UA125682C2 - Ген чоловічої стерильності пшениці wms і його промотор специфічної для пиляка експресії та їх застосування - Google Patents
Ген чоловічої стерильності пшениці wms і його промотор специфічної для пиляка експресії та їх застосування Download PDFInfo
- Publication number
- UA125682C2 UA125682C2 UAA201711536A UAA201711536A UA125682C2 UA 125682 C2 UA125682 C2 UA 125682C2 UA A201711536 A UAA201711536 A UA A201711536A UA A201711536 A UAA201711536 A UA A201711536A UA 125682 C2 UA125682 C2 UA 125682C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- dna
- gene
- protein
- plants
- wheat
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 241000209140 Triticum Species 0.000 title claims abstract description 59
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 title claims abstract description 57
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 title claims abstract description 54
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 title claims abstract description 54
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 156
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 204
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 24
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 179
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 54
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 45
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 45
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 42
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 15
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 10
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 claims description 4
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 12
- 241001124076 Aphididae Species 0.000 claims 1
- 241000899771 Arenga undulatifolia Species 0.000 claims 1
- 241000159610 Roya <green alga> Species 0.000 claims 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 claims 1
- 101150116749 chuk gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 claims 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 abstract description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 abstract description 3
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 abstract 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 59
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 238000000034 method Methods 0.000 description 40
- 101150112752 M5 gene Proteins 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 34
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 26
- 101100346935 Arabidopsis thaliana MUCI21 gene Proteins 0.000 description 24
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 24
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 23
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 22
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 15
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 14
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 13
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 11
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 10
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 10
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 10
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 9
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 7
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 7
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 6
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 6
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 6
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 6
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 5
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 5
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 5
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 5
- 238000003167 genetic complementation Methods 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 4
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 3
- 101100123850 Caenorhabditis elegans her-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 3
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 3
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229940027257 timentin Drugs 0.000 description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 235000008733 Citrus aurantifolia Nutrition 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 2
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 2
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 2
- 235000011941 Tilia x europaea Nutrition 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N bilanafos Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O GINJFDRNADDBIN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000004571 lime Substances 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001853 pulsed-field electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000033458 reproduction Effects 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 2
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 2,2-dichloro-n-[(1s,2s)-1,3-dihydroxy-1-(4-nitrophenyl)propan-2-yl]acetamide Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@@H](CO)[C@@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101150096316 5 gene Proteins 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 description 1
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 description 1
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 description 1
- 101100504103 Caenorhabditis elegans gpb-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150073211 ET gene Proteins 0.000 description 1
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000630665 Hada Species 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- 241000170545 Iago Species 0.000 description 1
- FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N Kinetin Natural products N=1C=NC=2N=CNC=2C=1N(C)C1=CC=CO1 FAIXYKHYOGVFKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101150030193 Nanp gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Chemical group 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101150017038 Ser gene Proteins 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 101150034049 cep gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N kinetin Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NCC1=CC=CO1 QANMHLXAZMSUEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001669 kinetin Drugs 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Chemical group 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012372 quality testing Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 1
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000014639 sexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000015041 whisky Nutrition 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Винахід стосується гену WMS, який забезпечує чоловічу стерильність пшениці. Добре відомий ген Ms2, який викликає домінантну чоловічу стерильність пшениці, широко застосовувався для повторюваної селекції в Китаї. Підхід на основі секвенування РНК застосовували для виявлення специфічного для пильовика транскрипту в парі М82-ізогенних ліній, "Lumai 15" і "Lumail5+Ms2". Як наслідок цього, був виявлений ген WMS, який проявляє специфічну для пильовика експресію на ранній стадії мейозу та тільки у пшениці, що несе ген Ms2. Регулювання WMS може призвести до зміни чоловічої фертильності рослин. Було встановлено, що промотор WMS має специфічну для пильовика активність. Винахід можна застосовувати для досягнення специфічної для пильовика експресії гена, для індукції чоловічої стерильності у різних видів рослин, для розробки селекції різних видів рослин, що повторюється, а також для того, щоб полегшити отримання гібридного насіння.
Description
різних видів рослин, для розробки селекції різних видів рослин, що повторюється, а також для того, щоб полегшити отримання гібридного насіння.
СПОРІДНЕНА ЗАЯВКА
ІЇО00О1| Дана заявка претендує на пріоритет відповідно до заявки на патент КНР
Мо201510303817.0, яка була подана 4 червня 2015 р., зміст якої повністю включений у даний документ за допомогою посилання.
ОБЛАСТЬ ТЕХНІКИ
І0002)| Даний винахід відноситься до одного гена чоловічої стерильності пшениці (УММ5), його промотору, специфічного для пильовика, і варіантів їх застосування.
РІВЕНЬ ТЕХНІКИ
ІЇ0003| Чоловічу стерильність рослин можна використовувати для того, щоб полегшити схрещування з метою селективного розмноження й отримання гібридного насіння (Као еї аї., 1990; КетркКеп, Ргіпо, 1999; МасКепліє, 2012). У багатьох сільськогосподарських культурах було виявлено велику кількість ліній з чоловічою стерильністю, які зберігають в якості цінних генетичних ресурсів; також вживаються численні спроби отримати лінії з чоловічою стерильністю, особливо для основних зернових сільськогосподарських культур, таких як кукурудза та рис. (0004) Компанія Ріопеег Ні-Вгей Іпіегпайопаї, Іпс. розробляє технологію отримання насіння (5РТ) (Умайу, 2012). Для кукурудзи технологія 5РТ об'єднує використання домінантного гена
М545 для надання чоловічої фертильності, рецесивного гена іп545 для надання чоловічої стерильності та гена ЮО5Кед2 в якості маркера візуальної селекції. Ген М545 регулюється специфічним для пильовика промотором. Лінія-закріплювач кукурудзи ОР-32138-1 (т545Б/т545,
М545-О5Кеаг2/ ) служить донором пилку для отримання нетрансгенних ліній кукурудзи з чоловічою стерильністю (іп545/т1545), які використовуються в якості жіночої інбредної батьківської рослини для отримання гібридного насіння. Існують інші дослідження чоловічої стерильності кукурудзи; мутагенез цитохром Р.і50-подібного гена (М526) призводить до чоловічої стерильності у кукурудзи (СіиКапоміс еї аїЇ., 2013). З іншого боку, специфічна для пильовика експресія генів-мішеней має вирішальне значення для надання рослині чоловічої стерильності без інших побічних порушень. ГІ цо еї аї. (2006) виявили специфічний для тапетуму ген КТЗ шляхом диференційного скринінгу бібліотек КДНК рису (Іцо еї аї., 2006). Ген ЕТ5 переважно експресується в тапетумі під час мейозу, і його експресія пригнічується перед
Зо періодом цвітіння. ім еї аЇ. (2013) виявили специфічний для пильовика ген білка- переносника ліпідів рису (О5Ї.ТРб) за допомогою високопродуктивного скринінгу профілю експресії (ім еї аї., 2013). В цілому, специфічна для пильовика експресія генів чоловічої фертильності/стерильності важлива для впровадження найважливіших ліній для отримання гібридного насіння.
І0005) Редагування геному дозволяє здійснювати специфічну модифікацію генів-мішеней у ссавців й інших еукаріотичних організмів (Спепо, АїІрег, 2014 року). Останнім часом ефекторна нуклеаза, подібна активаторам транскрипції (ТАГЕМ), ї короткі паліндромні повтори, зібрані в клестери з регулярними проміжками (СКІЗРК)/Са59, зарекомендували себе як ефективні інструменти для пшениці (Умапо еї аї., 2014) й ячменю (Ууепаї еї а!., 2013; Сиги5піае еї а!., 2014 року). Відповідно, редагування геному можна застосовувати для введення специфічної для мішені модифікації в зернових сільськогосподарських культурах, які можна використовувати для отримання продуктів з доданою вартістю. 0006) Лінія пшениці з чоловічою стерильністю (далі називана "Таіди") являє собою мутовану лінію гексаплоїдної пшениці з чоловічою стерильністю, створену в Китаї (Уапд еї аї., 2009).
Чоловічу стерильність в "Таіди" визначає один домінантний ген М52. При схрещуванні пшениці "Таіїди" з гексаплоїдною пшеницею з чоловічою стерильністю їх потомство КЕ: розділяється на рослини з чоловічою фертильністю/стерильністю: для половини рослин характерна чоловіча фертильність, тоді як для іншої половини рослин характерна чоловіча стерильність (Оепо, сао, 1982). Для локусу М52 були розроблені фенотипові (карликові, обумовлені КРІ-Ю1с) та молекулярні маркери (Сім ЮОепд, 1986; Сао еї аїЇ., 2009). З 1983 року пшениця "Таїди" використовувалася в якості інструменту для періодичної селекції в Китаї. На сьогоднішній день розроблені сотні китайських ліній пшениці для перенесення гена М52 або тісно пов'язаного локусу КМ-О1с/М52 (у подальшому називаного КМ52), які в сукупності називаються "пшениця
Таїди". До 2010 року сорок два сорти пшениці з покращеною стійкістю до хвороб і засолення грунтів, посухостійкістю або продуктивністю були створені за допомогою повторюваної селекції на основі ЕМ52. Щоб маніпулювати геном М52 для отримання кращої виробничої системи, автори даного винаходу зробили спробу клонувати ген М52 з використанням транскриптомного аналізу.
КОРОТКИЙ ОПИС
І0007| Згідно з даним винаходом запропонований новий ген чоловічої стерильності (МУМ5) 60 пшениці, промотор зазначеного гена та варіанти їх застосування.
ЇО008| У даному винаході застосовується секвенування РНК, щоб охарактеризувати транскриптом пильовика "і иптаї 15" і " итаї 15--М52" (далі І МІ 5мег) на ранній стадії мейозу. В результаті було виявлено один ген УММ5, який демонстрував специфічну для пильовика експресію на ранній стадії мейозу та тільки у пшениці, що несе домінантний ген М52.
Передбачається, що ген М/М5 залучений в розвиток фенотипу чоловічої стерильності у пшениці, і маніпулювання зазначеним геном М/М5 в рослинах може змінити фертильність рослин. Крім цього, вважають, що промотор М/М5 має специфічну для пильовика активність, яка важлива для забезпечення експресії генів, специфічної для пильовиків. Відповідно, можна сказати, що даний винахід має велику цінність в якості інструменту для забезпечення експресії генів, специфічної для пильовиків, для розвитку чоловічої стерильності у різних видів рослин, для розробки періодичної селекції у різних видів рослин, а також для того, щоб полегшити отримання насіння. Зокрема, відповідно до даного винаходу запропоновані:
МЇ виділена ДНК, яка має будь-яку з наступних ознак (а)-(е): (а) кКДНК, яка містить нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 1; (Б) ДНК, що кодує амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 2; (с) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮО МО: 6; (а) ДНК, що кодує білок, який (ї) функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЗЕО ІЮ МО: 2, ії (ії) містить амінокислотну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 2, в якій замінені, видалені, додані та/або вставлені одна або більше амінокислот; і (е) ДНК, яка (ї) кодує білок, який функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 2, і (ії) гібридизується в суворих умовах з ДНК, що містить нуклеотидні послідовності, представлені в
ЗЕОІЮ МО: 1 і 6; (2) ДНК, що кодує антизмістовну РНК, яка комплементарна продукту транскрипції ДНК, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 1 і 6;
ЇЗЇ ДНК, що кодує РНК з рибозимною активністю, яка специфічно розщеплює продукт транскрипції ДНК, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ МО: 1 і 6;
І4) ДНК, що кодує РНК, яка знижує експресію ДНК, послідовність якої представлена в 5ЕО ІЮ
МО: 1 їі 6, шляхом спільного пригнічення при експресії в рослинних клітинах;
ІБ ДНК, що кодує РНК, яка має ознаку, що є домінантно-негативною для ендогенних
Зо транскриптів в клітинах рослин, кодованих ДНК згідно з (1) або ДНК, що кодує білок, який має ознаку, що є домінантно-негативною для ендогенного білка в клітинах рослин, кодованого ДНК згідно з 1;
Іб) вектор, що містить ДНК згідно з будь-яким із (11 - (51;
Г/Ї трансформована рослинна клітина, в яку введена ДНК згідно з будь-яким із (ГП - І5) або вектор відповідно до |бЇ;
ІЗЇ трансформована рослина, що містить трансформовані рослинні клітини згідно з (7);
ІЇЇ клон трансформованих рослин або потомство трансформованих рослин згідно з |81|, причому вказаний клон або потомство містить трансформовані рослинні клітини згідно з 71; 101 насінина, тканина й орган з трансформованих рослин згідно з І8) або |9І|, за умови, що вони містять трансформовані рослинні клітини згідно з І7|;
МІ ДНК згідно з будь-яким із (а)-(с), що має активність специфічного для пильовика промотору: (а) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 5; (р)
ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 5, в якій один або більше нуклеотидів замінені, видалені, додані та/або вставлені; і (с) ДНК, яка гібридизується в суворих умовах з ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮО МО: 5; 121 вектор, що містить ДНК згідно з (111; 113) трансформована рослинна клітина, що містить ДНК згідно з 111 або (121; 114) трансформована рослина, що містить трансформовані рослинні клітини згідно з (131; 151 клон трансформованих рослин або потомство зазначених трансформованих рослин згідно з (14), причому вказаний клон або потомство містить трансформовані рослинні клітини згідно з | 131|;
І16Ї насінина, тканина й орган з трансформованих рослин згідно з (14) або (15), за умови, що вони містять трансформовані рослинні клітини згідно з | 31; 171 генетично модифікована рослинна клітина, отримана шляхом редагування геному й/або індукованого мутагенезу ДНК, що містять нуклеотидні послідовності, наведені в ЗЕО ІЮО МО: 1 ії 4, причому зазначені модифікації регулюють чоловічу фертильність рослин;
І18) генетично модифікована рослина, яка містить генетично модифіковані рослинні клітини згідно з (171;
П19| рослинний клон або потомство генетично модифікованих рослин згідно з (181), причому бо вказаний клон або потомство містить модифіковані рослинні клітини згідно з (171; і
(20) насінина, тканина й орган з генетично модифікованих рослин згідно з 181 або (19), за умови, що вони містять модифіковані рослинні клітини згідно з (|17|.
КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ
І0009) На Фіг. 1 представлені результати генотипування за маркерами УУМ5-ЕМ ії УУМ5-РМ.
На верхніх панелях представлені результати генотипування за маркером М/М5-ЕМ, на нижніх панелях представлені результати генотипування за маркером УУМ5-РМ; на лівих панелях представлені генотипи звичайної пшениці (батьківські лінії) та клонів ВАС, на правих панелях представлені генотипи примірників Еї з комбінації І М15мег// штаї 15. Для рослин КЕ було представлено шість типових рослин, включаючи три рослини з чоловічою стерильністю (51, 52 і
ЗЗ3) та три рослини з чоловічою фертильністю (Е1, 2 і ЕЗ3). Стрілки вказують на специфічні смуги, розділені внаслідок наявності ознаки чоловічої стерильності. 00010) На Фіг. 2 представлені клони ВАС, що несуть ген М/М5/Лмт»5. Р89 ії Р1076 були отримані з 40-хромосоми, яка несе рецесивний ген м/т5; Р204 і Р1І593 були отримані з 40- хромосоми, яка несе домінантний ген М/М5. Область з сірим штрихуванням являє собою повну матрицю експресії гена М/М5 (наприклад, 5ЕО ІО МО: 4) у даному винаході. Розмір вставки кожного клону ВАС представлений у масштабованому вигляді.
І00011) На Фіг. З представлені результати дослідження специфічної для пильовика експресії гена МУМ5. А) ЗТ-ПЛР проводили для детектування КДНК УУ/М5 у пильовику, лушпинні, листі, нижній квітковій лусочці, верхній квітковій лусочці, пестику, корені та стеблі. В) Кількісну ЗТ-ПЛР проводили для вимірювання рівнів КДНК УУМ5 у пильовиках, СР (лушпинні, нижній квітковій лусочці, верхній квітковій лусочці), листі, пестику та стеблі. Актин використовували в якості контролю для досліджень методами ЗТ-ПЛР та кількісної ЗТ-ПЛР.
