質転換に使用することができるベクターは、植物細胞内で挿入遺伝子を発現することができる限り特に限定されない。例えば、特定の植物組織内で遺伝子を発現させるプロモーター（例えば、本発明の配列番号５のプロモーター）と植物細胞内で構成的に遺伝子を発現させるプロモーター（例えば、Ｕｂｉプロモーター）とを含むベクターを使用することができる。さらに、外部刺激によって誘導されたときに活性化されるプロモーターを含むベクターを使用することもできる。本明細書では、「植物細胞」は、様々な植物種の様々な形態の植物細胞、例えば浮遊培養細胞、プロトプラスト、植物切片およびカルスを含む。

ベクターは、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介法および粒子銃法などの当業者に公知の様々な方法を用いて植物細胞に導入することができる。植物細胞の種類によっては、当業者に公知の方法を用いて形質転換植物細胞から植物体を再生させることも可能である。植物では、例えば、組換え植物を作製する技術が既に多数確立されており、本発明の分野で広く用いられている。このような方法としては、ポリエチレングリコールを用いてプロトプラストに遺伝子を導入し、次いで植物体を再生させる方法、電気パルスを用いてプロトプラストに遺伝子を導入し、次いで植物体を再生させる方法、粒子銃法を用いて細胞内に遺伝子を直接導入し、次いで植物体を再生させる方法のほか、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を介して遺伝子を導入し、次いで植物体を再生させる方法が挙げられる。これらの方法を本発明で適宜用いることができる。

本発明のＤＮＡのゲノムが挿入された形質転換植物体が得られれば、その植物体から有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることが可能である。上記の植物体、その子孫またはそのクローンから繁殖材料（種子、カルス、プロトプラストなど）を得ることができる。これらの材料を用いて上記の植物体を大量生産することができる。本発明は、本発明に包含されるＤＮＡを導入した植物細胞、その細胞を含む植物体、その植物体の子孫またはクローンのほか、上記の植物体、その子孫およびそのクローンの繁殖材料を含む。したがって、本発明は、（ａ）本発明のＤＮＡを保有するトランスジェニック植物細胞；（ｂ）（ａ）のタイプの植物細胞を保有する植物体；（ｃ）（ａ）のタイプの植物細胞を含む（ｂ）のタイプの植物体の植物体クローンまたは植物体子孫；（ｄ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）および（ｃ）のクローンまたは子孫由来の種子、組織および器官を包含する。

このようにして作製した植物の稔性／不稔性は、野生型植物のものとは異なるものであることが予想され得る。例えば、コムギ「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」は雄性稔性であるが、ＤＮＡ（例えば、配列番号４）の発現によってトランスジェニックＢｏｂｗｈｉｔｅに雄性不稔性が付与される。一方、アンチセンスＤＮＡなどの導入によってＴａｉｇｕコムギのＤＮＡ（例えば、配列番号４）の発現が抑制されていれば、雄性稔性が付与されると考えられる。植物では、本発明の方法を用いて稔性／不稔性を調節し、自家受粉を抑制して他家受粉させることにより、雑種強勢という価値のある特徴を付与することができる。

本発明は、葯特異的プロモーター活性を備えたＤＮＡを提供する。このようなＤＮＡの例には、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号５）の開始コドン上流のゲノムＤＮＡ（配列番号４）がある。本発明のプロモーターＤＮＡには、葯特異的プロモーター活性を備えている限り、配列番号５のヌクレオチド配列と相同性の高いＤＮＡが含まれる。このようなタイプのＤＮＡの例には、１つまたは複数のヌクレオチドが置換、欠失、付加または挿入された配列番号５のヌクレオチド配列を含み、葯特異的プロモーター活性を有するＤＮＡがある。本発明のＤＮＡプロモーターは、好ましくは単子葉植物、より好ましくはイネ科（Ｇｒａｍｉｎｅａｅ）、最も好ましくはコムギ連（Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ）の種に由来するものである。しかし、葯特異的プロモーター機能を備えている限り、その由来は特に限定されない。

葯特異的プロモーター活性を備えたＤＮＡの単離に上記の本発明のＷＭＳタンパク質コードＤＮＡを用いることができる。例えば、本発明のＤＮＡ（配列番号６）またはその一部分をプローブに用いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによって、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡの上流にあるゲノムＤＮＡを得ることができる。このような上流ゲノムＤＮＡは葯特異的プロモーター活性を備えていると考えられることから、葯内で任意の遺伝子を特異的に発現させるのに使用すれば、その産業上の価値は高くなる。「任意の遺伝子」とは、本発明のＤＮＡプロモーター（配列番号５）によって転写を誘導することができるＤＮＡを意味する。「任意の遺伝子」は任意のコードＤＮＡおよび非コードＤＮＡのフラグメントであってよく、そのうち非コードＤＮＡは、リボザイム活性を備えたものであっても、またはａｍｉＲＮＡ、ａｓＲＮＡ、ｈｐＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどの作製に使用するものであってもよい。このようなＤＮＡフラグメントは、ＷＭＳプロモーター（配列番号５）の下で葯特異的発現パターンを示す。さらに、本発明のＷＭＳタンパク質をコードするＤＮＡはほかにも、植物の葯に特異的に発現することから、花全体を解剖する際に葯組織を特定するマーカーとして有用であると考えられる。

このほか、ＰＣＲ技術（Ｓａｉｋｉら，１９８５）、組換えＤＮＡ技術および人工遺伝子合成（ＫｏｓｕｒｉおよびＣｈｕｒｃｈ，２０１４）を用いて、配列番号５のヌクレオチド配列と相同性の高いＤＮＡを得ることができる。例えば、配列番号５のヌクレオチド配列またはその一部分を含むＤＮＡを鋳型として使用し、ＤＮＡ分子（配列番号５）と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして使用することによって、コムギをはじめとする植物種から配列番号５のヌクレオチド配列と相同性の高いＤＮＡを単離することができる。

このようなＤＮＡの調製には当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡに１つまたは複数の塩基の置換、欠失、付加または挿入を含めた変異を導入するには、当該技術分野で周知のゲノム編集技術（ＣｈｅｎｇおよびＡｌｐｅｒ，２０１４）を用いることができる。このほか、部位特異的変異誘発、変異原／放射線誘導性変異誘発およびＰＣＲ法（Ｓａｉｋｉら，１９８５；Ｈｅｍｓｌｅｙら，１９８９；Ｌａｎｄｔら，１９９０）を用いて変異を導入することができる。

上記のように調製したＤＮＡが葯特異的プロモーター活性を備えているかどうかを検討するには、レポーター遺伝子を用いる既知のレポーターアッセイなどを用いることができる。レポーター遺伝子は、その発現が検出可能なものである限り、特に限定されない。例えば、当業者が一般に使用するレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子（ＬＵＣ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）および緑色蛍光遺伝子（ＧＦＰ）などが挙げられる。レポーター遺伝子の発現レベルは、その種類に応じた当業者に公知の方法を用いて求めることができる。例えば、レポーターであるルシフェラーゼ遺伝子の発現レベルは、ルシフェラーゼ遺伝子発現産物の触媒作用によって引き起こされる蛍光化合物の蛍光を測定することによって求めることができる。ＧＵＳ遺伝子の発現レベルは、ＧＵＳ遺伝子発現産物の触媒作用によって引き起こされる５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−グルクロニド（Ｘ−Ｇｌｕｃ）の発色またはグルクロン（ＩＣＮ）の発光を分析することによって求めることができる。ＧＦＰ遺伝子の発現レベルは、ＧＦＰタンパク質による蛍光を測定することによって求めることができる。

