JPS61502166A - 植物細胞の形質転換のための改良された方法及びベクタ− - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 植物細胞の形質転換のための改良された方法及びベクター 茨血光互 この発明は、高等植物の形質転換への組換ＤＮＡ技法の通用の分野に関する。さ らに詳しくは、この発明は、高等植物の形質転換及びこれらへの所望の性質の付 与において有用なベクター、及びこのようなベクターを形質転換において使用す る方法に関する。

責員侠貨 最近１０年間の組換ＤＮＡ技法の分野における知識の増加の後、高等植物の遺伝 子構造の変更への組換技法の適用は所望の結果の予測可能性及びぎりぎりの達成 さえも困難なようである。かなり以前から、原核生物を形質転換しそしてそれら に外来性蛋白質の生産に関する所望の性質を運ぶことが可能となっており；さら に最近では、真核性生物、例えば酵母が、それらを所望の特性に適合させるため に好結果をもって形質転換され、そしておそらく最も最近においては、組織培養 物中のを椎動物細胞が組換発現ベクターによる形質転換のための宿主細胞として 使用されている。しかしながら、若干の成功が存在するとしても、植物細胞の好 結果の形質転換の技法はつかまえどころがないままである。少数の植物種、明ら かにタバコ、ペチュニア、及び棉を除き、“組織培養”において植物由来細胞を 維持しそして次に無傷の植物を再生することは今だ可能ではない。

植物細胞の好結果の再現性ある形質転換は、“正常な”植物への植物組織のその 後の再生（これらが通常の農業的再生産サイクルに従って機能することを可能に する）と相まって、幾つかの非常に効果的な結果の可能性をもたらす。例えば、 発現した場合に昆虫による略奪、除草剤、又は植物病による感染に対する耐性を 植物に付与するであろう遺伝子により形質転換された植物は、一層効果的な農業 及び林業体系をもたらすであろう。従って、外来性遺伝物質を植物組織に永久的 に導入することを保証する簡単な方法が長い間求められていた。

おそらく植物細胞壁の硬さ及び限定された透過性のため、“裸の”ＤＮＡによる 植物細胞の直接形質転換は不可能であることが明らかにされている。細胞壁を除 去しそして得られた原形質体を培養した後でさえ、植物細胞は外来性裸のＤＮＡ の組込１−抵抗するようである。従って、ＤＮＡ挿入のためのすでに天然に存在 する方法に努力の焦点が絞られている。

これらの内、双子葉植物に感染しそしてそれらにクラウンゴール（ｃｒｏｗｎ　 ｇｏｌｌ）腫瘍として一般に知られているものの増殖をもたらす遺伝的変化を付 与するアグロバクテリウム・チュメ７７　’／　：Ｌンス（八ｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の能力が注目に値する。

感染された植物へのアグロバクテリウムＤＮＡの組込みに関連する幾つかの因子 は現在理解されている。第１に、感染された植物細胞を形質転換する細菌性ＤＮ Ａは非染色体性少なくとも２種類のＴｉ（腫ｗｊ誘発）プラスミドタイプ〔これ らは、これらと関連するオパイン（ｏｐｉｎｅ）に従って命名される〕がマフピ ングされており、そして広範に研究されている：１ツバリン（ｎｏｐａ　１　ｉ 　ｎｅ）”Ｔｉプラスミド、例えばｐＴｉＴ３７　（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、 等、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａ　１．Ｇｅｎｅｔ、（１９８２）上：　５６１；Ｂｅｖ ａｎ　、　Ｍ、等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｃ　Ｒｅｓ、（１９８３）１１： ３６９）、及び“オクトピン（ｏｃｔｏｐｉｎｅ）”プラスミド、例えばｐＴｉ Ｂ６Ｓ３（ＤｅＧｒｅｖｅ　％　Ｈ，等、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐ　ｌ　Ｇｅｎｅ ｔ、（１９８２）上：　４９９）。

これらは非常に大形〔例えばｐＴｉＣ５８については１３２　Ｍ　ｄａｌ又は約 ２００キロベース（ｋｂ）］であり、そして多数の重要な特徴を有する。それぞ れの場合において、好結果の感染及び宿主植物細胞へのあるＤＮＡ部分の組込を 可能にする機能と関連すると考えられる“ビルレンス（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ；ｖ ｉｒ）″領域が存在する。すわなち、この領域は、植物細胞への細菌の付着、植 物細胞へのプラスミドＤＮＡの移送、又は感染のために要求されるその他の必要 な機能を行うなんらかの生成物をコードすることと関連する。意味のある第２領 域は、感染後植物ゲノムに実際に組込まれるプラスミドの部分を構成する“トラ ンスファー−ＤＮＡ”又はＴ−ＤＮＡ領域である。

野性型Ｔｉプラスミドにおいては、このＴ−領域は、多数の重要な特徴を有する 。第１に、これは一般にオバイン合成酵素領域を含有し、この領域は、発現され た場合、特徴的なオバインーノバリン型プラスミドの場合はツバリン、そしてオ クトピン型プラスミドの場合はオクトビン−１の合成のために必要な酵素をもた らす、（ツバリンはアルギニンとα−ケトゲルタール酸との接合体であり、オク トビンはアルギニンとピルビン酸との接合体である。）おそらく、これらのオパ インの合成は感染の通常の過程における自然の機能に役立ち一一一プラスミドの 他の領域は、Ｔ−ＤＮＡ領域の合成酵素によりコードされる特定のオバインの分 解及び代謝を可能にする酵素をコードする。従って、特定のプラスミドにより感 染された植物細胞は、特定のオバイン、すなわちツバリン又はオクトビンを合成 する能力を獲得し、この生成物は次に他の感染細胞の栄養となる。すなわち、特 定のオバインを代謝する能力は合成酵素コード領域と同じプラスミドにコードさ れているが、宿主細胞のゲノムには組み込まれない。

Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　領域はまた、植物ホルモンであるサイトカイニン及びオーキ シンの内性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）レベルに影響を与えると考えられる遺伝子 をもコードする。これは２重に意義がある。積極的な面では、この機能は組織培 養における好結果の形質転換体を選択する場合に有用である。なぜなら、一般に 形質転換された細胞のみがこれらのホルモンを合成する能力を有し、そして培地 からのそれらの非存在下で再生することができるからである。他の面では、移行 したＤＮＡ中でのこれらの特異的な遺伝子の存在は感染の過程にそれなりの結果 を与え、そして植物ホルモンの増加した又は均衡の破れた量のために、形質転換 された植物細胞は完全な正常植物に再生しなくなり、そして感染された無傷の（ ｉｎｔａｃｔ）植物はクラウンゴールを発達させる。確かに、これらのホルモン のレベルに影響を与える特異的な変異がＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ領域に生じた場合、生 ずる腫瘍組織からの主として根の、又は主として芽の生長をもたらすのに十分な オーキシン−サイトカイニン比の不均衡が得られることが示されている。

最後に、Ｔ−ＤＮＡはその両端に“ボーダー”配列を有し、さの配列は約２５ヌ クレオチドの直接反復を含有する。これらの配列の性質のために、これらの領域 は被感染細胞の染色体への介在Ｔ−ＤＮＡの挿入に関与することが、知られては いないが推定される。

Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　９Ｍ域が宿主細胞の染色体に組み込まれるため、この領域を 外来性ＤＮＡによる植物宿主細胞の形質転換のためのビヒクルとして使用する試 みが行われてきた。正常な植物という面で発現される外来性遺伝子の好ましい組 合わせを得るという目的について評価した場合、これらの試みはいずれも十分に 成功していない。

Ｓｈａｗ、Ｃ，Ｈ，等、Ｇｅｎｅ（１９８３）２３　：　３１５は、おそらく組 換られたＴｉプラスミドを含有するＡ、チュメファシエンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓ）をタバコ実生の無菌（ａｘｅｎｉｃ’）培養物に感染せしめるこ とによりそれらを形質転換することに成功した。

このプラスミドは、Ａ、チュメファシエンス細胞中でのＴ−ＤＮＡの相同領域が 関与するインービボ組換（ｃｒｏｓｓ　−ｏνｅｒ）から生じると考えられた。

この仮定的組換られたベクターは、ラビットβ−グロビン遺伝子が挿入されてい るツバリンプラスミドｐＴｉＣ５８の旧ｎｄｌｎ　２３右端Ｔ領域断片を含有す る広宿主域中間体ベクター、及びアグロバクテリウムに生来的なＴｉプラスミド （やはりｐＴｉＤ５８）から誘導された。感染された実生はβ−グロビンＤＮＡ を含有したが、その転写物をなんら作らなかった。

１（ｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａｓ　Ｌ、等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３ ０３　：２０９は、アグロバクテリウム感染誘発されたタバコ実生腫瘍からの無 菌培養物においてクロラムフェニコール耐性を付与する異種性蛋白質のためのコ ード配列の発現を得ることに成功した。クロラムフェニコールアセチルトランス フェラーゼ（ＣＡＴ）のコード配列がツバリン合成酵素遺伝子のプロモーター配 列に連結されてＮＯＳ　−ＣＡＴキメラ遺伝子が得られ、そして狭宿主域（Ｅ、 コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ））複製開始点、Ｔ−ＤＮＡ相同領域、及びアンピシリン耐 性付与（Ａｍｐ”　）配列を有する組換ベクター中に置かれた。このプラスミド が、ｐＴｉＣ５８を１旦持するＡ。

チュメファシエンスに形質転換され、そして好結果の、Ｊ質転換体がＡ　ｍｐＲ について選択され、こうして細菌性ベクターとＴｉプラスミドとの間の組換が生 じたことが確認された。予想される組換えられたプラスミドを含有するアグロバ クテリウムを使用してタバコ実生に感染させた場合、組織培養において増殖した 生じた腫瘍細胞は植物に再生しなかったが、しかしＣＡＴ−コード蛋白質を生産 することができた。

Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ　（ＵＳ Ａ）　（１９８３）８０：４８０３は、前項の研究と同様に、２種類のベクター ：すなわぢ、第１の、ツバリン合成酵素プロモーターに連結されたネオマイシン 耐性を付与する蛋白質のコード配列を有するキメラ遺伝子を含有し、そして組換 を助長するためにｐＴｉＢ６Ｓ３と相同の配列を有する狭宿主域プラスミドベク ター、及び第２の、生来的なＴｉプラスミドであるｐＴｉＢ６Ｓ３のインービボ 組換のために選択されたＡ、チュメファシエンスとの同時培養によるペニチェア 原形質体の形質転換を開示している。植物細胞に対して通常は毒性であるアミノ グリコシド抗生物質カナマイシンに耐性を有する原形質体が得られた。耐性は挿 入された遺伝子により付与されると予想された。正常な植物は再生しなかった。

さらに、Ｆｒａｍｏｎｄ　ＳＡ、Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ　（１９８３） ２６２−２６９、及びＨｏｅｋｅｍａ　、　Ａ等、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８３） 　３０３　：１７９により、感染後に植物細胞を形質転換しそして腫瘍を好結果 に（生じさせるのであろうＴｉプラスミドのビルレンス機能及びＴ−ＤＮＡ機能 は、２分節系（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ）に分けることができること が示された。

最後に、Ｂａｒｔｏｎ、　Ｋ、Ａ、等、Ｃｅｌ！　（１９８３）３２　：　１０ ３３は、Ｔｉプラスミドの“ルーティー（ｒｏｏｔｙ）”座に挿入された酵母由 来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）のＤＮＡ配列が、感染後に再生され た植物から単離されたＤＮＡ中に多数コピーとして見出される（但し、細胞は腫 瘍性ではない−すなわち、それらは増殖のためにサイトカイニンの添加を必要と する）ことを示す実験を開示する。これらの植物の自家授粉から得られる種子も 正常なタバコ植物を生じた。但し、おそらくそのＩ）　Ｎ　Ａ中に約２０コピー のＡＤＨコード配列を含有する。

Ａ、　Ｄ　Ｈは発現されなかった。形質転換後、腫瘍の形成に関して植物は正常 に維持されるので、形質転換に使用されたベクターは“無力化されている”（ｄ ｉｓａｒｍｅｄ）と称された。

前記の開示のいずれにおいても、同じ実験において発現及び正常植物の再生の両 者を示すことは不可能であった。この発明は、この好ましい結果を得る手段を提 供する。これはまた、インービボ組換現象についての選択の必要性を伴わないで 、好結果の形質転換ベクターを造成する場合に標準的組換Ｄ　Ｎ　、Ａ技法を使 用することを可能にすることにより２、得られる発現の性質に対する一層大きな 制御をもたらす。

褒則勿肌示 この発明は１つの観点において、植物Ｍ４織中で外来性遺伝子を発現するために 有利なベクターに関する。基本的な中間体キャリヤーベクターは、植物組織中で 作用可能なプロモーター及びポリアゾニレ−ジョンシグナル配列を利用するため に適切に配置されるように任意の所望の外来性遺伝子配列を導入することを可能 にｒる受理ユニットとして機能する。広範囲の種類の外来性遺伝子を容易に導入 することができる。

さらに、このような所望の遺伝子配列が挿入された場合、生ずる発現キャリヤー ベクターを標準的組換ＤＮＡ制限及び連結技法を用いてスプライスして、種々の 遺伝子のためにある望ましい数の発現力セントを含むようにすることができる。

これらのカセットの内、好結果に形質転換された細胞の容易な選択を可能にする であろうマーカーを含有することが好ましい。

前記の発現キャリヤーベクターは、植物細胞に直接形質転換された場合、標準的 Ｔｉベクター形質転換技法において使用される組換えられたベクターと異り、腫 瘍を形成せず、そしてこれらのキャリヤーベクターのみにより形質転換された植 物細胞は、正常な再生、および目的遺伝子の発現の両者が可能である。

従って１つの観点において、この発明は、絹換植吻細胞中での外来性遺伝子のコ ード配列の発現に効果的な発現キャリヤーベクター、並びに中間体Ｄ　Ｎ　Ａ配 列及びそれらの造成に有用なベクターに関する。このような発現キャリヤーベク ターは次のものを包含する。

１．１又は複数の発現カセットを含有する組換ベクターであって、これらの各発 現カセットが植物細胞中で正常に作用可能なプロモータ・−及び植物細胞中で作 用可能なポリ了デニシーシ３ンシグナルを含んで成り、両者が所望の外来性蛋白 質のためのコード配列に作用可能、一連結されているもの。

この発現ベクタ・−は複数のこれらの発現カセットを含むことができる。これら のベクターはさらに少なくとも１個のカセットユニーク制限部位を少なくとも１ 個の発現カセットの末端に有する。このクラスのベクターは直接形質転換後に植 物細胞中で外来コード配列の発現を得るために有用である。

２、他のクラスの発現キャリヤーベクターは前項のそれらを含んで成るが、し７ かし発現カセットの１端、又はベクター中に複数の発現カセットが含まれる場合 はこれらの列の１端の近位に少なくとも１個のＡ、チ二メファシェンスＴ−ＤＮ Ａボーダー配列を含有するように修飾されている。好ましくは１個の発現力セン ト、又は複数の発現カセットの列は２個のそのようなＴ−ＤＮＡボー・ダー配列 により囲まれている。

これらのベクターは、そのベクタ一部分上に、広宿主域細菌性複製開始点を含有 する。これらは、前記のベクターと関連して用いられる直接形質転換法により、 又はアグロバクテリウムＴｉプラスミドのビルレンス領域の介在が関与する形質 転換法において、外来性蛋白質の発現を得るように植物細胞を形質転換するのに 有用である。

他の観点において、この発現は、前記のベクターの造成において使用される中間 体プラスミド及びＤＮＡ配列、これらのベクターを用いる植物又は植物細胞の形 質転換法、このようなベクターにより形質転換された植物又は植物細胞、こうし て形質転換された植物を用いる外来性蛋白質の製造方法、及びこうして製造され た蛋白質に関する。

遷ｍ０）Ｐ２υ１℃礼吸 第１図はｐＣＭＣ５９及びｐｃＭｃ６０の造成を示す。

第２図は四ＭＣ１２１の造成を示す。

第３図はｐｃＭｃｌｏｌの造成を示す。

第４図はｐｃＭｃ９１の造成を示す。

第５図はｐｃＭｃ７１の造成を示す。

発明を　施する態様 ここで使用する場合、“植物細胞中で正常に作用可能な”プロモーター配列とは 、少なくともコード配列のｍＲＮＡへΦ転写を開始することができると言う意味 において植物細胞と適合性であるのみならず、同時に植物組織において遺伝子の 発現を本来的（ｎａｔｉνｅｌのに行うことが見出されるブロモ・−ター・配列 を意味する。通常、この配列は細菌中では比較的静かであり、そして感染された 植物細胞中で特異的に機能するように設計される。例えば、この発明のベクター の多くはツバリン合成酵素のプロモーターを使用し、これはアグロバクテリウム ・チュメファシエンスのプラスミド上に担持されるが、しかし細菌中で発現する ことは知られていない。しかしながら、感染された植物細胞中にプラスミドが導 入された場合、これはこの関連においてツバリン合成酵素コ・−ド配列を発現す るために機能する。これらのプロモーターは、、植物に由来しないが、その中で “正常に作用可能”である。

“植物細胞中で作用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル”は、その転写、核か らのポリＡ　−ｍＲＮＡの輸送及び細胞質中でのその安定な蓄積に必要であり、 真核細胞におけるその後の翻訳を可能にすると考えられる、コード配列の３′に 通常見出される配列を意味する。最近、これらの配列の機能はコード配列から転 写されるメツセンジャーＲＮＡのポリアデニル化を合い図することであると信じ られている。しかしながら、これらのシグナル配列の完全な機能は一義的には確 立されていない。従って、ここで使用する場合、この用語は、ＤＮＡ中のコード 配列に後続し、そして真核細胞環境下でのその発現（翻訳を包含する）を保証す るシグナルを意味する。

植物中での発現を確実にするこの能力が天然において植物細胞中でそのように用 いられることが知られている配列に限定されるか否かは現在明らかでない。従っ て細胞中でこの機能を行う場合に実際に好結果をもたらす任意の配列がこの定義 に含まれる。

“ポリリンカー”は、受容体ＤＮＡ配列に連結された後、少なくとも３個の接近 して組み合わされている制限酵素部位を含有するＤＮＡ配列を意味する。

“発現カセ−／　ト”は、含有されるコード配列を植物において発現せしめるこ とができるＤＮＡ配列を意味する。すなわち、典型的な発現力セントは、植物細 胞中で正常に作用可能な、コード配列に作用可能に連結されたプロモーター配列 、及び植物細胞中で作用可能でありやはりコード配列に作用可能に連結されてい るポリアゾニレ−ジョンシグナルを含有する。“カセット”なる語はまた、ユニ ットとして取り扱われるために設計され・る他のＤＮＡ配列に関しても使用され る。

例えば、一連の“発現カセットはまた“ＤＮＡ配列カセットとも称される。

“カセット・ユニーク”制限部位は、言及されるカセット又は一連のカセット中 に１回のみ見出されるエンドヌクレアーゼ酵素開側認識部位を意味する。

“ベクター配列”又は“ベクターセグメント”又は“ベクター断片”は、発現カ セット、ＤＮＡ配列カセット、又は他の“カセット″ＤＮＡ配列の部分ではない プラスミド上のＤＮＡ配列を意味する。典型的な“ベクター配列”は複製開始点 及びＴ−ＤＮＡボーダー配列である。

