HU220358B - Eljárás hibrid vetőmagok előállítására - Google Patents

Eljárás hibrid vetőmagok előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU220358B
HU220358B HU9302688A HU9302688A HU220358B HU 220358 B HU220358 B HU 220358B HU 9302688 A HU9302688 A HU 9302688A HU 9302688 A HU9302688 A HU 9302688A HU 220358 B HU220358 B HU 220358B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plant
nucleotide sequence
parent
expression cassette
promoter
Prior art date
Application number
HU9302688A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT69965A (en
HU9302688D0 (en
Inventor
Lyle D. Crossland
Jeffrey I. Stein
Annmarie B. Tuttle
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HU9302688D0 publication Critical patent/HU9302688D0/hu
Publication of HUT69965A publication Critical patent/HUT69965A/hu
Publication of HU220358B publication Critical patent/HU220358B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8217—Gene switch
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
    • C12N15/8289—Male sterility
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S47/00—Plant husbandry
    • Y10S47/01—Methods of plant-breeding and including chromosome multiplication

Abstract

A találmány tárgya egy kétlépéses eljárás hímsteril növényekelőállítására. Két genetikusan transzformált növényt, a szülő 1 és 2-tkeresztezik, hogy hímsteril utódokat nyerjenek. A szülő 1-t egy olyanexpressziós kazettával transzformálják, amely egy portokspecifikuspromotert kódoló szekvenciát tartalmaz, amely működőképesen kap-csolódik egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához. A szülő2-t egy olyan target-nukleotidszekvenciát tartalmazó expresszióskazettával transzformálják, amely a transzaktivátor aktiválására képesés működőképesen kapcsolódik egy RNS-t vagy egy polipeptidet kódolónukleotidszekvenciához, amely megakadályozza az életképes pollenekképződését. Ennek következtében a szülő 1-et keresztezve a szülő 2-velhímsteril utódnemzedéket kapnak. A hímsteril növények felhasználhatókhibrid vetőmagok termelésére. A találmány tehát kompozíciókat éseljárásokat szolgáltat egy kódolórégió magas szintű kifejezésére,különösen növényekben. ŕ

Description

A jelen találmány a növényi biotechnológia területéhez tartozik. A találmány tárgya eljárás hímsteril növények termesztésére és ezen növények felhasználása a hibrid vetőmagok termelésében. A találmány továbbá a találmány szerinti módszerrel előállított transzgén hímsteril növényekre és hibrid vetőmagokra is vonatkozik.
A gabonaféléknél a heterózis különös figyelmet érdemel, mert jelentős hatással volt a fejlődésre. A gabona különböző törzseinek keresztezése során egy megnövekedett termelékenységet figyeltek meg a 19. század végén és ez fejlődött a szisztematikus genetikai eljárásoknak megfelelően.
A termesztett hibrid gabonákat szokásosan úgy állítják elő, hogy kifejlesztenek sok beltenyésztésű vonalat, ezeket keresztezik és meghatározzák, hogy mely hibridek a legproduktívabbak az adott helyen.
A hibrid kukorica sikere buzdította a növénynemesítőket arra, hogy kutassák a hibrid erő (vigor) létét és nagyságát számos egyéb fajtánál, melyek közgazdaságilag jelentősek. Általában a hibridek növelik a hozamokat. A hibridek általában a növekedési faktorokat hatékonyabban használják fel és nagyobb választ adnak egységenként a növekedési faktorokra, úgymint a vízre és a trágyára. Mostoha körülmények között az FI hibrid általában kiválóbb a szülőkultúránál, és stabilabb teljesítményű a környezet széles területein. Olyan hibridekkel, ahol egységes a termék és az érettség, gyakran megkönnyíthető az aratás és megnövekszik a termék értéke a piacon. Az FI hibridet olyan tulajdonságokkal lehet kombinálni, amelyeket bonyolult vagy lehetetlen más módon kombinálni. Ez különösen igaz több interspecifikus és intergenerikus hibrid esetén. A kutatásból levonható általános következtetés az, hogy a hibrid erő egy általános jelenség a növényekben, és elegendően nagy ahhoz, hogy kereskedelmi hasznosítást biztosítson, ha alkalmas technikákat eszközölünk.
A hibridaktivitásról megállapították, hogy az széles körű jelenség a növényekben és állatokban már sok éve. A kereskedelmi hibrideket ma elterjedten használják sok terménynél, beleértve a búzát, cirokot, cukorrépát és a napraforgót is. A kutatás számos egyéb terményre is irányul, ami lehetővé fogja tenni a kereskedelmi hibridek széles körű alkalmazását a jövőben.