本発明のプロモーターＤＮＡを用いて、例えば、（ａ）本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターを構築することによって；（ｂ）任意の遺伝子を（ａ）のベクター内の本発明のプロモーターＤＮＡの下流に作動可能に連結することによって；（ｃ）ＷＭＳプロモーター（配列番号５）または（ｂ）のベクターを保有するトランスジェニック植物細胞を作製することによって；および（ｄ）（ｃ）のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物体を得ることによって、任意の遺伝子を葯特異的に発現させることができる。「作動可能に連結する」とは、任意の遺伝子が本発明のプロモーターＤＮＡの活性化に応答して発現し得るように、それを本発明のプロモーターＤＮＡと結合させることを意味する。本発明のプロモーターＤＮＡは高い葯特異的活性を備えているため、任意の遺伝子は特に葯に発現し得る遺伝子であるのが好ましい。例えば、コムギの不稔性／稔性に関連する本発明のＷＭＳを用いるのが適切であり得る。本発明のプロモーターＤＮＡを含むベクターの構築には、一般的な遺伝子工学技術を用いることができる。ベクターを導入する植物細胞に関して特に制限はない。上記の当業者に公知の方法は、植物細胞へのベクターの導入、形質転換植物細胞の植物体への再生などに用いることができる。

したがって、本発明は、（ａ）本発明が包含するプロモーターＤＮＡを有する遺伝子改変植物細胞；（ｂ）（ａ）のタイプの細胞を含む植物体；（ｃ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）の植物体の子孫またはクローン；（ｄ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）および（ｃ）のクローンまたは子孫由来の種子、組織および器官を包含する。

当業者には、ゲノム編集を用いてＷＭＳプロモーター（配列番号５）およびその相同配列を改変したり、変異誘発を用いてＷＭＳプロモーター（配列番号５）およびその相同配列に変異（１つまたは複数）を導入したり、またはＷＭＳプロモーター（配列番号５）およびその相同配列上に天然の自発的変異を同定したりすることが実行可能である。したがって、本発明は、（ａ）ゲノム編集、変異誘発および天然のスクリーニングによって得られるＷＭＳプロモーター（配列番号５）上の変異を有する遺伝子改変植物細胞；（ｂ）（ａ）のタイプの細胞を含む植物体；（ｃ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）の植物体の子孫またはクローン；（ｄ）（ａ）のタイプの細胞を含む（ｂ）および（ｃ）のクローンまたは子孫由来の種子、組織および器官を包含する。

以上をまとめると、本発明にはＷＭＳ遺伝子（配列番号１および６）、ＷＭＳ相同体およびそのプロモーター（例えば、配列番号５）が含まれる。さらにＷＭＳ遺伝子（配列番号１および６）の特異的発現によって、通常の雄性稔性植物に雄性不稔性を付与することが可能である。植物のＷＭＳ遺伝子発現を抑制することによって、通常の雄性不稔性植物に雄性稔性の特徴を付与することが可能である。さらに、ＷＭＳ遺伝子プロモーターは、葯特異的活性を備えていると考えられることから、任意の遺伝子を葯特異的に発現させるのに有用である。予想される通り、ＷＭＳ（配列番号１および６）、その相同体およびそのプロモーター（例えば、配列番号５）を応用すれば、植物育種および種子産業に大きな進歩がもたらされる。

これより、実施例を用いて本発明を具体的に説明するが、本発明がそれに限定されるものと解釈するべきではない。

実施例
本発明は、山東農業大学（Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｔｉｙ）で開発された１対のＭｓ２同質遺伝子コムギ系統「Ｌｕｍａｉ １５」および「ＬＭ１５_Ｍｓ２」に基づくものである。コムギ植物体は、温室内で１６時間の光周期下（１０５μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）、日中温度２５〜３０℃、夜間温度１５〜２０℃で維持した。水、通常の化学薬品および植物ホルモンはＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（ピッツバーグ、ペンシルベニア州、米国）およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から、植物組織培地はＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（オーバーランドパーク、カンザス州、米国）から、微生物増殖培地はＢＤ社（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社、フランクリンレイクス、ニュージャージー州、米国）から、抗生物質はＧｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（セントルイス、ミズーリ州、米国）から購入したものである。本発明のＰＣＲプライマーを表１に記載する。

実施例１
トランスクリプトーム解析によって葯特異的発現を示す遺伝子を明らかにする
ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）では、ハイスループットなＤＮＡシーケンシング技術を用いるｃＤＮＡの直接シーケンシングを実施する（Ｎａｇａｌａｋｓｈｍｉら，２００１）。ＲＮＡ−ｓｅｑ法を実施して１対のＭｓ２同質遺伝子系統「Ｌｕｍａｉ １５」と「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の葯特異的トランスクリプトームを明らかにした。発育段階がほぼ同じ葯を選択する基準として、止め葉と最後から２番目の葉との間の葉耳間長を用いた。葉耳間長が４ｃｍに達した主茎または分げつ枝から葯、雌ずいおよび止め葉を別個に採取した。葯については、「Ｌｕｍａｉ １５」および「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の三つ組をそれぞれ準備した。雌ずいについては、「Ｌｕｍａｉ １５」および「ＬＭ１５_Ｍｓ２」由来の組織を等量プールすることによって三つ組を準備し、止め葉についても同様に準備した。Ｔｒｉｚｏｌ法（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グランドアイランド、ニューヨーク州、米国）を用いて全ＲＮＡを抽出し、Ｂｅｒｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社（北京、中国）が提供するＲＮＡ−ｓｅｑに供した。

平均挿入サイズ５００ｂｐのシーケンシングライブラリーを調製した。ＨｉＳｅｑ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、サンディエゴ、米国）を用いて２レーン分の１２５塩基対のリードについてペアエンド（ＰＥ）シーケンシングを実施した。Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ（Ｂｏｌｇｅｒら，２０１４）を用いて未処理データを前処理し、アダプター、低品質塩基（品質値Ｑ≦３のリードの半数以上の塩基）および未知の塩基（リードの未知の塩基は３％超）を除外した後、クリーンデータを得た。Ｔｒｉｎｉｔｙ（Ｈａａｓら，２０１３）を用いてクリーンデータのｄｅ ｎｏｖｏトランスクリプトームアセンブリを実施した。ＲＳＥＭ（ＬｉおよびＤｅｗｅｙ，２０１１）を用いて転写産物の存在量を推定し、ｅｄｇｅｒプログラム（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，２０１０）を用いて差次的に発現した転写産物／遺伝子を同定した。全般的には、「Ｌｕｍａｉ １５」の葯よりも「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の葯の方が発現量の多い遺伝子が多くみられた。特に、未知の遺伝子（配列番号１）は「ＬＭ１５_Ｍｓ２」で特異的発現がみられたが、「Ｌｕｍａｉ １５」では検出されず、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」にコムギ雄性不稔（ＷＭＳ）が付与されるものと考えられた。現在ＷＭＳという名称のこの未知の遺伝子を機能解析に選択した。