“狭宿主域細菌性複製開始点”は、非常に限定された数の細菌種においてのみ機 能することができる複製開始点を意味する。典型的には、はとんどの組換研究に おいて、このようなレプリコンは、Ｅ５コリのごとき一般に使用される種牛での 機能に限定され、そしてこの発明に関して言えば、アグロバクテリウムのごとき 外来性宿主中では複製しない。逆に、“広宿主域細菌性複製開始点”は、それが 由来する様においてのみならず、他の細菌種においても機能するレプリコンに関 する。この発明に関して言えば、はとんどの意味ある例は、Ｅ、コリ、及びアグ ロバクテリウムの両者において複製することができる開始点であろう。

ここで、使用する場合、“Ｔ−ＤＮＡボーダー配列”は、Ａ、チュメファシエン スのＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ部分を囲むそれと同一か又はそれに類似する反 復するＤＮＡ配列を意味する。野性型Ａ、チュメファシェンスにおいては、これ らの反復配列は、感染された細胞の染色体に移送されるＴ−ＤＮＡを囲む。この 発明において使用されるボーダー配列の定義はこれらの特異的反復セグメントに 限定されず、Ｔｉプラスミドのビルレンス領域の助けを伴って介在する物質を宿 主細胞ゲノムに移送するのを中介する機能をなお有する、その任意の変形物を包 含する。Ａ、チュメファシェンスのプラスミドのＴ−ＤＮＡを囲むそれらの配列 を命名するために、略号“Ｌ　Ｂ”　（左側ボーダー）及び“ＲＢ″　（右側ボ ーダー）が使用される。

“植物”又は“植物細胞”は種子の形成によって再生産可能な植物タイプに関し 、そしてこれらの語は、植物それ自体、植物の細胞、植物細胞由来の原形質体、 他の植物由来細胞、例えば組織培養細胞、腫瘍細胞、カルス及び種子、並びにこ れらの子孫を包含する。子孫は数世代にわたって培養された場合自然的な又は意 図的な変化を経験することがあるものと理解され、そしてこのように変化した子 孫は、それらが言及される植物細胞又は植物に由来する限りにおいて包含される ことが意図される。

“作用可能に連結された”とは、その機能が維持される態様で並置されている配 列を意味する。従って、コード配列に“作用可能に連結された”プロモーターは 、この配列の転写及び翻訳を行うことができるプロモーターの配置を意味する。

同様に、コード配列に“作用可能に連結された”ポリアゾニレ−ジョンシグナル は、コード配列からの蛋白質の生産を可能にするこのシグナルの配置を意味する 。

Ｂ、一般的記絞叉艷殖ｉνＵ腹課 この発明の形質転換技法は、一般的用途の交換可能な一セットのベクター中での 遺伝子配列の容易な操作を許容するベクター造成物の系を用いる。

Ｂ、１．　中間体キャリヤーベクター 根本のベクターは、任意の所望のポリペプチドコード配列の便利な挿入を許容す るように設計された中間体キャリヤーベクターである。

このベクターは、センス鎖において５’−３’の順序で次のものを包含する“カ セット”ＤＮＡ配列を含んで成る：（ａ）　第１のカセット−ユニーク制限部位 ；（ｂ）　植物細胞中で正常に作用可能な（５’−３’に向けられた）プロモー ター配列； （Ｃ）　ポリリンカー； （ｄｌ　植物細胞中で作用可能な（５’−３’に向けられた）ポリアゾニレ−ジ ョンシグナル；及ヒ （ｅ）　第２のカセット−ユニーク制限部位。

ポリリンカーの存在がコード領域に関する容易な操作を可能にし、“成熟”蛋白 質をコードするＡＴ、Ｇで始まる配列、。

又はプロモーターと共に作用可能に含まれる部分コード配列とリーディングフレ ームが整合する配列の挿入が可能となる。

このようなコード配列の挿入の後、このベクターは、植物細胞中に形質転換され た場合にコード配列を発現することができる発現キャリヤーベクターとなる。広 範囲の種類のコード配列、例えばＡＰＩ（−，１及びＡＰＩＩ−Ｉｔ　（これは 、細菌細胞のほかに酵母、植物及び哺乳動物に毒性を有するアミノグリコシド抗 生物質Ｇ４１８又はカナマイシンに対する耐性を付与する蛋白質をコードする） ；β−インターフェロン（これは実際に、ウィルスの感染に対して植物及び哺乳 動物を保護することができる）　（Ｏｒｃｈａｎｓｋｙ　、　Ｐ、等、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　（ＬＩＳＡ）（１，９８２）Ｌぜ：２２７８ ）　；　Ｂ　ｔ　−トキシン（植物組織のための内部農薬として機能する）；及 びＣＡＴ　（クロラムフェニコールのアセチル化修飾を触媒する）を含有するプ ラスミド。このリストはすべてでは全くなく、そしてそれ自体のＡＴＧ開始コド ンを備えることができそして適当な制限部位により囲まれた任意のコード配列を 使用することができる。さらに、プロモーター配列を含有する中間体ベクターが さらに該プロモーターと作用可能に連結されたＡＴＧ開始シグナルを含むコドン を含有する場合、このＡＴＧコドンとリーディングフレームを合わせて置（こと ができる任意の配列が融合蛋白質として発現され得る。例えば、β−ガラクトシ ダーゼコード配列の一部分がこのように連結されている。従って、多くの目的遺 伝子配列のためのキャリヤー発現ベクターの立派な装いを中間体キャリヤーベク ターから造成することができる。

Ｂ、２．　直ｔ　）　１換のための　キャリヤーベクター中間体キャリヤーベク ター−・のコード配列の挿入から生ずる最初の単一カセットキャリヤー発現ベク ターは、それらの中に含有される複数の発現カセットが交換可能であり、そして それらの組合わせが２個、３個又は任意の所望の個数のカセットを有するキャリ ヤー発現ベクターを形成するために使用され得ることを特徴とすることができる 。従って、例えば、目的遺伝子配列のためのカセットのみならず、好結果に形質 転換された細胞の選択を可能にする選択可能なマーカーの発現のためのカセット をも含有するベクターを造成することが可能である。

発現キャリヤーベクターの必須部分は１又は複数の発現カセットを含んで成り、 そのそれぞれは植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナルの両者に作用可能に連結された目的コー ド配列を含有する。好ましい具体例において、少なくとも１個の目的コード配列 が形質転換された植物細胞の選択を可能にする表現型特性をもたらす蛋白質−・ すなわち優性選択マーカーをコードする。さらに、単一発現力セントベクター中 の発現カセットの一端、及び複数カセットベクター中の一連の複数のカセットの 末端又は、２個のカセットの連結部にカセット・ユニーク制限部位が位置し、そ してこの場合にはその位置の特定の発現カセットに対してのみならず、全系列又 は“ＤＮＡ配列カセット”に対してもユニー°りである具体例も好ましい。発現 キャリヤーベクターが受容体に追加の発現カセットを供給するための供与体ベク ターとして使用されるべき場合、発現カセットの他端に第２のカセットユニーク 制限部位が存在するのが一層好ましい。

１個より多くの発現カセットを含有する発現キャリヤーベクターの造成の好まし い方法においては、２個の発現カセットベクターが使用され、一方は単に発現力 セントを提供しく供与体）、そして他方はベクター配列と共に自らの発現力セン トを提供する（受容体）。この方法においては、受容体ベクターが、その発現力 セントの末端のカセットユニーク部位において切断する１つの制限酵素により開 裂され；供与体プラスミドを２種類の制限酵素（発現カセットの両端における各 カセットユニーク制限部位のためのもの）により処理することによって供与体発 現カセットが切り出される。次に切り出された発現カセ・ノド及び受容体プラス ミドが、生ずる複数発現カセットベクターを得るための標準的条件を用いて連結 される。

複数のカセット−ユニーク制限部位が、それらが適合性の（ｃｏｍｐａｔｉｂｌ ｅ）接着末端をもたらすように選択されれば（例えば、Ｘｈｏｌ及び５ａｉｌ） 、挿入された発現カセ７）は２つの方向のいずれかに方向ずけられることができ 、そして再構成されたカセット−ユニーク制限部位の位置は、いずれの方向付け が生じたかに依存するであろう。例えば、下記の例において、複数の発現カセッ トが、それぞれ５′及び３′端においてＸｈｏＩ及び５ａｉｌ制限部位により連 結される。受容体ベクターが５ａｌＩで処理され５ａｉｌ接着末端を有する線状 ＤＮＡが生成する。切り出された供与体発現カセットはＸｈｏｌ及び５ａｉｌ接 着末端を担持する。これらの状況下で、発現カセットが、６ＮＡ配列が受容体と 同一の方向にあるように方向付けられれば、５ａｉｌ部位は生ずるＤＮＡ配列２ 重カセットの末端に再構成され；逆の方向に方向付けられれば、カセット−ユニ ーク５ａｉｌ部位は２個の発現カセットの間に位置するであろう。両方向付けが 機能的であり、そして両方共、この２重発現カセットベクターが追加の発現カセ ットの挿入のための受容体として機能することを許容するのに適当なカセットユ ニーク制限部位をもたらすであろう。

要約すれば、中間体キャリヤーベクターが造成され、そしてこの発明の部分であ る。このものは、センス鎖の５′から３′の方向に読んで、第１制限部位、植物 中で正常に作用可能なプロモーター、ポリリンカー、植物中で作用可能なポリア ゾニレ−ジョンシグナル、及び第２制限部位を有する。このポリリンカーが目的 コード配列の便利な挿入を可能にし、２個の制限部位により単一カセットがその 中に結合している単一カセット発現キャリヤーベクターを生成せしめる。これら の２個の制限部位において開裂された１つのそのようなベクタ・−の発現カセッ トを切り出し、そして受容体ベクターの制限部位の１個のみを用いてそれを他方 に挿入するとい・う、任意の所望の回数反復することができる方法により、多カ セット発現キャリヤーベクターを造成することができる。特に好ましい具体例に おいては、この方法は、２個の発現カセ・ノドの連結の後に部位の内の１つが再 構成されないような制限部位の組み合わせを用いることにより、一層効率的に行 われる。

適切な条件下での植物組織への直接形質転換のために適当なすぐ上に記載した発 現キャリヤーベクターの残りのベクタ・−断片部分の性質は、他の形質転換技法 のために必要とされるそれよりも臨界的ではない。すなわち、これらは、感染細 菌の介在を用いる形質転換のために必要とされるであろう配列を含有することを 必要としない。すなわち、これらのベクターは、Ａ、チュメファシエンスからの Ｔ−ＤＮＡポーダ・−配列を含有し７ていても含有していなくてもよく、そして それらの復製開始点は狭又は広宿主域のいずれに適合してもよい。

言い換えれば、下記の８．３３項に記載されるアグロバクテリウム−依存性キャ リヤー発現ベクターは、直接形質転換における゛通常の”発現キャリヤーベクタ ーとして使用され得る。

下記の例示項のすべてが直接形質転換に適当な発現キャリヤーベクターを記載す る。００項において造成されるベクターの例は、直接形質転換及びアグロバクテ リウム−介在形質転換の両者に適当なベクターを記載する。

Ｂ６３．　アグロへ優」」訣二子作ｍ狽寥Ｊ炒ど（旬２用−蕉衾叉凸」ヨ！二さ 久久二 上記の発現キャリヤーベクターは、これらが細菌により介在される植物細胞形質 転換における使用に適合するように、それらのベクターセグメントにおいて変形 することができる。

Ａ。チュメファシエンスが怒染剤として使用されるべき場合、変形されたベクタ ーは、発現カセット又はそれらの列の末端の近位に配置された少なくとも１個の Ａ、チーエメファシエンスがＴ−ＤＮＡボーダー配列を有するであろう。好まし くは、発現カセット又はその列は１対のそのようなボーダー配列により囲まれて いる。ベクターが例えばＥ、コリ中で造成されることを許容しながら、ベクター がＡ、チュメファシエンス宿主中で複製することを可能にするために、ベクター セグメントは広宿主域細菌性複製開始点を含有する。これらの変形は発現キャリ ヤーベクターが植物細胞を直接形質転換する能力を害さないが、これらは中間体 細菌のオフィスを用いながら形質転換を許容することを必要とする。

変形されたベクターの造成において、好ましい重要なベクターは、Ａ９チュメフ ァシエンスと関連する右側ボーダー（ＲＢ）及び左側ボーダー（ＬＢ）に囲まれ た、植物中で正常に使用可能なプロモーター及び植物中で作用可能なポリアゾニ レ−ジョン配列の両者に作用可能に連結された目的コード配列（好ましくは優性 選択マーカーをコードする）を含有する発現カセットを含んで成る。カセットユ ニーク制限部位はボーダー配列の１つと発現力セントの末端との間に配置される 。ベクターセグメントは広宿主域細菌性複製開始点を含有する。

この基本的な発現キャリヤーアグロバクテリウム−適合ベクターは、ｐｃＭｃ９ １により下に例示される。ｐｃ１１ｃ９１においては、コード配列Ｇ４１８及び カナマイシンに対する耐性を付与する優性選択マーカー、変形されたＡＰＩ−ｎ をコードする。基本造成物の誘導体は追加の発現力セント含有し、これらの誘導 体は形質転換された植物細胞中で任意の目的外来性遺伝子のコード配列を発現せ しめるのに有用であり、そしてさらにもとのカセットの選択可能なマーカーの特 徴をなお維持している。これらの発現力セントはＢ、２０項においてすでに記載 したベクターから便利に誘導することができる。これらは、カセットのいずれか の末端の２個のカセット−ユニーク制限部位の使用、及び受容体ベクター中のボ ーダー配列はＡＰＩ−Ｉ［カセットの末端との間のカセット−ユニーク制限部位 におけるカッ七トの連結により切り出される。

この発明のすべての発現キャリヤーベクターが植物細胞を直接形質転換するため に使用され得る。この方法においては、細菌感染は使用されない。そうではなく 、植物細胞は適切な条件下で裸のＤＮＡにより、すなわち該当するベクターの懸 濁液により、直接処理される。現在、この形質転換を行う１つの実施可能を方法 は、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のごとき適当な促進剤の存在下で 植物細胞原形質体をプラスミドＤＮＡと共に懸濁することである。この技法は下 記のＨ０項において非常に詳細に記載される。ま泪こ使用されている他の方法は 個々の植物細胞への微量注射を用しする。この方法は一層退屈であるが原形質体 の調製を必要としない。いずれにしても、この発明のベクターは実施可能な直接 形質転換技法のために適当であり、そしてこの発明は前記の特定の方法における それらの使用に限定されないことを理解すべきである。

Ｂ、４．ｂ、夷皿九夜展覧翫換 Ｂ、３０項に記載されるベクターは、植物宿主の細菌介在形質転換において使用 するのに適する。このような方法の２つの変法が一般に使用される。両者は、同 一の初期段階−・ビルレンスコード領域を担持するＴｉプラスミドを有する適当 な細菌宿主の形質転換−を共有する。細菌細胞は、今や発現キャリヤーベクター 及びビルレンス含有プラスミドの両者を含有し、組織改善において植物細胞と共 に、好ましくは原形質体と共に同時培養され、あるいは傷つけられた植物組織に 直接注射される。代替可能なこれらは後で一層詳細に記載される。

いずれの方法が使用されるにしても、感染するか又は同時培養されるアグロバク テリウムは、発現キャリヤーベクター、及び腫瘍誘発プラスミドと通常関連する ビルレンス領域を担持するプラスミドの両者を含有するであろう。生ずる形質転 換された細胞が腫瘍性になるのを防止するため、そのＴ−ＤＮＡ領域に通常担持 されている腫瘍誘発機能を欠（プラスミド上にビルレンス領域が存在することが 好ましい。このような無力化されたビルレンス領域を含有するプラスミドは後で 例において詳細に記載するように宿主細菌細胞中にすでに存在し、あるいは、お そらく便利ではないが、腫瘍誘発プラスミドを欠く細菌宿主がキャリヤー発現プ ラスミド及び無力化されたピルレンスコードベクターの両者により同時に又は逐 次に形質転換される。好ましい態様においては、無力化されたＴｉプラスミドを すでに含有するＡ、チュメフ１シェンス宿主が発現キャリヤー・ベクターのため の受容体として使用される。

要約すれば、形質転換の４つの例示的方法は次の通りである。

（１）　キャリヤー発現ベクターを植物細胞原形質体と共に直接形質転換を可能 にする適当な条件下で懸濁せしめる。

（２）微量注射。

方法（１）又は（２）が使用される場合、レプリコンが狭宿主域のものであるか 広宿主域のものであるか、及びボーダー配列が存在するか否かは重要でない。Ｂ 、２．及びＢ、３゜の両者のベクターを使用することができる。

（３）キャリヤー発現ベクターをまず無力化Ｔｉベクターを含有するアグロバク テリウム中に形質転換又は接合せしめ、そして次にこのアグロバクテリウムをＭ ｉ織培養において植物原形質体と共に同時培養する。

（４）　キャリヤー発現ベクターをまず上記のようにしてアグロバクテリウムに 形質転換し、そしてこのアグロバクテリウムを傷つけられた植物組織に直接適用 する。

方法（３）及び（４）は、Ｂ、３．０ベクターについてのみ適当である。

Ｃ，ベクターの造成に使　される　法 所望のコード配列及び制御配列を含有する適当なベクターの造成は、当業界にお いてよく理解されている標準的連結及び制限技法を用いる。単離されたプラスミ ド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドが開裂され、仕立てられ、 そして所望の形に再連結される。

当業者において一般に理解されている条件（その具体的事項はこれらの商業的に 入手可能な制限酵素の製造者により定特さている）下で適当な制限酵素（１又は 複数）で処理することにより部位特異的ＤＮＡ開裂が行われる。例えば、ニュー イングランドビオラプスの製品カタログを参照のこと。一般に、約１μｇのプラ スミド又はＤＮＡ配列が１ユニツトの酵素により約２０μＥの緩衝液中で開裂さ れ；この明細書の例においては、ＤＮＡ基質の完全な消化を保証するために過剰 の制限酵素が使用される。場合によっては部分消化が挙げられる。約３７℃での 約１〜２時間のインキュベーションが実施できるが、変更することも可能である 。各インキュベーションの後、フェノール／クロロホルムによる抽出によって蛋 白質が除去され；この段階に続いてエーテル抽出を行うことができ、そしてエタ ノールを用いる沈澱により水性画分から核酸が回収され、次にセファデックスＧ −５０スピンカラムに通される。所望により、標準的方法を用いるポリアクリル アミドゲル又はアガロースゲル電気泳動により、開裂された断片のサイズ分離を 行うことができる。サイズ分離の一般的記載はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙ ｍｏｌｏｇｙ　（１９８０）６５　：　４９９−５６０中に見される。

制限開裂された断片は、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，６）　、５０ｍＭＮａＣ １、６ｍＭ　ｌ’１ｇｃ１ｚ、６ｍＭＤＴＴ及び０．１　ｍＭ　ｄＮＴＰ中、２ ０〜２５℃にて、約１５〜２０分間のインキュベーション時間を用いて、４種類 のヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下でＥ。

