CN102181398B - 一种逆境诱导表达的基因启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种在植物体中调控异源核苷酸序列表达的方法和DNA载体，该DNA载体包含一个新的植物逆境诱导表达启动子的核苷酸序列，并提供了使用本文所公开的逆境诱导表达启动子序列在植物中表达异源核苷酸序列的方法。

Description

一种逆境诱导表达的基因启动子及其应用

技术领域

本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域，具体涉及一种植物逆境诱导表达启动子的分离鉴定和应用。

背景技术

  植物逆境是指对植物的正常生长发育有不利影响的环境因素。研究发现，对植物产生重要影响的逆境主要有干旱、低温、盐碱、高温等非生物逆境，以及病原体侵害等生物逆境。无论非生物逆境还是生物逆境都会造成各种农作物产量和质量的下降，因此，培育和推广抗逆品种是保证作物稳产高产的有效途径。利用植物自身的抗逆基因，通过常规育种和分子标记辅助育种方法可以培育抗逆新品种，然而，抗性基因在种属间的利用具有一定的局限性，而转基因方法可以克服上述局限，为作物抗逆育种开辟一条新的途径。

植物基因调控主要是在转录水平上进行的, 受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调。 启动子是重要的顺式作用元件, 它是位于结构基因5′端上游区域调控基因转录的一段DNA 序列, 能活化RNA 聚合酶, 使之与模板DNA 准确地结合, 确保转录精确而有效地起始, 在转录调控中起关键作用。根据其驱动基因表达的不同特点，启动子分为组成型启动子和特异性启动子。组成型启动子能在所有细胞或组织中，不分时间和空间地启动转录； 特异性启动子又可分为组织特异性启动子和诱导型启动子，其中诱导型启动子平时不启动转录或转录活性很低，但在某些特定的逆境信号的刺激下，转录活性能够显著地提高。

外源DNA序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达，启动子类型的选择决定基因的表达时间和部位。目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组成型的强启动子，比如CaMV 35S启动子和玉米Ubiquitin-1启动子（Battraw and Hall，1990; Christensen et al. 1992），然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以期改良作物的品质时，往往会由于目的基因表达的时间（发育阶段特异性）或空间（组织器官特异性）不能很好地控制而导致改良效果不明显，或者由于这些组成型启动子诱导基因表达量太高而对植物的生长发育造成影响，这些都是目前利用组成型强启动子结合功能基因来改良作物品质时遇到的障碍。

此外,在研究某些代谢过程或调节途径时，常常需要将同一途径上的两个以上的基因转化到同一个株系中去，采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个基因，或者两个基因分别转化完成后再进行杂交，都需要等待较长的时间，为了提高效率缩短多个基因转化的时间，最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化（Lin et al. 2003; Chen et al. 2006），但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子，也会由于启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。因此，克服以上转化技术上的困难，就很有必要克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子，从而可以根据需要选择不同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。

发明内容

本发明内容给出了本发明的一些实施方式，以及在多种情况中给出了这些实施方式的变动和变更。本发明内容只是很多的和不同的实施方式的示例，所提及的给定实施方式示例也是一个或多个代表性的特点。这样一个实施方式通常可以具有或不具有所提及的特点；同样，这些特点也可以被施用于本发明的其他实施方式中。为了避免过多的重复，本发明内容没有罗列或提及这些特点的所有可能的组合。

本发明提供了一种植物逆境诱导型启动子的核苷酸序列，及克隆并应用该启动子的方法。在一些实施方式中，方法包括（a）将基因核苷酸序列可操作地连接于包括序列SEQ ID No：1的启动子KT584P，以产生表达盒；和（b）生成包括该表达盒的转基因植物，由此在植物中表达所述基因核苷酸。在一些实施方式中，所述“生成”包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的转基因植物细胞中再生出转基因植物。