実施例２
ＷＭＳ遺伝子の完全長ｃＤＮＡのクローン化
「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の葯の全ＲＮＡ（ＲＮＡの一部をＲＮＡ−ｓｅｑに供した）を使用して、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｒｉｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｅｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、マウンテンビュー、カリフォルニア州、米国）を用いたＲＡＣＥ ＰＣＲにより「ＬＭ１５_Ｍｓ２」からＷＭＳ遺伝子（配列番号１）の５’ｃＤＮＡ末端および３’ｃＤＮＡ末端を同定した。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲにはＷＭＳ−ＲＰ１およびＷＭＳ−ＲＰ２の２種類のＷＭＳプライマーを使用し、ＷＭＳ−ＲＰ１にＷＭＳ−ＲＰ２をはめ込んだ。３’ＲＡＣＥ ＰＣＲには別の２種類のＷＭＳプライマー、ＷＭＳ−ＦＰ１とＷＭＳ−ＦＰ２を使用し、ＷＭＳ−ＦＰ１にＷＭＳ−ＦＰ２をはめ込んだ。５’ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物および３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ産物のシーケンシングにより、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析時に組み立てられたＷＭＳ遺伝子の完全長の状態での妥当性が確認された。したがって、ＷＭＳプライマーであるＷＭＳ−ＦＰ３およびＷＭＳ−ＦＰ３を用いて「ＬＭ１５_Ｍｓ２」からＷＭＳの完全長ｃＤＮＡをクローン化し、これは配列番号１のヌクレオチド配列と一致するものであった。１，４８５ｂｐのｃＤＮＡには８８２ｂｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が含まれていた。ｃＤＮＡの５’末端にインフレーム停止コドンが２つあることから、予測ＯＲＦが信頼できるものであると考えられた。本発明では、予測開始コドンに隣接する上流領域がＷＭＳ遺伝子のプロモーターであると考えた。

実施例３
「ＬＭ１５_Ｍｓ２」のゲノムＢＡＣライブラリーの構築
標準プロトトル（ｐｒｏｔｏｔｏｌ）（ＬｕｏおよびＷｉｎｇ，２００３；Ｓｈｉら，２０１１）を用いて「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリーを構築した。簡潔に述べれば、葉組織から高分子量（ＨＭＷ）ゲノムＤＮＡを抽出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩを用いて部分的に消化し、１％アガロース上でパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により分離し；１００〜３００ｋｂの範囲のＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから回収し、再びＰＦＧＥを実施することによって再選択し、ＨｉｎｄＩＩＩによって開環し脱リン酸化したＢＡＣベクターｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ５３６−Ｓ内に連結し；連結産物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ Ｔ１ Ｐｈａｇｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｅｌｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ社、カールスバッド、カリフォルニア州、米国）に形質転換し；１２．５ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール、８０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌ、１００ｍｇ／ＬのＩＰＴＧを含むＬＢ培地で形質転換細胞を選択し；白色コロニーを個々に取り出して３８４ウェルマイクロタイタープレートに入れた。結果として、ＢＡＣクローン７０６，１７６個を取り出し、３８４ウェルプレート１，８３９個に配置した（表２）。無作為に選択した３３７個のＢＡＣクローンに品質検査を実施したころ、平均挿入サイズが１２４．６ｋｂであり、空き率が０．５０％であることがわかった。したがって、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」ＢＡＣライブラリーのカバレッジはコムギゲノム（約１６Ｇｂ）の５．５倍であることがわかった。

実施例４
「ＬＭ１５_Ｍｓ２」のＢＡＣクローンのスクリーニングおよびシーケンシング
「ＬＭ１５_Ｍｓ２」ＢＡＣライブラリー用にＰＣＲベースのスクリーニング法を開発した。最初に、新たな３８４ウェルプレートのセットに播種することによってＢＡＣライブラリーを複製し、ＺＲ ＢＡＣ ＤＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、アーバイン、カリフォルニア州、米国）を用いて各複製プレートの培養物から一次プラスミドプールを調製し、１０個の一次プラドミド（ｐｌａｄｍｉｄ）プールから等量のプラスミドＤＮＡをプールすることによって超プラスミドプールを作製した。全体で１，８３９個の一次プラスミドプールを調製し、１８４個の超プラスミドプールを作製した。

ＢＡＣライブラリーをスクリーニングするため、ＷＭＳ遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号１）に合わせて複数のＰＣＲプライマーを設計し、次いで、それが「Ｌｕｍａｉ １５」および「ＬＭ１５_Ｍｓ２」由来のゲノムＤＮＡに対して機能するかどうかを試験した。その結果、ＷＭＳ−ＦＰ４およびＷＭＳ−ＲＰ４によって「Ｌｕｍａｉ １５」では単一のフラグメントが増幅されたが、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」では２つのフラグメントが増幅され、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の大きい方のフラグメントは、１％アガロースゲルで「Ｌｕｍａｉ １５」のフラグメントと同じ高さまで泳動した（図１）。小さい方のフラグメントは「ＬＭ１５_Ｍｓ２」に特異的であり、「Ｔａｉｇｕコムギ」に雄性不稔性をもたらすＭｓ２領域に由来するものである可能性が極めて高いように思われた。実際、小さい方のフラグメントは大きい分離集団（約５０００の植物体）の雄性不稔性と共分離し、この集団は、「Ｌｕｍａｉ １５」の雄性稔性植物体の花粉粒によって受粉した「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の雄性不稔性植物体から種子を収穫したものであり、雄性稔性と雄性不稔に約半数ずつ分離した。したがって、ＷＭＳ−ＦＰ４プライマーおよびＷＭＳ−ＲＰ４プライマーを使用することによって、エキソン由来ＰＣＲマーカーであるＷＭＳ−ＥＭを開発した。

このＷＭＳ−ＥＭマーカーを用いて、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」ＢＡＣライブラリーの超プラスミドプール、次いで一次プラミド（ｐｌａｍｉｄ）プールをスクリーニングした。一次プールが同定されれば、３８４ウェルＰＣＲを用いてＢＡＣクローンが決定されるというものであった。小さいＰＣＲ産物を生じたクローン１つおよび大きいＰＣＲ産物を生じたクローン２つを併せて計３つのＢＡＣクローンが回収された（図２）。大きいＰＣＲ産物を生じたＢＡＣクローン（Ｐ８９およびＰ１０７６）は、優性Ｍｓ２遺伝子を欠く４Ｄ染色体から生じたものであり、小さいＰＣＲ産物を生じたＢＡＣクローン（Ｐ１５９３）は、優性Ｍｓ２遺伝子を保有する４Ｄ染色体から生じたものである可能性が極めて高い（図１）。Ｐ１５９３のＷＭＳ−ＥＭマーカーは雄性不稔性と完全に連鎖しており、Ｐ１５９３上の優性ＷＭＳ遺伝子であることが示唆され、Ｐ８９／Ｐ１０７６のＷＭＳ−ＥＭマーカーには雄性不稔性との密接な関係はみられず、Ｐ８９／Ｐ１０７６上の劣性ｗｍｓ遺伝子であることが示唆された。３つのＢＡＣクローンはいずれも、Ｂｅｒｒｙ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社が提供する次世代シーケンシング用に選択した。アダプター、低品質塩基（品質値Ｑ≦５のリードの半数以上の塩基）および未知の塩基（リードの未知の塩基は１０％超）を除外することによって未処理配列データを前処理した。Ｐｈｒａｐパッケージのｃｒｏｓｓ ｍａｔｃｈツール（Ｅｗｉｎｇら，１９９８）を用いてＢＡＣベクター（ｐＩｎｄｉｇｏＢＡＣ５３６−Ｓ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムＤＮＡを除去した。ＡＢｙＳＳ１．５．２プログラム（Ｓｉｍｐｓｏｎら，２００９）によって、様々なＫ量体サイズ（２１〜９１）についてクリーンデータのｄｅ ｎｏｖｏアセンブリを実施した。配列アセンブリには、最良Ｎ５０値に相当するＫ量体値４１を選択した。配列解析により、Ｐ８９とＰ１０７６が同じ染色体を表す５４，０５６ｂｐの同一のフラグメントを有することが明らかになったが、この２つはＰ８９／Ｐ１０７６とＰ１５９３との間に実在する多型であった。ＷＭＳ ｃＤＮＡ（配列番号１）によれば、３つのＢＡＣにはいずれも、ＷＭＳ／ｗｍｓ遺伝子の転写可能領域全体が含まれており、Ｐ１５９３の予測ＷＭＳ ｃＤＮＡは配列番号１のニュークレトード（ｎｅｕｃｌｅｔｏｄｅ）配列と一致していたが、Ｐ８９／Ｐ１０７６の予測ｗｍｓ ｃＤＮＡと配列番号１のニュークレトード（ｎｅｕｃｌｅｔｏｄｅ）配列との間には一ニュークレオチド（ｎｅｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）多型（ＳＮＰ）が１１個存在していた。比較では、Ｐ８９とＰ１０７６のｗｍｓ遺伝子はプロモーター（配列番号３）の配列情報が完全なものであったが、Ｐ１５９３のＷＭＳ遺伝子は不完全なプロモーターにつながるＢＡＣの一端に位置していたため、不完全なものであった（図２）。