І00012)| На Фіг. 4 представлені результати, які підтверджують специфічну для пильовика активність промотору МУМ5. А) Плазміди отримували для дослідження активності промотору;
РСб13 являє собою приймаючий вектор, який несе касету СЕР, придатну для технології клонування Са(емжау; РС966 несе касету експресії Рууме:ОЕР, в якій Рум5 являє собою промотор
МУМ5 (ЗЕО ІЮ МО: 5); РС976 несе геномну копію гена М/М5 (ЗЕО ІО МО: 7); всі три вектори мали аналогічний кістяк плазміди РСАМВІА1Т300. В) Короткочасна експресія флуоресцентного білка
СЕР у пильовиках пшениці; стрілки позначають флуоресцентні сигнали в зеленій частині спектра. С) ЗТ-ПЛР проводили для детектування КкДНК УУМ5 у пильовиках, лушпинні, листі, нижній квітковій лусці, верхній квітковій лусці, пестику та стеблі трансгенної пшениці "927-2" (таблиця 3), яка була отримана в результаті генетичної трансформації з використанням РС976; також були використані два контролі, включаючи пильовик 1 з "І итаї 15" і пильовик 2 з "І итаї 15мег», масштабна мітка 100 мкм. 00013) На Фіг. 5 представлені результати скринінгу методом ТІССІМО ї фертильні пильовики рослин Мі, що несуть індуковані мутації в домінантному гені МУ/УМ5. А) Наявність домінантного гена М/М5 підтверджували за допомогою ПЛР з використанням УУМ5-ЕР12 і УММ5-КРІ12 (верхня панель); Детектування мутації М/М5 методом ТІСГІМО проводили з використанням праймерів
МУМ5-ЕР8В і М/М5-КРВ8 у відібраних рослинах Мі (5: стерильний відросток; Е: фертильний відросток, стрілки вказують смугу після розщеплення СеїЇ, нижня панель). В) Розвиток фертильних пильовиків у відібраних мутованих варіантів Мі, несучих ген М/М5. "Гитаї 15" і "рштаї 15мег2 були включені в якості контролів. Масштабна мітка - 1,5 мм. 00014) На Фіг. 6 показана генетична комплементація домінантного гена МУМ5 у "Вору/пе".
А) Дослідження методом ПЛР підтвердило геномну інтеграцію (ВАК і УУМ5) й експресію КкДНК (МУМ5 й актин) у поколінні То. В) Біологічне кількісне дослідження на основі ВАК для визначення стійкості до гербіцидів (верхня панель, масштабна мітка - 2,5 мм); експресія КДНК УУМ5 викликала розвиток фенотипу чоловічої стерильності в трансгенних рослинах То (нижня панель, масштабна мітка - 1,5 мм). "Ворм/пйе" використовували в якості контролю дикого типу.
ІЇ00015| На Фіг. 7 показана генетична комплементація домінантного гена УУМ5 у
Вгаспуродішт "Ваг1-3". А) Дослідження методом ПЛР підтвердило геномну інтеграцію (ВАК і
МУМ5) й експресію КкДНК (МУМ5 й актин) у поколінні То. В) Біологічне кількісне дослідження на основі ВАК для визначення стійкості до гербіцидів (верхня панель, масштабна мітка - 2,5 мм); експресія КДНК УУМ5 викликала розвиток фенотипу чоловічої стерильності в трансгенних рослинах (нижня панель, масштабна мітка - 0,5 мм). Вгаспуродішт "Ваг21-3" використовували в якості контролю дикого типу.
ДОКЛАДНИЙ ОПИС ВИНАХОДУ
00016) Згідно з даним винаходом запропоновані ДНК, що кодують білок М/М5. Нуклеотидна послідовність КДНК М/М5 у "пшениці Таіди" представлена в 5ЕО ІЮО МО: 1, амінокислотна послідовність білка, кодованого КДНК М/М5, представлена в 5ЕО ІЮ МО: 2, повнорозмірна бо нуклеотидна послідовність, включаючи промотор, транскрипційний Фрагмент і термінатор гена
МУМ5 у "пшениці Таїди", представлена в 5ЕО ІЮ МО: 4, нуклеотидна послідовність промотора
МУМ5 у "пшениці Таіїди" представлена в 5ЕБО ІЮО МО: 5, і нуклеотидна послідовність транскрипційного фрагмента гена М/М5 у "пшениці Таіди" представлена в ЗЕО ІО МО: 6. 00017) В область даного винаходу включена кДНК і геномна ДНК, які кодують білок М/М5.
Фахівець у даній галузі техніки може отримати кКДНК і геномну ДНК з використанням стандартних методів. КДНК може бути отримана, наприклад, шляхом: а) екстракції мРНК з "пшениці Таїди" (наприклад, "М15мег"); В) синтезу КДНК з використанням мРНК в якості матриці; с) ампліфікації КДНК МУ/М5 з використанням ПЛР-праймерів, специфічних для кКДНК відповідно до даного винаходу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 1); а) клонування продукту ПЛР у вектори.
Аналогічним чином, геномна ДНК може бути отримана шляхом виділення з "пшениці Таїди", створення геномної бібліотеки (в якій ВАС, косміда, фосміда тощо можуть бути використані в якості вектора), з подальшим скринінгом позитивних клонів з використанням Фрагментів ДНК відповідно до даного винаходу (наприклад, ЗЕО ІО МО: 4). Геномну ДНК також можна отримати шляхом клонування методом ПЛР на основі ДНК-матриці відповідно до даного винаходу (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 4).
ІЇ00018| В область даного винаходу включені ДНК, які кодують білки, функціонально еквівалентні більюу М/М5 з пшениці Таіди (наприклад, ЗЕО ІЮ МО: 2). У даній заявці "білки, функціонально еквівалентні білку М/М5 з пшениці Таїди", означають білки-мішені, які мають біологічну або біохімічну функцію, еквівалентну такій для білка М/М5 відповідно до даного винаходу (наприклад, 5ЕО ІЮО МО: 2). Приклади включають індукцію стерильності рослин. Для того, щоб оцінити, чи може випробовуваний ген індукувати чоловічу стерильність, "пшениця
Таїди" може бути мутована за допомогою ЕМ5-індукованого мутагенезу, як показано у прикладі 7, і мутовані варіанти з блокованою або пригніченою функцією досліджуваного гена можуть бути виявлені за допомогою ТІ ГІМО, як показано у прикладі 8. Чоловіча стерильність, індукована досліджуваним геном, може бути підтверджена з використанням генетичної комплементації в лінії пшениці з чоловічою фертильністю "Вобм/піе". Наприклад, геномна алель М/М5 (ЗЕО ІЮ
МО: 7) може бути введена у "Вобм/пйе" з використанням балістичної трансфекції, як показано у прикладі 9. Крім цього, доцільно ввести геномну алель М/М5 (ЗЕБО ІЮ МО: 7) в модельну рослину Вгаспуродійшт з використанням Адгорасіегішт-опосередкованої трансформації, як
Зо показано у прикладі 10. Отримані фенотипи рослин можуть бути досліджені.
ІЇ00019| Іншим прикладом такої функції є специфічна для пильовика експресія, яка характеризується переважною експресією у пильовику, яка щонайменше у п'ять разів або більше, переважно у десять разів або більше, і більше переважно у 15 разів або більше, перевищує експресію в інших тканинах, перерахованих у прикладі 5. Щоб оцінити, чи піддається досліджуваний ген специфічній транскрипції у пильовику рослини, мРНК можуть бути виділені з різних типів рослинних тканин, і КДНК будуть синтезовані на підставі вказаних мРНК. Кількісну
ПЛР зі зворотньою транскрипцією (кКЗТ-ПЛР) можна використовувати для вимірювання кількості
КДНК досліджуваного гена в різних типах рослинних тканин, як показано у прикладі 5. (00020) ДНК, які кодують білки, функціонально еквівалентні білюу М/М5 (5ЕБЕО ІЮО МО: 2), переважно отримують з однодольних, більше переважно з сгатіпеає та найбільше переважно з видів Тгййсеаеє. Підходящі ДНК включають, наприклад, алелі, гомологи, варіанти, похідні та мутовані варіанти відповідно до даного винаходу (5ЕО ІЮ МО: 1 або 5ЕО ІО МО: 6), які кодують білок, що містить амінокислотну послідовність, представлену в ХЕО ІЮ МО: 2, в якій одна або більше амінокислот замінені, видалені, додані або вставлені.
І00021| Редагування геному може бути використане для блокування генів-мішеней у рослин і тварин (Спепо, Аїрег, 2014). Ряд методик редагування геному, які включають нуклеазу з цинковими пальцями (2ЕМ5), ефекторну нуклеазу, подібну активаторам транскрипції (ТАГЕМ)) та короткі паліндромні повтори, регулярно розташовані групами (СКІ5РЕ), були успішно використані для пшениці (Зйпап еї аї., 2014; УМапд еї аї., 2014) й ячменю (Ууепаї еї аї., 2013;
Сигив5під;е еї аіІ., 2014). Редагування геному зазвичай призводить до видалення або вставки однієї або декількох основ в цільовій області, що представляє інтерес, при цьому вставки або видалення, які відбуваються в кодуючих екзонах, можуть викликати зміну амінокислоти або скорочення білка (У/апд еї аї!., 2014). До тих пір, поки ДНК, отримана в результаті редагування геному, кодує білок, функціонально еквівалентний природному білку МУМ5 (5ЕО ІЮ МО: 2), така
ДНК може бути включена в якості ДНК відповідно до даного винаходу, навіть якщо впроваджений білок М/М5 містить одну або більше замін, делецій, додавань або вставок амінокислот. ДНК відповідно до даного винаходу також включають консервативні мутовані варіанти, в яких нуклеотиди мутувані без мутації амінокислотної послідовності білка (консервативні мутації).
І00022| Фахівці у даній галузі техніки можуть модифікувати ген М/М5 і його гомологи відповідно до даного винаходу (ЗЕО ІО МО: 1 і 6) з використанням методик редагування геному.
Крім цього, цільова мутація може бути введена за допомогою індукованого мутагенезу або шляхом скринінгу природних ідіоплазм. Наприклад, Зіаде еї аїЇ. (2005) розробили ЕМ5- індуковану мутовану популяцію пшениці та потім успішно виділили цільові мутації, використовуючи метод націлювання локальних пошкоджень в геномах (ТІССГІМО) (5іІаде еї аї., 2005). Крім цього пул ідіоплазм розвивається з більшою кількістю спонтанних мутацій, що дозволяє виявити мутацію-мішень при зборі ідіоплазм, використовуючи Есоїйіпу (Ті еї аї., 2006). Фахівці у даній галузі техніки легко розроблять мутовані популяції рослин, з подальшим виявленням мутацій в ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 1 і 6) відповідно до даного винаходу. У той самий час спонтанні мутації ДНК (ЗЕО ІО МО: 1 і 6) відповідно до даного винаходу в пулі ідіоплазм або лініях/сортах, що розмножуються, можуть бути легко виявлені. Отже, область даного винаходу також включає: (а) використання методик редагування геному, індукованого мутагенезу та природнього скринінгу для отримання рослинних клітин, які несуть мутації ДНК (ЗЕО ІО МО: 1 і 6) відповідно до даного винаходу; (Б) рослина, яка несе тип рослинних клітин, описаних в (а); (С) рослинний клон або потомство типу рослин, описаних в (б), за умови, що вони містять тип рослинних клітин, описаний в (а); (0) насінина, тканина й орган клону або потомства, описаного в (Б) і (с), за умови, що вони містять тип клітини, описаний в (а). (00023) Інші способи отримання ДНК, які кодують білки, функціонально еквівалентні білку
МУ/М5 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 2), включають полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР) (заїКі еї аї., 1985;
Нетвіеу еї аї., 1989; І апаїї еї аІ., 1990), технологію рекомбінантної ДНК та синтез синтетичних генів (Козигі, Спигсй, 2014 року), які добре відомі фахівцям в даній області техніки. Зокрема, фахівець в даній області техніки може з використанням стандартних способів виділити ДНК, високо гомологічну гену М/М5 з пшениці або інших рослин, з використанням ПЛР-праймерів, які специфічно гібридизуються з нуклеотидною послідовністю гена М/М5 (5ЕО ІЮО МО: 1 і 6), або з використанням фрагмента гена МУМ5 (ЗЕО ІЮО МО: 1 ії б) в якості зонда для скринінгу ДНК та бібліотек КДНК. ДНК, які виділені з використанням технології ПЛР, технології рекомбінантної
ДНК, синтезу синтетичних генів тощо, і які кодують білки, функціонально еквівалентні білку
М/М5 (ЗЕО ІО МО: 2), також включені в ДНК відповідно до даного винаходу. Стосовно до амінокислотної послідовності виділені таким чином ДНК, як вважають, є високо гомологічними амінокислотній послідовності білка УУМ5 (ЗЕО ІЮ МО: 2). Високий ступінь гомології означає ідентичність послідовностей за всією довжиною амінокислотної послідовності щонайменше на 50 95 або більше, переважно на 70 95 або більше та більше переважно на 90 95 або більше (наприклад, на 95 9, 96 95, 97 9», 98 9б і 99 95 і більше). (00024) Ідентичність амінокислотної та нуклеотидної послідовностей може бути визначена з використанням алгоритму ВГАБТ (Айбспи! еї аї., 1990; Кагіїп, Ай5спиІ, 1993). На основі зазначеного алгоритму були впроваджені програми під назвою ВІ АЗТМ, ВІ А5ТР, ВІ АЗТХ,
ТВГА5ТМ ії ТВГАЗТУХ (Когі еї аї., 2003). ВГАЗТМ виконує пошук за базою даних нуклеотидних послідовностей з використанням нуклеотиду, що запитується; ВІ А5ТР виконує пошук за базою даних білків з використанням білка, що запитується; В АБТХ виконує пошук за базою даних білків, використовуючи трансльований нуклеотид, що запитується; ТВ А5ТМ виконує пошук за базою даних трансльованих нуклеотидів з використанням білка, що запитується; ТВІ АЗТХ виконує пошук за базою даних трансльованих нуклеотидів з використанням трансльованого нуклеотиду, що запитується. Основні етапи зазначених методів аналізу є загальнодоступними (пер/біаві. пері. піт. піп. дом/Віаві. соді). 00025) Скринінг геномної ДНК або бібліотек кКДНК може бути заснований на технології
Саузерн-блоттингу (Зоцїпегп, 1975). Саузерн-блоттинг складається з двох основних етапів. На першому етапі відбувається прикріплення фрагментів ДНК до нітроцелюлозної або нейлонової мембрани, і другий етап полягає у проведенні гібридизації між міченим ДНК-зондом і фрагментом ДНК, приєднаним до мембрани. Під час промивки необхідно створити суворі умови шляхом контролю температури, вмісту солі та часу. Суворість умов підвищується при зниженні вмісту солі у буфері БОС (20х, 10х, бх, 2х, 1х, 0,5х, 0,2х, 0,1х), підвищенні температури (42 2С, 50 20,55 20,60 20, 65 20, 70 б, 75 С) та збільшенні тривалості промивки (1 хв, 2 хв, 5 хв, 10 хв, 15 хв, 20 хв, 30 хв). У даному винаході термін "дуже суворі умови" вказує на те, що етап промивки буде виконаний у розбавленому буфері СС («1 х), при високій температурі (255 2С) і протягом тривалого періоду часу (210 хв). (00026) Як вважають, ДНК (5ЕО ІО МО: 1 ії 6), які кодують білок М/М5 відповідно до даного винаходу, також можна застосовувати для надання стерильності рослинам з чоловічою фертильністю. Іншими словами, вважається, що рослини з чоловічою фертильністю можуть 60 придбати стерильність в результаті вставки ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 1 ї 6), яка кодує білок УУМ5 відповідно до даного винаходу, у підходящий вектор, введення зазначеного вектора в рослинні клітини, які здатні формувати рослини з чоловічою фертильністю, відновлення отриманих рекомбінантних рослинних клітин, з наступним відтворенням трансгенних рослин, для яких характерна чоловіча стерильність. Оскільки рослини з чоловічою стерильністю не можуть самозапилюватися, їх необхідно підтримувати з використанням пилку інших рослин з чоловічою фертильністю. З іншого боку, ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 1 ї 6), які кодують білок М/М5 відповідно до даного винаходу, також можна застосовувати, щоб надати фертильність рослинам з чоловічою стерильністю, яка забезпечується геномом М/М5. Іншими словами, вважається, що фертильність можна надати рослинам з чоловічою стерильністю шляхом вставки антизмістовної РНК (асРНК) та/або шпилькової РНК (ШРНК) для відповідної ДНК (5ЕО ІО МО: 1), що кодує білок МММ5 відповідно до даного винаходу, у підходящий вектор, введення зазначеного вектора в рослинні клітини, які здатні формувати рослини з чоловічою стерильністю, з подальшим відновленням отриманих рекомбінантних рослинних клітин.
Оскільки сорти рослин з чоловічою стерильністю не можуть самозапилюватися, їх складно підтримувати, навіть якщо зазначені сорти мають бажані ознаки. Однак, якщо фертильність може бути відновлена з використанням антизмістовного гена та/лабо шпилькової РНК для відповідної ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 1 і б), яка кодує білок М/М5, самозапилення стає можливим, також як і підтримання бажаних ознак.
І00027| Антизмістовні нуклеїнові кислоти регулюють експресію гена-мішені за допомогою транскрипційної інтерференції, маскування РНК, механізмів, що залежать від дволанцюжкових
РНК (дцРНК), і ремоделювання хроматину (Гарідої, Ріїреї, 2006). Антизмістовні послідовності, які використовуються у даному винаході, можуть інгібувати експресію гена-мішені будь-яким із вищевказаних способів. В якості одного з варіантів реалізації винаходу, антизмістовна послідовність, яка сконструйована так, щоб бути комплементарною нетрансльованій області, розташованій поблизу 5'-кінця мРНК гена, буде ефективно інгібувати трансляцію зазначеного гена. Також можна використовувати послідовність, комплементарну кодуючій області або 3'- кінцевій нетрансльованій області Отже, ДНК, що містять антизмістовні послідовності трансльованих областей гена, а також нетрансльованих областей, включені в антизмістовні
ДНК, які можуть бути використані для ДНК (ЗЕО ІЮ МО: 1) відповідно до даного винаходу.
