CN101182530B - 一种诱导增强性组成型启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物诱导增强性超强组成型启动子及其应用。该启动子具有下述核苷酸序列：序列表中序列4或6所述的核苷酸序列，以及与所述核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的核苷酸序列。本发明的启动子能够在植物细胞中驱动基因恒定的表达，同时具有响应化学诱导剂的能力，在诱导剂诱导下其能够驱动基因超强表达，在没有诱导剂的条件下，其驱动能力大约为CaMV 35s启动子的2倍；在化学诱导剂诱导后，其驱动能力为CaMV35s启动子的5倍左右。

Description

一种诱导增强性组成型启动子及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种植物诱导增强性组成型启动子及其应用。

背景技术

启动子一般位于功能基因的5′侧翼区域，能够与RNA聚合酶(RNApolymerase)以及其他蛋白辅助因子等反式元件相结合，从而控制基因转录的起始和速度。启动子是基因表达调控因子中最重要的因子，它基本决定一个基因是否表达、何时表达和何处表达。按作用方式和功能，启动子大体可以分为特异性启动子、诱导型启动子和组成型启动子三大类[王关林，方宏筠，2002，植物基因工程原理与技术(第二版)，北京，科学技术出版社]。

器官或组织特异性启动子(organ-and/or tissue-specific promoter)调控下的基因一般只发生在某些特定的器官或组织部位，或者往往只发生在植物生长发育的某一或某些特定阶段，受其控制或调节的基因表达具有明显的时空性，并往往表现出发育调节的特性。例如，根特异性启动子(Yamamoto YT等，1991，Plant Cell，3：371-382)、叶片特异性启动子[Taylor，WC，2001，Plant Mol Biol，46(3)：325-333]、果实特异性启动子(Pear JR等，1989，Plant Mol Biol，13：639-651)、花特异性启动子(Van tunen等，1988，EMBOJ.，7：1257)、花粉特异性启动子(Beom SP等，2002，Mol.cells，14：150-157)、韧皮部特异性启动子(Tian YC等，2004，Transgenic Research，13：559-566)等等。

诱导型启动子(inducible promoter)控制的基因在某些特定的物理、化学和生物信号(统称为“诱导子”或“诱导因子”)的刺激下，可以大幅度地增加转录水平。该类型启动子控制的基因在没有诱导因子存在的条件下不表达或者只有非常低的表达(也称为“本底表达”)，但一旦受到诱导因子的诱导，基因的表达量迅速并且大幅度增加。诱导型启动子常常根据其诱导信号来分类和命名，例如：激素诱导启动子[Xu D等，1993，Plant Mol Biol，22(4)：573-588；Taylor JE等，1995，Plant J，7(1)：129-134]、化学诱导启动子(Williams S等，1992，Biol/Technol，10：540-543；综述见：Padidam M，2003，Curr Opinion inPlant Biol，6 169-177)、光诱导启动子[Sheen JY等，1987，Plant Mol Biol，8(3)：227-238；Matsuoka M等，1994，Plant J，6(3)：311-319]、热诱导启动子[SchofflF等，1989，Mol Gen Genet，217(2-3)：246-53]、创伤诱导启动子[Farmer EE等，1992，Plant Cell，4：129-134；Carrera E等，1998，Plant J，15(6)：765-771]、真菌诱导启动子[Fukuda Y等，1994，Plant Mol Biol，24(3)：485-493]和共生细菌诱导启动子(Miao GH等，1993，Plant Cell，5：781-786)等。

组成型启动子(constitutive promoter)是指在所有组织中都能启动基因的表达、具有持续性、不表现时空特异性的启动子。在该类型启动子控制下，结构基因的表达大体恒定在一定水平上，在不同器官和/或组织的表达水平也没有明显差异，不受外界因素的诱导。目前研究和应用最普遍的有水稻肌动蛋白基因1(actin 1)启动子[Wang等，Molecular and Cellular Biology，12(8)：3399-3406(1992)]、玉米泛素蛋白基因(ubiquitin)的启动子(美国专利5641876)和花椰菜菜叶病毒启动子(CaMV 35S)[Odell等，Nature，313：810-812(1985)]。Actin 1启动子(Actl)和ubiquitin启动子(Ubi)在单子叶植物中具有很强的驱动基因表达的能力，但在双子叶植物中，它们或者驱动能力很弱(例如，Ubi在转基因烟草中则不到35S启动子的1/10(Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.，18：675-689))，或者几乎没有驱动力(例如，Act1在双子叶植物烟草悬浮细胞中则不表达(Schledzewsk等，1994，Transgenic Research，3：249-255))。CaMV 35S启动子则在双子叶植物中具有很强的驱动基因表达的能力，在单子叶植物中其驱动能力相对较弱，也远远低于Ubi启动子(例如，在转基因玉米中，CaMV 35S启动子的活性是Ubi启动子的1/10左右(Christensen等，1992，Plant Mol.Biol.，18：675-689))。CaMV 35S启动子因来源于植物病原体，往往会引起人们对转基因植物生物安全性和环境安全性的争议，在转基因的商品化生产中受到限制。另外一方面，其植物病毒的来源也限制了其驱动抗病基因等的应用。