したがって、ｗｍｓプロモーター（配列番号３）に合わせて複数のＰＣＲプライマーを設計し、次いで、それが「Ｌｕｍａｉ １５」および「ＬＭ１５_Ｍｓ２」由来のゲノムＤＮＡに対して機能するかどうかを試験した。その結果、ＷＭＳ−ＦＰ５およびＷＭＳ−ＲＰ５によって「Ｌｕｍａｉ １５」では２本のバンドが増幅されたが、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」では３本のバンドが増幅され、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の小さい方のフラグメントは、１％アガロースゲルで「Ｌｕｍａｉ １５」のフラグメントと同じ高さまで泳動した（図１）。大きい方のフラグメントは「ＬＭ１５_Ｍｓ２」に特異的なものであると思われた。したがって、ＷＭＳ−ＦＰ５プライマーおよびＷＭＳ−ＲＰ５プライマーを使用することによって、プロモーター由来ＰＣＲマーカーであるＷＭＳ−ＰＭを開発した。このＷＭＳ−ＰＭマーカーを用いて「ＬＭ１５_Ｍｓ２」ＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。ほかにもＢＡＣクローンＰ２０４が同定され（図１および２）、これは優性Ｍｓ２遺伝子を有する４Ｄ染色体に由来するものであった。ＢＡＣクローンＰ２０４にも同じくシーケンシングおよびアセンブリを実施し、１，２１２ｂｐがＢＡＣクローンＰ１５９３と重複していた。比較では、ｗｍｓ遺伝子（配列番号３）は８，６５７ｂｐであるが、ＷＭＳ遺伝子の対応する配列は１０，５９２ｂｐ（配列番号４）であり、このサイズの差は、主にＷＭＳプロモーターへのトランスポゾン挿入に起因するものである。

実施例５
ＷＭＳ遺伝子の組織特異的発現の解析
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびｑＲＴ−ＰＣＲの両方を用いて各コムギ組織のＷＭＳ遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定した。ＲＴ−ＰＣＲには、ＷＭＳ−ＦＰ６およびＷＭＳ−ＲＰ６の２種類のＷＭＳプライマーを使用し、アクチン対照としてアクチン−ＦＰ１およびアクチン−ＲＰ１の２種類のプライマーを使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲには、別の２種類のＷＭＳプライマー、ＷＭＳ−ＦＰ７とＷＭＳ−ＲＰ７を使用し、アクチン対照としてアクチン−ＦＰ２およびアクチン−ＲＰ２の２種類のプライマーを使用した（Ｆｕら，２００７）。ＷＭＳ遺伝子は、コムギの葯には特異的に発現したが、苞穎、葉、外穎、内穎、雌ずい、根および茎などのほかの組織には発現しなかった（図３Ａ）。葯のＷＭＳのｍＲＮＡレベルは、ほかの被験組織よりも１００倍顕著であった（図３Ｂ）。

実施例６
ＷＭＳプロモーターの同定
予測開始コドンの上流にあるＤＮＡ領域を優性ＷＭＳのものと劣性ｗｍｓのものとで比較することによって解析した。機能的プロモーターを回収するため、植物遺伝子、特に未知の植物遺伝子としては比較的長いフラグメント（２〜４ｋｂ）を考慮した。本発明では、３５０２ｂｐのフラグメント（配列番号３）が「Ｌｕｍａｉ １５」の劣性ｗｍｓ遺伝子のプロモーターであると考えた。「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の優性ＷＭＳ遺伝子の対応する領域は５５７８ｂｐ（配列番号４）であった。選択したＷＭＳおよびｗｍｓのプロモーターは、５’末端の２４１４ｂｐの塩基が一致していたが、ｗｍｓプロモーターの残りの１０８８ｂｐには、ＷＭＳプロモーターの残りの３１６４ｂｐと比較して相当な差がみられた。ＷＭＳプロモーターのサイズの増大は、それぞれ２７５ｂｐおよび１７９１ｂｐの２つのトランスポゾンの挿入が主な原因であった。ＷＭＳ遺伝子の５５７８ｂｐの上流領域が葯特異的活性を備えているのではないかと考えられた。

ＷＭＳプロモーター（配列番号５）の葯特異的活性を検証するため、デスティネーションベクターＰＣ６１３およびＧＦＰレポーター構築物ＰＣ９６６（Ｐ_ＷＭＳ：：ＧＦＰ）を含めた２種類の植物発現構築物を調製し（図４Ａ）、ここでは、Ｐ_ＷＭＳはＷＭＳプロモーター（配列番号５）を表す。ＰＣ６１３およびＰＣ９６６のＧＦＰ遺伝子はｐＧＷＢ４（Ｎａｋａｇａｗａら，２００７）から誘導したものである。ＰＣ６１３およびＰＣ９６６はともに同じｐＣＡＭＢＩＡ１３００のプラスミド骨格を有していた。Ｐ_ＷＭＳとＧＦＰとの間のＤＮＡリンカーは５’−ＴＡＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡＧＴＧＧＴＧＡＴＣＡＴＧ−３’であり、５’塩基ＴＡＧＧＧＡＧをＷＭＳプロモーターの末端に由来するものであり、３’末端ＡＴＧはＧＦＰの開始コドンを表す。ＰＣ６１３およびＰＣ９６６を実施例９で説明する通りに様々な花器（外穎、内穎、雌ずいおよび葯）内に撃ち込んだ。撃込みから３日後、実体蛍光顕微鏡下でＧＦＰ蛍光を観察した。構築物ＰＣ９６６（Ｐ_ＷＭＳ：：ＧＦＰ）を撃ち込んだ組織、特に葯にＧＦＰシグナルが検出されたが、構築物ＰＣ６１３を撃ち込んだ組織には検出されなかった。したがって、本イノベーションのＷＭＳプロモーター（配列番号５）は、プロモーター活性を有し、葯でのＧＦＰ発現を促進し得る。