Зо Антизмістовну ДНК, яку використовують у даному винаході, лігують в напрямку 3'-кінця відносно відповідного промотора, такого як промотор убіквітину кукурудзи (Бі) (Спгіхтепзеп еї аї., 1992) або промотор М/М5 (5ЕО ІО МО: 5), і послідовність, що містить сигнал термінації транскрипції, переважно лігують з 3"--кінцем ДНК. Отримані таким чином ДНК можуть бути введені у бажану рослину з використанням відомих способів. Антизмістовні послідовності ДНК переважно являють собою послідовності, комплементарні ендогенному гену або його частині з рослини, що підлягає трансформації, але не обов'язково повинні бути повністю комплементарними до тих пір, поки вони можуть ефективно інгібувати експресію гена. Транскрибована РНК переважно на 90 95 або більше, більше переважно на 95 95 або більше (наприклад, 96 95, 97 9», 98 Фо, 99 95 або більше) комплементарна транскрибованим продуктам гена-мішені. Для ефективного інгібування експресії гена-мішені з використанням антизмістовної послідовності антизмістовна
ДНК повинна містити щонайменше 15 нуклеотидів або більше, переважно 100 нуклеотидів або більше та ще більше переважно 500 нуклеотидів або більше. Використовувані антизмістовні
ДНК зазвичай містять менше 5 тис.п.н. і переважно менше 2,5 тис.п.н. (00028) Експресія ендогенного гена також може бути пригнічена з використанням ДНК, яка кодує ген-мішень (Наттопоа еї аї., 2001; Радаїізоп еї аї., 2002). Для експресії шпилькових РНК в рослинних клітинах ДНК-матриця, яка сконструйована так, щоб формувати шпилькові РНК або індукувати РНК-інтерференцію (РНКІ), може бути з'єднана з послідовністю промотору, такого як промотор ШрБі, та послідовністю термінації транскрипції. За допомогою технології шпилькових
РНК або РНКІ продукти транскрипції генів-мішеней відповідно до даного винаходу можуть бути специфічно пригнічені, так само може бути пригнічена експресія гена.
ІЇ00029| Пригнічення експресії ендогенного гена також може бути досягнуте шляхом спільного пригнічення в результаті трансформації ДНК, яка містить послідовність, ідентичну або схожу з послідовністю гена-мішені (Зтуїй, 1997; Кеціпод, Ріабіек, 2000). Термін "спільне пригнічення" відноситься до явища пригнічення експресії введеного екзогенного гена й ендогенного гена-мішені, коли ген, який містить послідовність, ідентичну або схожу з послідовністю ендогенного гена-мішені, вводять в рослини шляхом трансформації. Наприклад, щоб отримати рослину, в якої ген М/М5 спільно пригнічений, рослини, які представляють інтерес, трансформують векторною ДНК, сконструйованою для експресії гена М/М5 (ЗЕО ІЮ МО: 1 ї 6), або ДНК, що містить подібну послідовність, потім з отриманих таким способом рослин бо відбирають рослини з пригніченою чоловічою стерильністю, у порівнянні з рослинами дикого типу. Гени, які використовуються для спільного пригнічення, не обов'язково повинні бути повністю ідентичні генам-мішеням, однак повинні містити послідовність, яка ідентична їм щонайменше на 70 95 або більше, переважно на 80 95 або більше, більше переважно на 90 95 або більше (наприклад, 95 95, 96 9, 97 9, 98 Фо, 99 95 і більше). Ідентичність послідовності може бути визначена з використанням вищеописаного способу.
І000ОЗ0І Крім цього, пригнічення експресії ендогенного гена у даному винаході також може бути досягнуте шляхом трансформації рослини геном, що має характеристики, які є домінантно- негативними для гена-мішені. Ген, що має домінантно-негативні характеристики, являє собою ген, який при експресії здатний усунути або зменшити активність вихідного ендогенного гена рослини. У Вгаспуродішт мікроРНК (міРНК), тік5200, розщеплює мРНК гена ЕТ, який активний під час цвітіння, і гіперекспресія тік5200 затримує час цвітіння у Вгаспуродішт (и еї аї., 2013).
Деякі міРНК або короткі інтерферуючі РНК (кіРНК) можуть бути націлені на УУМ5 та його гомологи. Також може бути сконструйована синтетична мікроРНК (сміР НК), націлена на М/М5 та його гомологи. Підсумовуючи, слід зазначити, що отримання ефективних сміРНК, міРНК і кіРНК можна контролювати, щоб регулювати накопичення мРНК УММ5 та його гомологів для керування чоловічою фертильністю рослин. 00031) Вектори, які можуть бути використані при трансформації рослинних клітин, можуть включати різноманітні вектори, за умови, що зазначені вектори можуть експресувати вставлений ген в рослинних клітинах. Наприклад, можуть бути використані вектори, які містять промотори для експресії генів в конкретних тканинах рослин (наприклад, промотор відповідно до даного винаходу, представлений у послідовності ЗЕО ІЮО МО: 5) і промотори для конститутивної експресії генів в рослинних клітинах (наприклад, промотор ШБі). Крім цього, також можуть бути використані вектори, що містять промотор, який активується при індукції зовнішнім стимулом. У даній заявці "рослинні клітини" включають різні форми рослинних клітин, наприклад, клітини суспензійної культури, протопласти, зрізи рослин і калуси різних видів рослин.
І00032| Вектор може бути введений в рослинну клітину з використанням різних способів, відомих фахівцям в даній області техніки, таких як способи з використанням полієтиленгліколю, способи електропорації, способи опосередковані Адгобасіегішт, і способи бомбардування
Зо частинками. Відновлення рослин з трансформованих рослинних клітин також можливо здійснювати з використанням способів, відомих фахівцям в даній області техніки, в залежності від типу рослинних клітин. Наприклад, багато методик отримання рекомбінантних рослин вже добре відомі та широко використовуються в області даного винаходу. Підходящі способи включають спосіб введення генів у протопласти з використанням поліетиленгліколю з подальшим відновленням рослин, спосіб введення генів у протопласти з використанням електричного імпульсу з подальшим відновленням рослин, спосіб безпосереднього введення генів в клітини з використанням способу бомбардування частинками з наступним відновленням рослин і спосіб введення генів з використанням Адгорасієегіцшт з подальшим відновленням рослин. Підходящі способи можуть бути відповідним чином використані у даному винаході. 00033) Після отримання трансформованих рослин, в які був введений геном ДНК відповідно до даного винаходу, потомство зазначених рослин можна отримати шляхом статевого або безстатевого розмноження. Репродуктивні матеріали (насіння, калуси, протопласти тощо) можуть бути отримані із зазначених рослин, їх потомства або клонів. Зазначені рослини можуть бути випущені у великій кількості, використовуючи отримані матеріали. В об'єм даного винаходу включені рослинні клітини, що містять введену ДНК відповідно до даного винаходу, рослини, що містять зазначені клітини, потомство або клони зазначених рослин і репродуктивні матеріали зазначених рослин, їх потомство та їх клони. Отже, в область даного винаходу включені: (а) трансгенні рослинні клітини, що несуть ДНК відповідно до даного винаходу; (Б) рослина, яка несе тип рослинних клітин, описаних в (а); (с) клон рослини або потомство типу рослин, описаних в (Б), за умови, що вони містять тип рослинних клітин, описаний в (а); (4) насінина, тканина й орган із клону або потомства, описаного в (Б) і (с), за умови, що вони містять тип клітин, описаний в (а). (00034) Можна очікувати, що фертильність/стерильність рослин, отриманих таким способом, відрізняється від такої у рослин дикого типу. Так, наприклад, пшениця "Вобм/пйе" має чоловічу фертильність, але експресія ДНК (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 4) надає чоловічу стерильність трансгенній пшениці Вобулпіїе. З іншого боку, пригнічення експресії ДНК (наприклад, 5ЕО ІЮ МО: 4) у пшениці Таїди шляхом введення антизмістовної ДНК або тому подібного, як вважають, забезпечить розвиток фенотипу чоловічої фертильності у зазначеній пшениці. Способи відповідно до даного винаходу можуть бути використані у рослин для регулювання фертильності/стерильності, щоб пригнітити самозапилення та стимулювати перехресне запилення, забезпечуючи тим самим цінну характеристику гібридної сили. 000351 Згідно з даним винаходом запропонована ДНК, яка містить промотор зі специфічною для пильовика активністю. Прикладом такого роду ДНК є геномна ДНК (ЗЕБЕО ІЮ МО: 4), розташована в напрямку 5'-кінця відносно стартового кодону в ДНК (ЗЕО ІО МО: 5), що кодує білок М/М5 відповідно до даного винаходу. Промоторні ДНК відповідно до даного винаходу включають ДНК, які високо гомологічні нуклеотидній послідовності 5ЕО ІЮ МО: 5, за умови, що вони містять промотор зі специфічною для пильовика активністю. Прикладом зазначених типів
ДНК є ДНК з промоторною активністю, специфічною для пильовика, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 5, в якій один або більше нуклеотидів замінені, видалені, додані або вставлені. Промотори ДНК відповідно до даного винаходу переважно отримані з однодольних, більше переважно отримані з сгатіпеає, і найбільше переважно отримані з видів Тг/йісеае. Однак, до тих пір, поки вони містять промотор зі специфічною для пильовика активністю, джерело їх походження не є обмежуючим.
І00036| Вищевказані ДНК, що кодують білок М/М5 відповідно до даного винаходу, можна застосовувати для виділення ДНК, що містить промотор зі специфічною для пильовика активністю. Наприклад, геномні ДНК, розташовані в напрямку 5'-кінця відносно ДНК, що кодує білок М/М5 відповідно до даного винаходу, можуть бути отримані з використанням ДНК (5ЕО ІЮ
МО: 6) відповідно до даного винаходу або її частини в якості зонда для скринінгу бібліотеки геномної ДНК. Оскільки, як вважають, зазначені геномні ДНК, розташовані в напрямку 5'-кінця, містять промотор зі специфічною для пильовика активністю, вони мають високу промислову цінність при використанні для специфічної експресії довільних генів у пильовику. "Довільний ген" означає ДНК, чия транскрипція може бути індукована промотором ДНК (ЗЕБЕО ІЮ МО: 5) відповідно до даного винаходу. "Довільний ген" може являти собою будь-який кодуючий та не кодуючий фрагмент ДНК, причому не кодуючий фрагмент ДНК може мати рибозимну активність або може бути використаний для створення смігРНК, асРНК, шпилькових РНК, мікроРНК, міРНК і так далі. Підходящий фрагмент ДНК буде забезпечувати специфічний для пильовика профіль експресії під контролем промотора М/М5 (ЗЕО ІО МО: 5). Крім цього, оскільки ДНК, які кодують білок М/М5 відповідно до даного винаходу, специфічно експресуються у рослинних пильовиках,
Зо як вважають, їх можна застосовувати в якості маркерів для виявлення тканини пильовика в зрізах цілих квіток. (00037) ДНК з високим ступенем гомології нуклеотидної послідовності ХЕО ІО МО: 5 також можуть бути отримані з використанням методів ПЛР (ЗаїКкі еї аї., 1985), технології рекомбінантної ДНК та синтезу синтетичних генів (Козигі, Спигсй, 2014 року). Наприклад, ДНК з високим ступенем гомології нуклеотидної послідовності «ЕО ІЮ МО: 5 може бути виділена з пшениці та інших видів рослин за допомогою ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в 5ЕО ІЮ МО: 5 або її частина, в якості матриці, і за допомогою олігонуклеотидів, які специфічно гібридизуються з молекулою ДНК (ЗЕО І МО: 5), в якості ПЛ;-праймерів. 00038) Способи, добре відомі фахівцям в даній області техніки, можуть бути використані для отримання підходящої ДНК. Наприклад, методики редагування геному, які добре відомі в даній області техніки (Спепд і АїІрег, 2014 року), можна застосовувати для введення мутацій, включаючи одну або більше замін, делецій, додавань або вставок нуклеотидів в ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, представлену в ЗЕО ІЮ МО: 5. Мутації також можуть бути введені за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу, мутагенезу, індукованого мутагеном/випромінюванням, а також методів ПЛР (заїкКі еї аї., 1985; Нетвіеєу еї аї., 1989; І апаї еї а!., 1990). 000391 Відомі кількісні методи досліджень з використанням репортерних генів або т.п. можна застосовувати для того, щоб дослідити, чи має ДНК, отримана з використанням способів, описаних вище, специфічну для пильовика активність промотору. Репортерний ген може являти собою будь-який репортерний ген, за умови, що його експресія піддається детектуванню.
Наприклад, репортерні гени, які зазвичай використовуються фахівцями в даній області техніки, включають ген люциферази (ОС), ген В-глюкуронідази (505) і ген зеленого флуоресцентного білка (СЕР) тощо. Рівень експресії репортерного гена може бути визначений з використанням способів, відомих фахівцям в даній області техніки, відповідно до типу репортерного гена.
Наприклад, рівень експресії гена люциферази, використовуваного в якості репортера, може бути визначений шляхом вимірювання флуоресценції флуоресцентного з'єднання, викликаної каталітичною дією продукту експресії гена люциферази. Рівень експресії гена СОЗ5 може бути визначений шляхом оцінки інтенсивності забарвлення 5-бром-4-хлор-3-індол-бета-глюкуроніду (Х-СіІйс) або люмінесценції СіІисигоп (ІСМ), викликаної каталітичною дією продукту експресії гена
СИ5. Рівень експресії гена СЕР може бути визначений шляхом вимірювання флуоресценції
СЕР. 00040) Промотор ДНК відповідно до даного винаходу можна застосовувати для експресії довільного гена специфічним для пильовика чином, наприклад, шляхом (а) конструювання вектора, що містить промоторну ДНК відповідно до даного винаходу; (б) функціонального приєднання довільного гена в напрямку 3'-кінця відносно промоторної ДНК відповідно до даного винаходу в зазначеному векторі (а); (с) створення трансгенних рослинних клітин, несучих промотор МУ/М5 (ЗЕО ІО МО: 5) або вектор, описаний в (Б); і (4) отримання трансгенних рослин, що містять трансгенні рослинні клітини, описані в (с). "Функціональне з'єднання" означає зв'язування довільного гена з промоторною ДНК відповідно до даного винаходу так, що зазначений ген може експресуватися у відповідь на активацію промоторної ДНК відповідно до даного винаходу. Оскільки промоторна ДНК відповідно до даного винаходу має високу активність, специфічну для пильовика, довільні гени переважно являють собою гени, які можуть бути специфічно експресовані у пильовику. Наприклад, ген М/М5 відповідно до даного винаходу, який зв'язаний зі стерильністю/фертильністю пшениці, може бути використаний відповідним чином. Загальні методи генної інженерії можуть бути використані для конструювання вектора, який містить промоторну ДНК відповідно до даного винаходу. Відсутні які-небудь обмеження щодо рослинних клітин, в які вводять вектор. Вищевказані способи, відомі фахівцям в даній області техніки, можуть бути використані для введення векторів в рослинні клітини, для відновлення трансформованих рослинних клітин з отриманням рослин тощо. 00041) Отже, в область даного винаходу включені: (а) генетично модифіковані рослинні клітини, що містять промоторну ДНК відповідно до даного винаходу; (6) рослини, що містять тип клітин, описаний в (а); (с) потомство або клони рослин, описаних в (Б), за умови, що вони містять тип клітин, описаний в (а); (4) насінина, тканина й орган із клону або потомства, описаного в (Б) і (с), за умови, що вони містять тип клітин, описаний в (а). (00042) Фахівці в даній області техніки можуть модифікувати промотор МУ/УМ5 (ЗЕО ІО МО: 5) та його гомологічну послідовність, використовуючи редагування геному, введення мутації(й) у промотор УУМ5 (ЗЕО ІО МО: 5) та його гомологічну послідовність за допомогою мутагенезу, або
Зо шляхом виявлення природної спонтанної мутації у промоторі М/М5 (ЗЕО ІО МО: 5) та його гомологічній послідовності. Отже, в область даного винаходу включені: (а) генетично модифіковані рослинні клітини зі зміною у промоторі М/М5 (ЗЕО ІЮ МО: 5), отриманим шляхом редагування геному, мутагенезу та природного відбору; (Б) рослини, які містять тип клітин, описаний в (а); (с) потомство або клони рослин, описаних в (б), за умови, що вони містять тип клітин, описаний в (а); (а) насінина, тканина й орган із клону або потомства, описаного в (Б) і (с), за умови, що вони містять тип клітин, описаний в (а). 00043) Отже, в область даного винаходу включений ген М/М5 (ЗЕО ІЮ МО: 1 і 6), гомологи
МУМ5 та їх промотор (наприклад, 5ЕО ІО МО: 5). В іншому варіанті, специфічна експресія гена
МУМ5 (ЗЕО ІО МО: 1 ї 6) здатна надати ознаку чоловічої стерильності звичайним рослинам з чоловічою фертильністю. Пригнічення експресії гена М/М5 в рослинах надає ознаку чоловічої фертильності звичайним рослинам з чоловічою стерильністю. Крім цього, оскільки промотор гена М/М5, як вважають, має специфічну для пильовика активність, доцільною є специфічна експресія довільних генів у пильовику. Як очікується, застосування М/М5 (5ЕО ІЮ МО: 1 і 6), його гомологів та їх промоторів (наприклад, 562 ІЮО МО: 5) значно поліпшить селекцію рослин і виробництво насіння.