Legnagyobb a jelentősége a kereskedelmi hibrideknek azoknál a terményeknél, amelyekben hibrid vetőmagokat lehet termelni ténylegesen és gazdaságosan. Három biológiai követelménye van a sikeres hibridvetőmag-termelésnek és ezek a következők: hibrid életerő jelenléte, a nőnemű pollen eliminálása a nőnemű szülőben és kielégítő beporzás a hím szülő által.
A célból, hogy szennyezésmentes hibrid vetőmagokat kapjunk saját magú, beporzásikontroll-módszerekkel, biztosítani kell, hogy keresztbeporzás és ne önbeporzás menjen végbe. Ismert beporzásikontroll-mechanizmusok rendszerint mechanikai, kémiai vagy genetikai módszerek.
A termékeny pollen eltávolítása a nőnemű szülőből némely fajtánál, így a kukoricánál és az egylaki fajtáknál kézi emaszkulációval érhető el. A termékeny pollen ugyanilyen eliminálása érhető el a hím virágzat (kukoricahaj) letépésével vagy levágásával a növényekről, a nőnemű szülő populációban. Ez az egyszerű eljárás megakadályozza az önmegtermékenyítést a mechanikailag semlegesített nőnemű szülők által, mielőtt a kihulló pollenek meghiúsítják az önbeporzást. Azonban a haszonnövények legnagyobb része funkcionális hím és női szervekkel is rendelkezik ugyanazon virágon belül, így az emaszkuláció nem egy egyszerű eljárás. Mindenesetre a hibridvetőmag-termelés ezen formája különlegesen munkaigényes és ennélfogva drága.
Ahhoz, hogy elkerüljük a munkaigényes kukoricahaj-eltávolítást, az önmegtermékenyítést szükséges megakadályozni a hibridkeresztezésekben. Ehhez citoplazmikus faktorokat használnak, amelyek hímsterilitást eredményeznek néhány fajtánál, összekapcsolva helyreállító (restorer) génekkel.
Nőnemű szülőben hímsterilitást lehet kontrollálni nukleáris génekkel vagy egy citoplazmikus-genetikus rendszerrel. A genetikai hímsterilitás előidézhető olyan nukleáris génekkel, amelyekben a sterilitásra szolgáló allélek általában lappangók a fertiiitásra szolgáló allélekhez képest. A genetikai hímsterilitás sok fajtában megjelenik. Azok a nemesítők, akik a genetikai hímsterilitást használják a hibridvetőmag-termeléshez, rendszerint kifejlesztenek egy fenotípusosan egységes nőnemű vonalat, amely elkülöníti 1:1 arányban az Msms és nem Msms egyedeket. Az ilyen vonalak számára termelt mag megnövekedett izolációban az msms növényekből learatandó mag által, amelyek Msms növényekből lettek beporozva. Ahhoz, hogy genetikai hímsterilitással rendelkező kereskedelmi FI hibrid vetőmagot termeljünk, a női Msms növények 50%-át be kell gyűjteni a földekről, amint a termékenységük megállapítható. A nőnemű növényekből a termékeny növények kiválasztásával kapcsolatos munka nagyban akadályozza a genetikai hímsterilitás alkalmazását a hibridvetőmag-termelésben. Néhány probléma is adódik ezzel a rendszerrel kapcsolatban, ha kereskedelmi hibridvetőmag-termelésre használjuk. Mindenekelőtt, nem lehet eliminálni a kívánt hímsteril növényekből a termékeny növényeket a nőnemű populációban. A genetikai himsteril növényeket fent lehet tartani párosítva azokat hímtermékeny egyedekkel. Egy ilyen keresztezésből származó FI növények fele lenne steril, a maradó fél azonban termékeny lenne. így a nem kívánt hímtermékeny növények a nőnemű populációban szétszórhatják a pollent és csökkenthetik a kívánt hím szülő hatékonyságát.
A citoplazmikus hímsterilitás sikeres használata a kereskedelmi hibridvetőmag-termelésben megkövetel egy stabil hímsteril citoplazmát, egy kielégítő pollenforrást és egy hatékony rendszert a pollen átjuttatására a hím szülőből a hímsteril nőhöz. Tehát a hímsterilitás citoplazmikus-genetikus rendszere három vonalat igényel egyetlen keresztezett hibrid előállításához; az A vonalat (hímsteril), a B vonalat (hímtermékeny hordozó) és az R vonalat (hímsteril visszaállító génekkel). Háromszori keresztezések, melyek citoplamikus-genetikus hímsterilitást eredményeznek, magukban foglalják az előállítását és a termelését négy vonalnak, az egyik
HU 220 358 Β beltenyésztésű A és B vonalnak, és a másik két hímtermékeny beltenyésztésű vonalnak.