目前，在世界范围内，人们在鉴定、分离和利用“天然”或“自然”启动子(Natural promoter，native promoter)-自然生物体基因的启动子的同时，也积极地展开了“重组启动子”-嵌合启动子的研发以弥补天然启动子的不足和满足人们的需要。并且，随着分子生物学研究的深入，特别是对天然启动子中关键或者基本功能元件(即所谓的“box”或“motif”-“盒”或“基元”)的解析，越来越多的嵌合启动子被用于基因工程。例如，为了增强CaMV 35S启动子的活性，人们利用双CaMV 35S作为嵌合启动子(Kay等，1987，Science，4806：1299-1302)，或者在启动子的一定部位插入“增强子”(enhancer)组成嵌合启动子(Wang等，2004，J plant physiol.and mol.Biol.，30：87-93)。除了上述增强表达的嵌合启动子之外，人们在组成型启动子的特定部位插入组织特异性启动子关键元件，将组成型启动子转换成组织特异性启动子，获得天然组织特异性启动子的强驱动能力更强的组织特异性嵌合启动子。例如，Van deMeer等在组成型启动子CaMV 35S的特定部位插入一个“花药盒”(控制基因在花药中表达的核心DNA片段)后形成的嵌合启动子，即具有CaMV 35S的强驱动能力，又具有很高的花药特异性(Van de Meer等，1990，The PlantCell，4：253-262)。MeTT等(MeTT等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：4567-4571)，林忠平等(Lin等，2003，Acta Botanica Sinica，45：1307-1311)在组成型启动子CaMV 35S基本启动区前加上MRE(Metal Response Element，金属离子相应元件)片段后形成的嵌合启动子，即具有CaMV 35S的强驱动能力，又具有金属离子诱导性，使组成型启动子变成金属离子诱导性启动子。Grimmig等将β-1，3-葡聚糖酶启动子的ERE(乙烯响应元件，EthyleneResponsive Element，该序列含有两个完整的GCC box-相关于臭氧的诱导)加在组成型启动子CaMV 35S基本启动区前构成了嵌合启动子，该嵌合启动子高效响应臭氧的诱导(Grimmig等，2003，Plant Mol.Biol.，51：599-607)。Roger等在组成型启动子CaMV 35S基本启动区前加上Box II序列(水稻东格鲁杆状病毒启动子的一个顺式元件，维管组织中特异表达的转录因子RF2a和RF2b的结合序列)片段后形成的嵌合启动子，共转化含RF2a和RF2b的烟草原生质体和拟南芥，启动子的活性比非共转化(不含RF2a和RF2b转录因子)大大提高(Roger等，2006，J.Gen.Virol.，87：715-722)。Lee等在病毒SV40的启动子前插入EBS(Binding sites of Egr-1，早期生长基因Egr-1中的早期生长因子结合位点)、MRE(Metal Response Element，金属离子响应元件)和3拷贝的HRE(Hypoxia-response Element，缺氧响应元件)组成嵌合启动子，使该启动子的可诱导性有很大的提高，用于基因治疗(Lee等，2006，Gene Therapy，13：857-868)。

在化学诱导型启动子中，病程相关蛋白基因(PR)的启动子是研究较为深入的启动子之一，它响应一些化学剂如Salicylic acid(SA)、Benzothiadiazole(BTH)和烟草花叶病毒(TMV)的诱导而呈现出驱动基因表达的能力。它的诱导表达必需区域(Uknes等，1993，Plant Cell，5：159-169)和主要调控元件(Van de Rhee等，1993，Plant Mol.Biol.，21：451-461)和增强元件及其转录因子(Strompen等，1998，Plant Mol.Biol.，37：871-883)都比较清楚。此外，Gruner等报道，用来自CaMV 35S启动子中的增强元件取代烟草PR启动子中增强元件，PR启动子仍然可以响应于SA和TMV的诱导而驱动报告基因的表达，而且驱动能力明显提高(Gruner等，2003，Eur.J.Biochem.，270：4876-4886)。

然而，在PR启动子中插入增强元件或者插入多少增强元件后PR启动子是否仍然可以响应于SA和TMV的诱导而驱动报告基因的表达等方面还未见报道和专利。

发明内容

本发明以从烟草克隆的“天然”化学诱导型启动子PR-N为基础，在其中插入串联的增强元件，构建成“重组启动子”或“人工启动子”。所构建的重组启动子不仅保持了“母体”启动子(PR-N)对化学诱导剂的响应性，而且响应效果明显提高，还显著地提高了“本底”驱动能力一组成型驱动基因表达的能力。这样，本发明提供的重组启动子在本质上结合了其“母体”启动子对化学诱导剂的响应性和插入的“增强元件”的表达增强性，成为诱导增强性组成型超强启动子。

本发明的一个目的是提供一种植物诱导加强的组成型启动子。

本发明的另一个目的是提供一种植物诱导加强的组成型启动子的应用。

本发明所提供的植物诱导加强的组成型启动子，它的核苷酸序列是：

(1)序列表中序列4或6所述的核苷酸序列；或

(2)(1)所述的核苷酸序列在严谨杂交条件下能够杂交的并与(1)所述核苷酸序列具有同等功能的核苷酸序列。

(3)与(1)具有60％或60％以上同源性的核苷酸序列。

上述严谨杂交条件为本领域技术人员公知的杂交条件，可为在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃杂交并洗膜2次，每次5min；或者在0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃杂交并洗膜2次，每次15min。

序列表中序列4由1081个脱氧核苷酸组成，自5′端的第1019-1024位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)的保守序列，自5′端的第1053位脱氧核苷酸为转录起始位点，自5′端的第327位至479位脱氧核苷酸为插入人工增强元件序列(序列表中序列3)；序列表中序列6由1132个脱氧核苷酸组成，自5′端的第1070-1121位脱氧核苷酸为TATA盒(TATA box)的保守序列，自5′端的第1104位脱氧核苷酸为转录起始位点，自5′端的第327位至530位脱氧核苷酸为插入人工增强元件序列(序列表中序列7)。