І00044| Даний винахід далі буде докладно описаний з використанням прикладів, які не повинні бути розтлумачені, як обмежуючі даний винахід.
ПРИКЛАДИ
І00045| Даний винахід був заснований на парі М52-ізогенних ліній пшениці "Гитаї 15" і "/Мі5мег», які були розроблені в Шаньдунському сільськогосподарському університеті. Рослини пшениці підтримували в теплиці з 16 год. фотоперіодом (105 мкмоль:м-:с"), денною температурою 25-30 С і нічною температурою 15-20 С. Вода, стандартні хімічні речовини і рослинні гормони були отримані від Рієпег 5сієпійіс (Піттобург, Пенсильванія, США) і Зідта-
АїЇйгіспй (Сент-Луїс, Міссурі, США), культуральні середовища для рослинних тканин були отримані від РпуюТесппоїоду І арогагіеє (Оверленд-Парк, Канзас, США), мікробні ростові середовища були отримані від ВО (Весіоп, Оіскіпвоп, Франклін Лейкс, Нью-Джерсі, США), антибіотики були отримані від СоЇй Віоїесппоїоду (Сент-Луїс, Міссурі, США). ПЛР-праймери відповідно до даного винаходу наведені в таблиці 1.
Таблиця 1
ПЛР-праймери, що використовуються у даному винаході
Примітка: щоб полегшити клонування гена сайт ферменту рестрикції Мої! був включений у
ПЛР-праймер М/М5-ЕРІ1, і сайт Аб5сіІ був включений у ПЛР-праймер М/М5-ЕРІ11. Сайти ферментів рестрикції були виділені за допомогою підкреслення. "Праймери для ЗТ-ПЛР Асііп-ЕРІ й Асііп-АР1І були придатні для використання в зразках
КДНК пшениці та Вгаспуродійт.
Приклад 1
Дослідження транскриптому виявило ген із специфічною для пильовика експресією (00046) Секвенування РНК (РНК-секв.) включає пряме секвенування кДНК з використанням технології секвенування ДНК з високою пропускною здатністю (Мадаїакепті еї аї., 2001). Підхід на основі секвенування РНК використовували, щоб виявити специфічний для пильовика транскриптом у парі М52-ізогенних ліній, "Гитаї 15" ії ""Мі5мег. Відстань між вушками верхніх листів і передостанніх листів використовували в якості критерію для вибору пильовиків на аналогічній стадії розвитку. Пильовики, пестики та верхні листи збирали окремо на основному стеблі або відростку, на якому відстань між вушками досягла 4 см. Для пильовиків отримували три повторних зразка для "І итаї 15" ї ""М15ме», відповідно. Для пестиків і також для верхніх листів три повторних зразка отримували шляхом об'єднання рівної кількості тканин від "І итаї 1571 "СМ5м52». Загальну РНК екстрагували з використанням ТКІ20! (ІМе Тесппоіодіє5, Гранд-
Айленд, Нью-Йорк, США) і відправляли для секвенування РНК в компанію Вегпу Сепотісв5 (Пекін, Китай).
І00047| Бібліотеки для секвенування отримували для середнього розміру вставки 500 п.н.
Секвенування спарених кінцевих фрагментів (РЕТ) проводили для двох доріжок лічених спарених фрагментів довжиною 125 п.н. на Нізед2500 (Шитіпа, Сан-Дієго, США). Вихідні дані попередньо обробляли з використанням Тгіттоптаїс (ВоїЇдег еї аї., 2014 року), і остаточні дані отримували після усунення адаптера, основ з низькою якістю (половина або більше основ ліченої послідовності зі значенням якості 0:23) і невідомих основ (невідомі основи для ліченої послідовності» З 95). Об'єднання остаточних даних транскриптому де помо проводили з використанням Тгіпйу (Наа5 еї аї,, 2013). Представленість транскриптому оцінювали з використанням КЗЕМ (Ії, Оеуеу, 2011), і диференційно експресовані транскрипти/гени виявляли за допомогою програми еддек (Кобіпзоп еї аї., 2010). В цілому, багато генів були пов'язані з більше високою експресією у пильовиках з "І М15мег", ніж у пильовиках з "І итаї 15".
Зокрема, невідомий ген (5ЕО ІЮ МО: 1) специфічно експресувався в "/М15ме2», проте не піддавався детектуванню в "І штаї 15", була висловлена гіпотеза, що зазначений ген надає ознаку чоловічої стерильності пшениці (М/М5) в "МІ 5мег». Невідомий ген, позначений УУМ5, вибрали для функціонального аналізу.
Приклад 2
Клонування повнорозмірної кКДНК гена УУМ5 (00048) Загальну РНК з пильовиків "ІГМІ15мег», аліквоту РНК, відправлених на секвенування
РНК, використовували для отримання кКДНК з використанням набору для синтезу кКДНК
Кемепдій Ртгізі 5ігапа (ТПегто зсіепіййс, Уолт, Массачусетс, США). 5'- і 3'-кінці КДНК гена УУМ5 (ЗЕО ІЮ МО: 1) виявляли в "І Мі5мег за допомогою КАСЕ-ПЛР з використанням набору для ампліфікації КДНК ЗМАКТег КАСЕ (Сіопіесп ГІ арогайогіє5, Маунтін-В'ю, Каліфорнія, США). Для проведення 5" КАСЕ-ПЛР використовували два праймери М/М5, УУМ5-КРІ і МУМ5-КР2, причому
М/М5-КР2 був вкладеним по відношенню до М/М5-КРІ. Для 3'-кінцевої КАСЕ-ПЛР використовували два інших праймери УУ/М5, УММ5-ЕРІ і УУМ5-ЕР2, причому УУМ5-ЕР2 був вкладеним по відношенню до М/М5-ЕР1. Секвенування 5' і 3' продуктів КАСЕ-ПЛР підтвердило повний розмір гена МУМ5, зібраного в ході аналізу продуктів секвенування РНК. Відповідно, повнорозмірну КДНК УУМ5 клонували з "ПМ15мег з використанням праймерів УУМ5, УУМ5-ЕРЗ і
М/М5-ЕРЗ, які відповідали нуклеотидній послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1. КДНК довжиною 1485 п.н. містить відкриту рамку зчитування, що містить 882 п.н. (ОРС). Два внутрішньорамочних стоп- кодона на 5'-кінці КДНК свідчать про те, що передбачена ОРС є вірною. У даному винаході область, розташовану в напрямку 5'-кінця та безпосередньо поруч з передбаченим старт- кодоном, розглядали в якості промотору гена УУМ5.
Приклад З
Зо Конструювання геномної бібліотеки ВАС на "І М15мег» 00049) Бібліотеку бактеріальних штучних хромосом (ВАС) конструювали для "І МіБмег" З використанням стандартних протоколів (шо, М/по, 2003; ЗПі еї а!., 2011). В загальних рисах, високомолекулярну (ВММ) геномну ДНК екстрагували з тканин листя, частково розщеплювали за допомогою ферменту рестрикції Ніпа! та розділяли на 1 95 агарозному гелі методом електрофорезу в пульсуючому полі (РЕСЕ); Фрагменти ДНК з масою в діапазоні 100-300 тис.п.н. виділяли з агарозного гелю, повторно поділяли методом РЕСЕ, лігували у вектор, ВАС ріпаїдоВАСЬ36-5, який розрізали за допомогою Ніпап ії дефосфорилували; продукт лігування трансформували в клітини штаму Е.соїї ОНІТОВ, стійкі до фагу Т1 (Іпмігодепе, Карлсбад,
Каліфорнія, США); Трансформанти відбирали на середовищі ЇВ з додаванням 12,5 мг/л хлорамфеніколу, 80 мг/л Х-гал, 100 мг/л ІРТО; білі колонії індивідуально збирали в 384-лункові планшети для мікротитрування. В результаті 706176 клонів ВАС збирали і поміщали в 1839 384- лункових планшетів (таблиця 2). Випробування якості на 337 випадково відібраних клонах ВАС виявило, що середній розмір вставки становить 124,6 тис.п.н., і частота ВАС без вставки становить 0,50 95. Отже, бібліотека ВАС "І М15мег" представляла 5,5-кратне покриття геному пшениці (- 16 млн.п.н.).
Таблиця 2
Бібліотека ВАС пшениці "І М15Бмег" що : кіл-ть ВАС без вставки . здо. партії | планшетів Я клонів геному | бібліотеки (95) клонів | вставки (Уо (тис.п.н.)
А 17 1112 | 106 | 000 | 1180 | 427008 | 3149 | 5781
В 1 9330 | 123 | 081 | 1322 | 126720 | 1047 | 19,02 0 771711142 | 31 | 000 | ло21 | 54528 | 09548 | 639
Приклад 4
Скринінг і секвенування клонів ВАС "І М15мег»
ІЇ00050| Процедуру скринінгу на основі ПЛР розробили для бібліотеки ВАС "| М'і5Бмег».
Бібліотеку ВАС спочатку дублювали шляхом інокуляції нового набору 384-лункових планшетів, первинний плазмідний пул отримували з культури кожного дубльованого планшету з використанням набору 2 ВАС ОМА Міпіргер (Хуто Кезеагсп Согрогаїййоп, Ірвін, Каліфорнія,
США), і суперплазмідний пул отримували шляхом об'єднання рівної кількості плазмідної ДНК із десяти первинних плазмідних пулів. В цілому отримали 1839 первинних плазмідних пулів і 184 суперплазмідних пула.
ЇО0О51| Для скринінгу бібліотеки ВАС конструювали множину ПЛР-праймерів, що відповідають послідовності КДНК гена МУ/М5 (ЗЕО ІЮ МО: 1) і випробовували їх функціональність для геномних ДНК з "Гитаї 15" і "М15мег2. В результаті УУМ5-ЕРА ї УУМ5-КРА ампліфікували один фрагмент в "І итаї 15" і два фрагменти в "/Мі5мег», причому більший фрагмент "І М15мег»" формував смугу на тому самому рівні в 1 95 агарозному гелі, як і фрагмент "Гитаї 15" (Фіг. 1).
Мабуть, менший фрагмент був специфічним для "І! М15мег», найбільше ймовірно для області
М52, яка призводить до чоловічої стерильності "пшениці Таіди". Дійсно, менший фрагмент був асоційований з чоловічою стерильністю у великій сегрегаційній популяції (близько 5000 рослин), для якої насіння збирали з рослин з чоловічою стерильністю "І М15мег", які були опилені пилком від рослин з чоловічою фертильністю "Іштаї 15", і популяція розділилася приблизно на половину рослин з чоловічою фертильністю та половину рослин з чоловічою стерильністю.
Відповідно, отриманий з екзону ПЛР-маркер, М/М5-ЕМ, створювали з використанням праймерів
МУ/М5-ЕРА і МУМ5-А РУ.
І00052| Маркер УУМ5-ЕМ використовували для скринінгу суперплазмідних пулів і потім первинних плазмідних пулів бібліотеки ВАС "І М15мег. Після ідентифікації первинного пулу клон
ВАС визначали з використанням ПЛР в 384-лунковому планшеті. В цілому виділяли три ВАС- клона (Фіг. 2), при цьому один клон дав менший ПЛР-продукт, і два клона дали більший ПЛР- продукт. Ймовірно, ВАС-клони (Р89 і Р1076), які давали більший ПЛР-продукт, отримували з 40 хромосоми, позбавленої домінантного гена М52, у той час як клон ВАС (РІ593), який давав менший ПЛР-продукт, отримували з 40 хромосоми, несучої домінантний ген М52 (Фіг. 1).
Зо Маркер УУ/М5-ЕМ для РІ1593 був повністю зв'язаний з чоловічою стерильністю, що вказує на домінантний ген М/М5 на Р1593, у той час як маркер М/М5-ЕМ для Р89/Р1076 не виявив тісного зв'язку з чоловічою стерильністю, що вказує на рецесивний ген улт5 на Р89/Р1076. Всі три ВАС- клона відбирали для секвенування наступного покоління, наданого компанією Вету Сепотісв.
Вихідні дані секвенування попередньо обробляли шляхом усунення адаптерів, основ з низькою якістю (половина або більше основ ліченої послідовності зі значенням якості О25), а також невідомих основ (невідомі основи ліченої послідовності 210 95). Вектор ВАС (ріпаіїдоваАаС536-5) і геномну ДНК ЕЕ. соїї очищали, використовуючи інструмент для оцінки перехресної відповідності пакету РІігар (Ем/по еї аї., 1998). Збірку остаточних даних де помо виконували для К-мірних дерев різного розміру (21-91) за допомогою програми АВузз 1.5.2 (Бітрзоп еї аї!., 2009). К-мірне значення 41 вибирали для збірки даних секвенування, що відповідає найкращому значенню
М50. Аналіз результатів секвенування виявив, що Р8О і Р1076 містять ідентичний фрагмент масою 54056 п.н., що представляє одну і ту саму хромосому, проте, між Р8ВО/Р1076 і Р1593 спостерігали суттєвий поліморфізм. Відповідно до кКДІНК МУМ5 (ЗЕО ІЮО МО: 1), всі три ВАС містили повну транскрибовану область гена М/М5Лит5, передбачена кКДдДНК М/М5 Р1593 була ідентична нуклеотидній послідовності «ЕО ІЮ МО: 1, однак містила одинадцять поліморфізмів одного нуклеотиду (ЗМР5) між передбаченою кДНК улт5 РВО/Р1076 і нуклеотидною послідовністю 5ЕО ІЮ МО: 1. Для порівняння, ген улт5 у Р89 ії РІ076 був повнорозмірним з урахуванням інформації про послідовність промотору (ЗЕО ІЮО МО: 3), однак ген УУМ5 у Р1593 був неповним, оскільки він розташовувався на одному кінці ВАС, що в результаті призвело до неповного промотору (Фіг. 2). 00053) Отже, множину ПЛР-праймерів розробляли так, щоб вони відповідали промотору м/т5 (ЗЕО ІЮО МО: 3), і потім випробовували їх функціональність на геномних ДНК з "І итаї 15" і "МІ5мег. В результаті М/М5-ЕР5 ії М/УМ5-КР5 ампліфікували дві смуги в "Гитаї 15", але три смуги в "СМ15мег2», причому менший фрагмент "ІМ 5мегг формував смугу на тому самому рівні в 195 агарозному гелі, як і фрагмент "Гитаї 15" (Фіг. 1). Мабуть, більший фрагмент був специфічним для "І М15мег". Отже, отриманий з промотору ПЛР-маркер, УУМ5-РМ, створювали з використанням праймерів УМ/М5-ЕР5 ії УУМ5-КР5. Маркер УУМ5-РМ використовували для скринінгу бібліотеки ВАС "І Мі5мег». Був виявлений додатковий клон ВАС Р204 (фії. 1 і 2), який був отриманий з 40 хромосоми з домінантним геном М52. Аналогічним чином, клон ВАС Р204 бо секвенували та збирали, при цьому було встановлено, що він містить ділянку розміром 1212 п.н., яка аналогічна ділянці в клоні ВАС Р1593. Для порівняння ген улт5 (ЗЕО ІЮ МО: 3) містить 8657 пар основ, однак відповідна послідовність гена М/М5 містить 10592 пар основ (5ЕО ІЮО МО: 4), різниця в розмірах в основному обумовлена вставкою транспозону у промотор УУМ5.
Приклад 5
Дослідження тканинноспецифічної експресії гена М/М5
І(00054| ПЛР із зворотньою транскрипцією (ЗТ-ПЛР) і кЗзТ-ПЛР використовували для вимірювання рівня мРНК гена УУМ5 в кожній тканині пшениці. Для ЗТ-ПЛР використовували два праймери УУМ5, УУМ5-ЕРб і М/М5-КРб, і два праймери, Асііп-ЕР1 й Асііп-КРІ1, для контрольного білка актину. Для кЗзТ-ПЛР використовували два інших праймери УУМ5, УУМ5-ЕР7 і МУМ5-ЕР, і два праймери, Асііп-ЕР2 й Асііп-КР2, для контрольного білка актину (Ри еї аї., 2007). Ген М/М5 специфічно експресувався у пильовиках пшениці, але не в інших тканинах, таких як лушпиння, лист, нижня квіткова луска та верхня квіткова луска, пестик, корінь та стебло (фіг. ЗА); рівень
МРНК УУМ5 у пильовику був у 100 разів вище, ніж у будь-яких інших досліджених тканинах (Фіг.