コリＤＮＡポリメラーゼの大断片（Ｋｌｅｎｏｗ）で処理することにより、平滑 末端化することができる。このＫｌｅｎｏ−断片は、５′接着末端をフィル−イ ンするが、４種類のｄＮＴＰが存在する場合でさえ３′接着末端をチューバック する。所望により、１種のｄＮＴＰのみ、又は接着末端の性質により指示される 限界内で選択された複数のｄＮＴＰを補給することにより、選択的修復を行うこ とができる。Ｋｌｅｎｏｗで処理した後、混合物をフェノール／クロロホルムで 抽出し、そしてエタノール沈澱を行い、次にセファデックスＧ−５０スピンカラ ムに通す、Ｓ１ヌクレアーゼによる適当な条件下での処理が単鎖部分の加水分解 をもたらす。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａ＋１ｅｕｃｃｉ等、Ｊ、Ａｎ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏ ｃ。

（１９８１）　１０３　：　３１８５−３１９１のトリエステル法により調製さ れる。

アニーリングに先立つ、又はラベル化のための単鎖のキナーゼ処理は、過剰の、 例えば１　ｎ　ｍｏｌｅの基質に対して約１０ユニツトのポリヌクレオチドキナ ーゼを用いて、５０ｍＭ　Ｔｉｔｓ（ｐＨ７，６）　、１０ｍＭ　ＭｇＣＬｚ、 ５ｍＭジチオスレイトール、１〜２ｏ＋Ｍ　ＡＴＰ　％　１．７ｐｍｏｌｅ　Ｔ 　３２Ｐ　ＡＴＰ（２，９ｍｃｉ／ｍ　ｍｏｌｅ）　、０．１５１Ｍスペルミジ ン、０．１．　ｒａ？１ＢＤＴＡの存在下で達成される。　連結は次の標準的条 件及び温度のもとで１５〜３０１容積において行われる：　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ（ｐＨ７，５）　、１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、及び１０ｍＭ　ＤＴＴ、 　３３　ＩＩ　ｇ／ｍＡ　ＢＳＡ　、　１０ｍＭ〜５０ｍＭ　ＮａＣ１；及び４ ０　ｐ　Ｍ　ＡＴＰ、　０．０１〜０．０２（Ｗｅｆｓｓ）ユニットのＴ４ＤＮ Ａリガーゼ、０℃（“接着末端”連結のため）；又は１　ｎ＋Ｍ　ＡＴＰ、０、 ３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ）ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１４℃（“平滑末 端”連結のため）。分子間“接着末端”連結は通常３３〜１００　ｐ　ｇ　／　 ｍｌの合計Ｄ　Ｎ　Ａ濃度（５〜１１００ｎ合計末端濃度）において実施される 。分子間平滑末端（通常１０〜３０倍過剰のリンカ−を用いる）は１μＭ合計末 端濃度において行われる。

“ベクター断片”を用いるベクターの造成において、５′リン酸を除去しそして ベクターの再連結を防止するため、ベクター断片は一般に細菌アルカリホスファ ターゼ（ＢＡＰ）により処理される。ＢＡＰ消化はｐＨ８において約１５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ中で、Ｎａ”及びＭ　ｇ−２の存在下にて、ベクターμｇ当り約１ユ ニツトのＢＡＰを用いて６０℃にて約１時間行われる。

核酸断片を回収するため、調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、そして エタノール沈澱せしめ、そしてセファデックスＧ−５０スピンカラムに適用する ことにより脱塩する。

別法として、不所望の断片の追加の制限処理により２重消化されたベクターにお いて再連結を防止することができる。

下記の造成において、プラスミド造成のための正しい連結が、Ｅ、コリーゼネテ インクストソクセンター（Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ）　−２Ｃ ＧＳＣ”　６１３５から得られるＥ、コリ１２９４株（Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｋ 、等、Ｇｅｎｅ（１９８０）１２　：　２３５　；　Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、Ｍ、等 、Ｎ！勲憇（１９６８）　２１７　：　１ｌｌｏ）　、又は他の適当な宿主を連 結混合物で処理することにより確認される。好結果の形質転換体が、当業界にお いて理解されているように、アンピシリン、テトラサイタリンもしくは他の抗生 物質耐性により、又はプラスミド造成の態様に依存して他のマーカーを使用する ことにより選択される。次に、可能な場合にはクロラムフェニコール増幅（Ｃ］ ｅｉ＋ｅｌｌ、Ｄ、Ｂ、、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、（１，９７２）韮６６７ 　）の後、形質転換体からのプラスミドが、Ｃｌｅｗｅ１１．、Ｄ、Ｂ、等、Ｐ ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、（１９６９）６２　：１１５９の方法に 従って調整され、そして制限処理により分析され、そして／又はＳａｎｇｅｒ、 　Ｆ、等、ジブトキシ法により、又はＭａｘａ＋ｗ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８０）６５　：　４９９の方法により、配列決定さ れる。

次の例は、適当な中間体キャリヤーベクター、単−及び２重カセット発現キャリ ヤーベクター、並びに前記されている形質転換技法のために適当なそれらの細菌 適合誘導体を例示する。これらのベクターにおいて、ｐＴｉＴ３７のツバリン合 成酵素（ＮＯ３）ブロモ−・ター・がこの遺伝子のポリアゾニレ−・−ジョンシ グナルと共に使用される。言うまでもなく、植物細胞中で正常に作用可能な他の プロモータ配列を、植物中で作用可能な他のポリアゾニレ−ジョンシグナルと同 様、使用することができる。適当な他のプロモーターには、アルコールデヒドロ ゲナーゼ−１又はアルコールデヒドロゲナーゼ−２のためのトウモロコシプロモ ーター（Ｇｅｒｉａｃｈ、Ｗ、Ｌ、等、匡匹８Ｎａｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　 （ｔｌｓＡ）　（１９８２）７９　：　２９８１）　、カリフラワーモザイクウ ィルスプロモーター（Ｄａｕｂｅｒｔ、　Ｓ、等、ｕ皿ｕ用（１９８２）１２２ 　：　４４４　）　、及びリブロースビホスフエートカルポキシラーゼの小サブ ユニットと関連する小麦プロモーター　（Ｂｒｏｇｌｉｅ。

Ｒ７等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８３）上：５５〕が包含される。前 記のものは当業界において容易に入手可能であるが、しかし言うまでもなく、他 の適当なプロモーターを使用することができる。現在入手可能な他のポリアゾニ レ−ジョンシグナルには、上記の遺伝子のいずれかに見出されるもの、又は５ｃ ｈｕｌｅｒ等（Ｓｃｈｕｌｅｒ、　Ｍ、Ｓ、等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒ ｅｓ、（１９８２）　１０　：　８２２５）が含まれる。下記の挿入されるコー ド配列もまた限定的ではない。任意の適当なコード配列が、成熟蛋白質をもたら すようにＡＴＧ開始コドンと共に、又はＮＯ３配列の部分とリーディングフレー ムを合わせて、置換され得るであろう。

中間体キャリヤーベクターｐｃＭｃ６０の造成が第１図に要約される。このプラ スミドは、Ａ。チュメファシエンスＴｉプラスミドｐＴｉＴ３７　（Ｂｅｖａｎ 、Ｍ、等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、（１９８３）　１１　：３６９ 　；　Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、Ａ、等、Ｊ、Ｍｏ１．Ａ　ｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ　（１ ９８２）土：５６］、３）のＴ−ＤＮＡ領域中の３．２キロベース（ｋ　ｂ）　 ＨｉｎｄｌＩ［−２３ＤＮＡに由来するツバリン合成酵素（ＮＯ３）を操作する ことによって造成される。ｐＴｉＴ３７から得られた、完全なＮＯ３遺伝子を含 有する旧ｎｄＩＩ［２３断片を、ｐＢＲ３２５（Ｂｏｌｉｖａｒ。

Ｆ、等、Ｇｅｎｅ　（１９７８）　ｊ：　１２１　：ｌの旧ｎｄｌ［Ｉ部位にク ローン化することにより出発プラスミドｐｃＭｃ１　（８，９ｋ　ｂ）を得た。

ｐＣＭＣ１は、ＮＯＳプロモーター、ポリアゾニレ−ジョンシグナル、及び細菌 適合プラスミド誘導体においては“右側”Ｔ−ＤＮＡボーダー配列の入手源とし て役立った。

ｐｃＭｃ６０の造成は第１図及び下記に示す多数の中間体プラスミドを用いる。

これらは、その３′末端に旧ｎｄＩＩ［部位を含むように変形されたＮ　ＯＳブ ロモ−クーをもたらすｐｃＭｃ３０、その５′末端にＸｈｏｌを含むように変形 されたＮＯＳプロモーターをもたらすｐＣＭ３９　、並びにポリリンカー、ポリ アゾニレ−ジョンシグナル及び細菌宿主レプリコンをもたらすｐＣＭＣ４９であ る。

Ｄ、１１匹匹並 ｐｃＭｃ３０は、３′末端にＨｉｎｄ　ＩＩ［部位を含有するように変形された ＮＯＳプロモーターを含有するように造成された。この変形を行うためにＭｅｓ ｓｉｎｇ＋Ｊ、…江り且竺社吐Ｌｎ丘竺旦り匹Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　 ：　Ｒｅｃｏｎ　ｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ（１９８１）、Ａ、Ｗｉｓｅｔｏｎ　Ｑ 、エルゼビル、アムステルダム、１４３−１５３頁に概説されているのと本質上 同じプライマー修復反応を用いた。これは次のようにして行った。ｐＣＭＣ１を ５ａｕ３ＡＩで消化してＮＯＳプロモーターを含有する３４６　ｂｐ断片を切り 出した。この断片を単離し、そして単鎖Ｍ１３バクテリオファージ１１ｐ　ｌ　 ＯＲＦ　（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ。

Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１９　：　２６９　）のＢａｍＨＩ部位にクローン化 して７．５７ｋｂバタテリオフア一ジｍｃＭｃ１０生成せしめ、この構成を、Ｓ ｓｔ■及び）ｌｉｎｄＩ［Ｉで消化して予想される２６０ｂｐ断片を放出せしめ ることにより確認した。

５ａｕ３Ａ　Ｉ挿入部の配列がＮＯＳプロモーターを含有することが確認され、 そしてこのプロモーターの３′末端を囲む配列がジブトキシ配列決定法により、 Ｄｅｐｉｃｋｅｒ、　Ａ、等、Ｊ、Ｍｏｌ。

紅且匹ｅｎｅｔ、　（１９８２）Ｖｏｌ　Ｉ　、５６６頁に開示されているよう に予想される配列と一致することが確認された。このプロモータ７の３′末端を 、Ａ、　Ｔ　Ｇコドンの最初のＡ及び１４個の上流のヌクレオチドを含むように この断片を補充する合成オリゴヌクレオチド５　’　−ｐＴＴＧＣＡＧＡＴＴＡ ＴＴＴＧＧ−Ｏｆ（３’とのアニールよりプライマー修復反応を用いて変形した 。プライマー修復においては、５０重ｇの単鎖ｍｃＭｃ１０ＤＮＡをＨａｅＩ［ ［で消化し、そして５９７ｂｐ断片を単離した。１重ｇの単離された断片を１５ マー（前記）とアニールせしめ、そして標準的条件下ｄＮＴＰの存在下で７４Ｄ ＮＡポリマーラーゼエを用いて延長した。３′末端の残りの単鎖領域をアニール されたプライマーの５′末端まで同時に分解した。従って、生じたプライマー修 復された２本鎖断片は、ＮＯＳコード配列の位置１のＡＴＧコドンのＡの後の３ ′末端で終る。この２本鎖断片をＥｃｏＲＩで消化し、そして３２０　ｂｐＥｃ ｏＲＩ　／平滑ＤＮＡ断片を精製し、そしてｐＵｃ１３　（ポリリンカーを含有 する自由に入手できるｐＢＲ３２２誘導体；　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊｏ等、Ｇｅ ｎｅ　（１９８２）　１９：２６９を参照のこと〕に、次のようにしてクローン 化した。

ｐＵｃ１３　（１０ｐ　ｇ）を旧ｎｄＩ［Ｉで消化し、そして次にｄＮＴＰの存 在下でＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で消化し、そして次にＥｃ ｏＲＩで消化した。ベクター断片を上記の３２０ｂｐＥｃｏＲＴ　／平滑プロモ ーター断片と連結し、そして連結混合物をＥ、コリＭＭ２９４に形質転換した。

好結果の形質転換体をＡ　ｍｐ”により選択し、そして必要なプラスミドｐｃＭ ｃ３０を５ｓｔＩＩ　／Ｈｉｎｄ　ｍで制限分析することにより確認して予想さ れる１８８ｂｐＤＮＡ断片を得た。

正しい造成物はさらにジデオキシ配列決定により、挿入部と　ｐｕｃ　１３との 連結部に再形成された旧ｎｄｌｌ１部位を含有することが確認された。このプラ スミドはされにプロモーター配列に対して５′にＥｃｏＲＩ　、　Ｓｓｔ　Ｉ　 、及びＳｍａＩ／ＸｍａＴ部位を備える。従って、ｐｃＭｃ３０は便利なＥｃｏ ＲＩ　、　Ｓｓｔ　ｉ　ｓ又はＳ　ｍ　Ｔ　（Ｘｍａ　Ｉ　）　／Ｈ４ｎｄｎ［ カセットとしてＮＯＳプロモーターを提供する。

Ｄ・２・　Ｒ鼎暮ニー ｐＣＭＣ３９は他の中間体グラスミドであり、これは５′末端においでＸｈｏｉ 部位を含有するように変形されたＮＯＳプロモーターを含有する。ＸｈｏＴ部位 をｐＢＷｉ　４　（４３７５ｂｐ）から切り出した。ｐＢＷｉ４は、ｐＢＲ３２ ２のＫｌｅｎｏｌ、Ｉ修復された旧ｎｄｌｌＮ消化物４、：：、Ｘｈｏｌ含有、 ｔクタＥクレ：ｔチｉ’　（５’−ＣＣＴ（、ＧＡＧＧ−３’）が連結されたｐ ＢＲ３２２の誘導体である。ｐＢＷｉ４をＸｂｏｌで消化し、ｄＮＴＰの存在下 でＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）で消化し、そして次にＥｅｏＲ Ｉで処理した。約４ｏｂｐのＥｃｏＲＩ　／ＸｈｏＴ（平滑）断片を単離し、そ して２段階連結においてｐＣＭＣ２９のＳ　ｍａ　Ｉ　／　ＥｃｏＲＩで消化物 に連結した。ｐＣＭＣ２９は、ｐＣＭＣｌをＳａｕ　３Ａ　Ｉで消化しそしてｐ ｕｃ１３のＢａｎ部位に挿入することによりｐｃＭｌｌから最初に得られた未変 形のＮＯＳプロモーターを含有する。連結混合物を用いてＥ、コリＭＭ　２９４ を形質転換し、そしてＡｌ１１ｐｌ′コロニーを選択した。好結果の形質転換体 を目的とする３、　１　ｋｂプラスミドについて選択し、ｐＣＭＣ３９と命名し た。

従って、ｐＣＭＣ３９は、第１図に示すようにすぐ上流にＸｈｏＩ部位を含有す るように５′末端において変形されたＮＯＳプロモーターを含有する。この構成 は制限分析により確認された。

Ｄ。３゜　がアル柊 ｐＣＭＣ４９は中間体プラスミドｐｃｌ’１ｃ２０を介して、ＮＯＳポリアゾニ レ−ジョンシグナル及びポリリンカーセグメントを含有するように造成され、今 度はｐｃＭｃ２０は、発現プラスミドのためのポリリンカー源として使用される ｒｓａｉ０３と組合わされた、該当配列の源とし、てのｐｃＭｌｌの消化物を用 いて造成された。

ｐＣＭＣ１を５ａｕ３Ａ　Ｘで消化し、そしてＮＯ３遺伝子からのポリアゾニレ −ジョンシグナルを含有する５ｂｐ断片を単離した。

単離された断片を、ＢａｍＨ１消化されたｐｕｃ８　（自由に入手できるｐＢＲ ３２２の誘導体であって便利な造成のためのポリリンカーを含有する；　Ｍｅｓ ｓｉｎｇ、Ｊ、等（前掲）を参照のこと〕と連結し、そして連結混合物をＥ、コ リＮＮ　２９４に形質転換した。好結果の（Ａ、ｍｐＲ）形質転換体を予想され る３、０ｋｂプラスミドについてスクリーニングし、そして造成物を制限分析に よって確認した。ｐｃＭｃ２０はポリリンカーシグナルに対して５′にユニーク ５ｓｔｌ及びＳｍａｌ　（Ｘｍａｌ）を、そして該シグナルに対して３′にＳａ ｔ　Ｉ　、　Ｐｓｔ　Ｔ　、、Ｈａｅｎ、旧ｎｄｌｌｌ及びＢｓ５Ｈ］’Ｉ部位 を含有する。

ｐＣＭＣ４９を与えるため、ｐｃＭｃ２０をＸｍａｌで消化し、Ｋｌｅｎｏ−断 片及び４種類のｄＮＴＰにより平滑末端化し、そして次に５ａｉｌにより消化し た。　２６０ｂｐの目的とするターミネータ−シグナル断片を精製し、そしてＢ ａｍＨＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ修復）／５ａｌＩ消化ｒｓａ１０３精製ベクター＋ポ リリンカー断片に連結し、そして連結混合物をＥ、コリＭＭ２９４に形質転換し た。Ａｍｐ”形質転換体を選択し、そして目的プラスミドｐＣＭＣ４９について スクリーニングした。このｐＣＭＣ４９は、旧ｎｄＩ［［、Ｘｈａｌ、Ｂｇｌｍ 、Ｐｓｔｌ　、ＢａｍＨＴ及びＸｍａＩ／　（Ｓｍａｌ）部位を含有する５′ポ リリンカーと３’５ａ１１部位とに囲まれたシグナル断片、並びにｒｓａ１０３ からの複製開始点を含有する。（ｒｓａ１０３は、ＢＲ３２２の誘導体であって 、この誘導体においては（ｉ）Ｖχ（５ｅｅｄ、Ｂ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄ　Ｒｅｓ、　（１９８３）旦二２４２７）がらの小ＨｉｎｄＩ［Ｉ　−Ｂａｍ ＨＩ断片をｐＢＲ３２２の大胆ｎｄ　ＩＩＩ　−ＢａｍＨＩ断片中に挿入するこ とによって、旧ｎｄｌＩＩ、ＸｂａＩＳＢｇｌＩＩ、Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｂａｍ）ｌ 　Ｉ、及び５ａｌｌを含有するポリリンカーがテトラサイクリン耐性領域中の６ ２１ｂｐ　Ｈｉｎｄ　ｍ　／　Ｓ　ａｌ　Ｉベクター断片の代りに置き換えられ ており、そして（ｉｉ　）複製開始点を含有するバクテリオファージＭ１３ＲＦ からの５１４ｂｐ　Ｒｓａ　Ｉ　ＤＮＡ断片が旧ｎｄｌＩＩリンカ−と適合され 、旧ｎｄｌＩＩにより切断されそしてＨｉｎｄｌＩ［部位に挿入されている。ｒ ｓａ１０３においては、Ｍ１３ＲＦ複製開始点はｐＢＲ３２２部分のｂｌａ遺伝 子と同じ方向に向けられている。）Ｄ、４．且ＣＭＣ６０の完成 ｐＣＭＣ３９からの３′が変形されておらず５′にＸｈｏが補充されているＮＯ Ｓプロモーターと、ｐＣＭＣ４９からのポリリンカー−シグナル配列及びｒｓａ １０３ベクター断片を連結してｐＣＭＣ５９、すなわちｐｃＭｃ６０の調製にお ける後から２番目のプラスミドを得る。これはまた（変形された）中間体キャリ ヤーベクターである。これを行うため、ｐＣＭＣ３９をＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌ ｌＩで消化し・、消化物をＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄ　ｍ消化されたｐＣＭＣ４ ９に連結し、そして連結混合物を用いてＥ、コリＭＭ　２９４を形質転換した。