遺伝的相補性試験を実施し（実施例９）、ＷＭＳプロモーター（配列番号５）の機能を検証するため、ＷＭＳゲノム対立遺伝子（配列番号７）をクローン化し、植物発現構築物ＰＣ９７６の組立てに用いた（図４Ａ）。実施例９で説明する通りにベクター構築および粒子撃込みを実施した。ＰＣ９６６およびＰＣ９７６にはともに、ＷＭＳプロモーター（配列番号５）の同一のフラグメントを用いた。トランスジェニックコムギ系統「ＪＺ７−２」でのＷＭＳ遺伝子の組織特異的発現については報告しており（表３）、これにはＷＭＳのＷＭＳプライマーであるＷＭＳ−ＦＰ６およびＷＭＳ−ＲＰ６ならびにアクチンプライマーであるアクチン−ＦＰ１およびアクチン−ＲＰ１を使用した。その結果、本イノベーションのＷＭＳプロモーター（配列番号５）によってＷＭＳ遺伝子の葯特異的発現がもたらされたが、葉、茎、苞穎、外穎、内穎および雌ずいを含めたほかの組織には発現がみられなかった（図４Ｃ）。結論を述べれば、ＷＭＳプロモーター（配列番号５）は葯特異的発現活性を有する。

したがって、ＷＭＳプロモーター（配列番号５）と標的遺伝子とを含む発現カセットを組み立てることが実現可能である。この発現カセットを植物（穀類、樹木、野菜および花など）に導入すれば、標的遺伝子の葯特異的発現がもたらされる。このことは、植物に雄性不稔性をはじめとする重要な形質を生じさせるのに重要なものとなる。

実施例７
「ＬＭ１５_ＲＭｓ２」のＥＭＳ集団の開発
メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ミズーリ州）の８７．４μＭ溶液を用いてＷＭＳ陽性Ｍ_１植物体１，２００体を含む「ＬＭ１５_Ｍｓ２」の変異体集団を作出した。簡潔に述べれば、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」／「Ｌｕｍａｉ １５」の交配から得られた種子（Ｍ_０）全４００個を８７．４μＭのＥＭＳ（０．９％水溶液、ｖ／ｖ）１００ｍｌに浸漬した後、１５０ｒｐｍで稼働させた振盪器で２５℃にて１０時間インキュベートした。ＥＭＳ処置の後、種子を流水下、室温で４時間洗浄した。変異を誘発したＭ_１種子を湿紙上に置き、プラスチックラップで覆ったプラスチック製の箱（長さ×幅×高さ＝４０ｃｍ×３０ｃｍ×２０ｃｍ）の中で維持した後、２５℃、１６時間の光周期下で８日間インキュベートした。根を有する活発な実生を土壌に移植し、４℃の低温室中、１２時間の光周期で６週間維持した。次いで、春化処理したＭ_１植物体を２５℃の温室中、１６時間の光周期で維持した。温室では、優性ＷＭＳ遺伝子を保有する植物体のみを維持したが、優性ＷＭＳを欠く植物体を廃棄し、これにより、ＷＭＳを有するＭ_１植物体１２００体を含む変異体集団を得た。

実施例８
「ＬＭ１５_Ｍｓ２」のＥＭＳ集団のＷＭＳ変異のＴＩＬＬＩＮＧスクリーニング
ＷＭＳを有するＭ_１植物体１２００体にはいずれも優性ＷＭＳ遺伝子が存在することから、これらは雄性不稔性であると考えられる。しかし、ＷＭＳ遺伝子の変異のなかには、ＷＭＳ遺伝子の機能を打ち消し雄性稔性の特性を生じさせるものがあると考えられる。したがって、ＷＭＳを有するＭ_１植物体１２００体の穂すべてを対象に雄性稔性／不稔性の特性を検討した。調査した穂３１３８個のうち２０個が、正常な葯、花粉分散および結実を特徴とする雄性稔性の表現型を示した（図５）。

サルコシル法（Ｙｕａｎら，２０１２）を用いて、Ｍ_１植物体の主茎に付随する止め葉からゲノムＤＮＡを調製した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウィルミントン、デラウェア州、米国）を用いてＤＮＡ濃度を測定し、１００ｎｇ／μｌに正規化した。等量のＤＮＡを４倍でプールし、９６ウェルフォーマットにまとめた。ほかにも、雄性稔性の穂を生じた主茎または分げつ枝の止め葉からＤＮＡ試料を調製した。これらのＤＮＡをそれぞれ等量の野生型「ＬＭ１５_Ｍｓ２」由来ゲノムＤＮＡとともに２倍でプールした。

サルコシル法（Ｙｕａｎら，２０１２）を用いて全ゲノムＤＮＡを抽出した。植物体のいずれについても、一次分げつ枝の止め葉の一部（長さ３〜５ｃｍ）を用いて、独立したＤＮＡ試料を調製した。ＮＤ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、ウィルミントン、デラウェア州、米国）によってＤＮＡ濃度を測定し、ｄｄＨ_２Ｏを用いて１００ｎｇ／μｌに合わせて補正した。ＤＮＡ試料を４つずつまとめてプールし、９６ウェルプレートで保管した。雄性稔性の表現型を示す２０個の分げつ枝／穂については、その止め葉を採取して独立したＤＮＡ試料を調製した。雄性稔性の分げつ枝が偶然一次分げつ枝であった場合、その一次分げつ枝のＤＮＡ試料を代わりに用いた。次いで、雄性稔性分げつ枝のＤＮＡをそれぞれ同じように野生型「ＬＭ１５_Ｍｓ２」のＤＮＡとともにプールし、９６ウェルプレートで保管した。

改変ＴＩＬＬＩＮＧ法（Ｕａｕｙら，２００９）を用いて、ＷＭＳ遺伝子に誘導された変異を検出した。ポリアクリルアミド検出法では２段階のスクリーニング法を用いる。１回目のＰＣＲスクリーニングは、以下に示す２つのＰＣＲ反応を実施するものである：１）全ＤＮＡプールについてＫＯＤ ＦＸキット（東洋紡社、大阪、日本）を用いて長距離ＰＣＲを実施し、ＷＭＳ対立遺伝子を増幅した；ＰＣＲには、選択的ＰＣＲプライマーであるＷＭＳ−ＦＰ８およびＷＭＳ−ＲＰ１０を使用した；１×ＰＣＲ緩衝液（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ）、１．５ｍＭのＭｇＳＯ_４、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．２μＭの各プライマー、２００ｎｇのゲノムＤＮＡ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ）およびｄｄＨ_２Ｏを含有する混合物５０μｌを用いてＰＣＲを実施した；ＰＣＲ反応を以下の条件で実施した：９４℃で２分間の初期変性、次いで９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間および６８℃で６分間を３５サイクルならびに６８℃で１０分間の最終伸長；ｄｄＨ_２Ｏを用いてＰＣＲ産物を５００倍に希釈した後、それを次のＰＣＲの鋳型として使用した；２）１×ＰＣＲ緩衝液（１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ；Ｐｒｏｍｅｇａ社、マディソン、米国）、０．２μＭの各プライマー、希釈したＰＣＲ産物のＤＮＡ鋳型２μｌ、１ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）およびｄｄＨ_２Ｏを含有する混合物２５μｌを用いて２回目のＰＣＲを実施した；増幅には５９２２ｂｐの鋳型を３つのフラグメントに分割した：第一のフラグメントはＷＭＳ−ＦＰ８およびＷＭＳ−ＲＰ８で増幅し、第二のフラグメントはＷＭＳ−ＦＰ９およびＷＭＳ−ＲＰ９で増幅し、第三のフラグメントはＷＭＳ−ＦＰ１０およびＷＭＳ−ＲＰ１０で増幅した；ＰＣＲ反応を以下の条件で実施した：９４℃で５分間の初期変性、次いで３５サイクル（９４℃で３０秒間、６１℃で３０秒間、７２℃で９０秒間）および７２℃で１０分間の最終伸長。プール内に変異が存在する場合、ＰＣＲ反応の最後に変性／再アニーリング段階（９９℃で１０分間、１サイクル毎に０．３℃低下させながら７２℃で２０秒間を９０サイクル）を組み入れてヘテロ二本鎖を形成させる。