ЗВ).
Приклад 6
Ідентифікація промотору УУМ5
ІЇ00055| Область ДНК, розташовану в напрямку 5'-кінця відносно передбаченого старт- кодона, досліджували шляхом порівняння зазначених генів, домінантного МУМ5 і рецесивного мит5. Для відновлення функціонального промотору розглядали можливість використання відносно довгого фрагменту (від 2 до 4 тис.п.н) для генів рослин, особливо невідомих генів. У даному винаході фрагмент розміром 3502 п.н. (ЗЕО ІО МО: 3) розглядали в якості промотору для рецесивного гена улт5 в "І итаї 15". Відповідна область домінантного гена М/М5 з "МІ 5Бме2» містила 5578 п.н. (ЗЕО ІЮ МО: 4). Вибрані промотори УУМ5 і улт5 містили 2414 ідентичних пар нуклеотидів на 5'-кінці, тоді як решта послідовності промотору улти5 довжиною 1088 п.н. істотно відрізнялася у порівнянні з іншою частиною послідовності промотору МУМ5 довжиною 3164 п.н.
Збільшення розміру промотору М/М5 в основному було зумовлено вставками двох транспозонів довжиною 275 п.н. і 179 п.н., відповідно. Імовірно, область послідовності довжиною 5578 п.н., розташована в напрямку 5'-кінця відносно області гена УУМ5, мала активність, специфічну для пильовика.
Зо (00056) Щоб підтвердити специфічну для пильовика активність промотору УУМ5 (ЗЕО ІЮ МО: 5), отримували дві конструкції для експресії у рослин, включаючи приймаючий вектор РСб613 і конструкцію РС9б66, яка містить репортерний білок СЕР (Ру/м5:СЕР) (Фіг. 4А), у даній заявці Руум5 означає промотор М/М5 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 5). Ген СЕР у РСб13 і РС96б отримували з роууУваі (маКадама еї а!., 2007). РСО613 і РС966 містили аналогічний плазмідний кістяк РСАМВІА1300.
Лінкерна область днк між Рмм5 і СЕР являла собою 5- тАасаАдсАасаса,аСсасСсвАСССАаст ТТ атАСАААатТааТтаАТСАТОИ-З, 5'-кінцеві нуклеотиди ТАСсООсАСс отримували з кінця промотору УМУМ5, і 3'-кінцевий нуклеотид АТО означає старт-кодон СЕР. РСб13 і РСО6б вводили шляхом балістичної трансфекції в різні органи квітки (нижню квіткову луску, верхню квіткову луску, пестик і пильовик) у відповідності до інструкцій у прикладі 9. Флуоресценцію СЕР спостерігали під флуоресцентним стеріомікроскопом через три дні після балістичної трансфекції. Сигнали СЕР детектували в тканинах після балістичної трансфекції конструкцією РС966 (Руме5:ОЕР), особливо у пильовику, але не в тканинах після балістичної трансфекції конструкцією РСб613. Отже, промотор МУМ5 (ЗЕО ІО МО: 5) відповідно до даного винаходу має промоторну активність та може стимулювати експресію СЕР у пильовику.
І00057| Для виконання генетичної комплементації (приклад 9) та для перевірки функції промотору М/М5 (5ЕБЕО І МО: 5), геномну алель М/М5 (ЗЕБЕО ІЮ МО: 7) клонували і використовували для збірки конструкції для експресії у рослин РС976 (фіг. 4А). Конструювання вектора та балістичну трансфекцію виконували, як описано у прикладі 9. У РС966б і РС976 використовували ідентичні фрагменти промотору М/М5 (5ЕО ІЮ МО: 5). Тканинноспецифічну експресію гена УММ5 реєстрували в трансгенній лінії пшениці "9У27-2" (таблиця 3), для детектування використовували праймери УУМ5, У/М5-ЕРб і М/М5-КРВб, і праймери актину, Асііп-
ЕРІ й Асііп-КРІ. Як наслідок цього промотор УУМЗ (ЗЕБО ІЮО МО: 5) відповідно до даного винаходу викликав специфічну для пильовика експресію гена М/М5, яка була відсутня в інших тканинах, включаючи лист, стебло, лушпиння, нижню квіткову луску, верхню квіткову луску та пестик (Фіг. 4С). На закінчення слід зазначити, що промотор М/УМ5 (5ЕО ІО МО: 5) здатний викликати специфічну для пильовика експресію. (00058) Отже, доцільною є складання касети експресії, що містить промотор М/М5 (5ЕО ІЮ
МО: 5) і ген-мішень. Після введення в рослини (наприклад, зернові сільськогосподарські бо культури, деревні породи, овочі та квіти) касета експресії забезпечить специфічну для пильовика експресію гена-мішені. Це буде мати велике значення для формування чоловічої стерильності та інших важливих ознак у рослин.
Приклад 7
Отримання ЕМ5-індукованої популяції "І М 5мег"
ІЇ00059| Мутовану популяцію "І М15ме2, яка містить 1200 УУМ5-позитивних рослин Мі, створювали з використанням 87,4 мкМ розчину етилметансульфонату (ЕМ5; 5ідта-Аїагісп, Сет-
Луїс, Массачусетс, США). В загальних рисах, по 400 насінин (Мо) від рослин, отриманих в результаті схрещування "І М15мег2»/«І иптаї 15", замочували в 100 мл 87,4 мкМ ЕМ5 (0,9 95 у воді, об./об.), і потім інкубували у працюючому шейкері при 150 об./хв і 25 "С протягом 10 год. Після обробки ЕМ5 насіння промивали під проточною водою при кімнатній температурі протягом 4 годин. Насіння Мі після мутагенезу поміщали на вологий папір і підтримували у пластиковій коробці (довжина х ширина х висота - 40 см х 30 см х 20 см), яка покрита поліетиленовою плівкою, і потім інкубували при 25 С з 16 год. фотоперіодом протягом 8 днів. Життєздатні саджанці з корінням пересаджували в грунт і підтримували у холодному приміщенні при 4 2С і 12 год. фотоперіоді протягом 6 тижнів. Яровізовані рослини Мі потім підтримували в теплиці при 25 2С і 16 год. фотоперіоді. В теплиці підтримували тільки рослини, які несуть домінантний ген М/М5, і відбраковували рослини без домінантного гена УММ5, які давали мутовану популяцію, включаючи 1200 М/М5-вмісних рослин Ми.
Приклад 8
Скринінг методом ТІССІМО мутації М/М5 в ЕМ5-обробленій популяції "ІМ 5мег» 00060) Внаслідок присутності домінантного гена УУМ5 всі 1200 У/М5-вмісних рослин Мі, імовірно, характеризуються чоловічою стерильністю. Однак деякі мутації в гені УУМ5, як вважають, пригнічують його функцію, викликаючи чоловічу фертильність. Отже, характеристики чоловічої фертильності/стерильності досліджували у всіх колосках 1200 УМУМ5-вмісних рослин
МІ. Із 3138 оглянутих колосків, двадцять колосків мали фенотипи чоловічої фертильності, які характеризуються звичайним пильовиком, пиленням і зав'язуванням насіння (Фіг. 5).
І00061| Геномну ДНК отримували з верхніх листів основного стовбура рослин Мі методом на основі саркозилу (Учап еї аї., 2012). Концентрації ДНК вимірювали з використанням спектрофотометра МапоОгор (Тпепто зЗсіепійіс, Уілмінгтон, Делавер, США) і нормували до
Зо концентрації 100 нг/мкл. Рівні кількості чотирьох зразків ДНК об'єднували і готували для дослідження в 96-лунковому планшеті. Зразки ДНК також отримували з верхніх листів основних стебел або відростків, які давали колосся з чоловічою фертильністю. Кожну із зазначених ДНК об'єднували з рівною кількістю геномної ДНК з дикого типу "ІМ15мег" з отриманням дворазового пулу.
І00062| Загальну геномну ДНК екстрагували методом на основі саркозилу (Упцап еї а!., 2012).
Для всіх рослин сегмент верхнього листа (довжиною 3-5 см) первинного відростку використовували для отримання незалежних зразків ДНК. Концентрацію ДНК вимірювали за допомогою спектрофотометра МО2000 (Трпепто зЗсіепійіс, Уілмінгтон, Делавер, США), і доводили до 100 нг/мкл з використанням бідистильованої води. Кожні чотири зразки ДНК об'єднували і зберігали в 96-лункових планшетах. Верхні листи двадцяти відростків/колосків з фенотипом чоловічої фертильності збирали й отримували з них незалежні зразки ДНК. У тих випадках, коли відросток з чоловічою фертильністю був первинним відростком, використовували зразок ДНК первинного відростка. ДНК з кожного відростка з чоловічою фертильністю потім об'єднували з рівною кількістю ДНК дикого типу "МІ 5мег" і також зберігали в 96-лунковому планшеті. (00063) Модифікований підхід ТІССІМО (Оапцу еї аїЇ.,, 2009) використовували для детектування індукованих мутацій гена УМУМ5. Метод детектування з використанням поліакриламіду включає двоетапний скринінг. Перший етап скринінгу методом ПЛР складається з двох реакцій ПЛР: 1)
ПЛР для довгих фрагментів проводили для ампліфікації алеля УУМ5 у всіх пулах ДНК з використанням набору КОЮ ЕХ (Тоуобо Со. Осака, Японія); для проведення ПЛР використовували селективні праймери для ПЛР, УМ/М5-ЕРВ ї М/УМ5-КР10; ПЛР проводили в 50 мкл сумішей, що містять їх буфер для ПЛР (КОО-РіІйив-Мео), 1,5 мМ Мо95О», 0,2 мМ кожного дДНТФ, 0,2 мкМ кожного праймера, 200 нг геномної ДНК, 1 Од полімерази Тад (КОО-Ріив-Мео) і бідистильовану НО; реакції ПЛР проводили в наступних умовах: початкова денатурація при 94 б протягом 2 хв, потім 35 циклів при 98 "С протягом 10 с, 60 "С протягом 30 с і 68 "С протягом 6 хв й остаточне подовження при 68 "С протягом 10 хв; продукт ПЛР розводили у 500 разів з використанням бідистильованої НО і потім використовували в якості матриці для наступної реакції ПЛР; 2) другий етап ПЛР проводили в 25 мкл сумішей, що містять їх буфер для ПЛР (1,5 мм Маосіг, 0,2 мМ кожного дНтТФ (Рготеда, Медісон, США), 0,2 мкМ кожного праймера, 2 бо мкг ДНК-матриці з розведеного продукту ПЛР, 1 Од полімерази Тад (Рготеда) і бідистильовану
НгО; матрицю розміром 5922 п.н. поділяли на три фрагменти для ампліфікації: перший фрагмент ампліфікували з використанням М/М5-ЕР8З і М/М5-ЕР8, другий фрагмент ампліфікували з використанням МУМ5-ЕРО і М/М5-КРОУ і третій фрагмент ампліфікували з використанням УУМ5-ЕР10 і МУМ5-КРІ10; реакції ПЛР проводили за наступих умов: початкова денатурація при 94 С протягом 5 хв, потім 35 циклів при 94 С протягом 30 с, 61 "С протягом 30 с, 72 "С протягом 90 с, й остаточне подовження при 72 "С протягом 10 хв. В кінці реакції ПЛР проводили етап денатурації та повторного відпалу (99 "С протягом 10 хв, 90 циклів при 72 26 протягом 20 с зі зниженням на 0,3 С в кожному циклі), щоб забезпечити утворення гетеродуплексів, якщо мутація присутня у пулі.
І00064| Після етапу повторного відпалу продукт ПЛР розщепляли за допомогою екстракту соку селери (СЕ), який отримували з використанням протоколу, описаного Тії еї аї. (Ті еї аї., 2006). Кількість СОЕ для розщеплення гетеродуплексів оптимізували, як це було запропоновано
Оацу ета. (ацу еї аІ., 2009). Реакція СОЕ включала: 14 мкл продукту ПЛР, 1 мкл СЕ, 2 мкл 10х буфера для розщеплення (ТІЇ! єї аїЇ., 2006) і З мкл бідистильованої НгО до кінцевого об'єму 20 мкл. Розщеплення проводили при 45 "С протягом 30 хв і негайно зупиняли реакцію шляхом додавання 5 мкл ЕДТА (75 мМ) в розрахунку на один зразок і ретельно перемішували. До зразків додавали по 5 мкл буфера для завантаження, що містить барвник бромфеноловий синій (бх), і приблизно 24 мкл реакційної суміші вносили в З 95 поліакриламідний гель (акриламід:біс у співвідношенні 19: 1). Позитивні пули ідентифікували шляхом детектування розщеплених продуктів ПЛР, об'єднаний розмір яких був порівнянний з розміром інтактного продукту ПЛР.
Відносно дворазових пулів ДНК присутність розщепленої смуги ПЛР вказувала на точкову мутацію в матриці ПЛР вибраного зразка ДНК. Відносно чотирикратних пулів ДНК присутність розщепленої смуги ПЛР вказувала на те, що один зразок ДНК з ідентифікованого пулу ДНК повинен нести точкову мутацію в матриці ПЛР, яка може бути ідентифікована на другому етапі скринінгу. 00065) Другий етап скринінгу виконували, щоб визначити, які окремі ДНК в чотириразовому пулі ДНК дійсно несуть мутацію. Кожний зразок ДНК потім об'єднували з рівною кількістю геномної ДНК з дикого типу "ІМ15мег" з отриманням дворазового пулу; зазначені дворазові пули
ДНК потім піддавали скринінгу для визначення продуктів розщеплення, виявлених на першому
Зо етапі скринінгу.
І00066| Щоб виявити зміну нуклеотиду проводили стандартну реакцію ПЛР на вибраній індивідуальній ДНК; продукт ПЛР секвенували, щоб виявити точкову мутацію (Фіг. 5). Для колосків Мі з чоловічою фертильністю ідентифіковані точкові мутації знову підтверджували в рослинах М».
І00067| Скринінг методом ТІСГІМО виявив 35 мутантів серед 1200 первинних відростків, у той час серед 20 відростків з чоловічою фертильністю було виявлено вісім мутованих варіантів (Фіг. 5). Відповідно до даних, отриманих для первинних відростків, частота мутацій гена УУМ5 становить близько 2,92 95. Однак серед 20 відростків з чоловічою фертильністю було виявлено вісім відростків, що несуть детектовані мутації, і 12 відростків, ймовірно, не мали мутацій в гені
МУМ5. Якщо припустити відсутність кореляції між М/М5 і чоловічою фертильністю (нульова гіпотеза), то частота мутацій у популяції (2,92 95) може бути використана для обчислення очікуваних значень для присутності мутації та відсутності мутації серед 20 відростків з чоловічою фертильністю, які складають 0,58 і 19,42 відповідно. Однак критерій згоди хі-квадрат відхилив нульову гіпотезу (Х2-97,13, аг1, Р-6,49.10-23). Отже, ген М/М5 ймовірно визначає чоловічу стерильність у пшениці Таїди.
Приклад 9
Отримання трансгенної пшениці Вобу/пйе з використанням балістичної трансфекції 00068) Для виконання генетичної комплементації геномний фрагмент розміром 10592 п.н. (ЗЕБЕО ІО МО: 7) гена М/М5 клонували з "ПМІ5ме52 з використанням набору ЕХ КОО і двох специфічних ПЛР-праймерів, УММ5-ЕРІТ1 ї М/М5-КРІ11. Після клонування продукту ПЛР у вставляючий вектор і приймаючий вектор отримували конструкцію для експресії у рослин (РС976), яка несла селективний маркер ВАК (Фіг. 4А). У даному винаході отримували ВАС- клони, що несуть ген М/М5. Це полегшить клонування гена МУМ5 (ЗЕО ІО МО: 7) із ВАС клонів відповідно до даного винаходу. Якщо необхідне пряме клонування з пшениці Таіїди, ПЛР із порівнянням з еталоном (Ммабві еї аіІ., 2004) полегшить ампліфікацію повнорозмірного гена УУМ5 (ЗЕО ІО МО: 7). 00069) Протоколи для тканинної культури і балістичної трансфекції пшениці адаптували з попередніх досліджень (Умуеекзв еї аї., 1993; Їм еї аІ., 2014 року). Незрілі зернівки з сорту Т. аевзіїмит "Ворж/піе" збирали через два тижні після цвітіння, стерилізували за допомогою 70 95 60 (об./о6.) етанолу, що містить 0,05 95 (об./об.) твін-20 протягом 5 хв, потім з використанням 20 95
(06б./06.) хлорного вапна Сіогох з додаванням 0,05 95 (06./06.) твін-20 протягом 15 хв, і промивали 3-5 разів з використанням стерильної дистильованої води. Незрілі зародки (приблизно 1 мм у довжину) виділяли зі стерилізованих зернівок, поміщали в середовище для диссекції так, щоб щиток був спрямований вгору (М5-основа 4,3 г/л, мальтоза 40 г/л, тіамін-НСЇ 0,5 мг/л, І -аспарагін 0,15 г/л, 2,4-О0 2 мг/л, Си5О» 0,78 мг/л, Рпуїадеї! 2,5 г/л, рН - 5,8), і підтримували протягом 4-6 днів при температурі 22-23 "С у темряві. Незрілі зародки потім обробляли протягом чотирьох годин в середовищах з високою осмолярністю (М5-основа 4,3 г/л, мальтоза 40 г/л, сахароза 171,15 г/л, тіамін-НСІ 0,5 мг/л, І-аспарагін 0,15 г/л, 2,4-О 2 мг/л,
Сибо» 0,78 мг/л, Рпуїадеїі 2,5 г/л, рН - 5,8), і піддавали балістичній трансфекції. Через двадцять годин після балістичної трансфекції незрілі зародки переносили в середовища для відновлення (склад яких аналогічний складу середовищ для диссекції), підтримували протягом 2-х тижнів при температурі 22-23 "С у темряві. Отримані із зародків калуси переносили в середовища для відновлення (середовище для диссекції, доповнене 0,1 мг/л 6-ВА і З мг/л біалафосу) і підтримували протягом двох тижнів у вегетаційній камері (22-23 С, 16 год. світло/8 год. темрява, інтенсивність світла 25 мкмоль:м:с"). Відновлені проростки (2-3 см) переносили в середовища для вкорінення (середовище для диссекції, ослаблене у два рази, з додаванням З мг/л біалафосу), і витримували при тих самих умовах навколишнього середовища, як і для відновлення. Життєздатні проростки з добре розвиненим корінням вкорінювали в грунт в теплиці.