Továbbá, a déli gabonaüszög, melyet a Helminthosporium maydis, Race T okoz, és amely némelykor megtámad minden kukoricahibridet, mely citoplazmikus hímsteril T-citoplazmával rendelkezik, demonstrálja a hibrid vetőmag ipari termelésének - mely a hímsteril citoplazmának egyetlen forrásán alapul - sebezhetőségét. A hibrid kukorica esetén a legtöbb magtermelő visszatért a kézi vagy mechanikus emaszkulációhoz és a szél általi beporzáshoz.
Hibrid vetőmag termelhető olyan kemikáliák segítségével is, amelyek blokkolják vagy megakadályozzák az életképes pollenképződést. Ezeket a vegyszereket, a gametocideket használják egy átmeneti hímsterilitás létrehozására. A kemikáliák költségessége és hatékonysága azonban, és az alkalmazásuk megbízhatósága limitálja a hibridvetőmag-termelést gametocidák segítségével.
Hibrid vetőmag előállítására a molekuláris módszereket is már leírták. Ezek a módszerek magukban foglalják a növények transzformálását antiszensz DNS-t és egyéb géneket tartalmazó szerkezetekkel, amelyek képesek a termékeny pollen termelésének szabályozására a növényekben. Az így regenerált növények funkcionálisan hímsterilek és felhasználhatók hibridvetőmag termelésére a hímtermékeny növényekből származó pollennel való keresztezéssel. Ezeknek a közelítéseknek elsődleges hiányosságai abból a tényből származnak, hogy a biotechnológiai úton manipulált hímsteril gén - akár egy antiszensz akár RNS - csak heterozigóta állapotban nyerhető. Ezek alapvetően ugyanolyanok, mint a természetes genetikai hímsterilek, amelyekben azokat fenntartják izogenikus hímtermékeny vonalakkal történő keresztezéssel. Ez a legnagyobb probléma a hibridkeresztezés területén, ahol a földterület nagy és a hozam is kritikus. A heterozigóta nőnemű szülőt, amelynek csak 50%-a lesz hímsteril, közvetlenül a pollent adó hím szülő melletti sorokban kell ültetni és az 50% termékeny nőnemű szülőt el kell távolítani. Ez könnyebben kivitelezhető a biotechnológiai úton előállított genetikai hímsterilekben, mert egy herbicid gén kapcsolható a hímsterilitás génjéhez, és így a herbicid sprayt fel lehet használni a termékeny növények eltávolítására, de ez még azt is jelenti, hogy a nőnemű szülősorokat dupla sűrűséggel kell ültetni, hogy ugyanolyan hozamot kapjunk földegységenként (acre) a mi szisztémánk szerint. Ez némi hozamveszteséget fog okozni a versenynek köszönhetően. A herbicid spray tehát egy hozamveszteséget jelent, mert a rezisztens növények sem 100%-ban immunok a herbicidre, és a spray hatóanyagának költségeit is figyelembe kell venni.
A fentiek alapján tehát a találmány fő célja egy megbízható, egyszerű technika kidolgozása hibridvetőmagtermelésére, amely mentes a fent leírt, ismert módszerek hátrányaitól.
Ezt a célt megvalósíthatjuk a találmány keretein belül megadott módszerrel, mely a hímsteril növények előállítására szolgál. A találmány szerinti módszer magában foglalja két, genetikailag transzformált szülő, a szülő 1 és 2 keresztezését. A szülő 1-et transzformáljuk egy expressziós kazettával, amely tartalmaz egy első polipeptidet, egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciát, mely egy második, egy target-nukleotidszekvencia szabályozására képes. Az első polipeptidet kódoló DNS-szekvencia működőképesen kapcsolódik egy portokspecifikus promoterhez.
A szülő 2-t transzformáljuk egy olyan expressziós kazettával, amely a target-nukleotidszekvenciát tartalmazza működőképesen kapcsolva egy RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló szekvenciához, mely mindkettő képes az életképes pollenképződés diszrupciójára. Amikor a szülő 1-et és 2-t keresztezzük, a polipeptid 1, a transzaktivátor szabályozza a target-nukleotidszekvenciát és átfordul a polipeptid 2 expressziójára. így nincs életképes pollenképződés a következő nemzedékekben.
A fentiek alapján a találmány elsődlegesen hímsteril növényeket előállító eljárásra vonatkozik, mely eljárás az alábbi lépésekből áll:
(i) transzformálunk egy első növényi sejtet egy első expressziós kazettával, mely kazetta tartalmaz egy portokspecifikus 5’ szabályozórégiót kódoló nukleotidszekvenciát, működőképesen kapcsolva egy transzaktivátor polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához; és regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 1-et a nevezett első transzformált sejtből;
(ii) transzformálunk egy második növényi sejtet egy második expressziós kazettával, mely tartalmaz egy target-nukleotidszekvenciát, amely aktiválható a nevezett transzaktivátor polipeptid által és működőképesen kapcsolódik egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, melyek az életképes pollenképződés diszrupciójára képesek; és regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 2-t a nevezett, második transzformált sejtből;
(iii) keresztezzük a kapott szülő 1-et a kapott szülő 2vel, hogy hímsteril utódokat nyerjünk.