本发明还提供了含有上述诱导加强的组成型启动子的表达盒和重组表达载体。

在所述表达盒中，所述诱导加强的组成型启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，用于驱动结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因、天然小RNA或人工合成的小RNA的表达。

所述重组表达载体是含有上述表达盒与质粒、病毒或其它运载体表达载体所构建的重组载体；所述重组表达载体为重组植物表达载体；所述重组植物表达载体包含上述表达盒并且能够将所述的表达盒转送进入植物宿主细胞、组织、器官或其后代，并且能够或者至少方便所述的表达盒整合到宿主的基因组中，它包括但不限于双元载体、共合载体。

上述重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物细胞、组织或器官，来得到转化体，该转化体可以为转基因植物细胞、组织或器官，或由此分化、再生的完整植株及其无性系或其后代。

本发明还提供了一种上述诱导加强的组成型启动子的获得方法，即以烟草的基因组DNA为模板，用核苷酸序列为序列表中序列2和序列3的一对引物进行PCR扩增得到原始启动子，然后插入增强元件。

本发明中所述的启动子核苷酸序列可以是其中一个或多个核苷酸发生取代、缺失、插入或倒位的核苷酸序列，即所分离的核苷酸序列的人工突变体或“天然”突变体，它保留其启动子功能；还可以是所述的核苷酸序列与其它启动子序列或启动子区保守调控序列(“motif”或“box”)的融合序列。本发明中所述的“启动子”包括具有或不具有TATA盒(TATA box)的启动子。TATA盒或类似区域，它定位于转录起始位点(+1)上游并且具有指导RNA聚合酶在正确位置上启动转录的功能，但不限于该区域附近的部分；此外，它还含有与除RNA聚合酶以外的蛋白质相关联的用于调节表达的另一个必须区域。本发明中所述的“启动子区域”定义为含有上文中定义的启动子的区域。本发明中所述的“启动子活性”是指当以某种基因的可表达方式将其连接到启动子的下游并导入到宿主中，该宿主显示具有在宿主内或宿主外生产该基因产物的能力和功能时，该启动子具有启动活性。通常，是将编码容易定性或定量检测的蛋白质的基因(报告基因)连接到该启动子的下游，将该基因导入宿主内，并检测所表达的蛋白质，可确定特定启动子的活性或是否存在该启动子或者该启动子的效力。本发明中所述的结构基因是指能够编码某种蛋白质或其它活性物质功能的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的调节基因是指其编码的某种RNA或蛋白质或其它活性物质能够对其它结构基因的表达进行调节或调控的一段核苷酸序列，包括RNA或DNA序列。所述的正义基因包括上述的结构基因和调节基因。所述的反义基因是指与上述结构基因或调节基因编码的RNA互补的RNA或DNA序列。所述的内源基因是指来自宿主自身的基因，包括RNA或DNA序列。所述外源基因是指任何一段核酸序列，并具有编码某种蛋白质或其它活性物质功能，包括天然的和人工合成的RNA或DNA序列。所述的小RNA是指分离自生物体的或人工合成的RNA序列片段，其长度通常为20-26个核苷酸或者在导入宿舍细胞后能够被剪切成20-26个核苷酸的RNA片段，它本身对生物体无毒或毒性极低。

本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何一种植物载体，例如pBin19、pBI121(美国ClonTech公司产品)和pCAMBIA系列(澳大利亚CAMBIA中心产品)等。

本发明中所述的转化是指现有技术中已知的、能够将外源基因导入植物细胞或植物组织的任何一种植物转化方法，如农杆菌介导法和基因枪等。

本发明中所述的宿主细胞或宿主组织或宿主器官及其后代细胞是指所有植物细胞或植物组织或植物器官或由这些细胞、组织或器官通过组织分化或无性胚再生并且发育成熟的整体植株(包括种子)。

术语“核酸序列”或“核苷酸序列”指含有天然存在的核苷酸或核苷单体的序列。该序列也包括具有相似功能的非天然存在的单体或其部分的修饰的或取代的序列。

术语“具有60％或60％以上同源性的序列”是指与(1)中的序列相比有60％或60％以上的核苷酸序列相同或相似的那些核酸序列或核苷酸序列，这些序列以基本相同的方式发挥作用并且能够驱动其下游基因的响应于化学诱导剂高效表达，它们与(1)中序列的差异可能是由于局部结构上的修饰或突变，包括人工突变和非人工突变。

实验证明，本发明诱导加强的组成型启动子Enh6和Enh8能启动报告基因GUS在转基因烟草中组成型表达，而且能够响应于诱导剂SA启动报告基因GUS在转基因烟草中超强表达，其中组成型启动子Enh8的启动能力在没有诱导剂存在的条件下是组成型启动子CaMV 35S的近2倍，在有诱导剂存在的条件下是CaMV 35S的近5倍。因此，本发明所提供的来源于烟草(Nicotiana tabacum)的插入增强元件的启动子Enh6和Enh8是具有超强的驱动能力的诱导加强的组成型启动子，特别是Enh8。

本发明的植物诱导加强的组成型启动子可在不同植物或作物中诱导表达，所述的植物或作物是指显花植物。根据不同的植物分类方法，所述的植物或作物可包括但不限于被子植物和裸子植物；单子叶植物和双子叶植物；草本植物、藤本植物和木本植物；一年生植物和多年生植物；水生和陆生植物以及有性和无性繁殖植物。其中按照水生和陆生植物的分类，所述植物或作物优选为陆生植物。