再アニーリング段階の後、Ｔｉｌｌらによって記載されているプロトコル（Ｔｉｌｌら，２００６）を用いて得たセロリジュース抽出物（ＣＪＥ）でＰＣＲ産物を消化した。Ｕａｕｙらが推奨する通りに（Ｕａｕｙら，２００９）、ヘテロ二本鎖の消化に用いるＣＪＥの量を最適化した。ＣＪＥ反応には、ＰＣＲ産物１４μｌ、ＣＪＥ １μｌ、１０×消化緩衝液（Ｔｉｌｌら，２００６）２μｌおよびｄｄＨ_２Ｏ ３μｌで最終体積を２０μｌにしたものを用いた。消化は４５℃で３０分間実施し、ＥＤＴＡ（７５ｍＭ）を１試料当たり５μｌ加えて十分にかき混ぜることによって短時間で停止させた。ブロモフェノールブルー添加染料（６×）を５μｌ加え、反応混合物を３％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミドとビスの比は１９：１）に約２４μｌ負荷した。合計サイズが未変化ＰＣＲ産物と同等である切断されたＰＣＲ産物を検出することによって、陽性プールを特定した。２倍ＤＮＡプールについては、切断されたＰＣＲバンドの存在から、選択したＤＮＡ試料のＰＣＲ鋳型に点変異が存在することがわかった。４倍ＤＮＡプールについては、切断されたＰＣＲバンドから、特定したＤＮＡプールのうちの１つのＤＮＡ試料が、ＰＣＲ鋳型内に点変異を保有しているはずであることが明らかになり、この点変異は２回目のスクリーニングで同定することができる。

２回目のスクリーニングを実施して、４倍ＤＮＡプールの個々のＤＮＡのうち実際に変異を保有しているものを明らかにした。次いで、個々のＤＮＡをそれぞれ等量の野生型「ＬＭ１５_Ｍｓ２」由来ゲノムＤＮＡとともに２倍プールし、次いで、その２倍ＤＮＡプールを１回目のスクリーニングで発見した切断産物についてスクリーニングした。

塩基変化を明らかにするため、選択した個々のＤＮＡに通常のＰＣＲを実施し、そのＰＣＲ産物にシーケンシングを実施して点変異を明らかにした（図５）。雄性稔性Ｍ_１の穂で同定された点変異がＭ_２植物でも同じく確認された。

ＴＩＬＬＩＮＧスクリーニングでは、一次分げつ枝１２００個に３５例の変異体が明らかになり、雄性稔性分げつ枝２０個では変異体が８例みられた（図５）。一次分げつ枝では、ＷＭＳ遺伝子の変異率は約２．９２％である。一方、雄性稔性分げつ枝２０個では、検出可能な変異を保有する分げつ枝が実際に８例みられ、１２個の分げつ枝はＷＭＳ遺伝子に変異がないものと思われた。ＷＭＳと雄性稔性とは独立の状態にあること（Ｈ_０仮説）を考慮に入れると、集団の変異率（２．９２％）を用いて雄性稔性分げつ枝２０個の変異および非変異の予測値が産出され、それぞれ０．５８および１９．４２となる。しかし、カイ二乗適合度検定によって帰無仮説が棄却された（χ^２＝９７．１３、ｄｆ＝１、Ｐ＝６．４９Ｅ−２３）。したがって、ＷＭＳ遺伝子がＴａｉｇｕコムギの雄性不稔性を決定しているものと思われる。

実施例９
微粒子銃撃込みを用いたトランスジェニックＢｏｂｗｈｉｔｅの作製
遺伝的相補性試験を実施するため、ＫＯＤ ＦＸキットおよび２つの特異的ＰＣＲプライマーＷＭＳ−ＦＰ１１およびＷＭＳ−ＲＰ１１を用いて、「ＬＭ１５_Ｍｓ２」からＷＭＳ遺伝子の１０，５９２ｂｐのゲノムフラグメント（配列番号７）をクローン化した。ＰＣＲ産物をエントリーベクターおよびデスティネーションベクターにクローン化した後、ＢＡＲ選択マーカーを保有する植物発現構築物（ＰＣ９７６）を調製した（図４Ａ）。本発明では、ＷＭＳ遺伝子を保有するＢＡＣクローンを得た。本発明のＢＡＣクローンからＷＭＳ遺伝子（配列番号７）をクローン化すると便利である。Ｔａｉｇｕコムギから直接クローン化することに興味がある場合、連続ＰＣＲ（Ｖａｓｌら，２００４）によって完全長ＷＭＳ遺伝子（配列番号７）の増幅が容易になる。

コムギの組織培養および微粒子銃撃込みのプロトコルは、これまでの研究（Ｗｅｅｋｓら，１９９３；Ｌｖら，２０１４）によるものを改変したものである。パンコムギ（Ｔ．ａｅｓｔｉｖｕｍ）の品種「Ｂｏｂｗｈｉｔｅ」の未熟穎果を開花から２週間後に採取し、Ｔｗｅｅｎ２０を０．０５％（ｖ／ｖ）含有する７０％（ｖ／ｖ）エタノールで５分間、次いで０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を添加した２０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）漂白剤で１５分間滅菌し、無菌蒸留水を用いて３〜５回洗浄した。滅菌した穎果から未熟胚（長さ約１ｍｍ）を単離し、胚盤を上に向けて解剖用培地（ＭＳベース４．３ｇ／Ｌ、マルトース４０ｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ ０．５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン０．１５ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４ ０．７８ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）上に置き、２２〜２３℃の暗所で４〜６日間維持した。次いで、未熟胚を高浸透圧調節物質培地（ＭＳベース４．３ｇ／Ｌ、マルトース４０ｇ／Ｌ、スクロース１７１．１５ｇ／Ｌ、チアミン−ＨＣｌ ０．５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アスパラギン０．１５ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ_４ ０．７８ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２．５ｇ／Ｌ、ｐＨ５．８）上で４時間処理し、微粒子銃撃込みに供した。撃込みから２０時間後、未熟胚を回復培地（解剖培地と同じもの）に移し、２２〜２３℃の暗所で２週間維持した。胚由来カルスを再生培地（０．１ｍｇ／Ｌの６−ＢＡおよび３ｍｇ／Ｌのビアラホスを添加した解剖培地）に移し、成長チャンバ（２２〜２３℃、明期１６時間／暗期８時間、光強度２５μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）内で２週間維持した。再生シュート（２〜３ｃｍ）を発根培地（３ｍｇ／Ｌのビアラホスを添加した濃度半分の解剖培地）に移し、再生と同じ環境条件下で維持した。根が十分に発達した活発なシュートを温室内の土壌に根付かせた。

ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国）を用いて微粒子銃撃込みを実施した。３回分の撃込みの準備には、マイクロキャリア（直径０．６μｍの金粒子；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、米国）２ｍｇを１．５ｍｌの微小遠心管に計り取り、純エタノール３５μｌと混合して滅菌し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍで５秒間）によって回収し、上清を除去し、氷冷無菌蒸留水２００μｌで洗浄し、遠心分離および上清の除去によって収集した。プラスミドＤＮＡ２０μｇを含有する予冷した滅菌水２４５μｌに前処理したマイクロキャリアを再懸濁させ、予冷したＣａＣｌ_２（２．５Ｍ）２５０μｌとさらに混合した。必要に応じて、前の諸段階の溶液をピペット操作によって十分にかき混ぜた。次いで、マイクロキャリア懸濁液に予冷したスペルミジン溶液（１．４５％、ｖ／ｖ）５０μｌを添加し、直ちに低温室（４℃）内で１５〜２０分間ボルテックスすることによってかき混ぜた。プラスミドでコートされたマイクロキャリアを遠心分離（１２，０００ｒｐｍで１０秒間）とそれに続く上清の除去によって回収し、最後に純エタノール３６μｌに再懸濁させた。１回の撃込み毎に、金懸濁液１０μｌをマクロキャリアディスク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の中心部に装填し、層流フード内で風乾し、１１００ｐｓｉ（約７６００ｋＰａ）の破裂板下でマイクロキャリア発射アセンブリに入れた。直径３．５ｃｍの円形に配置した未熟胚６０個をマクロキャリアアセンブリの６ｃｍ下方に置いた。ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ Ｓｙｓｔｅｍを製造業者の指示書に従って稼働させた。撃込み条件をヘリウム圧１，３００ｐｓｉ（約９０００ｋＰａ）および真空圧２５ｍｍＨｇとした。

計２７４２個のコムギ未熟胚に構築物ＰＣ９７６を撃ち込み、個々の胚から植物体がそれぞれ２６体再生した（表３）。温室では最初に、０．３％（ｖ／ｖ）Ｆｉｎａｌｅ（登録商標）除草剤に対する耐性を試験することによって、トランスジェニック植物体と推定される植物体をスクリーニングした。茎伸長期の全分げつ枝（分げつ枝１本当たり葉１枚、葉１枚当たり３ｃｍの部分）を除草剤塗布によって刺激した。塗布から５日後、除草剤感受性を調べた。除草剤耐性分げつ枝の塗布領域は緑色で健常な状態であったが、除草剤感受性分げつ枝のものはしおれていた。除草剤耐性を示した植物体はわずか５体であった（図６および表３）。開花期には、３体の植物体に雄性不稔性がみられ、そのうち２体には除草剤耐性もみられた（図６および表３）。次いで、ＰＣＲプライマーＢＡＲ−ＦＰ１、ＢＡＲ−ＲＰ１、ＷＭＳ−ＦＰ８およびＷＭＳ−ＲＰ１２を用いて推定トランスジェニック植物体のＢＡＲ選択マーカーおよびＷＭＳ遺伝子の有無を試験した。７体の植物体がＢＡＲ遺伝子およびＷＭＳ遺伝子ともに陽性であった（表３）。ＲＴ−ＰＣＲを用いて幼穂でのＷＭＳ転写を試験し、この試験では、ＰＣＲプライマーとしてＷＭＳ遺伝子にはＷＭＳ−ＦＰ６およびＷＭＳ−ＲＰ６、内部対照にはアクチン−ＦＰ１およびアクチン−ＲＰ１を用いた。ＷＭＳ ｃＤＮＡは雄性不稔性トランスジェニック植物体３体にのみ検出された（図６）。結論を述べれば、ＷＭＳゲノムフラグメント（配列番号７）の導入およびＷＭＳ ｃＤＮＡ（配列番号１）の発現によってトランスジェニックコムギに雄性不稔性がもたらされた。したがって、稔性植物（穀類、樹木、花および野菜など）にしかるべきプロモーターの下でＷＭＳゲノムフラグメント（配列番号７）またはＷＭＳ ｃＤＮＡ（配列番号１）を導入することによって雄性不稔性トランスジェニック植物が生じ得る。これにより植物の循環選抜およびハイブリッド種子生産が大幅に進歩する。

実施例１０
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換を用いたトランスジェニックヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）の作製
本発明ではほかにも、モデル植物のヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）でＷＭＳ遺伝子機能を検証した。エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）「ＡＧＬ１」系統に植物発現構築物ＰＣ９７６（図４Ａ）を送達した。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介プロトコル（Ｂｒａｇｇら，２０１２）を用いてトランスジェニックヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）植物体を得た。

細菌接種材料の調製には、しかるべき抗生物質（カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、カルベニシリン１００ｍｇ／Ｌおよびリファンピシン４０ｍｇ／Ｌ）を添加した固体ＭＧ／Ｌ培地（トリプトン５ｇ／Ｌ、Ｙｅａｔ抽出物２．５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、Ｄ−マンニトール５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４ ０．１ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ０．２５ｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン酸１．２ｇ／Ｌ、アガーパワー（Ａｇａｒ ｐｏｗｅｒ）１５ｇ／Ｌ、ＰＨ７．２）に構築物ＰＣ９７６を保有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＧＬ１を画線し、２８℃の暗所で２日間インキュベートし、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）コロニーをＭＧ／Ｌ培地から掻き取って採取し、ＯＤ_６００が０．６になるよう液体ＣＩＭに再懸濁させた。

種子登熟期のミナトカモジグサ（Ｂ．ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）アクセッション「Ｂｄ２１−３」から未熟種子を収集し、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を添加した１０％（ｖ／ｖ）Ｃｌｏｒｏｘ（登録商標）漂白剤で４分間滅菌し、滅菌水を用いて３回洗浄した。滅菌した種子から未熟胚（長さ０．３〜０．７ｍｍ）を単離し、カルス誘導培地（ＣＩＭ：ＬＳベース４．４３ｇ／Ｌ、ＧｕＳＯ_４ ０．６ｍｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、２，４−Ｄ ２．５ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２ｇ／Ｌ、ＰＨ５．８）上に胚盤を上に向けて置き、暗所にて２８℃でインキュベートした。４週間後、胚盤の増殖によってカルスが肉眼で確認できるようになり、黄色を呈した胚由来カルスのみを選択して継代培養およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換に供した。

２００μＭアセトシリンゴンと０．１％（ｗ／ｖ）ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ ＰＥ／Ｆ６８とを含有する新鮮なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）接種材料に胚由来カルスを浸漬することによって５分間感染させ、ろ紙の上で乾燥させて遊離接種材料懸濁液を除去し、２２℃の暗所で３日間、３層のろ紙の上でインキュベートした。共培養後、カルスを最初、１５０ｍｇ／Ｌのｔｉｍｅｎｔｉｎと４０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンを添加したＣＩＭ培地で１週間、２８℃の暗所で維持し、次いで、さらに２週間継代培養した。１５０ｍｇ／Ｌのｔｉｍｅｎｔｉｎと４０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシンとを含有する再生培地（Ｂｒａｇｇら，２０１２）（ＬＳベース４．４３ｇ／Ｌ、ＧｕＳＯ_４ ０．６ｍｇ／Ｌ、マルトース３０ｇ／Ｌ、カイネチン０．２ｍｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２ｇ／Ｌ、ＰＨ５．８）に活発なカルスを移し、ＬＤ条件（明期１６時間／暗期８時間、光強度２０μｍｏｌ・ｍ^−２・ｓ^−１）下、２８℃で維持した。再生シュートが１〜２ｃｍに達したとき、１５０ｍｇ／Ｌのｔｉｍｅｎｔｉｎを含有する発根培地（Ｂｒａｇｇら，２０１２）（ビタミン４．４２ｇ／Ｌ、スクロース３０ｇ／Ｌ、Ｐｈｙｔａｇｅｌ ２ｇ／Ｌを含むＭＳベース、ＰＨ５．８）に移し、再生段階と同じ条件下で維持した。再生シュートに健常な根が発達（２〜３ｃｍ）してから、温室内の土壌に根付かせた。