І00070| Балістичну трансфекцію проводили з використанням системи для доставки РОБ- 1000/Не Рапісіє (Віо-Кай Габрогаїгіез, США). Для проведення трьох трансфекцій 2 мг мікроносіїв (частинки золота діаметром 0, мкм; Віо-Каай, США) зважували в 1,5 мл мікроцентрифужних пробірках, стерилізували шляхом змішування з 35 мкл чистого етанолу, виділяли шляхом осадження (12000 об./хв протягом 5 с), видаляли супернатант, промивали в 200 мкл крижаної стерильної дистильованої води і збирали шляхом осадження з подальшим видаленням супернатанту. Попередньо оброблені мікроносії ресуспендували в 245 мкл попередньо охолодженої стерильної води, що містить 20 мкг плазмідної ДНК, й об'єднували з 250 мкл попередньо охолодженого розчину СасСі» (2,5 М). При необхідності розчини на попередніх етапах ретельно перемішували за допомогою піпетки. Потім до суспензії мікроносіїв
Зо додавали 50 мкл попередньо охолодженого розчину спермідину (1,45 95, об./06.) і відразу ж змішували за допомогою вортексу в холодній кімнаті (4 С) протягом 15-20 хв. Мікроносії, покриті плазмідною ДНК, виділяли шляхом центрифугування (12000 об./хв протягом 10 с), з подальшим видаленням супернатанту, і потім повторно суспендували в 36 мкл чистого етанолу.
Для кожної балістичної трансфекції по 10 мкл суспензії золота вносили в центр диска для мікроносіїв (Біо-Кайд), висушували на повітрі в ламінарному проточному боксі, і поміщали пусковий контейнер для мікроносіїв під розривним диском, який розривається при тиску 1100 фунтів на квадратний дюйм. Шістдесят незрілих зародків, розташованих у вигляді кола діаметром 3,5 см, поміщали на 6 см нижче пускового контейнера для мікроносіїв. Систему РОБ- 1000/Не використовували відповідно до інструкції виробника. Умови бомбардування включали тиск гелію 1300 фунтів на квадратний дюйм і вакуум при 25 мм ртутного стовпа. 00071) В цілому 2742 незрілих зародки пшениці бомбардували конструкцією РС976, і 26 рослин відновили з кожного окремого зародку (таблиця 3). Передбачувані трансгенні рослини спочатку піддавали скринінгу в теплиці шляхом перевірки їх стійкості до 0,3 95 (06./06.) гербіциду
РіпаІеф). На стадії подовження стебла все відростки (один лист на один відросток, З см сегменту на лист) покривали гербіцидом. Чутливість до гербіциду оцінювали через п'ять днів після нанесення гербіциду. Вкрита область залишалася зеленою та здоровою на відростках, стійких до гербіциду, однак зникала на відростках, чутливих до гербіциду. Тільки п'ять рослин виявили стійкість до гербіциду (Фіг. б і таблиця 3). На стадії цвітіння три рослини мали чоловічу стерильність, і дві з них були також стійкі до гербіциду (Фіг. 6 і таблиця 3). Потім передбачувані трансгенні рослини досліджували для того, щоб виявити присутність маркера селекції ВАК та гена М/УМ5 з використанням ПЛР-праймерів ВАК-ЕРІ, ВАВ-ВРІ, М/М5-ЕРВ і УУМ5-КРІ12. Сім рослин показали позитивні результати на наявність ВАК та гена М/М5 (таблиця 3). ЗТ-ПЛР використовували для дослідження транскрипції УУМ5 в молодих колосках за допомогою ПЛР- праймерів УУМ5-ЕРб ії УММ5-КРб для гена УУМ5 й Асііп-ЕР1, й Асііп-КРІ1І для внутрішнього контролю. КДНК УУМ5 піддавалася детектуванню тільки в трьох трансгенних рослинах з чоловічою стерильністю (Фіг. б). На закінчення слід відзначити, що введення геномного фрагменту М/М5 (5ЕО ІО МО: 7) й експресія КДНК М/М5 (5ЕО ІЮО МО: 1) призвела до розвитку фенотипу чоловічої стерильності в трансгенній пшениці. Отже, введення геномного фрагменту
МУМ5 (ЗЕО ІО МО: 7) або КДНК УМУМ5 (ЗЕО ІО МО: 1) під контролем відповідного промотору у бо фертильні рослини (такі як зернові культури, деревні породи, квіти й овочі) може забезпечити отримання трансгенних рослин з чоловічою стерильністю. Це дозволить значно поліпшити повторювану селекцію рослин й отримання гібридного насіння.
Таблиця З
Присутність гена М/М5 в трансгенних рослинах пшениці То гербіцид стерильність 92ва | 12271111 92633 | 21 171 ЇЇ вк їв її - ЇЇ - 92644 | 255 1. - ЇЇ - 1 - 1-1 - 926-5. | 2601-11-11 - 1 - 9266, | 2691-11-11 -1111- 1 - 9268, | 2901... - Її - 1-1 - 1 - 9269, | 2991... - ЇЇ 1-1 - 1 - чат | 400 177117 -1 1171-11-11 1 чита | 40201. - ЇЇ вк 11 її ЇЇ 23 | 45 11711ю Її її 9274 46 171117 -1 1171-11-11 1-1 925 47 1111-1111 1 9276 | 1420 177717 -1 1171-1111 1 чия | 48917777 -1 1111-1111 1 - иа | 4485 |. - | - 1 - Її - 1 - 9йх9-3 | 1446 1777-1111 -1ї1111- 1 - 9йх94 | 45201777 - 1171-1111 1 - 9йи5-5 | 455 17-11 1-1 9йх9-46 | 458.17 - 111-11-11 9йи9-7. | 459 1 Й - ЇЇ - 1 - 1 - 1 9йх9-8. | 46017777 -1 1117-1111 -1ї1111- 1 - 9йх99 | 4638177 кю | вт 1 жк її - ЇЇ - чйиао | 46417 - Їж 11 1-1 чив | 467 | - |! - 1-1 - 1 -
Примітка: «жк» вказує на стійкість до гербіциду, позитивний результат на наявність гена ВАК, позитивний результат на наявність гена М/М5, позитивний результат на наявність КДНК М/МЗ5 і чоловічу стерильність; Клітини з символом «ж» були затінені сірим кольором. Кількість рослин позитивних по відношенню до кожної досліджуваної ознаки була підкреслена в рядках проміжних підсумків.
Приклад 10
Отримання трансгенних рослин Вгаспуродішт з використанням Адгорасіегішт- опосередкованої трансформації (00072) Результати, отримані у даному винаході, підтвердили функціонування гена М/М5 в модельній рослині Вгаспуродіит. Конструкцію для експресії у рослин РС976 (Фіг. 4А) вводили в штам Адгобрасієгішт "АСі1" шляхом електропорації. Трансгенні рослини Вгаспуродійт отримували з використанням протоколу Адгобасіегіит-опосередкованої трансформації (Вгадад еї а!., 2012). 00073) Для отримання інокуляту Адгорасіегішт АСІ 1, несучі конструкцію РС976, наносили штрихом на тверде середовище МО/І. (триптон 5 г/л, дріжджовий екстракт 2,5 г/л, масі 5 г/л, О- манніт 5 г/л, Ма5О» 0,1 г/л, К"НРО» 0,25 г/л, І -глутамінова кислота 1,2 г/л, порошок агару 15 г/л, рн.-7,2) з додаванням відповідних антибіотиків (канаміцин 50 мг/л, карбеніцилін 100 мг/л і рифампіцин 40 мг/л), інкубували протягом двох днів при 28 "С у темряві, збирали шляхом зіскоблювання колоній Адгобрасіегішт з середовища МО// і ресуспендували до досягнення
ООвоо-0,6 в рідкій СІМ. (00074) Незрілі насіння збирали з ізоляту В. дібїаспуоп "Ва21-3" на етапі наливу насіння, стерилізували в 10 95 (06./06.) хлорного вапна СіогохФ), доповненого 0,1 95 (06./06.) тритоном Х- 100, протягом 4 хв і промивали З рази стерильною водою. Незрілі зародки (довжиною 0,3-0,7 мм) виділяли зі стерилізованого насіння, розташованого щитком вгору на середовищах для ініціації калуса (СІМ: І 5-основа 4,43 г/л, СибО» 0,6 мг/л, сахароза 30 г/л, 2,4-О 2,5 мг/л, Рпуїадеї 2 г/л, рН.-5,8) й інкубували при 28 2С у темряві. Через чотири тижні калуси стали видні внаслідок проліферації клітин щитка; для субкультивування й Адгорасіегішт-опосередкованої трансформації відбирали тільки жовтуваті ембріогенні калуси.
І00075| Ембріогенні калуси інфікували протягом 5 хвилин шляхом занурення в свіжий інокулят Адгорасіегішт, який містив 200 мкМ ацетосирингону і 0,1 95 (мас./об.) Зупрегопіс
РЕ/Е68, висушували на фільтрувальному папері для видалення вільної суспензії інокуляту й інкубували на трьох шарах фільтрувального паперу протягом З днів при температурі 22 С у темряві. Після спільного культивування калуси спочатку підтримували на середовищах СІМ, доповнених 150 мг/л тиментину і 40 мг/л гігроміцину протягом одного тижня при 28 "С у темряві, і потім культивували протягом ще двох тижнів. Життєздатні калуси переносили на середовища для відновлення (Вгада еї аї., 2012) (І 5-основа 4,43 г/л, СизО» 0,6 мг/л, мальтоза 30 г/л, кінетин 0,2 мг/л, Рпугаде! 2 г/л, рН-5,8), що містили 150 мг/л тиментину і 40 мг/л гігроміцину, і підтримували при 28 "С в умовах І О (16 годин світло/8 годин темрява, інтенсивність світла 20 мкмоль:м2-с7). Після того як відновлені пагони досягли 1-2 см в довжину їх переносили в середовища для вкорінення (Вгадо еї аї., 2012) (М5-основа з вітаміном 4,42 г/л, сахароза 30 г/л,
Рпуїадеї 2 г/л, рН.-5,8), які містили 150 мг/л тиментину, і підтримували при тих самих умовах, як і на етапі відновлення. Після того як відновлені пагони давали здорове коріння (2-3 см), їх вкорінювали в грунт в теплиці. (00076) В цілому 100 калусів інфікували штамом Адгобасіегішт АС 1, що несе конструкцію
РСО76. Одинадцять рослин були відновлені з восьми незалежних калусів (таблиця 4).
Передбачувані трансгенні рослини спочатку піддавали скринінгу в теплиці шляхом перевірки їх стійкості до 0,3 95 (о0б6./06.) гербіциду РіпаІеф) На стадії трьох листів (приблизно 10 см у висоту) всі відростки (один лист на відросток, 1 см сегмент на лист) обробляли гербіцидом. Чутливість до гербіциду оцінювали через п'ять днів після нанесення гербіциду. Покрита область залишалася зеленою та здоровою на стійких до гербіциду відростках, однак зникала на відростках, чутливих до гербіциду. Десять рослин виявили стійкість до гербіциду (Фіг. 7 і таблиця 4). На стадії цвітіння десять рослин мали фенотип чоловічої стерильності та також були стійкі до гербіциду (Фіг. 7 і таблиця 4). Потім передбачувані трансгенні рослини
Зо досліджували, щоб виявити присутність маркера селекції ВАК та гена М/М5 з використанням
ПЛР-праймерів ВАК-ЕРІ, ВАВ-ВРІ, УУМ5-ЕРВ і МУМ5-КРІ12. Всі десять рослин були позитивними у відношенні генів ВАК і М/М5 (таблиця 4). ЗТ-ПЛР використовували для перевірки транскрипції М/М5 в молодих колосках з використанням ПЛР-праймерів УУМ5-ЕРб і МУМ5-АРб для гена М/М5 й Асііп-ЕР1І, й Асііп-КРІ для внутрішнього контролю. КДНК У/М5 піддавалася детектуванню в десяти трансгенних рослинах з чоловічою стерильністю (Фіг. 7, таблиця 4). В сукупності, серед 11 передбачуваних трансгенних рослин десять рослин були стійкі до гербіциду, позитивні у відношенні трансгенів ВАК і МУ/УМ5, позитивні у відношенні КДНК УММ5 і мали фенотип чоловічої стерильності. У той час як тільки одна рослина була чутлива до гербіциду, не містила трансгени ВАК і М/М5, не містила КДНК МУМ5 і мала фенотип чоловічої фертильності. Отже, геномний фрагмент УУМ5 (5ЕБЕО ІЮ МО: 7) може ефективно індукувати чоловічу стерильність у Вгаспуроаічт.
І00077| В свою чергу, введення геномного фрагменту М/М5 (ЗЕО ІЮ МО: 7) або КкаНК УУМ5 (ЗЕБЕО ІО МО: 1) під контролем відповідного промотору у фертильні рослини (такі як зернові культури, деревні породи, квіти й овочі) може викликати розвиток фенотипу чоловічої стерильності у трансгенних рослин. Це дозволить значно поліпшити повторювану селекцію рослин й отримання гібридного насіння.
Таблиця 4
Присутність гена УУМ5 в трансгенних рослинах Вгаспуродійт То гербіциду стерильність пу: ШУ и с п ПО ПО я ПО
Примітка: «жк» вказує на стійкість до гербіциду, позитивний результат на наявність гена ВАК, позитивний результат на наявність гена М/М5, позитивний результат на наявність КДНК УУМ: і чоловічу стерильність; «-» вказує на чутливість до гербіциду, негативний результат на наявність гена ВАК, негативний результат на наявність гена МУМ5, негативний результат на наявність
КДНК М/М5 і чоловічу фертильність. Клітини з символом «ж» були затінені сірим кольором.
Кількість рослин позитивних у відношенні кожної досліджуваної ознаки була підкреслена у рядках проміжних підсумків.
Джерела інформації:
Аїйївспиї, 5., (зі5П, МУ., МіПег, М., Муегзв, Е., Гіртап, 0. (1990). Вавіс Іоса! аїдптепі з5еагспі ісої.
Уоитаї! ої МоїІесшіаг Віоїоду 215, 403-410.
Во!дег, А.М., Гонзе, М., Овааеї, В. (2014). Тіттотаїс: а Пехібів Шттег ог Шитіпа зедоепсе даїа. Віоіптогтаїйсз 30, 2114-2120.
Вгаздча, 9.М., Ми, у., богаоп, 5.Р., сийтап, М.Е., Тнітопу, В., І аго, С.В., Си, М.О, Модеї, У.Р. (2012). Сепегайоп апа сНагасієгігайоп ої Ше М/езіст Ведіопа! ВРезвагсп Сепієг Вгаспуродіт Т-
ОМА іпзепіопа! тиїапі соїІесііоп. Рі о5 ОМЕ 7, е41916.
Сао, МУ., Зотегв, 0.9., Гедак, а. (2009). А тоІесшаг таїКег сіозеїу ПпКей ю Ше гедіоп ої ВНІ- р1с апа М52 депез іп соттоп м/пеаї (Тийісит аєвіїмит). Сепоте 52, 95-99.
Спепа, У.К., АІрег, Н.5. (2014). Тне депоте еайіпа юоірох: а зресігпшт ої арргоаснев ог агдеївй тодіїїсайоп. Ситепі Оріпіоп іп Віоїесппоіоду З0, 87-94.