本发明的植物诱导增强性组成型启动子，不仅能够驱动其控制下的基因恒定稳定高强度地表达(是强组成型启动子CaMV 35S的近2倍)，而且还具有响应诱导剂的能力，在诱导剂诱导下它能够驱动其控制下的基因超强表达(是CaMv 35S的近5倍)。本发明的诱导加强性组成型启动子可以用于驱动外源基因在植物中稳定高效地表达和在诱导条件下超强表达，不但适用于对基因功能的分析等分子生物学理论研究，同时适用于利用基因工程技术进行植物品种改良，还适用于植物生物反应器，特别适用于高效抗虫、抗病、抗除草剂抗逆植物新品种的培育和高效植物生物反应器。此外，与本发明的诱导加强性组成型启动子相配套的化学诱导剂在适当的调控浓度内对植物及其细胞没有毒性，而且诱导效应的持续时间长。因此，本发明的植物诱导增强性组成型启动子具有重要的应用价值。

本发明提供的诱导增强性组成型超强启动子证明，在PR启动子中直接插入增强元件后，PR启动子仍然可以响应于SA等的诱导而驱动报告基因的表达，而且驱动能力明显提高。在插入6-8个增强元件后，PR启动子不仅仍然可以响应于SA等的诱导而驱动报告基因的表达，而且驱动能力显著提高，并展现出很高的组成型驱动能力。

诱导增强性组成型超强启动子在基因功能解析等理论研究和利用基因工程培育植物新品种和植物生物反应器等应用方面都具有重要的价值。例如，在基因功能研究方面，某些基因的强表达可能是致死的。如果利用现有的组成型启动子驱动该基因，则含有该基因的细胞和/或个体因为组成型表达了该基因而致死，研究者无法得到生活的转基因细胞和/或个体。如果利用现有的诱导性启动子驱动该基因，不施用诱导剂时，该基因不表达，研究者无法了解该基因的功能；如果施用了诱导剂，则含有该基因的细胞和/或个体因为表达了该基因而致死。如果利用本发明的诱导增强性组成型超强启动子来驱动该基因，不施用诱导剂时，该基因有比较弱的表达，虽然可能对含有该基因的细胞和/或个体的生长有不利的影响，但不致死，因此研究者可以解析该基因的功能；如果研究者希望得知该基因高效表达后的作用，只需要施用诱导剂就可以了。又例如，在培育抗病、抗虫、抗除草剂或抗逆植物新品种方面，利用本发明提供的诱导增强性组成型超强启动子驱动抗病、抗虫、抗除草剂或抗逆基因，转基因植物平时能够稳定表达一定量的抗病、抗虫、抗除草剂或抗逆蛋白，从而在保持一定的抗性的同时又不浪费植物自身的能量和物质消耗；在遇到比较严重的病、虫、害草或者逆境时，人们可以通过施用诱导剂来诱导抗性基因的超强表达，使植物在必要的时间段或者阶段内呈现出非常高的抗性，从而免除或者减少病、虫、害草或者逆境对植物体造成的危害。再例如，在利用植物细胞作为反应器生产蛋白、抗体或者其它次生代谢物(如，色素、香精油等)时，利用本发明提供的诱导增强性组成型超强启动子驱动相应的基因，在细胞生长和繁殖的阶段，不施用诱导剂以利于细胞集中“精力”生长和繁殖但维持该基因表达较低的恒定表达以维持表达通道的畅通；但细胞的群体达到一定的数量后，施用诱导剂，使细胞高强度地表达目标基因，集中精力高效地生产蛋白、抗体或者其它次生代谢物。

由此可见，本发明所提供的诱导增强性组成型超强启动子在理论研究和生产实践中都具有重要的应用价值。

附图说明

图1为化学诱导性启动子PR-N克隆的酶切鉴定图；

图2为诱导加强的组成型启动子Enh6的DNA序列。图中，下划线者为引物序列，斜体者为外加的限制性内切酶所识位点，5′端为Hind III位点，3′端为Bgl II位点，黑体部分为插入的增强元件；

图3为诱导加强的组成型启动子Enh8的DNA序列。图中，下划线者为引物序列，斜体者为外加的限制性内切酶所识位点，5′端为Hind III位点，3′端为Bgl II位点，黑体部分为插入的增强元件；

图4为诱导加强的组成型启动子Enh6和Enh8驱动GUS基因(即Enh6或Enh8::GUS融合基因)的植物表达载体pRDEnh6G和pRDEnh8G)的构建流程图；

图5为诱导加强的组成型启动子Enh6驱动GUS基因(即Enh6::GUS融合基因)的植物表达载体pRDEnh6G的酶切鉴定图；

图6为诱导加强的组成型启动子Enh8驱动GUS基因(即Enh8::GUS融合基因)的植物表达载体pRDEnh8G的酶切鉴定图；

图7为转pRDEnh6G烟草植株的PCR鉴定图；

图8为转pRDEnh8G烟草植株的PCR鉴定图；

图9为转pRDEnh6G烟草叶盘与未转基因对照叶盘经蒸馏水(H₂O)和诱导剂处理72小时后的GUS染色照片；

图10为转pRDEnh8G烟草叶盘与未转基因对照叶盘经蒸馏水(H₂O)和诱导剂处理72小时后的GUS染色照片；

图11为转pRDEnh6G、pRDEnh8G、pRDPR-N和p35SGUS烟草叶盘，未转基因对照烟草叶盘经蒸馏水(H₂O)和诱导剂处理72小时后的GUS活性荧光定量检测的柱形图。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1诱导加强的组成型启动子Enh6和Enh8的构建

1、烟草(Nicotiana tabacum)总DNA的提取

取温室盆栽的烟草嫩叶片1-2g，用CTAB法(《分子克隆》第三版)提取总DNA。取1-5μl DNA样品，用紫外分光光度计测量其浓度和纯度，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度和完整性。将提取的DNA于-20℃保存。