本发明中所述“表达盒”是指由一个或多个基因及调控其表达的元件所组成，主要含有三种组分：启动子序列、开放阅读框和终止子。表达盒通常是DNA载体用于克隆和转化的组成部分，不同的表达盒在使用正确的调控序列的前提下，可以被转入不同的物种，如细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞等。在每一个成果的转化体中，表达盒可以通过调控宿主细胞的代谢运行机制来产生相应的目的RNA和蛋白质，实现基因的过表达或表达抑制等调控结果。

本文中“启动子”一词指DNA调控序列，其中通常含有一个TATA盒，该序列能够指导RNA聚合酶II在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。启动子也可另外含有其他识别序列，它们通常位于TATA盒的上游或5’端，被称作上游启动子元件，这些元件能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后，分离并鉴定位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的其它调控元件就属于现有技术范围了。因此，本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件，如负责组织特异性和时间特异性表达的元件、调控组成型表达的元件和增强子等。

本发明所提供的植物逆境诱导表达启动子KT584P，含有序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本领域技术人员应知道，在已知一个启动子序列的功能后，通过缺失、突变或增加几个核苷酸或一段核苷酸，一般都不会影响启动子的原有功能。因此，本发明中来源于水稻的逆境诱导型启动子可为所述序列表中SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，也可为与所述核苷酸序列具有95％以上相似性且具有相同功能的DNA序列。

本发明中的启动子核苷酸序列可用于从其它生物中分离相应序列，如其它植物（单子叶或双子叶植物等）。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列同源性，使用如PCR、杂交等技术来鉴别分离这些相应序列。因此，根据它们与本发明所示启动子序列（或其片段）间的序列相似性而分离的相应片段，也包括在实施方案中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离，包括（但不限于）水稻、芸苔属、玉米、小麦、高粱、两节荠属、白芥、蓖麻子、芝麻、棉籽、亚麻子、大豆、拟南芥属、菜豆属、花生、苜蓿、燕麦、油菜籽、大麦、燕麦、黑麦（Rye）、粟、蜀黍、小黑麦、单粒小麦、斯佩尔特小麦（Spelt）、双粒小麦、亚麻、格兰马草（Gramma grass）、摩擦禾、假蜀黍、羊茅、多年生麦草、甘蔗、红莓苔子、番木瓜、香蕉、红花、油棕、香瓜、苹果、黄瓜、石斛、剑兰、菊花、百合科、棉花、桉、向日葵、芸苔、甜菜、咖啡、薯蓣、观赏植物和松类等。

    本发明的实施例中也包括DNA构建体，该DNA构建体含有操作性连接于基因编码序列或核苷酸片段上的启动子，该启动子含有本发明公开的全部序列或部分序列，并可在植物细胞中驱动上述基因编码序列或核苷酸片段进行表达。本发明的实施方案还提供了表达载体，以及在基因组中稳定包含上述DNA构建体的植物或植物细胞。“操作性连接”指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的连接方式，也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个DNA片段的编码序列都保持在适当的阅读框内。“异源核苷酸序列”指天然状态下没有与本文所述启动子序列操作性连接的序列，对于植物宿主来说可以是同源的，或是异源的。

本文所公开的逆境诱导表达启动子KT584P的启动子序列及其变异体和片段可用于植物基因工程，例如制备转化或转基因植物，以产生目的表型。“转化植物”或“转基因植物”指在基因组内含有异源核苷酸序列的植物。通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些异源核苷酸序列，可将该异源核苷酸序列稳定地遗传给下一代。这些异源核苷酸序列可单独或与重组DNA 构建体一起存在于基因组中。这里所述的“转基因事件”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物体部分或完整植物体，只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变，包括通过转基因操作而改变的起始宿主，以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得的后代。这里所用的“转基因事件”并不包括通过传统植物种植方法或天然事件（例如随机杂交、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变）改变了基因组（染色体或染色体外）的植物。