計１００個のカルスにＰＣ９７６を有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）「ＡＧＬ１」株を感染させた。独立したカルス８個から植物体１１体を回収した（表４）。温室では最初に、０．３％（ｖ／ｖ）Ｆｉｎａｌｅ（登録商標）除草剤に対する耐性を試験することによって、トランスジェニック植物体と推定される植物体をスクリーニングした。三葉期（高さ約１０ｃｍ）の全分げつ枝（分げつ枝１本当たり葉１枚、葉１枚当たり１ｃｍの部分）を除草剤塗布によって刺激した。塗布から５日後、除草剤感受性を調べた。除草剤耐性分げつ枝の塗布領域は緑色で健常な状態であったが、除草剤感受性分げつ枝のものはしおれていた。除草剤耐性を示した植物体は１０対であった（図７および表４）。開花期には、１０体の植物体に雄性不稔性がみられ、除草剤耐性もみられた（図７および表４）。次いで、ＰＣＲプライマーＢＡＲ−ＦＰ１、ＢＡＲ−ＲＰ１、ＷＭＳ−ＦＰ８およびＷＭＳ−ＲＰ１２を用いて推定トランスジェニック植物体のＢＡＲ選択マーカーおよびＷＭＳ遺伝子の有無を試験した。１０体の植物体はいずれもＢＡＲ遺伝子およびＷＭＳ遺伝子ともに陽性であった（図４）。ＲＴ−ＰＣＲを用いて幼穂でのＷＭＳ転写を試験し、この試験では、ＰＣＲプライマーとしてＷＭＳ遺伝子にはＷＭＳ−ＦＰ６およびＷＭＳ−ＲＰ６、内部対照にはアクチン−ＦＰ１およびアクチン−ＲＰ１を用いた。雄性不稔性トランスジェニック植物体１０体にＷＭＳ ｃＤＮＡが検出された（図７、表４）。以上をまとめると、推定トランスジェニック植物体１１体のうち１０体が、除草剤耐性を示し、ＢＡＲ導入遺伝子およびＷＭＳ導入遺伝子ともに陽性であり、ＷＭＳ ｃＤＮＡ陽性であり、かつ雄性不稔性であった。これに対し、除草剤感受性を示し、ＢＡＲ導入遺伝子およびＷＭＳ導入遺伝子の両方を欠き、ＷＭＳ ｃＤＮＡ陰性であり、かつ雄性稔性である植物体はわずか１体であった。したがって、ＷＭＳ（配列番号７）のゲノムフラグメントはヤマカモジグサ（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ）に雄性不稔性を誘導する効力がある。

ここでも同じく、稔性植物（穀類、樹木、花および野菜など）にしかるべきプロモーター下でＷＭＳゲノムフラグメント（配列番号７）またはＷＭＳ ｃＤＮＡ（配列番号１）を導入することによって雄性不稔性トランスジェニック植物が生じ得る。これにより植物の循環選抜およびハイブリッド種子生産が大幅に進歩する。

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Ｗｅｎｄｔ，Ｔ．，Ｈｏｌｍ，Ｐ．，Ｓｔａｒｋｅｒ，Ｃ．，Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，Ｍ．，Ｖｏｙｔａｓ，Ｄ．，Ｂｒｉｎｃｈ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｈｏｌｍｅ，Ｉ．（２０１３）．ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ａ ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｂａｒｌｅｙ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８３，２７９−２８５．
Ｗｕ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｄ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｒ．，Ｑｉｎ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｄ．，Ｌｉ，Ａ．，Ｆｕ，Ｄ．，Ｚｈａｉ，Ｗ．，ａｎｄ Ｍａｏ，Ｌ．（２０１３）．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ ＬＯＣＵＳ Ｔ ｂｙ ａ ＭｉｃｒｏＲＮＡ ｉｎ Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２５，４３６３−４３７７．
Ｙａｎｇ，Ｌ．，Ｌｉｕ，Ｂ．，Ｚｈａｉ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｈ．，Ｚｈｏｕ，Ｙ．，Ｍｅｎｇ，Ｆ．，Ｙａｎｇ，Ｊ．，Ｚｈｕ，Ｇ．，Ｃｈｕｉ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｑ．，ａｎｄ Ｗｅｉ，Ｙ．（２００９）．Ｄｗａｒｆ ｍａｌｅ−ｓｔｅｒｉｌｅ ｗｈｅａｔ：Ａ ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｗｈｅａｔ．Ｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌａｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｅｒａ，Ｑ．Ｙ．Ｓｈｕ，ｅｄ（Ｒｏｍｅ，Ｉｔａｌｙ：Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｎａｔｉｏｎｓ），ｐｐ．３７０−３７２．
Ｙｕａｎ，Ｃ．，Ｊｉａｎｇ，Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｋ．，Ｔａｎｇ，Ｈ．，Ｌｉ，Ｘ．，ａｎｄ Ｆｕ，Ｄ．（２０１２）．Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｉｐｅ ｒｕｓｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｌｏｃｉ Ｙｒ１０，Ｌｒ３４／Ｙｒ１８ ａｎｄ Ｙｒ３６ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｗｈｅａｔ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３９，５８７−５９２．

Claims (8)

1. 以下の（ａ）〜（ｇ）：
   （ａ）配列番号１のヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
   （ｃ）配列番号６のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
   （ｄ）コムギ雄性不稔を引き起こすタンパク質であって、配列番号２のアミノ酸配列と配列同一性が少なくとも９０％のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ；
   （ｅ）コムギ雄性不稔を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１または６のヌクレオチド配列を含むＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記高ストリンジェントな条件が、洗浄段階を、０．１×以下の希薄ＳＣＣ緩衝液中、６５℃以上で１５分以上実施する条件である、ＤＮＡ；
   （ｆ）コムギ雄性不稔を引き起こすタンパク質をコードするＤＮＡであって、配列番号１または６のヌクレオチド配列と配列同一性が少なくとも９０％のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；および
   （ｇ）配列番号１または６のＤＮＡの転写産物に相補的なアンチセンスＲＮＡをコードする、ＤＮＡ；
   のいずれか１つである単離されたＤＮＡ。
2. ベクター中に提供されている、請求項１に記載の単離されたＤＮＡ。
3. 前記ベクターが、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つのＤＮＡであって、葯特異的プロモーター活性を備えた、ＤＮＡ：
   （ａ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号５のヌクレオチド配列と配列同一性が少なくとも９０％のヌクレオチド配列を含むＤＮＡ；ならびに
   （ｃ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むＤＮＡと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、前記高ストリンジェントな条件が、０．１×以下の希薄ＳＣＣ緩衝液中、６５℃以上で１５分以上実施する条件である、ＤＮＡ；
   をさらに含む、請求項２に記載の単離されたＤＮＡ。
4. 請求項１に記載のＤＮＡあるいは請求項２または３に記載のベクターで形質転換された形質転換植物細胞。
5. 請求項４に記載の形質転換植物細胞を含む、形質転換植物体。
6. 請求項５に記載の形質転換植物体の種子、組織および器官。
7. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを用いる、植物の雄性稔性を調節する方法。
8. 請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡを用いる、植物に雄性不稔性を付与する方法。

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