ＡｍｐＨコロニーを、ユニークＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［［部位並びに他の予想 される制限部位を含有する４、４８ｋｂプラスミドの存在についてスクリーニン グした。

選択されたプラスミドｐＣＭＣ５９は、幾つかの５′制限部位に先行され３′が 変形されていないＮＯＳプロモーターを含有し、このプロモーターはポリリンカ ー及びポリアゾニレ−ジョンシグナルより上流にあり、このシグナルの３′末端 に続き追加の制限部位及びｒｓａＬＯ３のベクター断片が存在し、この断片はＡ ｍｐ”遺伝子及びレプリコンを含有する。ｐＣＭＣ５９は別の形の中間体キャリ ヤーベクターであり、目的コード配列の挿入を許容し、この配列が適切なリーデ ィングフレーム内に挿入されればＮＯ３配列の最初の約１５アミノ酸との融合蛋 白質をもたらす。　変形されたプロモーターによって与えられる旧ｎｄｎ［の前 に成熟蛋白質のためのコード配列を挿入することを許容する一層便利な中間体キ ャリヤーベクターｐｃＭｃ６０を、ｐＣＭＣ５９及びｐｃＭｃ３０を用いて造成 した。３′が変形されたＮＯＳプロモーターを含有するｐｃｈｃ３ｏを５ｓｔＩ 及び旧ｎｄＩ［［で消化し７、そして１ｓｓｂｐプロモ一ター含有断片を単離し た。

ｐＣＭＣ５９もＳｓｔ及び旧ｎｄＩＩＩで消化し、そしてベクター断片を精製し た。これら２種類の精製された断片の連結混合物をＥ６コリＭＭ　２９４に形質 転換し、そして１００μｇ、／ｍｌのアンピシリン及び４０μｇ　／　ｍ　ｐの Ｘ−ｇａｌを含有する培地上で、白色の篩ｐ７コロニーについて選択した。（不 所望のｐｃＩ’１ｃ３０形質転換のためにＡｍｐ″であるコロニー青色である； 　ｐｃＭｃ３０はＭＭ２９４中でβ−ガラクトシダーゼの抑制をもたらすｌａｃ オペレーシーーを含有し、従ってもし存在すればＸ−ｇａｌプレーシーのコロニ ーに青色を与える。）白色Ａｍｐｌ′コロニーを、目的造成物ｐｃｌ’１ｃ６０ を含有する形質転換体についてスクリーニングした。

従って、ｐｃＭｃ６０はｒｓａ１０３からの狭宿主域細菌宿主ベクターセグメン ト及び遺伝子制限配列カセットを含有し、このカセットは、５′から３′の方向 に、カセット−ユニーク制限部位（特にＸｈｏ１部位）、Ｔｉプラスミドのツバ リン合成酵素遺伝子中のＡＴＧ開始コドンであるかもし、れないものにすぐ先行 するＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を含有するようにその３′において変形されているＮ ＯＳプロモーター、ポリリカーセグメント、及びＮＯ３遺伝子由来のポリアゾニ レ−ジョンシグナル、そして最後にこれに続く第２のカセット−ユニーク制限部 位Ｓａｌ■を含有する。

Ｅ。単一カセット発現キャリヤーベクター・の造成制御配列及び複製配列のため の中間体キャリヤーベクターとしてｐｃＭｃ６０を用いて、次のようにして、単 一カセット発現ベクターを造成した。

ｐｃＭｃ７０は、トランスポゾンＴｎ６０］、　（Ｔｎ９０３としても知られて いる）　Ｃ３ｈｓｒｐ、Ｐ、Ａ、等１．１．Ｍｏ１．　Ｂｉｏ　Ｉ　（１９７３ ）７５　：　２３５　；　Ｏｋａ。

Ａ、等、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　（ｉ９８１）Ｌ４７　：　２１７　）由来の 、アミノグリコシダーゼホスホトランスフェラーゼをコードする、切断されそし て変形されたＡＰＩ−、ｉ蛋白質（ここでｍｔＡＰＨ−Ｉと称する）のためのコ ード配列を含有する。この配列によりコードされる蛋白質は抗生物質Ｇ　４１８ 又は方丈マイシンに対する耐性を付与することができる。

ｐｃＭｃ７１ば、トランスポゾンＴｎ　５　（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ、　Ｒ，Ａ、 等、　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　（１９７９）１７７　：　６５）上にコ・−ドされてい る、同様の抗生物質耐性を付与する酵素ＡＰＲ−，Ｈのためのコード配列を含有 する。

さらに次のものが造成された： ｐｃＭｃ１０２　（挿入配列がβ−インターフェロンをコードする）。

ｐｃＭｃ１０３　（挿入部が、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するク ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする〕。

ｐｃＭｃ１２１　（ある種の昆虫の幼虫に対して致命的な、バシルス・チュリン ジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からのエンドト キシンであるＢｔ−１−キシンをコードする〕。

次の記載は、いうまでもなく単なる例示として意図される。

以下の項は、種々のコード配列源及びそれらのｐｃｈｃ６ｏへの挿入を記載する 。

Ｅ。１゜匹剋副 ｐＤＧ１４４は切断され変形されたＡＰＲ−１蛋白質（ｍｔＡＰＨ−ｆ　）のた めの変形されたコード配列を含有する。この配列は、プロリン（９３）をコード するＣＣＣコドンをやはりプロリンをコードするＯＣＴに転換することによって アミノ酸９３／９４のコドンにおけるＸｉｓ（Ａｍｓ　Ｉ　）部位を破壊するこ とにより、及びリジンをコードするコドンＡ、　Ａ　Ｃをやはりリジンをコード するＡＡＡに転換することによってアミノ酸１７５／１７６のＨｉｎｄＩ［Ｉ認 識部位を破壊することにより変形されている。さらに、ＡＴＧ開始コドンのすぐ 前の野性タイプ配列をＧＧＴＧＴＴからＡＡＧＣＴＴに変え、アミノ酸２〜１０ のコドンを除去しそしてＡＴＧ開始コドンをアミノ酸１１のコドンと融合せしめ ることによって、Ｎ−末端配列が切除されそして旧ｎｄＩ［Ｉ認識部位のすぐ下 流に置かれている。従って、ＨｉｎｄＩＩ［認識部位に直接先行されるＮ−末端 配列は、今やＡＡＧＣＴＴＡＴＧＴＣＧＡＧＧである。

ｐＤＧ１４４を旧ｎｄＩＩＩ及びＰｖｕＩ［で消化して、ｍｔＡＰＨ−Ｉの３′ 非翻訳配列中で終る１、２１ｋｂ断片を切り出し、そして接着末端連結条件及び 次に平滑末端連結条件のもとでの２相連結において、旧ｎｄＩＩ［及びＳｍａＩ 消化されたｐｃＭｃ６０と連結した。次に、連結混合物を用いてＥ、コリ財２９ ４を形質転換し、ＡｍｐＲコロニーを選択し、そして目的の５．６ｋｂ組換プラ スミドｐｃＭｃ７０の存在についてスクリーニングした。制限分析により正しい 配列が確認された。

Ｅ、２、ａ、ｐｃＭｃ７１ ＡＰＲ−ＩＩをコードするｐｃ？Ｉｃ７１を同様にして造成した。ＡＰＲ−ＩＩ 遺伝子は、カナマイシン耐性を付与するプラスミドであるｐＡＭＩ　［ｄｅ　Ｆ ｒａｍｍｏｎｄ、Ａ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　２（１９８３）土：　２６２ −２６９　）をＢｇｌＩ［及びＳｍａＩで消化して、目的のＡＰＩ−ＩＩコード 配列及び翻訳開始コドンに先行する追加の３６ｂｐを含む１．０ｋｂＤＮＡ断片 を得ることにより得た。ｐｃ？Ｉｃ６０中のポリリンカー配列はＢｇｌｎ及びＳ ｍａＩ認識部位を、生ずるＡＰＩ−ＩＩ断片を許容しそして発現せしめるために 正しい方向に含有し、そしてそれ由にこの断片をｐｃＭｃ６０のＢｇｌ　ＩＩ　 ／Ｓｍａ　Ｉ消化物に連結し、そして混合物をＢａｍＨＩで消化して不所望の断 片を不活性化し、そしてＥ、コリＭＭ　２９４を形質転換するために用いた。Ａ 　ｍｐ”及びクロラムフェニコール感受性コロニーを、５．３５ｋｂプラスミド の存在についてスクリーニングした。ｐｃＭｃ７１は制限分析により分析され、 そしてＳｍａ１部位を喪失していることが示され；構造の残りの部分は予想通り であった。

Ｅ、２．ｂ、ｐＣＭＣ７２の造成 第５図に記載するようにしてｐｃＭｃ７１がらｐＣＭＣ７２を造成した。

コノａ成ハＡＰＨ−ＩＩ　ｍＲＮＡの５′−非コード領域中のフレーム外ＡＴＧ コドンを除去し、そしてそれ由にｐｃＭｃ７１に比べて上昇したレベルのＡＰ） ｌ−ｎ蛋白質生産をもたらす。

ｐｃＭｃ７１をＰｓ口により部分消化して、ＡＰＲ−ＩＩコード領域内の、アミ ノ末端ＡＴＣから１７７ｂｐに位置するＰｓｔＩ部位を開いた。次に、このプラ スミドをＢｇｌｌＴで完全消化し、そしてＮ−末端コード配列及び５′非翻訳領 域を含有する２０７ｂｐのＢｇｌｌＩ／Ｐｓｔｌ断片、並びにほとんど完全な長 さのベクター断片（この２０７ｂｐ断片を欠いている）の両者を単離した。次に ２０７ｂｐ断片を５ａｕ３Ａ　Ｉで消化した。これは、８ｇｌｌｌ末端がらの追 加の２４ヌクレオチドを除去したが、Ｂｇｌｆｆ接着末端と適合性の４個のヌク レオチド接着末端（ＧＡＴＣ）を残した。次に、生ずる５ａｕ３Ａ　Ｉ　／Ｐｓ ｔ　ｌ断片をｐｃＭｃ７１の単離されたＢｇｌＩＩ／Ｐｓｔｌベクター断片と連 結し、そしてＥ、コリに形質転換してＡｍｐＲにした。正しいプラスミドｐＣＭ Ｃ７２を制限分析により確認した。

９０月Ｃ７２はｐｃＭｃ７１と同じであるが、但し、ＡＰＲ−、ＩＩの５′末端 においてフレーム外Ａ　Ｔ　Ｇコドン及び細菌性リボゾーム結合部位を除去する ２４ｂｐの欠失を有する。

Ｅ、３９匹迎卸、Ｌ ｐｃＭｃ１０２は、キャリヤー・カセットの構成成分と作用可能に連結したβ− インターフェロン遺伝子を含有するやβ−インター７ｆ−ロン遺伝子の入手源と して、ｔｒｐプロモーターの制御のもとにβ−ＩＦＮコード配列を含有するプラ スミドｐβ１ｔｒｐ３−４−１を用いた。これを旧ｎｄＩ［Ｉ及びＸ）ＩＯＩＩ で消化し、そして成熟β−インタ〜・フェロンコ・−ド配列を含有する５０２ｂ ｐ断片を単離した。ｐｃｈｃｓｏを旧ｎｄｍ及びＢｇｌＩ！で消化し２、そして この断片を精製されたβ−インターフェロン断片と混合し、連結し、そして次に Ｘｂａｌで処理して不所望の連結生成物を除去した。連結混合物を用いてＥ。コ リ聞２９４を形質転換し、そしてＡ　ｍｐ”ついて選択した。好結果の形質転換 体を目的とする４、８９ｋｂプラスミドについてスクリーニングし、そして正し い造成物ｐｃ１１ｃ１０２を制限分析により確認しまた。

Ｅ、４．　ｐｃＭｃ１０３ クロラムフェニコ・−ル耐性を付与する蛋白質をコードする、クロラム２エニコ ールアセチルトランスラーゼ（ＣＡＴ）　をコードする遺伝子をｐＢＲ３２５（ Ｂｏｌｉｖｅｒ　、　Ｆ、等、Ｇｅｎｅ（１９７８）　ｊ：１２１〕から、Ｔａ ｇＩによる消化によって生成した７７５ｂｐ断片を単離することにより切り出し た。このＴａｇｌ断片をｐＬｌｃ１３中のポリリンカーのＡｃｃＩ部位にサブク ローン化することにより、ＡＴＧ開始コドンの４５ｂｐ上流の旧ｎｄＩ１１部位 とＴＡＡ終止コドンの１００ｂｐ　３　’のＸｍａＩ部位との間のＡＣＴコード 配列を含有する中間体プラスミドを得た。この中間体プラスミドから旧ｎｄ　ｍ 　／Ｘｍａ　ｌ断片を切り出し、そして精製した。

ｐｃＭｃ６０をＸｍａＩ及びＨｉｎｄＩ［［で消化し、そしてこの線状ＤＮＡを 前記の断片と連結し、次にＢｇｌｎ消化して不所望の生成物を不活性化した。連 結混合物をＥ、フリ聞２９４に形質転換し、そして好結果のコロニーをＡ、ｍｐ ”について選択した。目的ベクターｐｃＭｃ１０３を制限分析により確認した。

Ｅ、Ｓ、西回１２１ Ｂｔ−）キシンのための単一カセットキャリヤー発現ベクターであるｐｃＭｃ１ ２］を、ｐｃ１１ｃ６０を用いて、前記の造成と同様にして造成した。この造成 を第２図に要約する。

組換プラスミドｐＥＳＩ　（Ｗｏｎｇ等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９８３ ）２５８　：１９６０　；並びに５ｃｈｎｅｐｆ及びＷｈｉｔｅｌａｙ、Ｐｒｏ ｃ、Ｎ５ｔ１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

孤旦）（１９８１）７８　：　２８９３）は、挿入部としてＢｔ−トキシンのコ ード配列を含有するｐＢＲ３２２の誘導体である。さらに、ヨーロッパ出願公開 Ｎ１１００６３９４９（１９８２年１１月３日）を参照のこと。

Ｅ。コリに１２／）ＩＢＩＯＩ中のｐＥｓＩは、ブタペスト条約のちとに阻３１ ９９５としてＡＴＣＣに寄託されている。　ｐＥｓＩを細菌性トランスポゾンＴ ｎ５により、Ｇｕｙｅｒ＋Ｍ、Ｓ、等、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｎｚ　ｍｏｌ、（１ ９８３）１０１　：３６２の方法に従って変異処理して、Ｂｔ−トキシンに対し て５′にＸｈｏｌ認識配列を挿入した。ｐＥＳＩ−Ｔｎ５プラスミドから５．８ 　ｋｂ　Ｘｈｏ　ｌ断片を単離し、そしてｐＵＣ９のＳｃｉ１部位に挿入した。

連結混合物を使用してＥ９コリＫ］、２　ＪＭ８３（ＢＲＬから入手することが できる）を形質転換し、そして好結果の形質転換体をＡｍｐ”及びＬａｃ”によ り選択した。好結果の形質転換体を目的とする８、６ｋｂプラスミドの存在につ いてスクリーニングし、そして目的ｐＳＹＣ８２３の構成を制限分析により確認 した。

コード配列の末端に適切な制限部位を置くことによって、ｐｓＹｃ８２３をさら に変形した。５′末端に旧ｎｄｌＩ［を形成するため、ｐＳＹＣ８２３をＮｄｅ ｌにより完全消化し、そしてｄＡＴＰ及びｄＴＴＰの存在下でＫｌｅｎｏ−によ り平滑末端化した。ＢｉｎｄｌＩ［による完全消化の後、このＤＮＡを、Ｓｍａ ！及び旧ｎｄＩ［Ｉで消化されたファージベクターＭ１３ｍｐ８に連結した。Ｂ ｔ−トキシンのジ（中間体■）をミニブレブＤＮＡ分析（ｔ（ｏｌｍｅｓ、Ｄ、 Ｓ、等、江、Ｌ旺匹垣狸、　（１９８１）旦４：１９３）により同定した。

次に示すようにＡ　”ｒ　ｃ開始コドンの５′側配列の１塩基挿入ミスマツチ及 び旧ｎｃ１１１１部位を含有する次のプライマー、５　’　ＧＡＧＧＴＡＡ　Ｃ Ｔ丁ＡＴＧＧ　３　’　（Ｂｔ−トキシン配列）３　’　ＣＴＣＣＡＴＴＣＧ旦 ＴＡＣＣ５’　（プライマー）旧ｎｄｌｌｌ を用いて、Ｍｏ１ｌｅｒ、　Ｍ、Ｆ、等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 、　（１９８２）１０　：６４８７に記載されているようにして、目的ファージ の単鎖ＤＮＡ型を変形してＡＴＧ開始コドンのすぐ５′側に旧ｎｄｌｌ［部位を 得た。生じた形成されたベクターをｎ＋ｐ８ＢｔＲＦと命名した。

次のようにして、ｐＳＹＣ８２３中のＢｔ−）キシンコード領域に隣接して３　 ’　ＨｉｎｄｌｌＩ部位を置いた。ｐＳＹＣ８２３の他のサンプルをＮｄｅＩよ り部分消化し、Ｐｓｔｌにより完全消化し、そして４種類すべてのｄＮＴＰの存 在下でＫｌｅｎｏ−を用いて平滑末端化した。７．Ｏｋｂ断片を精製し、自己連 結し、そして次にＥ、コリ聞２９４に形質転換した。目的とする中間体プラスミ ドはｐｃｎｃ１２０と命名され、そしてベクターのユニークＰｓｔＩ部位からＢ ｔ−）キシンコード領域までのバシルス（Ｂａｃｉ　１１ｕｓ）配列の１、６　 ｋｂの欠失を伴うｐＳＹＣ８２３を代表する。この除去が、ｐｔｌｃ９ベクター の旧ｎｄｎｌ’部位をトキシンコード領域の３′末端に直接隣接して配置し、そ してＰｓｔ１部位を破壊した。

Ｂｔ−トキシンコード配列をｐｃＭｃ６０中間体プラスミドに、２つの部分、す なわちｍｐ８Ｂ　ｔＲＦの旧ｎｄＩＩＩ変形セグメントからの５′部分及び上記 の中間体プラスミドのｐｃＭｃ１２０３　’　Ｈｉｎｄ■変形Ｂｔ−）キシンコ ード配列からの３′部分として挿入した。

ｍｐ８Ｂ　ｔＲＦを旧ｎｄＩ［［及び５ｓｔ４により完全消化し、そして１．４ ｋｂ断片を単離した。ｐｃＭｃ１２０を５ｓｔｌにより完全消化し、次に旧ｎｄ ｍにより部分消化し、そしてｐＵｃ９ベクタ一部分のＨｉｎｄＩ［１部分から遺 伝子内に位置する５ｓｔ１部位までの２．３ｋｂＤＮＡ断片を精製することによ り第２断片を得た。前記の２個の断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化されＢＡＰ処理さ れたｐｃＭｃ６０と連結し、そしてＥ、コリＭＭ　２９４に形質転換した。Ａ　 ｍｐＨコロニーを選択し、そしてｐｃＭｃ１２１の存在についてスクリーニ、ソ ゲした。　ｐｃＭｃ１２１は、ＮＯＳプロモーター及びポリアゾニレ−ジョンシ グナル配列の制御のもとにＢｔ−）キシンの完全フ・−ドを含有する。