“转基因事件”通过以下步骤获得，使用外源DNA构建体（含有核酸表达盒，其中又含有目的基因）转化植物细胞，用基因组插入了外源DNA构建体的植物细胞再培养获得大量植物体，根据插入的外源基因进行筛选获得所需的阳性转基因系。转基因事件的典型表型特征是目的基因的表达。在遗传水平上，“目的基因”是植物基因组组成的一部分。“转基因事件”也指转基因植物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源DNA的后代。

本文的“植物”包括整株植物、植物组织器官（如叶、根、茎等）、种子、植物细胞，以及它们的后代。实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括转基因植物或其后代的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚，及从转基因植物或其后代长出的花、茎、果实、胚珠、叶或根等。

这里所用的“植物细胞”包括但不限于种子悬浮培养物、胚芽、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子、花粉、孢子体和小孢子。可用于本文所公开方法的植物种类包括所有可进行转化的高等植物，包括单子叶植物和双子叶植物。

本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因此，所述的异源核苷酸序列可以是操作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因（编码目的蛋白）。实施方案中的目的基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、激酶等，持家基因如热休克蛋白基因。更具体地说，转基因的种类包括如，所编码蛋白赋予植物耐受非生物逆境的抗性基因，所述非生物逆境包括干旱、温度、盐和毒素（杀虫剂和除草剂）等。或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因，如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫的侵害，以及由这些胁迫引起的疾病。表型的编码包括改变植物中某个基因的表达，从而改变植物对病原体或昆虫等的防御机制，或是提高植物对除草剂的抗性，根据环境改变植物的生长发育过程等。这些改变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获得。或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物，如酶、转运蛋白、辅因子等，通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。

由上可见，可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上，并在植物体中进行表达，优选在经受逆境诱导处理的植物中表达。

根据RNA干扰技术（RNA interference，RNAi），操作性连接于本文所公开的KT584P 逆境诱导表达启动子上的异源核苷酸序列，可以是某些靶基因的反义序列。“反义核苷酸序列”指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链RNA分子。当导入到植物细胞中后，反义DNA序列的转录能阻止靶基因DNA序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的RNA转录产物可与靶基因转录生成的内源 mRNA 互补，并可与其杂交，由此，靶基因编码的天然蛋白的合成就受到限制，从而获得相应的表型。

下面通过具体实施方式，结合附图对本发明做进一步详细描述，但不以任何方式限制本发明的范围。

附图说明

图1 是KT584基因的逆境诱导表达谱。KT584为KT584基因的扩增产物；ACTIN为水稻内参基因ACTIN的扩增产物；CK为正常生长对照；D1为干旱处理至叶片微卷时；D2为干旱处理至叶片半卷时；D3为干旱处理至叶片全卷时；S1为盐处理至叶片微卷时；S2为盐处理至叶片半卷时；S3为盐处理至叶片全卷时。

图2是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35s表示35s基因的终止子；HindIII和 BamHI分别表示限制性内切酶HindIII和 BamHI的酶切位点；诱导型启动子即为本发明所分离鉴定的逆境诱导表达启动子。

图3是KT584P转基因水稻的组织器官GUS染色。A为苗期水稻盐处理后的叶片染色；B苗期水稻盐处理后的根系染色；C为苗期水稻干旱处理后的叶片染色。

图4是KT584P启动子驱动的AtDREB1A基因转水稻株系的抗盐性分析。A：盐处理前苗生长状态；B：盐处理后苗生长状态；C：恢复正常培养7天后苗生长状态；D：盐处理存活率统计图；CK为中花11对照；L1、L2和L3分别为KT584P-AtDREB1A转基因水稻的三个株系。

图5是KT584P启动子驱动的AtDREB1A基因转水稻株系的抗旱性分析。A：旱处理前苗生长状态；B：旱处理后苗生长状态；C：恢复正常培养7天后苗生长状态；D：旱处理存活率统计图；CK为中花11对照；L1、L2、L3和L4分别为KT584P-AtDREB1A转基因水稻的三个株系。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-T1连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4 DNA连接酶购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。