2、PCR扩增与扩增片段的回收

根据序列(GenBank登录号：AB086949)设计并合成如下两条引物(引物1和引物2；序列表中序列2和序列3)扩增启动子PR-N的序列，为了方便以后的克隆和构建，在两条引物的5′端分别加入了限制性内切酶Hind III和Bgl II的识别序列位点(下列引物序列中的下划线序列)

引物1：5′AAGCTTCGAGGATTTCAAACTCTAGC-3′(Hind III)

引物2：5′AGATCTGACTATAGGAGAAATGTTG-3′(Bgl II)

以步骤1提取的烟草基因组DNA为模板，进行PCR反应：

反应体系为：

模板DNA：                     800ng；

10 X Exbuffer：               2μl；

dNTP混合物(2.5mM)：           2μl；

ExTaq DNA Polymerase(5U/μl)：0.5μl；

引物1(10μM)：                1μl；

引物2(10μM)：                1μl；

无菌重蒸馏水(sddH₂O)：        补足至20μl。

PCR反应程序：先预变性94℃ 5min；再94℃30sec，58℃30sec，72℃90sec，30个循环；最后72℃ 10min。

PCR反应完成后，取15μl扩增产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下快速用一次性刀片切下位于950 bp左右的特异片段，用DNA片段回收试剂盒回收并纯化(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，溶于30μl ddH₂O中，-20℃保存备用。

3、回收片段的亚克隆与测序

将步骤2回收的片段连接到质粒载体pBS-T(北京天根生化生物技术有限公司)，将所得到的重组质粒通过“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的白色菌落，接入含氨苄青霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀为0.6时，离心收集菌体，按小量碱裂解法(《分子克隆》第三版)提取质粒，用限制性酶Hind III和Bgl II双酶切后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，正确的重组载体应在紫外灯下可见分子大小大约分别为3000bp(载体带)和约950bp(目标带)的两条带(图1，图中，泳道1为双切λDNA大小分子标准-λDNA/HindIII+EcoR I；泳道2为插入上述PCR扩增片段的克隆载体的Hind III+BglII酶切图)。将通过上述酶切鉴定含有约950bp插入片段的质粒或含有该质粒的DH5α送交商业测序公司测序(Invitrogen(中国)公司)，将经测序表明正确的重组载体命名为pBSPR-N，其中PCR扩增片段命名为PR-N，序列见序列表中序列1。

4、诱导增强性组成型启动子的构建及其表达载体的构建

将步骤3中克隆到的含有启动子PR-N插入片段的重组载体pBSPR-N用限制性内切酶Nco I消化，热失活酶切体系后，用碱性去磷酸化酶CIAP(上海生工生物技术有限公司)去磷酸化，用DNA片段回收试剂盒回收载体片段(Easy-NA Gel Extraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)，将pB SPR-N/Nco I分别与人工合成的增强元件1(见序列表序列4)和增强元件2(见序列表序列6)连接。同步骤3，将其转化，酶切和测序证明得到正确插入增强元件的PR-N启动子，序列如图2和图3所示，将含有插入增强元件1或2的PR-N启动子的重组载体分别命名为pBSEnh6和pBSEnh8，相应的诱导增强性组成型启动子命名为Enh6和Enh8。图2和图3中，下划线者为所用的引物序列(上述引物1和引物2)，斜体为外加的限制性内切酶识别位点(Hind III和Bgl II)，黑体部分为插入增强元件。

实施例2诱导加强的组成型启动子驱动报告基因GUS(Enh6::GUS和Enh8::GUS)植物表达载体pRDEnh6G和pRDEnh8G的构建

诱导加强的组成型启动子驱动GUS融合基因(Enh6::GUS和Enh8::GUS)植物表达载体pRDEnh6G和pRDEnh8G的构建流程如图4所示，具体方法如下：

将pBSEnh6G和pBSEnh8G分别经限制性内切酶Hind III和Bgl II消化后，用冻融法(《分子克隆》第三版)或DNA片段回收试剂盒(Easy-NA GelExtraction Kit，德国Omeg-Bio/TEK产品)回收并纯化诱导加强的组成型启动子Enh6和Enh8片段(大约1200bp)，分别与经过Hind III和BamH I双酶切的植物表达载体pRD410(加拿大PBI产品)的大片段(大约为13.6kb)相连，得到重组质粒。将所得到重组质粒用“冻融法”(《分子克隆》第三版)转化到大肠杆菌菌株DH5α。转化的DH5α在含卡那霉素50mg/L的LB固体培养基上于37℃过夜培养，挑取平板上生长的单菌落，接入含卡那霉素50mg/L的LB液体培养基中于37℃振荡过夜培养。当菌液浓度达到OD₆₀₀值0.5-0.6时，离心收集菌体，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶Hind III和Sac I双酶切后(将含1.8kb的GUS一起切下)，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小分别约为12kb(pRD410载体带)和大约3kb(Enh6或Enh8+GUS)的两条带，并且进行了测序验证。将酶切和测序表明含有诱导加强的组成型启动子Enh6或Enh8片段和pRD410酶切大片段的重组表达载体相应命名为pRDEnh6G和pRDEnh8G。pRDEnh6G和pRDEnh8G中GUS基因需要诱导加强性组成型启动子驱动表达。

在该步骤中同时构建作为对照的未插入增强元件的化学诱导性启动子PR-N驱动GUS基因(PR-N::GUS)植物表达载体pRDPR-NG。实施例3转Enh6::GUS、Enh8::GUS融合基因烟草的获得和鉴定