Ｅ、６．　量査ｌ皇ｌユ１碧ｐＬ矛に適当な中間体及礎黄已」先−ｐ　’Ｊヤー プラスミドの造成ｐｃＭｃ１０１はｐｃＭｃ６０に類似するが、但し、成熟コ・ −ド配列の挿入のために適当な便利な旧ｎｄＩ１１部位中で終るＮＯＳプロモー ターの代りに、ｐｃＭｃ１０］　はβ−ガラクトシダーゼのためのコード配列と 融合したＮ　ＯＳプロモーターを伴うキメラセグメントを有する。β−ガラクト シダーゼコドンとリーディングフレームを合わせた、目的コード配列のその後の 挿入が、β−ガラクトシダーゼ配列及び挿入されたコドンに対応するアミン酸配 列の両者を含有する融合蛋白質をもたらす。これはまた発現キャリヤーベクター であって、ＮＯ３−β−ガラクトシダーゼ融合の効果的な発現を行うことができ る。造成を第３図に要約する。

プラスミドｐＭｃ１４０３　（Ｃａｓａｄａｂａｎ、Ｍｌ、等、Ｊ、Ｂａｃｔｅ ｒｉｏｔ。

（１，９８０）１４３　：　９７１〕は５′末端にポリリンカーを伴うβガラク トシダーゼコー　ド配列を含有する。便利な３′末端制限部位を得るため、ｐＭ ｃ１４０３の１ａｃ−Ｚ部分を、ＥｃｏＲＴ　（ボリンカー中を開裂する）及び １ａｃ−ｚ遺伝子［Ｂｕｃｈｅｌ、Ｄ、Ｅ、等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０）２８ ３　：　５４１）のちょうど３′を開裂するＣ１．ａｌで消化することにより切 り出した。このＥｃｏＲＩ　／Ｃ１ａ　Ｉ　３．４　ｋｂ断片を、ＥｃｏＲＩ　 ／Ｃ１，ａ　Ｉ消化さたｐＯＧ２３２６　（Ｅ　、　コリ及びＢ、ズブチリスの 両者くおいて複製することができそしてｐＢＲ３２２に由来する２機能性レプリ コン）中にクローン化してｐＤＨ５４２５を得た。

ｐＤＨ５４２５をＢａｍＨＩで消化して、１ａｃ−Ｚの１１番目のコドンにおけ るポリリンカー配列のＢａｍ）ｌ　Ｉ部位からベクタープラスミドのＴｅｔ”遺 伝子のＢａｍＨＩにわたる３゜８ｋｂ断片を得た。ＢａｍＨ■をｐＵｃ１３のＢ ａｎ）ｌ　Ｉ部位にサブクローニングしてｐｃＭｃ９１６３を得た。従ってｐｃ Ｍｃ９１６３は、１ａｅ−Ｚ遺伝子上に次のような５′末端ポリリンカーを有す る。

アミノ酸＃：（？　＋０　１＋　１２　１３ｘｄａｌ　Ｂａｍ）ｌ　Ｉ キメラプロモーター／コード配列を造成するため、変形されていないＮＯＳプロ モーターを含有するｐＣＭＣ２９中間体プラスミド（Ｄ、２．項）を使用した。

このプラスミドは、もとのＮＯＳコード配列のコドン１６の次に次のようなポリ リンカー領域を有する。

アミノ酸＃　：　１６　１７”　１８”　１９”　２０”　２１”　２２“２３ ”　２４”　２５”　２６“５ａｕ３Ａ　Ｉ　／ＢａｍＨＴ　ｚｂａ　Ｉ　Ｈｉ ｎｄＩＩＩ融合 ここで、＊は天然ＮＯ３配列の代りに置き換えられたコドンを表わす。

ｐｃＭｃ２９及びｐＣＭＣ９１，６３のＸｂａＩ部位は同一のリーディングフレ ーム内にある。さらに、ｐＣＭＣ２９中のポリリンカーの３′末端及びｐｃＭｃ ９１６３中のβ−ガラクトシダーゼコード配列の３′末端にユニーク旧ｎｄｌｎ 部位が存在する。従って、両プラスミドを旧ｎｄＩＩＩ及びＸｈａｌで完全消化 し、断片を連結し、そして連結混合物をＥ、コリＭＭ２９４に形質転換した。好 結果のコロニーをＡ　ｍ　ｐ　”について選択した。

従って、生ずるプラスミドｐｃＭｃ１７は、ｐｔｌｃ１３ポリリンカーの制限部 位ＥｃｏＲＩ　、、Ｓｓｔ　Ｉ、ＳｍａＩ　（Ｘｍａｌ）、、ＮＯＳプロモータ ー、及びＩａｃ−Ｚ遺伝子に正しいリーディングフレームで融合したＮＯ３のア ミン末端コード領域、コドン１８がら下流のβ−ガラクトシダーゼコード領域、 及びこれに続（Ｈｉｎｄ　ｍ部位を含んで成る。

キメラＮＯ５／１ａｃ−Ｚ配列を含有する中間体（そして発現）キャリヤーベク ターｐｃＭｃ１０１の造成を完結するため、ｐｃＭｃ６０をＥｃｏＲＩ及び旧ｎ ｄｌＩＩで消化し、そしてこのベクター断片を、ＥｃｏＲＴ及び旧ｎｄＩＩＩで 消化することによりｐｃＭｃ１７から得られたＮＯＳプロモーター及びアミノ− 末端コドン並びに融合した１ａｃ−Ｚ遺伝子を含有する３、４ｋｂ断片と連結し た。生じたベクターｐｃＭｃ１０１　ハ、Ａ　ｍｐ”について選択された好結果 のＥ、コリＭＭ　２９４から、目的とする７、９ｋｂプラスミドについてスクリ ーニングしそして制限分析によって確認することによって得各発現キャリヤーベ クターは発現力セントの５′及び３′の両方に便利なカセットユニーク制限部位 を担持するため、これらのカセットを簡単な方法で複数カセットベクターに組み 換えることができる。ＡＰＩ−ｎのためのｐｃＭｃ７１中のコード配列は選択可 能なマーカー特性をもたらすので、ｐｃＭｃ７１を上記の他のキャリヤー発現ベ クターの発現カセットの受容体ベクターとして使用した。言うまでもなく、造成 された種々のキャリヤーベクターの任意のものの間で交換を行うことが可能であ る。

ｐＣＭＣ７７は、ｐｃＭｃ１０２からのβ−インターフェロン配列及びＡＰＨ− ＩＩコード配列を含有する。このベクターを造成するため、ｐｃＭｃ１０２をＸ ｈｏＩ及び５ａｌｌＩにより完全消化し、そして目的とする１、１ｋｂ　ＤＮＡ 断片を精製した。この断片を、５ａｌＩ消化されＢＡＰ処理されたｐｃＭｃ７１ と連結し、そして連結混合物をＥ、コリＭＭ２９４に形質転換した。Ａ＋＋＋ｐ ”コロニーを目的とする６、５ｋｂプラスミドｐＣＭＣ７７の存在についてスク リーニングした。制限分析により正しい構成を確認した。ＸｈｏＩ及び５ａｌｌ 接着末端の連結は５ａｌｌ又はＸｈｏ１部位のいずれも再生しないので、もし供 与体発現力セントが受容体ベクターＤＮＡ配列と単一方向的（ｕｎｉｄｉｒｅｃ ｔｉｏｎａｌ）であれば、生ずるベクターは列の５′及び３′末端において“カ セット・ユニーク”のままのＸｈｏＩ及び５ａｌｌ部位を有し；もし逆の方向付 けが生ずれば発現カセ７）間に５ａｌｌ部位が存在する（前記の８．２９項を参 照のこと）。

ｐＣＭ（ＪＯ３からＣＡＴカセットを、ｐｃＦＸｃ７ｏからｍｔＡＰＨ−Ｉカセ ットを、そしてｐｃＭｃ１２１からＢｔ−）キシンカセットを調製するために同 様のＸｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｔ　Ｉ消化を用いた。これらの断片を５ａｉｌ消化ｐ ｃＭｃ７１に連結して次の２重カセット発現キセリャーベクターを形成しまた。

　、 ＡＰＲ−ＩＩ　カセ−／　）及びＣＡＴ力（！　ソトを含有するＰＣＭＣ７８、 ＡＰＩ−Ｉ［力（＝ノド及びｍｔＡＰＨ−Ｉカセットを含有するＰＣＭＣ７９、 ＡＰ帽■カセット及びＢｔ−）キシンカセットを含有するＰＣＭＣ７５゜遺伝子 に対して５′側にＸｈｏＩ部位がないのでその代りにＥｃｏＲＩ（５’力セフト ーユニーク部位）、及び５ａｌＩで消化することにより、ｐｃＭｃｌｏｌからＮ ０Ｓ−１ａｃ−Ｚ融合カセットを得た。この５　’　ＥｃｏＲＩ　／’３　’　 Ｓａｌ　Ｉガラクトシダーゼキメラを、ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏｌにより消化され たｐｃｌ’１ｃ７１に連結し、ミニブレブに従って選択して２重カセット＆ｌｌ 換プラスミド（ｐＣＭＣＴ６）≦２ｉ二亘観 ＰＣＭＣ９０、ｐｃ１１ｃ９１及びＰＣＭＣ９２は、ボーダー配列により囲まれ たｎ＋ｔＡＰＨ−１又はＡＰ旧旧道遺伝子ための、そして広宿主域細菌性複製開 始点を有する単一カセット発現ベクターである。これらの造成が第４図に要約さ れる。第４図に示されるごとく、ＰＣＭＣ９１は、ｍｔＡＰＨ−１コード領域を ＰＣＭＣ７１からのＡＰＨ−■コード領域で置き換え、ることによってＰＣＭＣ ９０から造成される。ｐｃ？１ｃ９２は、ｐｃ？Ｉｃ７１　ｆ１７）代りニｐｃ Ｍｃ７２を用イＴ　ｐＭｃｌ’ＩＣ９０がら造成される。これらのプラスミドは アグロバクテリウムに介在される形質転換において使用するために適当である。

Ｇ、１９匹匹観ｑ遺底 ＰＣＭＣ９０を下記の中間体ベクターから、右側ボータ゛−（ＲＢ）Ｔ−ＤＮＡ と共に適切な制御セグメントを有するｍｔＡＰＨ−Ｉコード配列を含有するｐｃ Ｍｃ８０からの２．８ｋｂＥｃｏＲＩ　／　Ｓ　ａｌ　１カセツトを、左側ボー ダー（ＬＢ）領域を担持する広範囲複製宿主プラスミドｐＣＭＣ２５に挿入する ことＧこより造成した。

Ｇ、１．ａ、ＰＣＭＣ８０の観 Ｅ、１項において記載したようにして調製さね、たＰＣＭＣ７０Ｌよ、変形され 切断された（ｍｔ）優性選択マーカーｍｔＡＰＨ−１のためのキャリヤー発現ベ クターである。これしよ、コート配タリに直接先行するＥｅｏＲＩ　／　）ｆｉ ｎｄ　ＩｎカセントとしてＮＯＳプロモーターを含有する。ＰＣＭＣ８０中では 、このカセ：ノト番よより大きなＥｃｏＲＴ　／　ＨｉｎｄＩＩＩカセットによ り置き代えられ、このカセットは、ＰＣＭＣ７０中のように翻訳開始のための部 位に直接光１テするＰＣＭＣ７０中のようにプロモーターの３′末端Ｇこ）Ｉｉ ｎｄＩ［１部（立を有するように変形されたＮＯＳプロモーターと共に、ｐＴｉ ７３７カ１らのＲＢ配列を含有する。

ｐｃＭｃｌを）ｉｉｎｄＩＩ［で消化し、ｄＮＴＰの存在下でＰ　ｏｌ　Ｉ　ｋ ｌｅｎｏ−断片で処理し、そして次に５ｓｔｌＩで消化した。　１．１ｋｂ　Ｈ ｉｎｄｌｎ（平滑）／５ｓｔＩＩ断片を単離し、そしてＰＣＭＣ７０をＸｈｏｌ でｔ肖化し、Ｋｌｅｎｏ−及びｄＮＴＰで処理し、そして次に５ｓｔＩ［でン肖 イヒすることによって得られたＤＮＡ断片と連結した。連結混合物からの約２０ ０ｎｇのＤＮＡを用いてＥ、コリＭＭ２９４を形質転換してＡ　ｍｐ”にした。

好結果のコロニーを目的とする６、５５ｋｂ組換プラスミドｐＣＭＣ８０につい てスクリーニングした。ｐｃＭｃ８０は、Ｔｉ　Ｔ−ＤＮＡ　ＲＢ　。

ＮＯＳプロ９モーター、ｍｔＡＰＨ−１コ一ド配列、並びにＮＯＳポリアゾニレ −ジョンシグナル及びこれに続＜５ａｌＩ部位を含有する。Ｐｏ１．Ｉ処理され たＸｈｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位の融合はＨｉｎｄ■部位を再生すると予想さ れるとしても、選択されたプラスミドｐｃＭｃ８０はこの部位を失っている。前 記の配列は２゜８ｋｂＥｃｏＲＩ／５ａｌＩ　ＤＮＡ断片として得られ、ＰＣＭ Ｃ７０の５　’　Ｘｈ。

１部位は喪失している。従って、ｐｃＭｃ８０は、転写カセットに対して適切に 配置された右側ボーダー配列を含有し、狭宿主域細菌性複製開始点を有する外来 性遺伝子のためのキャリヤー発現ベクターを例示するものである。

Ｇ、１．ｂ、ＰＣＭＣ２５の造成 ｐＣＭ（：２５を次のようにして造成した。ＬＢ配列を、ｐＴｉＴ３７か７ら、 標準的方法を用いてＥｃｏＲＩで消化しそして１．６ｋｂ断片２９を単離するこ とにより得た。この断片をｐＡＭｌのＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。ｐＡＭ ｌはｐＢＲ３２５の誘導体であり、これにはＡＰＩ−ＩＩ抗生物質耐性遺伝子を 含有するトランスポゾンＴｎ５からの１．５ｋｂ　Ｈｔｎｄ　ＩＩＩ　／　Ｓ　 ａｌ　Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片がＴｅｔ”遺伝子の旧ｎｄＩＩＩ　／　Ｓａｔ　Ｔ　 ’５５域に代って存在する。

こうして変形されたｐＡＭ１ベクターを含有する連結混合物をＥ、コリＭＭ２９ ４にクローン化し、そしてＡ　ｍｐＲについて選択した。好結果のコロニーを、 ＡＰＩ−ｎ遺伝子に隣接するＴ−ＤＮＡのＬＢ領領域含有する、目的とする８、 １ｋｂプラスミドｐＣＭＣ５についてスクリーニングした。

スルホンアミド耐性（Ｓｕ”）遺伝子を含有しそしてＥ。

コリ及びＡ、チュメファシエンスの両者において複製することができる広宿主域 多数コピープラスミドであるＲＳＦ　１０１０（Ｂａｇｄｌｏｌｏ（Ｂａ、　Ｍ 、等、　Ｇｅｎｅ　（１９８１）　１６　：　２３７　）のベクタ一部分を用い ることにより、ｐＣＭＣ５をさらに変形して広宿主域細菌性複製開始点を与えた 。これを行うため、ｐＣＭＣ５をＢｇｌ■により部分分解し、そして次に５ａｌ Ｉによりさらに消化して、Ｔ−ＤＮＡ　ＬＢ配列及び隣接するＡＰＲ−ｎを含有 する目的とする３、４ｋｂ　Ｂｇｌ　ＩＩ　／　Ｓａｌ　Ｉ断片を調製した。こ の断片をＫｌｅｎｏｗ及びＮ　′ｒ　Ｐ　ニより修復して、配列５　’　−ＧＡ ＴＣＴ−ＬＢ−ＡＰＩ−ＩＩ　−ＧＴＣＧＡ−３′を有する平滑末端断片を得た 。この平滑末端断片を、５ｓｔＩで消化されＫｌｅｎｏｗで修復されたＲ５ＦＩ ＯＩＯ（従ってこれは５’Ｃ及び３’Ｇ末端ヌクレオチドを有するベクター配列 をもたらす）と連結した。この連結混合物をＥ、コリＭＭ２９４に形質転換し、 そして好結果の形質転換体をＫ　ａｎ”及びＳｕ”により選択し、そして好結果 の形質転換体を適切な１２．７ｋｂプラスミドについてスクリーニングした。ｐ ｃＭｃｌ５の正しい構成を制限分析により確認した。目的とする造成物はＡＰＩ −ｎの連結点において１個の５ａｌＩ部位を含有するがＳｓｔ　Ｔ及びＢｇｌ■ 部位を失っている。

ｐｃＭｃｌ５をさらに変形してＴ−ＤＮＡ−ＬＢ上セグメント隣接してポリリン カー領域を挿入した。ポリリンカーはＩ）ＵＣｌ３から、ＥｃｏＲＩにより消化 、Ｋｌｅｎｏｅｖ及び４種類すべてのＮＴＰによる修復、及びそれに続くＳａｌ ■による消化によってｇＨ−した。

このことが５ｓｔｌ、ＳｍａＩ　（Ｘｍｏｌ）　、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、及び Ｓａｌ１部位を含有する３２ｂｐ　ＥｃｏＲＩ　（平滑）／５ａｉｌ断片をもた らし、この断片を標準的方法により単離した。この断片を、ｐｃＭｃ１５をＥｃ ｏＲＩにより部分消化してＬＢとＡＰ）Ｉ−ＩＩとの間のＥｃｏＲＩ部位を開き 、Ｋｌｅｎｏ−で修復し、そしてさらに５ａｌＩにより消化することにより調製 された単離された１０．２ｋｂ断片と連結し７た。連結混合物をＥ、コリ聞２９ ４に形質転換してＳｕ”とし、そして次に形質転換体をカナマイシン感受性につ いてスクリーニングした。この形質転換体を、Ｌ、　Ｂ配列に近位にポリリンカ ー領域を含有する目的とする１０．２ｋｂプラスミドｐｃ？１ｃ２５についてス クリーニングした。

Ｇ・１・Ｃ＝　匹匹刈ｐ】滅 目的とするｐｃＭｃ９０を次のようにして造成した。ＰＣＭＣ２５をＥｃｏＲＴ 及び５ａｉＮにより消化してポリリンカー領域に次ぐベクターを開いた６ｐｃＭ ｃ８０をＥｃｏＲＩ及び５ａ１１で消化してｍｔＡＰＨ１発現カセットを遊離せ （−め、これを精製しそして開かれたｐＣＭＣ２５ベクターと連結した。連結混 合物を使用しでＥ、コｌｊ　ＭＭ２９４をＳｕ”＆：形質転換し、そしてＡｍｐ ’形質転換体を目的とする１２．９ｋｂ発現主ヤリャーブラスミドｐｃＭｃ９０ についてスクリー・ニングした。

要約すれば、ｐｃＭｃ９０は広宿主域プラスミドＲ３ＦＩＯＩＯの多コピー性Ｓ ｕ’Ａｍｐｓ誘導体であって、Ｔ　−Ｄ　Ｎ　Ａ右側及び左側ボーダー配列に囲 まれた、変形されたｍｔＡＰＨ−ｉ配列のための発現カセットを含有する。挿入 されたカセットは、ポリ７デニ、シーションシグテルと１．Ｂ配列との間のその ３′にユニーク５ａｉＮ部位を含有Ａる。