1．KT584基因的逆境表达谱分析

选取两叶期的水稻中花11材料进行逆境处理。其中干旱处理的材料和样品在以下阶段收集：期1（D1）：叶轻微卷，相对含水量（RWC）在90%-95%；期2（D2）：叶半卷，相对含水量（RWC）在80%-85%；期3（D3）：叶完全卷，相对含水量在70%-75%。D1、D2和D3代表干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存于-80℃。200mM 高盐处理的材料和样品也分以上三个时期进行收集和保存。

分别提取以上各时期干旱和盐处理材料的总RNA，通过反转录得到cDNA，具体反应为：取约2μg的总RNA，加入1μl 10×DNase buffer，1μl的DNase，补DEPC处理过的水至10μl体系，混匀，37℃温育30min后，加入1μl的RQ DNase stop solution, 65℃温育10min以终止反应后，加入2μl Oligo(dT)18 primer(0.1μg/μl)， 4μl 5× First-strand buffer，1μl Ribonuclease inhibitor(40U/μl)， 2μl 4×dNTP(各10mM)，1μl MMLV Reverse Transcriptase (200U/μl)，小心混匀，37℃保温1小时。然后70℃处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到的cDNA均稀释10倍，作为RT-PCR的扩增模板。

其中，KT584基因的RT-PCR检测引物是：

引物1：5'  AAGATACCACCTGCGAAACC  3'

引物2：5'  TGCGACGGACATCCAACT  3'

KT584基因的RT-PCR扩增片段是221bp。

Actin基因的RT-PCR引物：

引物3：5’- TGTTCCTGCCATGTATGT -3’

引物4：5’- ATGTCCCTCACAATTTCC -3’

ACTIN基因的RT-PCR扩增片段是252bp。

以上引物分别以经过上述干旱和200mM盐处理后的水稻幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正常生长的中花11幼苗cDNA，检测这些基因在盐处理和干旱处理中的表达变化，PCR检测体系和程序为：10×buffer       , 2μl ;10mM dNTP     ,0.4μl ;10 M引物F，0.4μl ；10 M引物R， 0.4μl；Taq polymerase，0.4μl；cDNA，1μl；ddH₂O，15.4μl。

PCR反应条件为：预变性：95℃,5分钟；变性：94℃，30秒,，退火：55℃，30秒，延伸：72℃，2min，28个循环；72℃，10分钟。

反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图1，其中：D表示干旱处理； S表示盐处理；字母后的数字1、2和3分别指干旱处理和盐处理的三个程度。KT484指该基因的扩增产物；Actin指水稻 actin 基因的扩增产物。可见，KT484基因在水稻幼苗中呈干旱和高盐诱导性。

2．KT584P启动子的分离和鉴定

设计克隆启动子KT584P所需引物：

引物5：5'- CGaagctt CATCCATCCAAAGCGGGGCTG -3'

引物6：5'- CGggatcc CAGCTCAGCGCCCTGTGTTC -3'

引物5中序列aagctt为HindIII的酶切位点,引物6中序列ggatcc为BamHI的酶切位点。

利用启动子的正反向引物（其中带下划线部分的序列为启动子序列），以植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）提取的水稻(中花11)基因组DNA作为模板，进行扩增，反应条件是： 95℃预变性5分钟；94℃变性30秒； 55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；30个循环；72℃延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T1，筛选阳性克隆并进行测序验证，结果表明：所扩增序列为预期的KT584P启动子序列。

3．构建表达载体

将测序验证已经插入KT584P启动子序列的质粒用HindIII和 BamHI 双酶切，连入同样用HindIII和 BamHI 双酶切的载体pHPG，挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序，测序验证正确后，提取相应阳性克隆质粒，命名为pHPG-KT584P。

菌落PCR检测所需引物：

引物7：5'- TCTCCGCTCATGACGATAAT -3'

引物8：5'- GACGTAACATGGTGAAGGGG -3'