1、农杆菌的转化与转化子的鉴定

用CaCl₂法(《分子克隆》第三版)制备根癌农杆菌菌株LBA4404(美国Life Technology公司产品)的感受态细胞。利用冻融法(《分子克隆》第三版)将含有Enh6::GUS和Enh8::GUS融合基因的植物表达载体pRDEnh6G和pRDEnh8G分别转入制备的LBA4404的感受态细胞。将转化的LBA4404细胞接种到含有链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB固体培养基，置于28℃在暗处培养48-72h，挑取平板上的单菌落，接入含有链霉素100mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB液体培养基，在28℃振荡过夜培养。当培养物的浓度达到OD₆₀₀值0.4-0.6时，取少量菌液(1.5-2ml)，按上述小量碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶HindIII和Sac I双酶切鉴定，在1.0％琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可见分子大小大约分别为12kb(载体带)和大约3 kb(Enh6或Enh8+GUS)两条带(图5和图6)。图5中，泳道1为双切λDNA大小分子标准-λDNA/HindIII+EcoR I，泳道2为转化大肠杆菌菌株DH5α的pRDEnh6G的Hind III+Sac I双酶切图谱，泳道3为转化农杆菌LBA4404的pRDEnh6G的Hind III+Sac I双酶切图谱。图6中，泳道1为双切λDNA大小分子标准-λDNA/Hind III+EcoR I，泳道2为转化大肠杆菌菌株DH5α的pRDEnh8G的Hind III+Sac I双酶切图谱，泳道3为转化农杆菌LBA4404的pRDEnh8G的HindIII+Sac I双酶切图谱。并测序鉴定。结果表明，植物表达载体pRDEnh6G和pRDEnh8G已经成功地转入农杆菌LBA4404。将酶切和测序鉴定表明含有植物表达载体pRDEnh6G或pRDEnh8G的农杆菌LBA4404克隆相应命名为pRDEnh6G/LBA4404和pRDEnh8G/LBA4404。

同时将对照植物表达载体pRDPR-NG，转入农杆菌LBA4404，将酶切和测序鉴定表明含有植物表达载体pRDPR-NG的农杆菌LBA4404克隆命名为pRDPR-NG/LBA4404。

2、转Enh6::GUS或Enh8::GUS融合基因烟草的获得

1)农杆菌的准备

挑取携带植物表达载体pRDEnh6G或pRDEnh8G的农杆菌LBA4404(pRDEnh6G/LBA4404、pRDEnh8G/LBA4404)单菌落，接种于5ml含链霉素(Str)100mg/L和卡那霉素(Kan)50mg/L的YEB液体培养基中，28℃振荡培养过夜(大约12h)以活化。取活化的农杆菌液，按1∶100的比例加入到含Str 100mg/L和Kan 50mg/L的YEB液体培养基中，继续培养至OD₆₀₀值为0.4-0.6；5000rpm离心5min，收集菌体；用1/2 MS0液体培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+蔗糖30g/L，pH 5.80)洗涤菌体一次，并将其稀释到离心前菌液3倍体积的1/2 MS液体培养基中，准备侵染用。

2)烟草的转化与转化植株的再生

烟草的转化根据叶盘法(Horsch RB等，1985，Science，227：1229-1231)进行。选取约30天苗龄的烟草(品种“NC89”，种子购自中国农业科学院)无菌苗，切下鲜嫩浓绿的叶片，用直径9mm的打孔器制取叶盘外植体；将新制备的外植体投入已准备好的农杆菌(LBA4404/pRDEnh6G或LBA4404/pRDEnh8G))菌液中，侵染15min；取出叶盘，用高压灭菌的吸水纸吸除叶盘表面残余的农杆菌菌液，置于固体再生培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.8)上暗处共培养2天；然后将共培养的叶盘转到含有羧苄青霉素(Carb)500mg/L和Kan 50mg/L的固体再生培养基在光下(1500-2500 Lx，光16h暗8h)进行筛选培养，每隔2-3周更换一次培养基，并逐渐降低Carb至200mg/L。待Kan抗性芽长到1-1.5cm时，将其切下换到含有Carb 200mg/L和Kan 50mg/L的固体生根培养基(MS无机盐+B5维生素+肌醇0.1g/L+IAA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉0.7％，pH 5.80)上诱导生根。所获得50株完整的卡那霉素抗性的转pRDEnh6G或pRDEnh8G烟草植株用于分子鉴定。

同时将携带对照植物表达载体pRDPR-NG的农杆菌LBA4404，转化烟草。

3)转pRDEnh6G与pRDEnh8G烟草的分子鉴定

对步骤2)得到的Kan抗性转pRDEnh6G与pRDEnh8G的烟草植株进行PCR鉴定。根据上述的CTAB法提取转基因烟草Kan抗性株和未转基因烟草对照株的叶片基因组DNA，用根据人工增强元件两侧设计的特异性引物对(引物1：5′-GAA TCT AAA GTC AAG TCG TG-3′；引物2：5′-TAT AATAAT ACC AAA CAC AG-3′)进行PCR扩增，转pRDEnh6G与pRDEnh8G烟草分别扩增得到大小约为450与500bp的目标带，而未转化的对照烟草在相应位置则没有扩增出此目标片段(图7和图8)。在图7和图8中，泳道1为DNA大小分子标准(marker)；泳道2为载体质粒对照(阳性对照)；泳道3-10为转pRDEnh6G(图7)或pRDEnh8G(图8)烟草Kan抗性植株；泳道11为未转基因植株对照(阴性对照)。这一结果表明目标基因(Enh6::GUS或Enh8::GUS)已整合到烟草基因组中。