Ｇ、２．　９０ＭＣ９１の瀘Ｕ茗 ｐｃ？１Ｃ９１を得るため、ｐｃＭｃ９０を旧ｎｄｌｎ及び５ａｌＩで消化し、 そして約１１．５ｋｂのベクター断片を精製した。ｐｃ′ＦＩＣ７１をＨ４ｎｄ ｌＩ［及び５ａｌｌで消化し、そしてＡＰＩ−、ＩＩコード領域及びＮＯ３停止 領域を含有する１、３ｋｂ断片を精製した。次に、１１．５ｋｂベクター及び１ ゜３ｋｂＡＰＨ−Ｉｔ断片を連結し、そしてＥ、コリ財２４９に形質転換して３ 　ｕ　Ｒとした。ｐ（ＪＣ９１の正しい構成を制限分析により確認し、そして９ ０ＭＣ９１を１９８５年４月１０日ごろ、受託番号−とし、７てＡＴＣＣに寄託 した。

Ｇ、３．が貰り力ｌ流床 ＰＣＭＣ９２を、９０ＭＣ９１について記載したのと正確に類似する方法で造成 し７た。世しＡＰＩ−１１遺伝子源としてＰＣＭＣ７１ではなくρＣＭ　Ｃ７２ を使用しだ。従って、ＰＣＭＣ９２は、フレーム外ＡＴＧ及・び細菌性リポゾー ム結合部位を欠（ＡＰ）ｌ−ＩＴ遺伝子のための変形された５′非翻訳領域を有 する。ＰＣＭＣ９２は１９８５年４月１０日ごろ受託番号隘−としてＡＴＣＣに 寄託された。

Ｇ、４．　２１１Ｅ遣±二士広宿主墳二エニ旦Ｎ人二±ニダニ溌ユ土土去笠ゴぜ ｌ二Δｌ底 ｐｃＭｃ１１２は、広宿主域レプリコンを有するベクター上にＡＰＲｌ、［及び β−ＩＦＮのためのＴ−ＤＮＡボーダー２重発現カセットを含有する。これは、 ＰＣＭＣ９１を５ａｌＩで消化し、ＢＡＰで処理し、そしてこの線状化ＤＮＡを 、ｐｃＭｃ１０２のＸｈｏ　Ｉ　／　Ｓａｌ　Ｉ消化の後に単離される１、、１ ｋｂ断片と連結することによって調製した。連結混合物をＥ、コリ聞２９４に形 質転換し、そしてＳ　ｕ　ＩＩコロニーを目的とする１３．８ｋｂ　ｐｃＭｃ］ 、］、２についてスクリーニングした。このものはＩＦＮカ七ソトとＬＢ配列と の間にユニーク５ａｉＮ部位を含有する。

正確に同様の方法において、発現キャリヤーベクターｐＣＭＣ７０（Ｅ、１．、 項）　、ｐｃＭｃ１０３（Ｅ、４．項）、及びｐｃＭｃ１２１　（Ｅ、５．項） がらＸｈｏ　Ｔ　／　Ｓａｌ　Ｔ発現カセットを切り出し、そしてｐＣＭＣ９］ のＳａｌ　ｒ部位？、こ連結した。こうして、アグロバクテリウムにより介在さ れる形質転換に適合する下記の２重カセット発現キャリヤーベクターを製造した 。

ＡＰ）Ｉ−Ｕ　、’ｙ　（？　−／　ト及びｍｔＡＰＨ−１カセットを含有すル ｐＣＭＣ１１４１ＡＰＨ−ＩＩカセント及びＣＡＴカ七ノドを含有するｐｃＭｃ １１３　；ＡＰＨ−ｎカセット及びＢｔ　−）キシンカセットを含有するｐｃＭ ｃ１２３゜ｐｃＭｃ１２３　？！：、１９８５年４月ｉｏ日ごと受託番号患−一 −としてＡＴＣＣに寄託された。

上記のすべてにおいて、カセット列は右側ボーダー及び左側ボーダーＴ−ＤＮＡ 配列に囲まれており、広宿主域複製開始点を含有するプラスミド上にあり、そし てほとんどの場合にカセット列のポリアゾニレ−ジョンシグナルとＬＢ配列との 間にカセット・ユニーク（ＳａｌＩ）部位を含有する。しかしながら、８．２に 記載したように、供与体力セ７）の逆の方向付けが複数の発現力セント間への５ ａｉＮ部位の配置をもたらすであろう。

さらに、ＥｃｏＲＩ　（平滑）／５ａｉ１カセットをｐｃＭｃｌｏｌ　（Ｅ、６ ゜項）から単離し、そしてＳａｔ　Ｉ　／　Ｓｍａ　Ｉ消化ｐＣ）’ＩＣ９１ニ 連結することができる。他方、ｐｃＭｃｌｏｌを５ａｌｌで消化し、そしてこの プラスミドを５ａｌＩ消化した９０ＭＣ９１と連結して一体化（ｃｏ　ｉ　ｎ　 ｔｅｇｒａ　ｔｅ）プラスミド（ｐｃＭｃ９１／１０１）を生成せしめることが でき、ξのプラスミドにおいては完全ガラクトシダーゼ発現ベクターがベクター ｐｃＭｃ９１に挿入されている。

以下の例は、上に調製した発現キャリヤーベクターの使用及びその結果を例示す る。Ｈ６項においては、ｐｃＭｃ７１、ＰＣＭＣ９１、及びＰＣＭＣ７７を用い る植物細胞の直接形質転換が例示される。言うまでもなく、同じ態様で、他のす べてのベクターを使用することができた。

１９項は、アグロバクテリウム介在形質転換におけるＰＣＭＣ９１、ｐｃＭｃｌ ｌｌ　、及びＰＣＭＣ１２３の使用を例示する。０９項においてその造成を例示 したすべてのベクターを同様に使用することができた。

Ｈ，９６ＭＣ７１、Ｃ？ＩＣ９１、墾西回７７を用いる直−豫診！藝換コノ項の 方法を用いてｐｃＭｃ７１．９０ＭＣ９１、及びＰＣＭＣ７７により植物細胞を 形質転換した。この項において使用する場合“発現キャリヤーベクター”なる語 はこれら３種類のプラスミドのそれぞれを意味する。

Ｎ、タバクム（Ｎ、ｔａｂａｃｕｍ）　ｖａｒ、　Ｈ４２５の原形質体を無菌の 芽からＫｒｅｎｓ等、Ｘ凹旦（１９８２）　２９６　：　７２の方法により調製 し、そして０．４Ｍシュークロース、０．１■／ｌのナフタレン酢酸（Ｎ　Ａ、 　Ａ　）及び０．２　ｒｒｇ／　Ｉ！のカイネチンを含有するに３培地中に懸濁 した。原形質体（１ｍＡ’中５Ｘ１０’細胞）を、］、４４０ｍＭＮａＣ１，、 ５ｍＭ　ＮａＣ１、５ｍＭ　ＫＣＩ、　０．７５ｍＭ　ＮａｚＰＯａ　、５ｍＭ グルコース及び１２５ｍＭ　ＣａＣ＋、’　２ＨｚＯがら成る取り込み（ｕｐｔ ａｋｅ）コール６０００　（０，５ｍ７りと混合した。この混合物に、ｉ〜、ｔ 。

μｇの発現キャリヤーベクター及びＯ〜５０μｇの精製されたＮ、タバクムνａ ｒ、Ｈ４２５のＤＮＡ（分解に対し７て保護するために添加される）を含有する 溶液５０μβを加えた。（精製された植物ＤＮＡの存在Ｆで一層効率の形質転換 が観察される。） 原形質体を、非常に穏和に振とうしながら２５℃にて３０分間インキュベートし た。この後５分間隔でＵＢ培地の２ｍβの了りコートを、１０ｍ！の新たなＵ　 Ｂ培地が添加されるまで、溶液に滴加した。原形質体を低速遠心Ｇこよりペレ・ ／ト化し、そＬ７てと清液を除去した。ベレットを１０ｍ！！のに３培地に再懸 濁し、そして無菌のワットマン＃２（定性用）濾紙ディスク上に置き、そして濾 紙の追加の層により野性タイプＮ９タバクムｖａｒ、Ｈ４２５Ｑ、濁細菌から分 離した。植物ホルモンを含有する標準Ｍ３栄養培地Ｃｈａｒｔｏｎ等４、Ｎａｔ ｕｒｅ（１９７９）　２７７：１２９〕上で細胞を増殖せしめた。

細胞を、１０ｃｍベトリブＬ／−ト当り１０２〜１０’の密度でプ１／　−）＝ 　Ｌ、た。細胞を暗中で２４時間インギュベートし１、ぞして次己こ２５°Ｃに して１２時間の光期間で、２．０００ルクスにて２週間増殖せしめた。この期間 の後、細胞の住存は約５０％であった。次に、上に小さい細胞塊が増殖している 濾紙上層を、植物ホルモン（０，１ｍｙ／　Ｉ！　ＮＡＡ及び０．２　ｍ、６　 ／　１．カイネチン）及びＧ４１Ｂ　（２５ｗ／　ｅ　）又はカナマイシン（１ ００＋ｎｇ／β）を補充したＭ３培地に移し、そして２５℃にて１２時間の光期 間でインキュベーションを続けた。細胞は２通間で個々の小塊に効果的に増殖し 、そしてこれらのカルスを所望の密度で選択培地上にプレートした。前記抗生物 質に対して耐刷のカルスは拡大し続け、他方プラスミドマーカーＤＮＡＡＰＲ− Ｈにより形質転換されなかったと考えられるカルスは増殖を停止し、そして次の ２〜４週間にわたって徐々に褐色に変った。

上記の条件のもとで増殖したカルスが約１鶴の直径に達した時、これらを収得し 、そして次のようにして幼植物に再生した。カルスをピンセントで拾い上げ、そ して植物ホルモン及びカナマイシン０００■／ｊｌりを含有し０．４％寒天で固 化したＭ３培地上に置いた。これらのカルスが直径２ｕに達したとき、小片を、 ０゜１■／ｌのＮＡＡ及び０゜５■／ｌ〜１■／βのカイネチンを含有するＭ３ 培地６ご移して新芽形成を誘導した。次に芽を切り取り、そして発根培地〔シュ ークロース又は植物ホルモンを含まない１／１０４度のＭ３培地、０．４■〆根 した幼植物を高湿度のもとて数日闇土壌中に置き、次に通常のグリーンハウム生 長条件下に置いた。

Ｈ８１，バユ虹国」ｊ」Ｉ１秀の結果 Ｈ，１，ａ。ゲノムへのＤＮＡの挿 Ｈ０項に記載したようにして調製された植物の若葉から、Ｃ’、ｈｉｌｔｏｎ、 　Ｍ、Ｄ、等、Ｎａｔｕｒｅ　（１９８２）　２９５　：４３２により記載され ているようにして高分子量ＤＮＡを単離する。ＣｓＣｌ−エチジウムグラジェン ト中でＤＮＡをバンド化した後、３ＭＮａＣ！、０．３Ｍクエン酸すｌ−リウム で平衡化したイソプロピルアルコールにより色素を抽出する。透明な水性相を３ 容量の１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，４）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　Ｔ： 稀釈し、そして無水エタノールを最終濃度７０％に添加することによりＤＮＡを 沈澱せしめる。

形質転換された植物細胞及び形質転換されない植物細胞並びにカセットベクター ｐｃＭｃ７１　（対照として）からのＤＮＡをＨｉｎｄｌＩＩ及び５ａｌＩによ り完全消化する。標準ｐ　ＣＭ　Ｃ７１消化を、キャリヤーとしてのウェル当り ５μｇのウシ胸腺ＤＮＡの存在下で行う。消化されたＤＮＡを、Ｔｒｉｓ−酢酸 緩衝液中に調製された水平０．６％アガロースゲル中１×８Ｘ８ｍｍのウェル中 に負荷する（Ｃｈｉｌｔｏｎ、　Ｍ、Ｄ、等、如旦（１９７７）旦：２６３）。

アガロースゲル電気泳動及びゲル画分されたＤＮＡのニトロ　−セルロースへの 移行を、Ｔｈｏｍａｓｈａ−等、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

をＩよ−（ＵＳＡ）　（１９８０）　７７　：　６４４８に記載されているよう にして行う。植物ＤＮＡサンプルはウェル当り５μｇで負荷し、そしてｐｃＭｃ ７１のＤＮＡは１〜１００ゲノム相当に対応する種々の深度で負荷する。

ハイブリダイゼーションプローブは、Ｍａｎｉａｔｉｓ、、　Ｔ、等、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（１９７５）　７２：　１１ ８４の一般的方法に従って、プラスミドｐｆ、Ｉｃ７１からの精製された旧ｎｄ ｌＴＩ／Ｓａｌ　１　１．３ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片のニック−トランスレーション により生成せしめる。このプローブを、約１０”ｃｐｍ／μｇ　ＤＮＡの比活性 で、ニトロセルロース結合ＤＮＡ画分のサザンプロット分析［Ｃｈｉｒｇｗｉｎ 、　Ｔ、等、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（１９７９）　１８　：　５２９４ ）のために使用する。このサザン分析の結果は、ＡＰＲ−ｎ蛋白質をコードする ｐｃＭｃ７１からのＤＮＡ断片に大きさにおいて相当する、形質転換され再生さ れた植物からのＤ　Ｎ　Ａ中の旧ｎｄＩ［Ｉ／Ｓａｌ　Ｉ　１．３ｋｂＤ　Ｎ　 Ａ遺伝子断片の存在を示す。正常の（形質転換されていない）タバコ植物のＤＮ Ａ中には同様の大きさのＤＮＡ断片は観察されない。

Ｈ，１，ｂ、ｐｃＭｃ７１の転写 若い形質転換された植物及び正常植物からの全ＲＮＡ画分を、Ｂｅｖａｎ等によ り改変されたＣｈｉｒｇｗｉｎ（前掲）の方法、ＪｏＭｏｌ、　Ａｐ　ｌ、　Ｇ ｅｎｅｔ、（１９８２）上：５３９に従って単離する。若植物の葉及び茎（１抽 出当り５〜５０ｇ）を液体窒素中で凍結し、粉砕し、そして凍結乾燥する。組織 を、４Ｍグアニジンチオシアナート、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７， ０）、０．５％サルコシル及び０．０３％アンチホームＡ（シグマ）を含有する 抽出溶液中に均一化する。サルコシルはラウリルサルコシン酸ナトリウムの商標 であり、シグマから入手した。ホモジネートを、最初の組織重量１ｇ／ｍｌ抽出 液の濃度に調製した。ホモジネートをチーズクロスを通して濾過し、次に５００ ０Ｘｇにて１０分間遠心分離して沈澱物を除去し、そして上清液を１Ｍ酢酸にて ｐＨ５，０に調整し、１容量の無水エタノールを加えて核酸を沈澱せしめた。− ２０℃にて１時間の後、５０００Ｘｇにて３０分間遠心分離することにより沈澱 物をペレット化し、そして２５ｍｆｆの７．５Ｍ塩酸グアニジン、２５　ｍＭ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，０）中に再溶解する。１Ｍ酢酸によりｐＨを５．０ に調整し、そして１８ｍ！ｌの無水アルコールを加える。−２０℃にて１２時間 後に生成する沈澱を遠心分離により集め、７０％エタノールにて２回洗浄し、そ して２５ｍｌ１の２５ｍＭ　ＥＤＴ＾、０暑％ジエチルピロカーボネート（ｐＨ ８゜０）中に溶解する。

この溶液を、水飽和フェノール：クロロホルム混合′ｊｊｙＪ（６：５）で抽出 し、そして２容量のエタノールで沈澱せしめる。

次に、ペレットを、０．１％ジエチルピロカーボネートを含有する２　５　ｄ　 Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　８　ｍ／に再懸濁する。２ｍｌの１０　Ｍ 　ＬｉＣｌを加えてＲＮＡを選択的に沈澱せしめ、そして遠心分離から得られる ＲＮＡベレットをオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフノーにより分画する［ Ｂａｎｔｌｅ等、　−展、　肛９−ｈｅｍ、−（１９７８）　７２　：　４１３ 　）。

ポリアデニル化ＲＮＡ（ポリＡ　ＲＮＡ）を１Ｍグリキサールを用いて５０″ｃ 　（、ごて１時間変性する（ＭｃＭａｓ　ｔｅｒ等、上皿。

Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）　（４Ｑ７７）　７４　：　４ ８３５：）　、、ＲＮＡを電気ン永動し・そ（、−てＢｅｖｏｎ等、Ｊ、　Ｍｏ １．　Ａｐｐｌ、−Ｇｅｎｅｔ、、　（１９８２）上：５３９に記載されている ようにしてナサンブロソト分析にかける。Ｈ，１，ａ、項に記載されるように（ 、で調整され、約１０　’ｅｐｍ／μｇの比活性にラベルされた二ツクトランス レー１−　Ｄ　Ｎ　、Ａを用いて＋１ＰＨ−ＩＩ　ｒｎ　ＲＮ　Ａを探知する５ 、ゲルーヒでの分子量標準とＬ７てタバコリボゾームＲＮＡを用いる。

ｐｃＭｃ７１プローブ屋１、正阜（形質転換されていない）タバコ中のポリＡＲ ＮＡへのハイブリダイゼ・−ジョンを示さないが、ｐｃＭｃ７１で形質転換され た組織培養から再生された植物から単離されたｍＲＮＡ中にはハイブリダイゼー ションバンドが観察される。ＡＰＨ−ＩＮ　ｍ　ＲＮ　Ａの算定されたサイズは １０００ヌクレオチドより過剰である。

Ｈ，１，ｃ、一覧転換体中での＾Ｐ止工現ｐす翅、択形質転換された植物細胞に 対するＧ４１８　（又はカナマイシン）耐性に・ついての効果的な選択は、導入 された遺伝子が発現されることを意味する。このことは、形質転換された植物細 胞中でのＡＰ）Ｉ−ＩＩ蛋白質の存在をイムノアフセイにより示すことにより確 認される。

再生された植物からの組織サンプルを、３Ｈグリシンを用いる短時間の放射性ア ミノ酸ラベル化条件のもとで増殖せしめる。植物上清蛋白質をＢｏｒｔ、ｏｎ、 　Ｋ、等、Ｊ、　Ｒｉｏｔ、−リ＋ｅｍ、　（１９８２）２５７　：　６０８９ の方法により抽出する。形質転換された植物又は正常植物からの上清蛋白質（５ ００μｇ／ｍｌ）を、標準的方法で調製された免疫前又は免疫した抗−ＡＰＨ〜 ■ラヒ！フト血−清の０．１容量と混合する。３７℃にて４時間免疫沈澱を行・ う。

免疫沈澱吻を遠心分離によりベレット化１７、ドデシル硫酸す１・り勺ム（Ｓ　 ｌ）　Ｓ　）中に？容解し、そして５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析する。放射性バ ンドバタ・−ンをフルオログラフィーにより決定するＣＬａ５ｋｅｙ、　Ｒ，Ａ 、等、　、Ｅｕｒ、　、Ｔ、一旦匹ハｅｍ、　（１，９７５）　５６　：３３５ 　：］　。