引物7和引物8为pHPG载体上引物，位于所克隆的启动子片段两侧，扩增片段约为启动子的长度，以菌液为模板，扩增检测，PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒；55℃退火30秒；72℃延伸1分钟；34个循环；72℃延伸10分钟。

所构建的表达载体的T-DNA区的图谱如图2所示，其中：LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界；hpt表示潮霉素抗性基因；Pnos表示nos基因的启动子；Tnos表示nos基因的终止子；GUS表示gus蛋白基因；T35S表示35S基因的终止子；HindIII和 BamHI分别表示内切HindIII和 BamHI的酶切位点；逆境诱导启动子即为本发明所述的启动子。

4．农杆菌共转化

利用热激法将质粒pHPG-KT584P转入农杆菌AGL0菌株，利用农杆菌介导法对水稻进行共转化，同时利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥植株。

5．启动子功能鉴定

将转基因植株进行干旱和200mM盐处理后，进行GUS活性检测，将处理过的材料置于含有GUS染色缓冲液的EP管中，放于37℃温箱温育过夜，然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。

将苗进行200mM NaCl处理后，剪取叶片和根等组织器官进行染色，结果如图3A和图3B所示，其中CK为正常处理的苗染色结果，Salt为盐处理后的染色结果。从图中可以清楚看出，经过盐处理后，叶片和根的染色程度明显加深。

将苗置于空气中进行干旱处理后，剪取叶片和根等组织器官进行染色，结果如图3C所示，干旱处理后，叶片的染色程度加深，其中CK为正常处理的苗染色结果，Drought为干旱处理的苗染色结果。

6. KT584P启动子的应用分析

6.1  pHPG-KT584P-AtDREB1A载体的构建

    为进一步确定KT584P启动子在转基因植物中的可应用性，本发明将抗逆相关基因AtDREB1A可操作性地连接到KT584P启动子后，并将其转入水稻中花11中，以验证其功能。

其中AtDREB1A基因的序列如SEQ ID No：3所示，长度为651bp，以哥伦比亚型拟南芥的cDNA为模板，通过PCR扩增获得，其扩增引物是：

引物9：5' gaattctctaga ATGAACTCATTTTCTGCTT  3'

引物10：5'  ggcgcgccTTAATAACTCCATAACGATA  3'

其中gaattc 为EcoRI的酶切位点，tctaga为XbaI的酶切位点，ggcgcgcc为AscI的酶切位点，下划线标识的序列为AtDREB1A基因的起始端和终止端部分。

将按具体实施例3所获得的载体pHPG-KT584P用XbaI加AscI双酶切，将把1.9k的GUS基因切掉的载体与进行了同样双酶切的AtDREB1A基因进行连接，获得pHPG-KT584P-AtDREB1A载体，并按常规的农杆菌介导法，将此载体转入水稻中花11株系中。

6.1 KT584P-AtDREB1A转基因水稻的耐盐性分析

收获KT584P-AtDREB1A的转基因水稻纯系种子，选取5个系进行高盐胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，同时以水稻转基因受体品种中花11作对照，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期时（第3片叶完全舒展），其生长状态如图4A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至全卷时（图4B），洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。一周后照相，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图4D（横坐标为不同的转基因株系编号，纵坐标为盐处理存活率统计）。实验结果显示，转基因水稻植株对盐的耐受能力明显高于水稻野生型植株，经盐处理后，KT584P-AtDREB1A转基因水稻T1代阳性株系的植株恢复培养后能够继续生长，野生型中花11对照（CK）植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡，结果如图4C所示。