实施例4转pRDEnh6G与pRDEnh8G烟草GUS基因表达的组织化学检测

将同时具有卡那霉素抗性和PCR呈阳性的转pRDPR-NG、pRDEnh6G、pRDEnh8G和p35SGUS(ck+)烟草和未转基因的烟草NC89对照植株(CK-)试管苗取叶盘分别于蒸馏水(H₂O)和1mM化学诱导剂(SA)诱导培养72小时后检测GUS基因的表达。转基因烟草GUS基因表达的组织化学检测按照Jefferson RA[1987，Plant Mol Biol Rep，5(4)：387-405]的方法进行。将转pRDPR-NG、pRDEnh6G、pRDEnh8G和p35SGUS烟草及其对照烟草NC89诱导处理72小时的叶盘在X-Gluc溶液中温育24-48h进行染色，然后将染色的植物材料分别用70％和100％的乙醇彻底漂洗脱色和固定，观察样品并拍照。

叶盘GUS染色的结果如表1、图9和图10所示。结果表明，未转基因的烟草NC89对照植株(CK-)的叶盘蒸馏水(H₂O)和化学诱导剂处理的均未染色，而转p35SGUS烟草叶盘(阳性对照，CK+)H₂O和诱导剂处理的都被相似程度地较强地染色；在检测的转pRDEnh6G烟草的10个PCR阳性株系中，H₂O处理的有9/10株系的叶盘被较强地染色，而经诱导剂诱导处理的都能很强地被染色；在检测的转pRDEnh8G烟草的11个PCR阳性株系中，H₂O处理的9/11被较强的染色，化学诱导剂处理所有株系11/11的叶盘都能很强地被染色。图9和图10为分别为转pRDEnh6G和转pRDEnh8G烟草叶盘经过H₂O或化学诱导剂诱导后GUS染色照片图；在图9和图10中，A行为H₂O处理，B行为化学诱导剂处理；“CK-”(列1)为未转基因的烟草NC89对照，列2-6为转基因烟草植株叶盘。这些结果显示启动子pRDEnh6G和pRDEnh8G不仅具有很强的驱动目的基因GUS组成型表达的能力，而且能够响应化学诱导剂的诱导并且具有超强的驱动目的基因GUS表达的能力。

表1转pRDEnh6G、pRDEnh8G、pRDPR-NG和p35SGUS烟草叶盘的GUS染色

构建	株系	GUS染色结果
				化学诱导	H<sub>2</sub>O诱导
		CK-(未转基因植株)	1			-	-
2	-			-
			3		-	-
CK+(p35S-GUS)	1			+++			+++
		2	++		++
	3			+++		+++
		4	++		++
	5			+++		+++
		pRDEnh6G	1		+++++		+
4	+++++			+++++
			5		++++	+++
7	+++++			++

	8	+++	-
				11	++++	+
	12	+++++	+
				13	+++++	+++
	24	+++++	+++
				26	+++++	++
	pRDEnh8G	4	+++++				++
14				+++++	+
		15	+++++			+++
17				+++++	-
		22	+++++			+
23				+++++	++
		27	++++			++
29				+++++	++
		30	+++++			+++
31				+++++	+++
		32	+++++			-

	8	+++	-
				11	++++	+
	12	+++++	+
				13	+++++	+++
	24	+++++	+++
				26	+++++	++
	pRDPR-NG	4	++++				-
15				+	-
		18	+			-
19				+	-
		21	+++			-
22				+	-
		13	+			-
25				+	-
		23	+			-

注：表中“+”表示GUS染色阳性；“+++++”表示染色最强；“-”表示GUS染色阴性。

实施例5、转pRDEnh6G与pRDEnh8G烟草GUS活性的荧光定量检测

转基因烟草GUS活性的荧光定量检测按照Jefferson RA[1987，Plant MolBiol，21：121-131]的方法进行。取0.1g按照实施例3中方法处理的转基因叶盘于1.5ml离心管中，加入液氮，研成粉末，加600μl酶提取液(50mM磷酸缓冲液pH7.0，0.1％SDS(w/v)，10mM EDTA，20％甲醇(v/v)，0.1％TritonX-100和10mM巯基乙醇)，于13000rpm 4℃离心10min。取适量的上清液，按照Bradford MM的方法(1976，Anal Biochem，72：248-254)测定蛋白的含量，用牛血清白蛋白(BSA)作标准曲线。

取50μl含GUS的上清液(可根据测定的蛋白含量进行适当的体积调整)加入到450μl在37℃预热的检测液(2mmol/L MUG溶液)中。迅速充分混匀，并立刻取出50μl加入到950μl反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)。将该管作为酶促反应的0点，然后分别在30min和60min取出50μl的反应液，转入950μl的反应终止液中。用荧光分光光度计(HiTACHI，F-4500)在激发波长365nm、发射波长455nm下，测定不同时间点的荧光值。GUS活性以每mg可溶性蛋白每分钟产生的pmol 4-甲基伞形酮(4-methyluMbelliferone，4-MU)为单位(1 unit，1U)，GUS活性数据是同一构建5个独立的转基因株系测定值的平均值。

叶盘GUS活性测定的结果如图11所示。图11中，纵坐标为GUS活性荧光测定值U(1 unit＝1 nmol 4-MU per min per mg protein)，横坐标为不同启动子驱动GUS基因的转基因植株叶盘；纵纹柱代表H₂O处理，斜纹柱代表化学诱导剂处理。