低分子に（２７，ＯＯＱダルト）・未満）の微量の放射性ノくンドが、免疫前血 清及び抗−ＡＰＨ−Ｔｉ血清の両者を用いて、正常植物及び形質転換された植物 の両者に存在する。放射能の明瞭なバンドが、形質転換された細胞に由来する上 滑蛋白質中に、ＡＰＲ−ＩＩの見かけ上の分子量に相当する約２７，０００ダル トンにおいて観察されるが、形質転換されていない植物組織からの上清には観察 されない。このポリペプチドはＡＰＩ−ＩＩに対して調製された抗血清とのみ免 疫沈澱した。

Ｈ，２、匹ごｙ」」■と紀豚買１丑換の結果ｐｃＭｃ９１を用いて挿入されるコ ード配列はｐｃＭｃ９１を用いて挿入されるそれと同じであるから、ゲノムへの ＤＮＡの組み込み、コード配列の転写、及びメツセンジャーの翻訳を確認する場 合と全く同じ方法が用いられ、そして同じ結果が得られる。

Ｈ・３・　回道ｐ７７ｆ［、、へ杢ゑ箕飢標の結果好結果の形質転換及び２重カ カセントベクターｐＣＭＣ７７からゲノムＤＮＡへの−組み込みがｐＣＭＣ７２ についての前記の方法と同様の方法で確認される。しかしながら、）！、１．ａ 、項の方法に従ってサザンブロソト分析を行う場合、ｐｃＭｃ１０２からの０． ５ｋｂ　Ｈｉｎｄ　ｍ　／　Ｂ　ｇｌ　Ｈβ−ＴＦＮ遺伝子断片をニックトラン スレートしてプローブを調製し、そして形質転換された植物細胞からＤＮＡを抽 出ＥｃｏＲＴ及び５ａｉｌの両者により消化する。２重消化が１．１ｋｂ断片と してβ−ＩＦＮ遺伝子を放出せ同様に１７で、この発明の他のベクターからのコ ー　ド配列の組み込みの確認が、発現キャリヤーベクターを制限酵素で消化する ことによってコード配列ＤＮＡのためのニックトランスレートプローブを造成し 、そして標準的サザンブロソト技法を用いて対応して消化されたゲノム性ＤＮＡ 中の口約断片の存在を検出することによって行われる。

■。アグロバクテリ」Ｘメ」庶作瀘土擾Ｎ、タベＬムーＱ−Ｍｌ翫泉 アグロバクテリウム関与形質転換を仲介するＴ−ＤＮＡボーダー配列を含有する この発明の発現キャリヤーベクターのすべてを、このＩ。項の方法において使用 することができる。

このようなベクターの造成は前記のＧ。項に例示されている。

この項の記載はｐｃＭｃ９１について行うが、Ｔ−ＤＮＡボーダー配列及び広宿 主域細菌性複製開始点を含有するこの発明の記載されたベクター又は他のベクタ ーの任意のものを使用することができる。この方法は、ビルレンス領域を供給す るための無力化されたＴｉプラスミドを含むアグロバクテリウム変異株の使用を 例示する。しかしながら、ＴｉプラスミドのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａ　６１域中に腫瘍 形成配列を欠く、このような配列を供給する他の手段、例えば、無力化Ｔｉプラ スミド及びこの発明の発現キャリヤーベクターの両者による“空の”アグロバク テリウムの同時形質転換を用いることができる。

１．１．　ｐｃＭｃ９１を堆公４Ａ、−チーん／１工之玉Ｚ五曳肛腎（逸使用さ れる無力化Ｔｉベクターは、ライデン大学Ｐａｕｌ）１ｏｏｙｋａａｓ博士から 入手されるＡ、チュメファシエンス株ＬＢＡ４４０４により担持されているそれ である（Ｏｏｍｓ、　Ｇ、、　Ｈｏｏｙｋａａｓ。

Ｐ、Ｊ、Ｊ、等、販憇（１９８１）　１４　：　３３　）。この株はｐＡＬ４４ ０４のみを担持するｆ；め非腫瘍性である。このｐＡｌ、４４０４はオクトビン ＴｉプラスミドｐＴｉＡｃｌ＋５の非毒性（ａｖ　ｉｒｕ　ｌｅｎ　ｔ、）欠失 変異誘導体であって、ＳａｍＩ断片３Ａ中にＴｎ９０４挿入部を有し、６そして この点からＳｍａｌ断片６に右に延びる欠失を有する。従って、このプラスミド は完全なオクトピンＴ−ＤＮＡ及びオクトピン代謝機能を欠くが、Ｔ−ＤＮＡの 左側上に無傷のビルレユ／ス領域を保持している（ｄｅ　Ｆｒａｍ＋ｎｄ、　Ａ 、　、Ｊ。等、旦とｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（１，９８３年５月）　２６２−２ ６９　；　Ｈｏｅｋｅｍａ、　Ａ、等、と４．ｔ　ｕ些（１９８３）　３部：１ ７９を参照のこと〕。Ａ、チュメファシエンスをＨｏ１ｓｔｅｒｓ等、１ｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、（１９７８）　１６３　、　：　１８１の凍結−解凍法に よりｐｃＭｃ９１で形質転換し、そしてＳｕＲについて選択することによって、 ｐｃＭｃ９１及び無力化ＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４の両者を担持するＡ、チ ェメファシエンスを得バクテリ欠に臣呵ゑＨ−、ｙαツメ６【丸、ｍ泉ニコチア ナ・タバクムー（Ｎｆｏｔｊａ１〕ａｔａｂａｃｕｍ）　ｖａｒ　Ｈａｒａｎａ ４２５（Ｈ４２５）の茎を、市販の７％クロロツクス（Ｃｈｌｏｒｏｘ）及び８ ０％エタノールにより表面殺菌し、次に無菌水ですすぎ、そしてｌ　ｃ＋ｎの長 さの切片に切断した。この切片を、２ｍｇ／βのナフタレン酢酸（ＮＡＡ）及び Ｏ５３■／Ｃのカイネチンのホルモン補充を伴う完全ＭＳ培地（Ｂｉｎｎｓ、　 Ａ、等、Ｐｌａｎｔａ（１９７９）−１４５，：　３６５　）を収容するベトリ 皿中に基部端を上にして置いた。各茎切片の基部端に注射器の針を反復して刺し 込み、そしてｐＣＭＣ９］で形質転換されたＡ５チュメファシ、エンスＬ　Ｂ　 Ａ　４４０４を接種した。接種された茎切片を２５℃にて毎日１６時間光を照射 し７ながら５〜８日間インキュベートした後、茎切片の種々の位置からカルスが 発達した。茎切片からカルス領域を取り、そして完全ＭＳ培地（２，０■／Ｉ！ のＮＡＡ及び０．３■／Ｉ！、のカイネチンが補充されたＭＳｉ礎培地）に移し た。培地はさらに接種細菌を殺すために２００■／ｌのカルベニシリン及び５０ ０■／ρのバンコマイシンを、そして形質転換された植物細胞を選択するために 抗生物質を含有した。

抗生物質の選択は日常的にカナマイシン（１００■／β）又はＧ４１８　（２５ ｍｇ／β）を含んだ。但しネオマイシン又はリビドマイシンも適用可能な代替物 である。カナマイシン又はＧ４１８に対して耐性の生存細胞の小塊を３回（およ そ４週間隔で）移した後、非形質転換細胞に対する形質転換された細胞について カルスが十分に？ＭＩＩされ、細胞中外来性ＤＮＡの存在、この外来性遺伝子の 転写、及び外来性Ｄ　Ｎ　Ａ遺伝子発現の測定が可能となる。

上記の条件下で生長したカルスが直径約１ｆｌに達した時、これらをピンセット で拾い上げ、そして植物ホルモン及びカナマイシン（１００■／１）を含有し０ ．４％寒天で固化されたＭ３培地上に置いた。カルスが直径２ｕ以上に達した後 、小片を０．１■／βのＮ　Ａ　Ａ及び０．５■／β〜１■／Ｃのカイネチンを 含有するＭ、培地に移して新芽形成を誘導する。次に芽を切り取り、次に発根培 地（シュークロース又は植物ホルモンを含有しない１／１０濃度のＭＳ培地、０ ．４■／ｒチアミン、１％寒天、ｐｌ（７，０）中に置く。発根した幼植物を、 数日間高湿度のもとで土壌中に置き、次に通常のグリーンノλウス生育条件に置 く。

ｉ、３、ｐｃＭｃ９１及び無力化ＴｉプラスミドＣよ硅−峙虞目１膝Ｎ、タバク ムｖａｒ　）ｔ４２５の実生を無菌条件下で生育せしめ、そして若葉をＨ６１０ 項に記載したようにして処理して生存原形質体を生じさせた。この原形質体を、 Ｏ，］、　ｒｒｇ　／　／！のＮＡＡ及び０．２ｍｇ／６のカイネチンを補充し たに３培地中で暗中で２４時間、そして次に２０００ルクスにて４８時間培養し た。再生する細胞壁を有する細胞を１．ＣｌＩＣ９１で形質転換されたＡ。

チェメファシエンスＬＢΔ４４０４と、ｍβ当り１０５個の植物細胞及び１０１ 個の細菌細胞として混合した。

細胞を上記のように植物ホルモンが補充されたに３培地中で２０℃、２０００ル クスにて約２４時間インキュベートし、この後反復洗浄により細菌を除去した。

最終洗浄は、上記の植。

物ホルモン、並びに２００■／２のカルベニシリン及び２５０■／βのバンコマ イシンを補充したに、培地中で行った。次に、細胞を、植物ホルモン、２００ｎ ｖ／７！のカルベニシリン及び２５０■／βのバンコマイシンを含有するＭ、培 地中フィーダ一層（単細胞クローニングについて上記したように）上のワフトマ ン＃２フィルター上に置いた。植物細胞密度を１０■ベトリ皿当り１０２〜１０ ５細胞の範囲で変え、高稀釈は単細胞からのコロニーを生じさせた。このような フィーダープレート上で４週間以下の間、直径約０．５■の細胞塊が見えるよう になるまで、細胞にカルスを形成せしめた。次に上部フ、イルターを、２００■ ／ｌのカルベニシリン及び１００■／２のカナマイシン（又はこれに代えて２５ ■／ｌのＧ４１８）を含有するＭ３培地の新鮮なプレートに移した。この方法の もとで、カナマイシン抗生物質に対する体性に基く連続的増殖により形質転換さ れたカルスが急速に選択され、他方非形質転換カルスは増殖を停止しそして褐変 した。カルスが直径１〜２顛に達した後、カルスを新鮮なプレートに移し、そし て上記の１．２．及び１項に記載したようにして、植物の直接再生のために細胞 数を増加せしめた。

■。４、星亘転求ｑ時呆 好結果の形質転換を、ｐｃＭｃ７１による植物細胞の形質転換についてｔｌ、１ ．ａ、〜Ｈ，１，ｂ、項において示したのと正確に同じ方法により確認する。言 うまでもなく、やはり結果は同じである。

同様にして、同じ方法であるが対応するプローブ及び抗体を用いて、任意の遺伝 子配列コードカセットを用いる好結果の形質転換をモニターすることができる。

下記のプラスミドが、特許手続のための微生物の寄託の国際的承認に関するブタ ベスト条約及びその規則（ブタベスト条約）に基きアメリカン・タイプ・カルチ ュアー・コレクション、ロックビル、メリーランド、米国（ＡＴＣ６）に寄託さ れており、そして従って、ブタベスト条約に基いて維持されそして入手可能にさ れる。これらの菌株の入手可能性は、いずれかの政府の権威のもとにその特許法 に従って許可された権利に違反してこの発明を実施する承諾と解釈してはならな い。

寄託されたプラスミドには表示されたＡＴＣＣ寄託番号が割り当てられた。プラ スミドはまた、この出願の承継人であるシタス・コーポレーション、エメリービ ル、カリホルニア、米国のマスター・カルチュアー・コレクション（ＣＭＣＣ） に寄託され、そして表示されたＣＭＣＣ寄託番号が割当てられた。

プラスミド　び宿主　印並！丘＼　ＡＴＣＣ寄託１１ｈｐβｌ　ｔｒｐ３−１− １　（Ｅ、コリに−１２／ＭＭ２９４中）　１７３０　３９６４６ｐｃＭｃ１　 （Ｅ、コリに４２／財２９４中’）　１９８５　３９６４１ｐｃＭｃ１５　（Ｅ 、コリに一、１２／聞２９４中）　２００２　３９６５４ｐＤＧ１４４　（Ｅ、 コリに−１２／ＭＭ２９４中）　１９６０　３９５７９ｐＤＨ５４２５（Ｅ、コ リに一１２／ＭＣ１００Ｏ中）　１５０３　３９６４５ｐＯＧ２３２６　（Ｅ、 コリに一１２／Ｃ５４１２中）１５７７　３９６００ｐＳＹＣ８２３（Ｈ、コリ ［４２／ＪＭ１０３中）　２０２０　３９６５７ｐＴｉＴ３７（Ａ、　チ１メフ ァシエシス　Ａ２０８中）　１７７３　３９４２３ｐＣ門Ｃ１２３（Ｅ、コリＸ −１２／肘２９４中）ｐＣ）’ＩＣ９１（Ｅ、コリに一、１２／Ｔ市２９４中） ｐＣＭＣ９２（Ｅ、コリに一１２／聞２９４中）〜ｎｑ　ｐｍ 手続補正書 昭和６１年５月Ｇ日 特許庁長官　宇　賀　道　部　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ８５１００６５９ ２、発明の名称 植物細胞の形質転換のための改良 された方法及びベクター ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　アグラシタス ４、代理人 住所〒１０５　東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正の対象 （１）明細書 （２）請求の範囲 ６、補正の内容 （１）■　明細書第５２頁第８行目、日付の後の「ごろ」を「に」に補正する。

■　同第５２頁第９行目「番号−一」を「番号５３０９４　Ｊに補正する。

■　同第５２頁第１６行目「ごろ」を「に」に補正する。

■　同第５２頁第１６行目「＆−」を ｒ　５３０９３　Ｊに補正する。

■　同第５３頁第１２行目「ごろ」をｒに」に補正する。

■　同第５３頁第１２行目ｒＡ　Ｊｔ−ｒ５３０９５Ｊに補正する。

■　同第６７頁第１２〜１４行目を次のように補正する。

以下余白 ｐｃＭｃ１２３（Ｅ、コリに一１２／／′ＮＭ２９４中）　２３０５　５夏ル５ ｐｃＭｃ９１　（Ｅ−＝７！ｊＫ−１２／ＭＭ２９４中）　２３０７　５３０９ ４ｐＣＭＣ９２（Ｅ、コリに一１２／ＭＭ２９４中）　２３０６　５３０９３（ ２）暫Ｈすのよシ１−頴正する。　」７、添付書類の目録 （１）補正請求の範囲　１通 （２）受託証の写し及びその抄訳　各１５通請求の範囲 １゜センス鎖において５’−３’と進む屓序で。

（、）　第１のカセット−ユニーク制限部位；（ｂ）　植物細胞中で正常に作用 可能な（５’−３’に方向付けられた）ｆロモーター配列； （ｃ）　ポリリンカー； （ａ）　植物細胞中で作用可能な（５’−３’に方向付けられた）ポリアゾニレ −ジョンシグナル；及び （、）　第２のカセット−ユニーク制限部位：金含有するＤＮＡ配列カセッ）ｋ 含んで成る中間体キャリヤーベクター。

２、（ｃ）の２リリンカー中に含有され、（ｂ）のプロモー　ター　及ヒ（ωの ホリアデニシーションシグナルに作用可能に連結された目的コード配列をさらに 含む請求の範囲＠１項に記載のベクター。

３、広宿主域細菌性複製開始点を含んで成るベクター・配列金さらに含む請求の 範囲第１項に記載のベクター。

４−　（ａ）の第１の制限部位及び（、）の第２の制限部位のいずれか又は両方 に近位にＴ−ＤＮＡボー／　−配列金さらに含む請求の範囲第３項に記載のベク ター。

５、（ａ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で正 常に作用可能なプロモーター配列； （ｂ）　目的コード配列； （Ｃ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル；及ヒ （ｄ）　カセットの一端に近位のカセット−ユニーク制限部位； 全含有する発現カセットを含んで成る発現キャリヤーベクター。

６、前記発現カセットが各カセット末端に近位にカセット−ユニーク制限部位を 有する請求の範囲第５項に記載のベクター。

７、広宿主域細菌性複製開始点金含んで成るベクター配列をさらに含んで成る請 求の範囲第５項記載のベクター。

８、前記発現カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ　−ＤＮＡ　、１＝Ｐ −グー配列をさらに含む請求の範囲第７項に記載のベクター。

９、（ａ）　（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞 中で正常に作用可能な第１プロモーター配列； （ｂ）　第１の目的コード配列； （ｃ）　前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用 可能な第１のポリアゾニレ−ジョンシグナル； を含有するＤＮＡ配列カセット；並びに。

（ｄ）　ｃｅ＞の第２の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能な第２のプロモーター； （、）　第２の目的コード配列： （ｆ）　前記目的コード配列に作用可能に連結された、第２のポリアゾニレ−ジ ョンシグナル； 全含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列：並びに （ｇ）　ＤＮＡ配列カゼット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含んで成る発現キャリヤーベクター。

１０、広宿主域細菌性複製開始点金倉んで成るベクター配列をさらに含む請求の 範囲第９項に記載のベクター。

１１、前記ＤＮＡ配列カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ−ＤＮＡボー ダー配列をさらに含む請求の範囲第１０項に記載のベクター。

１２、（ａ）第１のカセット−ユニーク制限部位；（ｂ）　（ｃ）の目的コード 配列に作用可能に連結された、植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター配列 ； （ｃ）　目的コード配列； （ｄ）　（ｅ）の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で作用可 能なポリアゾニレ−ジョンシグナル；及び （、）　第２のカセット−ユニーク制限部位；を含んで成る、形質転換された植 物細胞中で作用可能な発現カセット。

１３、（ａ）植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用 可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル（この両者は目的コード配列に作用可能に 連結されている）；及び （ｂ）　カセットの５′又は３′末端における。カセット−ユニーク制限部位； 全含有する発現カセットを含んで成る発現キャリヤーベクター。

１４、（ｉ）植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用 可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル（両者Ｈ目的：ｒ　−ト配列に作用可能に 連結されている）及び、（ｂ）カセットの５′又は３′末癩における。カセット −ユニーク制限部位、全含有する発現カセット金倉んで成る発現カセットベクタ ーであって； 前記カセットがＴ　−ＤＮＡ　ｆｆ−グー配列により囲まれておシ； 前記キャリヤーベクターが広宿主域細菌性複製開始点を含有する； 発現キャリヤーベクター。

１５、（ａ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能なプロモーター配列； （ｂ）　目的コード配列； （ｃ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル；及ヒ （ｄ）カセットの一端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含有する発現カセット金倉んで成る発現キャリヤーベクターによシ形質転換さ れた植物（その細胞及び種子を包含する）。

１６、前記ベクターが、広宿主域細菌性複製開始点金倉んで成るベクター配列、 及び前記発現カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ　−ＤＮＡボーダー配 列をさらに含む請求の範囲第１５項に記載の植物（その細胞及び種子全包含する ）。

１７、（ａ）　（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細 胞中で正常に作用可能な第１プロモーター配列： （ｂ）第１の目的コード配列； （ｃ）前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用可 能な第１のポリアゾニレ−ジョンシグナル； を含有するＤＮＡ配列カセット；並びに。