5.2  KT584P-AtDREB1A转基因水稻的耐旱性分析

收获KT584P-AtDREB1A的转基因水稻纯系种子，选取5个系进行高盐胁迫。用水浸种培养3天使其萌发，同时以水稻转基因受体品种中花11作对照，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10株，三个重复。培养至三叶期时（第3片叶完全舒展），其生长状态如图5A，进行急性干旱处理。旱筛前将苗根部洗净，选生长状态（粗细、株高）一致的苗（图5A），用吸水纸将根部水吸干，放入干燥的新三角瓶中。每瓶详细记录干旱起始时间，筛选至对照茎秆部分九成干或以上。旱筛过程大约9个小时左右（视表型而定），然后复水，三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。干旱处理后的苗生长状态如图5B所示，复水正常培养一周后苗恢复状态如图5C所示。最后统计各株系的苗存活率，结果如图5D的柱形图所示，转KT584P-AtDREB1A基因的株系的存活率均高于对照。

序列表（SEQUENCE LISTING）

<110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司

<120> 一种逆境诱导表达的基因启动子及其应用

<160>  3    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1000

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>  1

gggtttccac gtggcatcca tccaaagcgg ggctgcaaag gaggccggtt acatccggcc     60

tgccagacgg acaatagctg ggcctccgtt tttggataga gaaagaccca tctttagagg    120

caggcaggcc gttgttttct gcttgggcta tcacggactg tacggcccaa atacatcagc    180

tcgtggatca gctggttcag cactccactg ctccatgaga ccatgactta acagcagcat    240

agcctgcgtt acttcgacat tgcccgacgt gttgactgtg ttgctaccag cctagtacca    300

tcacagggcc aggtctaacg gagacgaaag cgaggtagca agacgagcag tcgagcagat    360

cgtcgacaaa gtccggttcc gaatgaaaca tgctgccgca tgcatcgaca tttcgcatgt    420

agggagtact ccactgctac tatctttgtc ctgcagcaat ctcaaatgct tgtggttgct    480

gctccccggc taatccgcct cgtgcagtgc aacgcacggc ccataaaaat ctaggtgaag    540

tcgtctcgtc tcgtgacgaa gttgtacgag gtgacgtagc tagtagtagt agctagtggc    600

gccggccggc caaggactcc gctgatggag catcaccggc ttaattaatt acgcgtcact    660

tgccccataa acgacaccgt ccatgggtgc ccagccagct cccaccgccc aaattaaggc    720

cggtccaccc atcgttctca tgacctgcca accccatccc agccctacac gtgtccatcc    780

tcaaccacgc gtcggcacct ccaacgcact tctggaagga agccaaaacg gcagcttatt    840

aatagcgtag ccgttacctg ctttatatgg tcttctcaat taaactccac taaacctccc    900

tatggcctat gccatccacc aaacaagcaa ctgaatcgga atcgcgtatt gctttcgagc    960

tccaattcaa cagattagca gaacacaggg cgctgagctg                         1000

<210>  2

<211>  1008

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

<400>  2

atggcgaatt gtggccggag gtttgccgcc gccggcgctc cggcgacggc gagacggtgt     60

aatctggagc tgttcctcga ggccaccacg ccggttgtcc cgacgacagc ctgctcctcc    120

aagaagagca tgaatggttg gaagcaatct gatgaagaaa atgcgctgcc attcttcagt    180

ttgggcgacc tctgggatgg gttcagagag agcagcgcat atggtatcgc tgtgccaatt    240

gttctgaatg gttgcagtga cggtgtggtg cagtattacg tcccttactt atctgcaatc    300

cagctttatg gaagattaag gaggcatttc taccattcca ggccaagtgg agaagacagc    360

gacggcgact actgtcaaga cacaggcagt gaagagatga gcgaccttga gcacgactca    420

tgtccaagca gcacggatgc gttctcagtc caagatacca cctgcgaaac ctccaccagc    480

gaagcatcga gcgacgaaag cgaatcaacg agaatttccc acgagcagct catcttcgag    540

tttctggaat ccgagcctcc ctaccagcgt gaaccgctag ctgacaagat ttgtagtctt    600

gccaggggat ttccggagct gaatactctc aggagctgtg atttgtcgcc aaccagttgg    660