从图11可以看出，未转基因的烟草NC89对照植株(CK-)的叶盘H₂O和诱导剂处理的活性都很低，分别为1.77和23个酶活单位(U)，表明烟草的GUS活性的本底很低。转p35SGUS的阳性对照(CK+)烟草叶盘H₂O和诱导剂处理的都同样具有较强的活性，H₂O处理和诱导剂处理的GUS酶活都在11000 U左右，显示出CaMV35s启动子的恒定性和不响应化学诱导剂的诱导。

检测的转pRDEnh6G烟草经H₂O处理GUS活性为4450U，低于转p35SGUS的活性；但经过诱导剂处理后，其活性为48003U，是转p35SGUS的活性的4倍多；检测的转pRDEnh8G烟草经H₂O处理GUS活性是转p35SGUS烟草的2倍，经过诱导剂处理后，GUS活性达到58673U，大约为转p35SGUS烟草的6倍。这些结果表明，重组启动子Enh6是本底较高的强诱导性启动子，而Enh8是诱导增强性超强组成型表达的启动子。

这2个启动子的超强诱导响应见它们对H₂O和化学诱导剂处理后GUS酶活的变化(图11)。转pRDEnh6G和pRDEnh8G烟草经诱导剂处理后，GUS活性都大大提高，其中转pRDEnh6G烟草诱导剂处理是H₂O处理的10倍，转pRDEnh6G烟草诱导剂处理是H₂O处理的2.7倍。

与未插入增强元件的“天然”启动子PR-N相比，插入人工增强子的重组启动子Enh6和Enh8极显著地提高了其驱动能力。在H₂O处理下，转pRDEnh6G和转pRDEnh8G烟草的GUS活性分别是转pRDPR-NG的30和122倍；在化学诱导剂处理条件下，转pRDEnh6G和转pRDEnh8G烟草的GUS活性分别是转pRDPR-NG的烟草12和15倍(图11)。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的诱导加强的组成型启动子Enh6和Enh8不仅具有很强的组成型驱动目的基因(例如，GUS基因)表达的能力，尤其是Enh8，而且还具有在化学诱导剂诱导的条件下，超强驱动目的基因的能力。因此，本发明所提供的启动子Enh6和Enh8是一种具有响应诱导剂能力的诱导增强性组成型的超强启动子。

                            序列表

<110>中国农业大学

<120>一种诱导增强性组成型启动子及其应用

<160>7

<210>1

<211>928

<212>DNA

<213>茄科烟草(Nicotiana tabacum)

<400>1

cgaggatttc aaactctagc ttcactaaaa cttgagcttt cttttccact aatgtcgaaa    60

aacgaaataa acataagcta tttacaaaaa ataaaaaaat actccatttg aatctaaagt    120

caagtcgtga ttgggataag aaaatagaaa tttatttata ctccagatca agccgtgatt    180

ggaatgagat aatagaaaag tatgatagta catgagtaac atcaagttgg aaattaaggg    240

aaggaaatta gagaaagaac tgaagaatat ccaaatattc tttacgtcca aatttgatag    300

ttatttaacg tcatcgagat gacggccatg gtcaagtttt ccacaaatat tgagaaaaga    360

aagaagaaga cacaaactgt gtttggtatt attatagttt tttcttttag agaattgatt    420

gtacatataa gaaatataat ataagattta gaaataagat tattagaaaa atcaaacatc    480

aaagtattta ttttaaattc tttttccaat ggacattccc attctgaaaa aaaagagata    540

taaatatgga agtaaaaatt aatcagatcg ttaaatgtag aaaatattaa ttaacacatt    600

aaccataacc agtctacttt atttaacaaa aagcacatct gatagatcaa aaaagtgttt    660

aacttcatgc attgacaatt taaaattatt ttgcaacatc gggtaaaact attttacaac    720

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taacaggata tcttacattg atattaccat gtcaaaaaat ttagtaagta catgataatc    840

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ttcaagatac aacatttctc ctatagtc                                       928

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aagcttcgag gatttcaaac tctagc                                          26

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

agatctgact ataggagaaa tgttg                                           25

<210>4

<211>1081

<212>DNA

<213>重组序列或者嵌合序列(人工序列)

<400>4

cgaggatttc aaactctagc ttcactaaaa cttgagcttt cttttccact aatgtcgaaa    60

aacgaaataa acataagcta tttacaaaaa ataaaaaaat actccatttg aatctaaagt    120

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c                                                                    1081

<210>5

<211>153

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

catgatgacg taagggatga cgcacaatcc cactgacgta agggatgacg ccatgatgac    60

gtaagggatg acgcacaatc ccactgacgt aagggatgac gccatgatga cgtaagggat    120

gacgcacaat cccactgacg taagggatga cgc                                 153

<210>6

<211>1132

<212>DNA

<213>重组序列或者嵌合序列(人工序列)

<400>6

cgaggatttc aaactctagc ttcactaaaa cttgagcttt cttttccact aatgtcgaaa    60

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<210>7

<211>204

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

catgatgacg taagggatga cgcacaatcc cactgacgta agggatgacg ccatgatgac    60

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tcccactgac gtaagggatg acgc                                           204

Claims (8)

1.一种诱导增强性组成型启动子，其核苷酸序列为：SEQ IDNO：4或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

2.一种表达盒，其特征在于含有权利要求1所述的启动子。

3.根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于所述启动子的下游连接结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA的编码DNA。

4.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的启动子或权利要求2或3所述的表达盒。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于是由权利要求2或3所述的表达盒与质粒或病毒表达载体所构建。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为双元载体。

7.一种权利要求1所述的诱导增强性组成型启动子的制备方法，其特征在于包括以烟草的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3作为一对引物进行PCR扩增得到原始启动子，然后插入SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7的增强元件。

8.权利要求1所述的启动子在驱动植物基因表达中的应用，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

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