（ｄ）　（、）の第２の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能な第２のプロモーター； （、）第２の目的コード配列； （ｆ）前記目的コ゛−ド配列に作用可能に連結された、第２のポリアゾニレ−ジ ョンシグナル； 金含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列：並びに （ｇ）　ＤＮＡ配列カセット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含んで成る発現キャリヤーベクターにより形質転換された植物（その細胞及び 種子を包含する）。

１８、前記ベクターが、広宿主域細菌性複製開始点を含んで成るベクター配列、 及び前記ＤＮＡ配列カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ−ＤＮＡゴーグ ー配列をさらに含む請求の範囲第１７項に記載の植物（その細胞及び種子を包含 する）。

１９、植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用可能な ポリアゾニレ−ジョンシグナル（両者は目的コード配列に作用可能に連結されて いる）全含んで成る発現キャリヤーベクターにより宿主植物細胞を直接形質転換 することを含んで成る植物（その細胞及び種子を含む）の形質転換法。

２Ｂ（ａ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で正 常に作用可能な！ロモーター配列； （ｂ）　目的コード配列； （ｃ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル；及ヒ （ａ　カセットの一端に近位のカセット−ユニーり制限部位； を含有する発現カセットを含んで成る発現キャリヤーベクターにより宿主植物細 胞を直接形質転換することを含んで成る植物（その細胞及び種子を包含する）の 形質転換法。

ム、（λ）（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中 で正常に作用可能な第１、プロモーター配列； （ｂ）第１の目的コード配列； （ｃ）前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用可 能な第１のポリアゾニレ−ジョンシグナル； 金含有するＤＮＡ配列カセット：並びに。

＜ａ）　（−）の第２の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で 正常に作用可能な第２のノロ屯−ター： （８）第２の目的コード配列； （ｆ）前記目的コード配列に作用可能に連結された、第２のポリアゾニレ−ジョ ンシグナル； を含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列；並びに （ω　ＤＮＡ配列カセット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含んで成る発現キャリヤーベクターにょシ宿主植物細胞を直接形質転換するこ とを含んで成る植物（その細胞及び種子を包含する）の形質転換法。

２２、植物細胞の形質転換法であって、（ｉ　植物細胞中で正常に作用可能なプ ロモーター及び植物細胞中で作用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル（両者は 目的コード配列に作用可能に連結されている）を含んで成る発現キャリヤーベク ター（前記発現カセットは少なくとも１個のＴ−ＤＮＡ＆−グー配列に近位にあ シ：そしてベクター断片は広宿主域細菌性複製開始点を含有する）によシＡ、チ ュメファシェンス（Ａ、ｔｕｍａｆａａｅｎｓ）を形質転換し： （ｂ）　Ａ、チュメファシエンス宿主にＴｌｆラスミドのビルレンス領域を含ん で成るグラスミドを与え；そして （ｃ）　感受性植物細胞を、得られたＡ、チュメ７アシエンスと接触せしめる； ことを含んで成る方法。

２３、　Ａ、チュメファシエンス感受性植物細胞を。

（Ａ）Ｔｌｆラスミドのビルレンス領域を含んで成るプラスミド；及び （Ｂ）（ａ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能なプロモーター配列； （ｂ）　目的コード配列； （ｃ）　（ｂ）の目的；−ド配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル； （ｄ、）　カセットの一端に近位のカセット−ユニーク制限部位； （、）　広宿主域細菌性複製開始点：及び（ｆ）　前記発現カセット末端のいず れか又は両方に近位のＴ−ＤＮＡボーダー配列；を含有する発現キャリヤーベク ターを含有するＡ、チュメファシエンスの細胞と接触せしめる、ことを含んで成 る植物細胞の形質転換法。

２４、発現キャリヤーベクターのＤＮＡカセットの各端にＴ−ＤＮＡ配列が存在 する請求の範囲第２３項に記載の方法。

５゜前記発現キャリヤーくフタ−がＤＮＡ配列カセット内に形質転換された植物 細胞のための優性選択可能なマ・−力−をコードするコード配列を含んで成る請 求の範囲第２３項に記載の方法。

２６、（ａ）のプラスミドが無力化されたＴｔプラスミドである請求の範囲第２ ３項に記載の方法。

２７、Ａ、チュメファシエンス感受性植物細胞を。

（Ａ）　Ｔｉプラスミｒのビルレンス領域金倉んで成るプラスミド；及び ＣＢ）０　（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中 で正常に作用可能な第１プロモーター配列； （ｂ）　第１の目的コード配列： （ｃ）前記第１の目的コーＰ配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用可 能な第１のポリアゾニレ−ジョンシグナル；を含有するＤＮＡ配列カセット−並 びに、（ｄ）　（ｅ）の第２の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細 胞中で正常に作用可能な第２のプロモーター； （、）　第２の目的コード配列； （ｆ）　前記目的コード配列に作用可能に連結された、第２のポリアゾニレ−ジ ョンシグナル： を含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列；並びに （ω　ＤＮＡ配列、カセット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位；並びに （ｈ）広宿主域細菌性複製開始点；及び（ｉ）　前記ＤＮＡ配列カセット末端の いずれか又は両方に近位のＴ　−ＤＮＡ　、ｙ−ダー配列：を含有する発現キャ リヤーベクター全含有するＡ、チュメファシエンスの細胞で感染させ又はこれと 共に同時培養すること金含んで成る植物細胞の形質転換方法。

詔、（、）のシラスミドが無力化Ｔｉプラスミドである請求の範囲第２７項記載 の方法。

２９、前記発現キャリヤーベクターがＤＮＡ配列カセット内に形質転換された細 胞のための優性選択可能なマーカーをコードするコーに配列を含んで成る請求の 範囲第２７項に記載の方法。

３０、　（ａ）のプラスミドが無力化Ｔｉプラスミドである請求の範囲第２７項 記載の方法。

３１、植物細胞又はその原形質体の懸濁液を、植物細胞中で正常に作用可能なプ ロモーター及び植物細胞中で作用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル（両者は 目的コード配列に作用可能に連結されてＡる）全含有する発現キャリヤーベクタ ーの有効量と混合することを含んで成る植物細胞の形質転換法。

３２、植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用可能な ポリアゾニレ−ジョンシグナル（両者は目的コード配列に作用可能に連結されて いる）を含んで成る発現キャリヤーベクターによシ宿主植物細胞全直接形質転換 することにより得られた植物（その細胞又は種子を含む）。

３３、（＆）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能なプロモーター配列； （ｂ）　目的コード配列； （−）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されておシ、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル；及ヒ （ｄ）カセットの一端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含有する発現カセット末端んで成る発現キャリヤーベクターにより宿主植物細 胞を直接形質転換することによシ得られ′ｆｃ植物（その細胞又は種子を含む） 。

３４、（ａ）　（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された一＊物細 胞中で正常に作用可能な第１ｆロモーター配列； （ｂ）第１の目的コード配列； （ｃ）前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用可 能な第１のホリアデニシーションシグナル； を含有するＤＮＡ配列カセット−並びに。

（ω　（ｅ）の第２の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で正 常に作用可能な第２のプロモーター； （、）　第２の目的コード配列； （ｆ）前記目的コード配列に作用可能に連結された。第２のポリアゾニレ−ジョ ンシグナル； を含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列；並びに （ω　ＤＮＡ配列カセット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位； を含んで成る発現キャリヤーベクターにより宿主檜物細胞金直接形負転換するこ とによシ得られた植物（その細胞又は種子を含む）。

３５、Ａ。チュメファシエンス感受性植物細胞を。

（ト）　Ｔｔプラスミドのビルレンス領域を含んで成るプラスミド；及び （Ｂ）（−）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で 正常に作用可能なプロモーター配列： （ｂ）　目的コード配列； （ｃ）　（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作 用可能なポリアゾニレ−ジョンシグナル； （ｄ）　カセットの一端に近位のカセット−ユニーク制限部位； （、）　広宿主域細菌性複製開始点；及び（ｆ）　前記発現カセット末端のいず れか又は両方に近位のＴ　−ＤＮＡゴーダ−配列；金含有する発現キャリヤーベ クターを含有するＡ、チュメファシエンスの細胞と接触せしめる。ことにより形 質転換された植物（その細胞又は種子を含む）。

３６、　Ａ、チュメファシエンス感受性植物細胞を。

（Ａ）　Ｔｔプラスミドのビルレンス領域を含んで成るプラスミド；及び （ａｔ（、）　（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細 胞中で正常に作用可能な第１ｆロモーター配列： （ｂ）　磯１の目的コード配列； （ｃ）　前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で作用 可能な第１のポリアゾニレ−ジョンシグナル；と含有するＤＮＡ配列カセット； 並びに。

（ｄ）　（、）の第２の目的コード配列に作用可能に連結された。植物細胞中で 正常に作用可能な第２のプロモーター； （、）　第２の目的コード配列； （ｆ）　前記目的コード配列に作用可能に連結された、第２のポリアゾニレ−ジ ョンシグナル； を含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列：並びに （ω　ＤＮＡ配列カセット末端に近位のカセット−ユニーク制限部位；並びに （ｂ）　広宿主域細菌性複製開始点；及び（ｉ）　前記ＤＮＡ配列カセット末端 のいずれが又は両方に近位のＴ　−ＤＮＡボーダー配列；を含有する発現キャリ ヤーベクターを含有する人、チュメファシエンスの細胞で感染させ又はこれと共 に同時培養することによシ形質転換された植物（その細胞又は種子を含む）。

３７、パシルス・チュリンジェンシスのエンドトキシンの発現についてコードす るキメラ遺伝子を含んで成るゲノムを有する植物（その原形質体、種子、細胞、 子孫、及び該子孫の種子を含む）。

ア、前記エンドトキシンがバシルス・チュリンジェンシスＨＤ−１株由来のＢｔ −トキシンでちる請求の範囲第３７項に記載の植物。

３９、その形質転換がＡ、チュメファシエンスにより介在されたものでおり、そ して組織培養から生じたものである請求の範囲第３７項に記載の植物。

４０、前記キメラ遺伝子の発現が前記エン−トキシン遺伝子に５′のノパリンシ ンサーゼプロモーターにより活性化される請求の範囲第３７項に記載の植物。

４１、その形質転換が１発現キャリャーベクターｐｃＭｃ１２１　により形質転 換されているＡ、チュメフプシエンスにより介在されたものである請求の範囲第 ３９項に記載の植物。

国際調−ｆ刊失 、１．、□ｅａｔｌ　Ｍｍｍｍ＃お、ＰＣＴ／ＵＳ　８５１００６５９ＡＮＮＥ Ｘ　Ｔｏ　部　ＸＮＴＥＦｔｋＪｋＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＥ’ＯＲＴ 　０ＮＵＳ−Ａ−４４０７９５６０４／１０／１３３　Ｎｏｎｅ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．センス鎖において５′−３′と進む順序で、（ａ）第１のカセットーユニー ク制限部位；（ｂ）植物細胞中で正常に作用可能な（５′−３′に方向付けられ た）ブロモーター配列； （ｃ）ポリリンカー； （ｄ）植物細胞中で作用可能な（５′−３′に方向付けられた）ポリアデニレー ションシグナル；及び（ｅ）第２のカセットーユニーク制限部位；を含有するＤ ＮＡ配列カセットを含んで成る中間体キャリャーベクター。 ２．（ｃ）のポリリンカー中に含有され、（ｂ）のプロモーター及び（ｄ）のポ リアデニレーションシグナルに作用可能に連結された目的コード配列をさらに含 む請求の範囲第１項に記載のベクター。 ３．広宿主域細菌性複製開始点を含んで成るベクター配列をさらに含む請求の範 囲第１項に記載のベクター。 ４．（ａ）の第１の制限部位及び（ｅ）の第２の制限部位のいずれか又は両方に 近位にＴ−ＤＮＡボーダー配列をさらに含む請求の範囲第３項に記載のベクター 。 ５．（ａ）（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で正常 に作用可能なプロモーター配列；（ｂ）目的コード配列； （ｃ）（ｂ）の目的コード配列に作用可能に連結されており、植物細胞中で作用 可能なポリアデニレーションシグナル；及び （ｄ）カセットの一端に近位のカセットーユニーク制限部位； を含有する発現カセットを含んで成る発現キャリャーベクター。 ６．前記発現カセットが各カセット末端に近位にカセットーユニーク制限部位を 有する請求の範囲第５項に記載のベクター。 ７．広宿主域細菌性複製開始点を含んで成るベクター配列をさらに含んで成る請 求の範囲第５項記載のベクター。 ８．前記発現カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ−ＤＮＡボーダー配列 をさらに含む請求の範囲第７項に記載のベクター。 ９．（ａ）（ｂ）の第１の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中 で正常に作用可能な第１プロモーター配列； （ｂ）第１の目的コード配列； （Ｃ）前記第１の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で作用可 能な第１のポリアデニレーションシグナル； を含有するＤＮＡ配列カセット；並びに、（ｄ）（ｅ）の第２の目的コード配列 に作用可能に連結された、植物細胞中で正常に作用可能な第２のプロモーター； （ｅ）第２の目的コード配列； （ｆ）前記目的コード配列に作用可能に連結された、第２のポリアデニレーショ ンシグナル； を含んで成る少なくとも１個の追加の発現配列；並びに（ｇ）ＤＮＡ配列カセッ ト末端に近位のカセットーユニーク制限部位； を含んで成る発現キャリャーベクター。 １０．広宿主域細菌性複製開始点を含んで成るベクター配列をさらに含む請求の 範囲第９項に記載のベクター。 １１．前記ＤＮＡ配列カセット末端のいずれか又は両方に近位にＴ−ＤＮＡボー ダー配列をさらに含む請求の範囲第１０項に記載のベクター。 １２．（ａ）第１のカセットーユニーク制限部位；（ｂ））（ｃ）の目的コード 配列に作用可能に連結された、植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター配列 ；（ｃ）目的コード配列； （ｄ）（ｃ）の目的コード配列に作用可能に連結された、植物細胞中で作用可能 なポリアデニレーションシグナル；及び （ｅ）第２のカセットーユニーク制限部位；を含んで成る、形質転換された植物 細胞中で作用可能な発現カセット。 １３．（ａ）植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用 可能なポリアデニレーションシグナル（この両者は目的コード配列に作用可能に 連結されている）；及び （ｂ）カセットの５′又は３′末端における、カセットーユニーク制限部位； を含有する発現カセットを含んで成る発現キャリャーベクター。 １４．（ａ）植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用 可能なポリアデニレーションシグナル（両者は目的コード配列に作用可能に連結 されている）及び、 （ｂ）カセットの５′又は３′末端における、カセットーユニーク制限部位、を 含有する発現カセットを含んで成る発現カセットベクターであって；前記カセッ トがＴ−ＤＮＡボーダー配列により囲まれており； 前記キャリャーベクターが広宿主域細菌性複製開始点を含有する； 発現キャリヤーベクター。 １５．請求の範囲第５項に記載のベクターにより形質転換された植物（その細胞 及び種子を包含する）。 １６．請求の範囲第８項に記載のベクターにより形質転換された植物（その細胞 及び種子を包含する）。 １７．請求の範囲第９項に記載のベクターにより形質転換された植物（その細胞 及び種子を包含する）。 １８．請求の範囲第１１項に記載のベクターにより形質転換された植物（その細 胞及び種子を包含する）。 １９．植物細胞中で正常に作用可能なプロモーター及び植物細胞中で作用可能な ポリアデニレーションシグナル（両者は目的コード配列に作用可能に連結されて いる）を含んで成る発現キャリャーベクターにより宿主植物細胞を直接形質転換 することを含んで成る植物（その細胞及び種子を含む）の形質転換法。 ２０．請求の範囲第５項に記載のベクターにより宿主植物細胞を直接形質転換す ることを含んで成る植物（その細胞及び種子を包含する）の形質転換法。 ２１．請求の範囲第９項に記載のベクターにより宿主植物細胞を直接形質転換す ることを含んで成る植物（その細胞及び種子を包含する）の形質転換法。 ２２．植物細胞の形質転換法であって、（ａ）植物細胞中で正常に作用可能なプ ロモーター及び植物細胞中で作用可能なポリアデニレーションシグナル（両者は 目的コード配列に作用可能に連結されている）を含んで成る発現キャリャーベク ター（前記発現カセットは少なくとも１個のＴ−ＤＮＡボーダー配列に近位にあ り；そしてベクター断片は広宿主域細菌性複製開始点を含有する）によりＡ、チ ュメファシエンス（Ａ．ｔｕｎｅｆａｃｉｅｎｓ）を形質転換し；（ｂ）Ａ．チ ュメファシエンス宿主にＴｉプラスミドのビルレンス領域を含んで成るプラスミ ドを与え；そして（ｃ）感受性植物細胞を、得られたＡ．チュメファシエンスと 接触せしめる； ことを含んで成る方法。 ２３．Ａ．チュメファシエンス感受性植物細胞を、（ａ）Ｔｉプラスミドのビル レンス領域を含んで成るプラスミド； （ｂ）請求の範囲第８項に記載の発現キャリャーベクターを含有するＡ．チュメ ファシエンスの細胞と接触せしめる、ことを含んで成る植物細胞の形質転換法。 ２４．発現キャリャーベクターのＤＮＡカセットの各端にＴ−ＤＮＡ配列が存在 する請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５．前記発現キャリャーベクターがＤＮＡ配列カセット内に形質転換された植 物細胞のための優性選択可能なマーカーをコードするコード配列を含んで成る請 求の範囲第２３項に記載の方法。 ２６．（ａ）のプラスミドが無力化されたＴｉプラスミドである請求の範囲第２ ３項に記載の方法。 ２７．Ａ．チュメファシエンス感受性植物細胞を、（ａ）Ｔｉプラスミドのビル レンス領域を含んで成るプラスミド；及び （５）請求の範囲第１１項に記載の発現キャリャーベクター を含有するＡ．チュメファシエンスの細胞で感染させ又はこれと共に同時培養す ることを含んで成る方法。 ２８．（ａ）のプラスミドが無力化Ｔｉプラスミドである請求の範囲第２７項記 載の方法。 ２９．前記発現キャリャーベクターがＤＮＡ配列カセット内に形質転換された細 胞のための優性選択可能なマーカーをコードするコード配列を含んで成る請求の 範囲第２７項に記載の方法。 ３０．（ａ）のプラスミドが無力化Ｔｉプラスミドである請求の範囲第２７項記 載の方法。 ３１．植物細胞又はその原形質体の懸濁液を、植物細胞中で正常に作用可能なプ ロモーター及び植物細胞中で作用可能なポリアデニレーションシグナル（両者は 目的コード配列に作用可能に連結されている）を含有する発現キャリャーベクタ ーの有効量と混合することを含んで成る植物細胞の形質転換法。 ３２．請求の範囲第１９項に記載の方法により形質転換された植物（その細胞又 は種子を含む）。 ３３．請求の範囲第２０項に記載の方法により形質転換された植物（その細胞又 は種子を含む）。 ３４．請求の範囲第２１項に記載の方法により形質転換された植物（その細胞又 は種子を含む）。 ３５．請求の範囲第２３項に記載の方法により形質転換された植物（その細胞又 は種子を含む）。 ３６．請求の範囲第２７項に記載の方法により形質転換された植物（その細胞又 は種子を含む）。