atgtccgtcg catggtatcc aatataccga attccgacgg gaccaacact atgcgatctg    720

gacgcctgct tcctcacata tcatcccctc tccacgcagc tcacaggcgg catctgcccg    780

gagccaaaag gcaacaacag cggcgtcccc gtgacgacgg cgatgtgcct cccgacgttc    840

gccatggcgt cgtacagact caaggtcgcg gcgtgggcac cgggcgggcg agacaggcag    900

ctggtcgcct ccctctcgca cgccgccgac gcctggctcg gcctcctcgg agttcaccac    960

ccggatcacc gcttcttcgc cgctcgccgc gtcgtgtcca gaagatga                1008

<210>  3

<211>  651

<212>  DNA

<213>  拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400>  3

atgaactcat tttctgcttt ttctgaaatg tttggctccg attacgagtc ttcggtttcc     60

tcaggcggtg attatattcc gacgcttgcg agcagctgcc ccaagaaacc ggcgggtcgt    120

aagaagtttc gtgagactcg tcacccaata tacagaggag ttcgtcggag aaactccggt    180

aagtgggttt gtgaggttag agaaccaaac aagaaaacaa ggatttggct cggaacattt    240

caaaccgctg agatggcagc tcgagctcac gacgttgccg ctttagccct tcgtggccga    300

tcagcctgtc tcaatttcgc tgactcggct tggagactcc gaatcccgga atcaacttgc    360

gctaaggaca tccaaaaggc ggcggctgaa gctgcgttgg cgtttcagga tgagatgtgt    420

gatgcgacga cggatcatgg cttcgacatg gaggagacgt tggtggaggc tatttacacg    480

gcggaacaga gcgaaaatgc gttttatatg cacgatgagg cgatgtttga gatgccgagt    540

ttgttggcta atatggcaga agggatgctt ttgccgcttc cgtccgtaca gtggaatcat    600

aatcatgaag tcgacggcga tgatgacgac gtatcgttat ggagttatta a             651

                        序列表（SEQUENCE LISTING）

 

<110>  北京未名凯拓作物设计中心有限公司

<120>  一种逆境诱导表达的基因启动子及其应用

 <160>  3    

 <170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1000

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

 

<400>  1

gggtttccac gtggcatcca tccaaagcgg ggctgcaaag gaggccggtt acatccggcc     60

tgccagacgg acaatagctg ggcctccgtt tttggataga gaaagaccca tctttagagg    120

caggcaggcc gttgttttct gcttgggcta tcacggactg tacggcccaa atacatcagc    180

 tcgtggatca gctggttcag cactccactg ctccatgaga ccatgactta acagcagcat    240

 agcctgcgtt acttcgacat tgcccgacgt gttgactgtg ttgctaccag cctagtacca    300

tcacagggcc aggtctaacg gagacgaaag cgaggtagca agacgagcag tcgagcagat    360

cgtcgacaaa gtccggttcc gaatgaaaca tgctgccgca tgcatcgaca tttcgcatgt    420

 agggagtact ccactgctac tatctttgtc ctgcagcaat ctcaaatgct tgtggttgct    480

 gctccccggc taatccgcct cgtgcagtgc aacgcacggc ccataaaaat ctaggtgaag    540

tcgtctcgtc tcgtgacgaa gttgtacgag gtgacgtagc tagtagtagt agctagtggc    600

gccggccggc caaggactcc gctgatggag catcaccggc ttaattaatt acgcgtcact    660

tgccccataa acgacaccgt ccatgggtgc ccagccagct cccaccgccc aaattaaggc    720

cggtccaccc atcgttctca tgacctgcca accccatccc agccctacac gtgtccatcc    780

tcaaccacgc gtcggcacct ccaacgcact tctggaagga agccaaaacg gcagcttatt    840

 aatagcgtag ccgttacctg ctttatatgg tcttctcaat taaactccac taaacctccc    900

 tatggcctat gccatccacc aaacaagcaa ctgaatcgga atcgcgtatt gctttcgagc    960

tccaattcaa cagattagca gaacacaggg cgctgagctg                         1000

 