СНгівїепзеп, А., ЗпатоскК, А., ОцаїЇ, Р. (1992). Маїге роїуибідийіп депев: вігисіцге, ШТептаї! репигбрайоп ої ехргезвіоп апа ігапзсрі з5ріїсіпу, апа рготоїег асіїмйу тоПоміпо Шапбїег ю ргооюоріавів Бу вівесігорогаїййоп. Ріапі Моїесшіаг Віоіоду 18, 675-689.
Оепа, »., сао, 2. (1982). Оібвсомегу апа деїептіпайоп ої а дотіпапі таїє віетпйе депе апа її5 ітропапсе іп депеїййсв апа мпеаї бгеєдіпд. Зсіепсе Спіпа: Спетівігу 25, 508-520.
Біикапоміс, М., ЗтіїН, У., Гоме, К., Мапод, М., Сао, Н., допе5, 5., Міспоїзоп, М.С, М/еві, А.,
І аре, »ю., Віапеу, 0., Са! Раїсо, 5., Уапіг, О., АіІехападег Гугпік, Г. (2013). МаїІе-51іепіе таї?е ріапів рюодисеа Бу їіагаєївд тиїадепевів ої Те суюснтоте Р450-ЇїКе депе (М526) изіпд а ге-дезідпеа І-
Сте! потіпу епдописієазе. Те Ріапі доштаї 76, 888-899.
Зо Ем/іпо, В., НіПег, Г., МУепаї, М.С., Стееп, Р. (1998). Вазе-саїІїпу ої ашотаїей зедпепсег ігасе5 ивзіпу РНгеєад. І. Ассигасу Аззез5тепі. Сепоте Незеагсі 8, 175-185.
Ем, 0., Оипваг, М., бибсоузкКу, у. (2007). М/пеаї МІМЗ-ЇїКе РНО їїіпдег депез аге ир-геашаїеа ру мегпаїїгаййоп. МоіІесцаг Сепеїїсв апа Сепотісв 277, 301-313.
Сигивзпід2е, М., Непзеї, а., НіеКеї, 5., Зспеаеї, 5., МаІКом, М., Китіенп, у. (2014). Тице-бгеєдіпа їагдеїєд депе Кпоск-оці іп Бапеу ивзіпа дезідпег ТАЇ Е-писієазе іп Наріоїд сеїв. Ро5 ОМЕ 9, е92046.
Наазв, В..)., Рарапісоїіаои, А., Маззоиг, М., старпе!т, М., Віоса, Р.О., Вомжмаеп, У., Соцадег, М.В.,
Ессієв, 0., Гі, В., Гіерег, М., МасМапез, М.О., ОЙ, М., Огів, у., РосНеї, М., ігог7і, Е., Меекзв, М.,
МУезіептап, В., ММШат, Т., Оємеу, С.М., Непзенеї, В., Герис, В.О., Еієдтап, М., Ведем, А. (2013). ре помо ігапзсагірі зедоепсе гесопвігисіоп їот АМА-5ед ивзіпуд Ше Типйу ріацогт ог геїегепсе депегаїйоп апа апаїувзів. Майте Ргоїосої!5 8, 1494-1512.
Наттогпга, 5.М., Сацау, А.А., Наппоп, (3.9. (2001). Розі-ігтапзсетіріопаї! депе вієпсіпа Бу доибіе- зігапаєд ВМА. Майте Неміємв Сепеїісвз 2, 110-119.
Нептзіву, А., Атпеєїт, М., Топеу, М.О., Сопоравві, сї., Саїав, 0.9. (1989). А взітріє теїйодй ог віїе-дієесієй тиїадепевзів ибвіпд Те роїутегазе спаїп геасіїоп. Мисієїс Асід5 Незеагсп 17, 6545- 6551.
Капіп, 5., Айвсепиї, 5.Р. (1993). Арріїсайоп5 апа в5іаїївіісв ог тийПіріеє підп-5согіпд зедтепів іп тоіесшціаг зедиепсев. Ргосеєдіпд5 ої їйе Маїйопа! Асадету ої бсіепсез 90, 5873-5877.
КетркКеп, Р., Ргіпод, 0. (1999). Ріапі Бгеєдіпд: Маїе 5іепійу іп піднег ріапіз-пипдатепіа!5 апа арріїсайопв5. Іп Ргодгев5 іп Воїапу, К. Еззег, УМ. Кадегей, 0. ГоКде, апа М. Кипде, єдз (Зргіпдег
Вепіп Неїдеїрего), рр. 139-166.
Кейіпа, ВА.Р., РіавзієїкК, Н.Н.А. (2000). А адепеїїс ПК Беїмееп со-зирргезбвіоп апа АМА іпіепегепсе іп С. еієдапв. Майте 404, 296-298.
Кот, І., Мапаеїї, М., Віедеї, 9. (2003). Ап еззепійа! диїде о пе Ббавіс оса! аїдптепі зеагспі їоо!:
ВІ А5Т. (Зебавзіорої, СА: О'Вейу Авзосіа!ев).
Козигі, 5., Спигсй, (С.М. (2014). І агде-зєсає де помо ОМА взупіпевзів: їесппоЇодієв апа арріїсайоп5. Маїшге Меїподз 11, 499-507.
І апаї, О., Стипепй, Н.-Р., НаНп, Ш. (1990). А депега! теїноа ог гаріа віе-дігесівєд тиїадепезів ивіпа Ше роїутегавзе сНаїйп геасіп. Сепе 96, 125-128.
І арідої, М., Ріїреї, У. (2006). сепоте-міде пайшгаї! апіізепзе Іапзсгірійоп: сошріїпа їв гедшайоп іо їїз айегепі гедшайгу теснапізтв. ЕМВО Рерогіз 7, 1216-1222.
Її, В., Оєжеу, С. (2011). А5ЕМ: ассигаїе ігапзсіірі доапійісайоп їот АМА-5ед даїа м/йй ог мйШтоці а геїегепсе депоте. ВМС Віоіптогтаїйсв 12, 323.
Пи, В., Оеєпа, у. (1986). А дотіпапі депе їог таїе 5іепійу іп мпеаї. Ріапі Вгеведіпу 97, 204-209.
Пи, Х., Зпапддцап, У., 7Ни, у., и, М., Нап, В. (2013). ТНе гісе О5І.ТРб депе рготоїег аїгесів апіпег-5ресіїіс ехргезвзіоп Бу а сотбіпайоп ої розійме апа педаїїме гедшіайгу єІетепів. Ріапіа 238, 845-857.
Ї о, Н., І ее, 9.-Х., Ни, О., МеіІбоп-Мавіїснік, К., Ейав, Т., ГісКмаг, С., Каизси, А., Спапаеє, ».,
Нодаєз, Т. (2006). ВТ5, а гісе апіпег-зресіїїс депе ів гедцігей ог таїе Тепіїйу апа їв рготоїег взедиепсе аіїгесів їіз5це-5ресіїйс депе ехргеввіоп іп айШегепі ріапі 5ресіє5. Ріапі МоїІесшаг Віоїоду 62, 397-408.
Го, М., М/іпд, А. (2003). Ап ітргомед теїйой ог ріапі ВАС Іргагу сопвігисіоп. п Ріапі
Коо) Еипсеїопа! Сепотісв, Е. Стоїємоїа, ей (Тоїома, МУ: Нитапа Ргевв5), рр. 3-19.
Їм, В., МісНег, В., Нап, Х., ММапо, 5., Мі, Е., Ії, К., Реагсе, 5., Ми, уУ., ВБирсоузкКу, ч., Ри, 0. (2014). Спагасієгіганйоп ої ЕГОМ/ЕВІМО ГГ ОСОБ Т1 (ЕТ) депе іп Вгаспуродіит апа у/неаї. Рі о5
ОМЕ 9, е94171.
МаскКепгіє, 5. (2012). Маїе віепійу апа пубгій веєей ргодисійоп. Іп Ріапі Віоїесппоіоду апа
Адгісипиге, А.А.М. Назедаула, ей (Зап Оієдо: Асадетіс Ргезв), рр. 185-194.
Мадаїакепті, О., УМаєгтп, К., Зпудег, М. (2001). АМА-вед: А теїнпой ог сотргепепвзіме мапзсгірюте апаїувів. п Ситепі Ргоюсої5 іп Моіесшаг Віоїоду (Чонп УмМіеу б 5опв, Іпс.
МаКадамжа, Т., Киго5е, Т., Ніпо, Т., ТапаКка, К., КажатикКаї, М., Міша, У., ТоуооКа, К.,
Маїзцока, К., про, Т., Кітига, Т. (2007). Оемеортепі ої зегієз ої даїемау Бріпагу месіоїв, рамМуУВв, ог теаїїгіпд ейісієпі сопзітисіп ої Тибвіоп депез ог ріапі ігапетогптаїйоп. Усигпаї ої Віозсіепсе апа
Віоепдіпеетіпу 104, 34-41.
Радаїзоп, Р.у., Сацау, А.А., Вегпвієїп, Е., Наппоп, С.9., СопКіїп, 0.5. (2002). Зпоп ПНаїгріп
АМАв5 (5ПАМАЗв) іпдисе зедиепсе-5ресіїїс вйепсіпуд іп таттаїїап сеїв. Сепез5 є ЮОемеІортепі 16, 948-958.
Вас, М.К., Оемі, К.О., Агипанаї;, А. (1990). Арріїсайопв ої депіє таїе в5іепійу іп ріапі Бгеєдіпд.
Ріапі Вгеєдіпд 105, 1-25.
Вобіпзоп, М.О., МеСайну, 0.)., Зтуй, (с.К. (2010). єддеВ: а Віосопдисіог расКкаде ог аїегтепіа! ехргеззіоп апаїувів ої діда! депе ехргеззіоп даїа. Віоіпіогтаїйсз 26, 139-140. заїкі, В., сна, 5., Раіоопа, Е., Миїїв, К., Нопт, сх., ЕпПісн, Н., АтНеїт, М. (1985). Епгутаїйіс атрійісайоп ої реїа-діоріп депотіс зедиепсез апа гевтгісіоп 5іїе апаїувзів ог діадповів ої віскіє сеї апетіа. 5сіепсе 230, 1350-1354. зЗпап, О., Мапао, М., Ії, 9У., (Зао, С. (2014). Сепоте еййіпд іп се апа мпеаї ивіпу Ше
СВІБРА/Саз зузієт. Маїшге Ргоїосоїв 9, 2395-2410.
ЗП, Х., 2епо, Н., Хиє, У., Їцо, М. (2011). А раї" ої пежм ВАС апа ВІВАС месіогз ІПаї Тасіїнаїе
ВАС/ВІВАС Ігагу сопзігисійп апа іпіасі іагде депотіс ОМА іпзегі ехспападе. Ріапі Меїйоодбв 7, 33. бітрзоп, У.Т., ММопо, К., Уасктап, 5.0., Зспеїп, 9.Е., допевз, 5.9.М., Вігої, Ї. (2009). АВуУЗ5: А рагаїІє!Ї аззетбіег тог 5поп геай зедиепсе даїа. Сепоте Везвеагсиі 19, 1117-1123.
Зіаде, А.)., Еегеіепрего, 5.І., І оеніег, О., Бівіпе, М.М., Рассіоці, О. (2005). А гемегзе депеїїс, попігапздепіс арргоасі ю м/пеаї стор ітргометепі Бу ТІ ІМС. Маїшиге Віоїесппоіоду 23, 75-81. 60 Зтуїй, О.В. (1997). Сепе 5іїєпсіпд: Созирргеззіоп аї а дібіапсе. Ситепі Віоіоду 7, 8793-8796.
зЗошпет, Е.М. (1975). ЮОеєїесійоп ої зресіїс зедоепсе5 атопа ОМА Гадтепів зерагаїєйд Бу деї еіесторпогевів. Чоштаї ої Моіесшаг Віоіоду 98, 503-517.
ТІЇ, В.9., 2еп, Т., Сотаї, Г.., Непікой, 5. (2006). А ргоїосої ог ТІ СІМС апа Есойпа іп ріапів апа апіта!5. Маїшге Ргоїосої!в 1, 2465-2477. ацу, С., Рагаїзо, Е., Соїазиоппо, Р., Тгап, В., Тваї, Н., Вегагаї, 5., Сотаї, І., Оибсоузку, 9. (2009). А тодійвйа ТІ ГІМа арргоасі о аеїесі іпдисед тиайопв іп їеігаріоїд апа пехаріоїд упеаї.
ВМО Ріапі Віоіоду 9, 115.
Мазі, 9у., Рапієї, с., Вепсіпа, М., Уегаіа, В. (2004). Ргерагайоп ої спітегіс депеб5 мйпоці 5ирсіопіпд. ВіоТесппідцез 37, 726-730. мапа, Е. (2012). Тіріовїпу агоипа ігапздепісв. Маїиге Віоїесппоіоду 30, 215-217.
Мапа, У., Снепо, Х., Зап, О., 7Напо, У., ім, уУ., асо, С., Он, у.-І. (2014). бітийапеоиз єдіїпд ої Шгєе пПотовеоаїІєЇе5 іп пехаріоїй ргєеай мпеаї сопіег5 Пепіаріє гезібїапсе Ю ромадегу тіЇдему.
Маїшге Віотесппоіоду 32, 947-951.
МУеекв, 9.Т., Апаегзоп, О.0О., Вієсні, А.Е. (1993). Варіа ргодисіюп ої тийіріє іпаерепаепі Іїпев5 огтТепіе мапздепіс мпеаї (Тиййсит аевіїмит). Ріапі Рнузіо! 102, 1077-1084.
Мепаї, Т., Но!т, Р., стакетг, С., Снгізіап, М., Моуїав, 0., Вііпсн-Редегзеп, Н., Ноїте, І. (2013).
ТАГ. епПесіог писівазев5 іпдисе тшиїайопз аї а рге-зеїІесієй Іосайоп іп Ше депоте ої ргітагу бапеу
Тапетоптапів. Ріапі Моїесшіаг Віоіоду 83, 279-285. ми, ГО, Пи, 0., Ми, у., 2папо, В., Оіп, 27., Пи, О., Її, А., Ри, 0., 7Наї, МУ., Мао, І. (2013).
Ведшіайнйоп ої ЕЯГОМ/ЕВІМИ ОСОБ Т ру а МістоВМА іп Вгаспуродіит аївіаспуоп. Ріапі Сеї 25, 4363-4377.
Мапа, Г., Пи, В., 2Наї, Н., Мапа, 5., Пи, Н., 7Нои, У., Мепо, Е., Мапа, у., 7пи, а, Спи, 5., папа, О., Меї, У. (2009). Ома та!е-віетпе мпеаї: А гемоіІшіопагу Бгеєдіпад арргоасі о упеаї. Іп
Іпдисей ріапі тшиїайопе іп Ше депотісв ега, О.М. Зп!у, ей (ПАоте, Маїу: Роод апа Адгісиниге Огдапігайоп ої Ше Опітей Маїйопв), рр. 370-372.
Учап, С., Лапо, Н., Мапо, Н., Ії, К., Тапо, Н., її, Х., Ри, 0. (2012). рівііршіоп, педиепсу апа мапайоп ої в5ігіре гиві гезівіапсе Іосі М/10, І и«34/у118 апа Ут36 іп Спіпезе упеаї сийімаг5. доштаї ої
Сепеїїйсв апа Сепотісв 39, 587-592.
Коо)
Claims (9)
1. Виділена ДНК згідно з будь-яким із (а)-(ї): а) КДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 1; р) ДНК, що кодує амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІО МО: 2; с) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО: 6; а) ДНК, що кодує білок, який (і) функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, в якій білок містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕБО ІЮ МО: 2, що індукує чоловічу стерильність пшениці, та (ії) містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності, наведеній в ЗЕО ІЮ МО: 2; е) ДНК, яка (ї) кодує білок, який функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, в якій білок містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 2, що індукує чоловічу стерильність пшениці, та (ії) гібридизується в жорстких умовах з ДНК, що містить нуклеотидні послідовності, наведені в 5ХЕО ІЮ МО: 1 і 6; (І) ДНК, що кодує антизмістовну РНК, комплементарну продукту транскрипції ДНК, послідовність якої наведена в ЗЕО ІЮ МО: 1 і 6; (94) ДНК, що кодує РНК з рибозимною активністю, яка специфічно розщеплює продукт транскрипції ДНК, послідовність якої наведена в 5ЕО ІЮО МО: 1 і 6; (п) ДНК, що кодує РНК, яка знижує експресію ДНК, послідовність якої наведена в ЗЕО ІЮ МО: 1 і 6, за рахунок спільного пригнічення при експресії в рослинних клітинах; () ДНК, що кодує РНК, яка має ознаку, що є домінантно-негативною для ендогенних транскриптів в клітинах рослин, що кодують ДНК за (а)-(є); або ДНК, що кодує білок, який має ознаку, що є домінантно-негативною для ендогенного білка в клітинах рослин, що кодують ДНК за (а)-(є).