 

<210>  2

<211>  1008

<212>  DNA

<213>  水稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)

 

<400>  2

atggcgaatt gtggccggag gtttgccgcc gccggcgctc cggcgacggc gagacggtgt     60

aatctggagc tgttcctcga ggccaccacg ccggttgtcc cgacgacagc ctgctcctcc    120

 aagaagagca tgaatggttg gaagcaatct gatgaagaaa atgcgctgcc attcttcagt    180

 ttgggcgacc tctgggatgg gttcagagag agcagcgcat atggtatcgc tgtgccaatt    240

 gttctgaatg gttgcagtga cggtgtggtg cagtattacg tcccttactt atctgcaatc    300

 cagctttatg gaagattaag gaggcatttc taccattcca ggccaagtgg agaagacagc    360

 gacggcgact actgtcaaga cacaggcagt gaagagatga gcgaccttga gcacgactca    420

 tgtccaagca gcacggatgc gttctcagtc caagatacca cctgcgaaac ctccaccagc    480

 gaagcatcga gcgacgaaag cgaatcaacg agaatttccc acgagcagct catcttcgag    540

 tttctggaat ccgagcctcc ctaccagcgt gaaccgctag ctgacaagat ttgtagtctt    600

 gccaggggat ttccggagct gaatactctc aggagctgtg atttgtcgcc aaccagttgg    660

 atgtccgtcg catggtatcc aatataccga attccgacgg gaccaacact atgcgatctg    720

gacgcctgct tcctcacata tcatcccctc tccacgcagc tcacaggcgg catctgcccg    780

 gagccaaaag gcaacaacag cggcgtcccc gtgacgacgg cgatgtgcct cccgacgttc    840

 gccatggcgt cgtacagact caaggtcgcg gcgtgggcac cgggcgggcg agacaggcag    900

 ctggtcgcct ccctctcgca cgccgccgac gcctggctcg gcctcctcgg agttcaccac    960

 ccggatcacc gcttcttcgc cgctcgccgc gtcgtgtcca gaagatga                1008

 

 

<210>  3

<211>  651

<212>  DNA

<213>  拟南芥（Arabidopsis thaliana）

 

<400>  3

atgaactcat tttctgcttt ttctgaaatg tttggctccg attacgagtc ttcggtttcc     60

 tcaggcggtg attatattcc gacgcttgcg agcagctgcc ccaagaaacc ggcgggtcgt    120

 aagaagtttc gtgagactcg tcacccaata tacagaggag ttcgtcggag aaactccggt    180

aagtgggttt gtgaggttag agaaccaaac aagaaaacaa ggatttggct cggaacattt    240

 

caaaccgctg agatggcagc tcgagctcac gacgttgccg ctttagccct tcgtggccga    300

tcagcctgtc tcaatttcgc tgactcggct tggagactcc gaatcccgga atcaacttgc    360

gctaaggaca tccaaaaggc ggcggctgaa gctgcgttgg cgtttcagga tgagatgtgt    420

gatgcgacga cggatcatgg cttcgacatg gaggagacgt tggtggaggc tatttacacg    480

 gcggaacaga gcgaaaatgc gttttatatg cacgatgagg cgatgtttga gatgccgagt    540

 ttgttggcta atatggcaga agggatgctt ttgccgcttc cgtccgtaca gtggaatcat    600

 aatcatgaag tcgacggcga tgatgacgac gtatcgttat ggagttatta a             651

 

 

Claims (6)

1.一种在植物中表达异源核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入特定表达盒，所述特定表达盒含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2. 权利要求1所述的方法，其中所述的植物为单子叶植物。

3. 权利要求2所述的方法，其中所述的单子叶植物为水稻。

4.一种启动子核酸分子，其特征是其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5. 一种表达盒，其特征是含有权利要求4所述的启动子。

6.一种植物表达载体，其特征在于，含有权利要求5所述的表达盒。

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