2. Виділена ДНК за п. 1, яка була вибрана з групи, що складається з: а) КДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО: 1; р) ДНК, що кодує амінокислотну послідовність, наведену в ЗЕО ІЮ МО: 2; с) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО: 6; (а) ДНК, що кодує білок, який (ї) функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну 60 послідовність, наведену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, в якій білок містить амінокислотну послідовність,
наведену в 5ЕБО ІЮ МО: 2, що індукує чоловічу стерильність пшениці, та (ії) містить амінокислотну послідовність, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності зБЕО ІЮ МО: 2: (є) ДНК, яка (ї) кодує білок, який функціонально еквівалентний білку, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕБЕО ІЮ МО: 2, в якій білок містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 2, що індукує чоловічу стерильність пшениці, та (ії) гібридизується в жорстких умовах з ДНК, що містить нуклеотидні послідовності, наведені в зЕО ІЮ МО: 1 і 6.
3. Вектор, який містить виділену ДНК за п. 1.
4. Вектор за п. 3, який додатково містить ДНК згідно з будь-яким з наведених нижче (а)-(с), що має специфічну для пиляка активність промотору: а) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 5; р) ДНК, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності ФЕО ІЮ МО: 5; і с) ДНК, яка гібридизується в жорстких умовах з ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 5.
5. Рослинна клітина, трансформована ДНК за п. 1.
6. Рослинна клітина за п. 5, трансформована вектором.
7. Рослинна клітина за п. б, яка характеризується тим, що вектор додатково містить ДНК згідно з будь-яким з наведених нижче (а)-(с), яка має специфічну для пильяка активність промотору: а) ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 5; Юр) ДНК, що має щонайменше 90 95 ідентичності послідовності зЕО ІЮО МО: 5; і с) ДНК, яка гібридизується в жорстких умовах з ДНК, що містить нуклеотидну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО: 5.
8. Трансформована рослина, що містить зазначену трансформовану рослинну клітину за п. 5.
9. Насінина, тканина й орган трансформованої рослини за п. 8, які містять виділену ДНК за п. 1. І и: ж ЯК ше єв у ко «Я Я ча ах ча ж
5-2. а : у нн в ЖАКА КАНАТ. ї ! що БаЕ Е у в ОО З ; зи о ! і МКК ооо ще джем Н Е вам ен нн нн М
З ниж пстксутях стале : 3 о Дегетативні тканини 0 Квіткові Брганіе ! а ох ; . пісі ше Кк и ще ше ЖЕ Ко Фе Я Ж 59, ; ж Х ЙО ва Ж шж 'іш й хх х З ж З Я м м Я ПОООжоОт «У Ж : Ж -- В, 5 ха Ж ; же ж Кк хх КЕ в ВЗ о З Ко дх х їх 5 Кк мо КЗ 5. ї ; м А с Ве В А Я: ФК о Кох З ш Ума. 5555. Ше В М и она ПЕВ З Я ОН В НЕ : ЕНН 5 Ме Ше Актив М я Я: ТУКА В в я и В о ШЕ В с ни Я 1 же длОммОмн а а І М З В 355, шЕ : х ШЕ о Я ВУ Ше х з506 Б ; х : ВО же мо 001 ВО ї ря ї ПИВ : й з я : Ю зві Б: : В : вх : хх ї МІП : - І я : щі с. і ій Б ди і : и М МОХ оон і Е їх Седе Явет Лушщняка щи ПнаБовнк 0 бкотак : ; п іикия хатка ; : п пусюмУмевхно Ї ЕС «коЇгкокА ника схкжк Фк кккжкК о і ! фіг, ЗАВ вовіз як и ок пн їв ХМ ; о ОКУ їь Х дк фу м м ши ши 000000 понти ще В Ка КОВО ОВ аБаиНАя ВЕЕАНЕК рн піккіжя М са х СКК с скюжжхя Щі ій й РІВ -е УОСОКККККХХ ь ня М Й ОК Вих й сук мк п КХ І М ЗО ВАя М хе У е днк плаклоте чт патоло ее Ух х се З ї В Кер ооооорнсоо о о о Юна КК КК ККААЛАЛО ОК Ж жартом й ПО В оо но 0 ОЦ ПОВЕ с МБО в и в в В
! 1. і п в У НН
Б. МОМ и ПКЕЕ ЕЕЕВВ КК КК АЛАЛАЧ КВ АЖЖАЛ ОО КН ОН Ки Ви Ви и нини За ОКА КК КА АААААААЛТОЮ ЖАКА М ооо оо олово тить В Й й ЕК АКА М ТК А А АААМ АК Кии Є ЩО ження КЕЛУХ ст і : є г9 ш «й « М : п х В є км 65 УВК, чук ВО 55 5 т КА Зк ВЕ З Я Ашвн у І ПН,ХНРщО Т.О Оп :. : чук Я
НИ З ооо й « п -й «ще ше і й й ще о Бе Я . Я ЕК в ки Бе З і ї -к Я їз як є сей по т щ- й З й їх ко з п ш-к о як я дае й ; о БО о шко ЩО Н У я До т що с в - ОО зе вка КО КЗ в ї : й я п ж й ПЕ пеня Б : жу осів - шо пеня ТТ от а ше и бло те т п ше Кт і коро п а п. - - те п З п. УКХ 5 ще дово: ше Пт же | ПИ, ооо вх Ох а с о с
Я. с; В одове я пт я ож с о о. с --- її ще КО с с с с сеетнне нове ВАВ. т | о с ща с й" п т ме З Зх о її о. ОН Іой с с о й ПКОо ОК пи З: а ОВ о їх о. Со о ОО о о о. 5. ВН МО реж ее І зов ших в о. с - --кк ІЗ п. и й 7 п : й тет Н її у ї с її ! В г те де | а с с З ЕОо о Н о ек, КК І ОХ щ 1 1 З І) ї о. З ту
3. З с й о С : шля с їх ' с ох о 5 МКК і : в СУ п Ки : З. с 5, с о. о 7. ДоБеОУ ие ; З є вин я, З М но. ти Ї Б ох с І: І У її іза 0,
і . м Х с о о. 5 е и, с пе; о п с а 1 ми с щ КО о о хо КОМ с ОК ХХ о. с ї и щих с і о с о. а Н с Ох р. помексюе еосснч Е с : с щ о с ; дого г о ве ХО пеня Зк спалення Аптнто.
! с. Є ше пр, о зе й а о. М сккккнжкяЖн іх сок й К З ех що м Я и шлих Е Ох окжжіакжжих | - : н- ще дей щ зх пе З дллллтлетовевестесо КЕ: с ч ОО хх ОКХ сек В в ще роя ЗК: с ших Яке ї 7 ще хз й ши дей г Щ щ НО. : о 5 «5 у, щи Зсвовня по о. Шин : с . ВЕ М ОХ о ооо. і сення ак Ж У - о. вн че З з зе о Ох 3 " сі дея ща ет ТІ з Я н дея: ПЕ о ти ше ши : В ж п: их ВАБ,днх пеня чу і
М о. т НН . - І ше весна "ЕЕ и: ї ЕКО ел я ХО У Пе | пенні І х п г винне лелодннх що о В нм мсееюююснх ав В і ї й к Щ М ЯК ек я ща щі Кк Є жк кп АА АЛ Бооооднонтесексікнкнне щі
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510303817.0A CN104911194B (zh) | 2015-06-04 | 2015-06-04 | 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 |
| PCT/IB2016/000537 WO2016193798A1 (en) | 2015-06-04 | 2016-04-11 | Wheat male-sterility gene wms and its anther-specific expression promoter and uses thereof |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA125682C2 true UA125682C2 (uk) | 2022-05-18 |
Family
ID=54080636
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UAA201711536A UA125682C2 (uk) | 2015-06-04 | 2016-04-11 | Ген чоловічої стерильності пшениці wms і його промотор специфічної для пиляка експресії та їх застосування |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US11124797B1 (uk) |
| EP (1) | EP3303592B1 (uk) |
| JP (1) | JP6899779B2 (uk) |
| CN (2) | CN104911194B (uk) |
| AU (2) | AU2016272688B2 (uk) |
| BR (1) | BR112017025961B1 (uk) |
| CA (1) | CA2988040C (uk) |
| DK (1) | DK3303592T3 (uk) |
| EA (1) | EA201792344A1 (uk) |
| LT (1) | LT3303592T (uk) |
| MX (1) | MX2017013699A (uk) |
| UA (1) | UA125682C2 (uk) |
| WO (1) | WO2016193798A1 (uk) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9803214B2 (en) * | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Breeding pair of wheat plants comprising an MS45 promoter inverted repeat that confers male sterility and a construct that restores fertility |
| CN104911194B (zh) | 2015-06-04 | 2019-03-08 | 山东农业大学 | 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 |
| CN106800594A (zh) * | 2015-11-26 | 2017-06-06 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 小麦太谷核不育基因ms2及其应用 |
| CN106446597B (zh) * | 2016-09-06 | 2018-11-23 | 清华大学 | 多物种特征选择及鉴定未知基因的方法 |
| WO2018172181A1 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Bayer Cropscience Nv | Anther-specific promoter and uses thereof |
| CN107974450A (zh) * | 2017-12-31 | 2018-05-01 | 青岛袁策生物科技有限公司 | 一种无碱基突变长序列基因的pcr高效扩增方法 |
| WO2021102255A1 (en) * | 2019-11-21 | 2021-05-27 | Northern Agri Brands Llc | Triticale cultivar 343cms and novel sequences for male sterility |
| CN113430209B (zh) * | 2020-03-05 | 2022-09-20 | 山东农业大学 | 大麦雄性不育基因bms-1及其应用 |
| CN112779269A (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-11 | 南京农业大学 | 一个新疆稻麦子促进颖壳增长基因p1及其编码的蛋白 |
| PL439284A1 (pl) * | 2021-10-22 | 2023-04-24 | Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie | Syntetyczny regulator ekspresji genów oraz sposób wytwarzania mieszańców roślin uprawnych z jego wykorzystaniem |
| CN116312796B (zh) * | 2022-12-27 | 2023-11-14 | 江苏先声医学诊断有限公司 | 一种基于期望最大化算法的宏基因组丰度估计方法及系统 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9910796D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Biogemma Uk Ltd | Dna |
| CN1291020C (zh) * | 2004-10-13 | 2006-12-20 | 山东农业大学 | 小麦TaGI1基因及其克隆与应用 |
| CN100532554C (zh) * | 2006-09-07 | 2009-08-26 | 中国农业大学 | 一种植物花药特异性启动子及其应用 |
| JP4251375B1 (ja) * | 2008-04-30 | 2009-04-08 | 淳一 田中 | 遺伝子操作手法により作出される優性の雄性不稔性を用いる自殖性植物におけるゲノムシャッフリング法および同方法に基づく循環選抜育種システム。 |
| CN101955945A (zh) * | 2010-01-07 | 2011-01-26 | 山东农业大学 | 长穗偃麦草TeWKS1基因的克隆、改造和应用 |
| US9574237B2 (en) * | 2011-11-28 | 2017-02-21 | Anglo Netherlands Grain B.V. | Method for differentiating fertile and sterile plant lines by detection of polymorphic markers in chloroplast DNA |
| CN102533761B (zh) | 2011-12-12 | 2013-03-20 | 华中科技大学 | 一种花粉特异性启动子及其表达载体和应用 |
| WO2013138309A1 (en) * | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
| CN103725677B (zh) * | 2013-11-18 | 2016-06-08 | 北京大北农科技集团股份有限公司 | 组织特异性启动子及其用途 |
| CN103820445B (zh) * | 2014-01-15 | 2016-07-06 | 深圳市作物分子设计育种研究院 | 一个植物花药特异表达启动子的鉴定和应用 |
| CN104911194B (zh) * | 2015-06-04 | 2019-03-08 | 山东农业大学 | 小麦雄性不育基因wms及其花药特异性启动子的应用 |
| WO2018172181A1 (en) * | 2017-03-23 | 2018-09-27 | Bayer Cropscience Nv | Anther-specific promoter and uses thereof |
-
2015
- 2015-06-04 CN CN201510303817.0A patent/CN104911194B/zh active Active
- 2015-06-04 CN CN201811201937.XA patent/CN109402141B/zh active Active
-
2016
- 2016-04-11 DK DK16802639.1T patent/DK3303592T3/da active
- 2016-04-11 MX MX2017013699A patent/MX2017013699A/es active IP Right Grant
- 2016-04-11 UA UAA201711536A patent/UA125682C2/uk unknown
- 2016-04-11 US US15/579,058 patent/US11124797B1/en active Active
- 2016-04-11 WO PCT/IB2016/000537 patent/WO2016193798A1/en active Application Filing
- 2016-04-11 EA EA201792344A patent/EA201792344A1/ru unknown
- 2016-04-11 JP JP2017559791A patent/JP6899779B2/ja active Active
- 2016-04-11 LT LTEPPCT/IB2016/000537T patent/LT3303592T/lt unknown
- 2016-04-11 CA CA2988040A patent/CA2988040C/en active Active
- 2016-04-11 EP EP16802639.1A patent/EP3303592B1/en active Active
- 2016-04-11 BR BR112017025961-3A patent/BR112017025961B1/pt active IP Right Grant
- 2016-04-11 AU AU2016272688A patent/AU2016272688B2/en active Active
-
2021
- 2021-09-21 US US17/480,686 patent/US11795466B2/en active Active
-
2022
- 2022-03-09 AU AU2022201656A patent/AU2022201656B2/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2988040A1 (en) | 2016-12-08 |
| BR112017025961A2 (pt) | 2018-08-14 |
| MX2017013699A (es) | 2018-08-01 |
| JP6899779B2 (ja) | 2021-07-07 |
| US20220073938A1 (en) | 2022-03-10 |
| DK3303592T3 (da) | 2022-05-30 |
| BR112017025961B1 (pt) | 2023-12-05 |
| AU2016272688A1 (en) | 2017-10-19 |
| AU2022201656A1 (en) | 2022-03-31 |
| CA2988040C (en) | 2023-09-26 |
| CN104911194B (zh) | 2019-03-08 |
| CN104911194A (zh) | 2015-09-16 |
| LT3303592T (lt) | 2022-06-10 |
| EP3303592A1 (en) | 2018-04-11 |
| CN109402141A (zh) | 2019-03-01 |
| AU2022201656B2 (en) | 2024-05-02 |
| US11124797B1 (en) | 2021-09-21 |
| US11795466B2 (en) | 2023-10-24 |
| WO2016193798A1 (en) | 2016-12-08 |
| AU2016272688B2 (en) | 2021-12-09 |
| EA201792344A1 (ru) | 2018-08-31 |
| CN109402141B (zh) | 2021-10-01 |
| EP3303592B1 (en) | 2022-02-23 |
| EP3303592A4 (en) | 2018-10-24 |
| JP2018521630A (ja) | 2018-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA125682C2 (uk) | Ген чоловічої стерильності пшениці wms і його промотор специфічної для пиляка експресії та їх застосування | |
| AU2016355682B2 (en) | Haploid induction compositions and methods for use therefor | |
| EP3186381B1 (en) | Generation of haploid plants | |
| EP3292204B1 (en) | Polynucleotide responsible of haploid induction in maize plants and related processes | |
| Fouquet et al. | Maize rough endosperm3 encodes an RNA splicing factor required for endosperm cell differentiation and has a nonautonomous effect on embryo development | |
| Conner et al. | Apomixis: engineering the ability to harness hybrid vigor in crop plants | |
| US20200354735A1 (en) | Plants with increased seed size | |
| WO2019038417A1 (en) | METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD | |
| US20090031444A1 (en) | Homologous recombination in plants | |
| Gao et al. | Fine mapping and candidate gene analysis of a QTL associated with leaf rolling index on chromosome 4 of maize (Zea mays L.) | |
| WO2016054236A1 (en) | In situ embryo rescue and recovery of non-genetically modified hybrids from wide crosses | |
| US20150052630A1 (en) | Methods and Compositions for Obtaining Useful Plant Traits | |
| JP5190928B2 (ja) | ホスホリパーゼｄ欠失性イネ系統 | |
| US20230309481A1 (en) | Modification of plant gene expression to effect increased seed size and yield | |
| Ruiu | Functional characterization of the parthenocarpic fruit mutation in tomato (Solanum lycopersicum L.) | |
| US10364438B1 (en) | Methods and compositions for obtaining useful plant traits | |
| 物科学専攻 | Molecular genetic studies on leaf development in Oryza sativa | |
| WO2024042199A1 (en) | Use of paired genes in hybrid breeding | |
| EA041890B1 (ru) | Ген мужской стерильности пшеницы wms и его промотор специфичной для пыльника экспрессии и их применение | |
| ET | Halle (Saale), 17. Dezember 2015 | |
| Atallah | Profiling gene expression during early gametophyte development and sex determination in Ceratopteris richardii | |
| Wijeratne | Expression and functional analysis of genes involved in early anther development | |
| EA043050B1 (ru) | Способы повышения урожая зерна | |
| Sandhu | Evaluation of a mitochondrial mutator system in higher plants | |
| Sloan | RNA polymerases as genetic requirements for the establishment and maintenance of epigenetic silencing |