A találmány így tehát transzgenikus növényekre és utódaikra is vonatkozik, melyek tartalmaznak egy stabilan integrálódott expressziós kazettát, ahol a nevezett expressziós kazetta magában foglal egy portokspecifikus promotert kódoló nukleotidszekvenciát működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciával.
A találmány olyan transzgenikus növényekre és utódaikra is vonatkozik, amelyek tartalmaznak egy stabilan integrálódott expressziós kazettát, ahol a nevezett expressziós kazetta magában foglal egy target-nukleotidszekvenciát, amely egy transzaktivátor által aktiválható és működőképesen kapcsolódik egy nukleotidszekvenciához, amely egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódol, melyek diszruptálni fogják az életképes pollenek képződését.
A találmány továbbá transzgenikus hímsteril növényekre és utódaikra is vonatkozik, melyek tartalmaznak egy stabilan integrálódott első expressziós kazettát, amely tartalmaz egy portokspecifikus promotert kódoló nukleotidszekvenciát, működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához, és egy második expressziós kazettát, amely magában foglal
HU 220 358 B egy target-nukleotidszekvenciát, mely a nevezett transzaktivátor polipeptid által aktiválódik, működőképesen kapcsolva egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, melyek az életképes pollen képződését fogják diszruptálni.
A transzgenikus növények a találmány szerint lehetnek kétszikű vagy egyszikű növények. Előnyösek az egyszikűek a Graminaceae családból, melyek közé tartoznak a Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale és Setaria növények.
Különösen előnyös transzgenikus növények a kukorica, búza és az árpa.
Az „utód” kifejezés alatt értjük a transzgenikus növényeknek mind az „aszexuális” mind a „szexuális” leszármazottjait. Ez a definíció tehát magában foglalja az ismert módszerek segítségével - így például sejtfúzióval vagy mutáns szelekcióval - kapható összes mutánst és variánst, amelyek még rendelkeznek a kiindulási transzformált növény jellegzetes tulajdonságaival, beleértve a transzformált növényi anyag összes keresztezett és fúziós termékét.
A találmány továbbá a transzgenikus növények szaporítóanyagára is vonatkozik.
A transzgenikus növények szaporítóanyaga a találmány értelmében bármilyen növényi anyag lehet, amely szexuálisan vagy aszexuálisan in vivő vagy in vitro szaporítható. Különösen előnyösek a találmány keretem belül a protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, magok, embriók, pollenek, petesejtek, zigóták, továbbá bármely más szaporítóanyag, melyet a transzgenikus növényből kaptunk.
A növényi részek, így például virágok, szárak, gyümölcsök, levelek, gyökerek, melyek a transzgenikus növényekből származnak vagy a találmány szerinti eljárással előzőleg transzformált növények utódai és ennélfogva a transzgenikus sejtek legalább egy részéből állnak, szintén a találmány tárgyát képezik.
A találmány szerinti hímsteril növényeket felhasználjuk hibridvetőmag-termelésre, amely szintén a találmány tárgyát képezi.
A fentiek alapján a találmány tehát hibridvetőmagtermelésére szolgáló eljárásra vonatkozik, mely hibrid magokat olyan növényekből kapjuk, melyeket a pollentermelő növények azon egyedeiből szelektáltunk, amelyek genetikailag transzformálhatok. Az eljárás a következő lépéseket foglalja magában:
(a) hímsteril növények előállítását, oly módon, hogy:
(i) transzformálunk egy első szülő növényi sejtet egy első expressziós kazettával, amely tartalmaz egy portokspecifikus 5’ szabályozórégiót kódoló nukleotidszekvenciát, működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához;
(ii) regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 1et, a nevezett első transzformált növényi sejtből;
(iii) transzformálunk egy második szülő növényi sejtet egy második expressziós kazettával, amely egy, a nevezett transzaktivátor által aktivált, target-nukleotidszekvenciát tartalmaz, működőképesen kapcsolva egy nukleotidszekvenciával, mely egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódol, melyek diszruptáljak az életképes pollenek képződését;
(iv) regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 2-t, a nevezett második transzformált növényi sejtből; és (v) keresztezzük a szülő 1-et a szülő 2-vel hímsteril utódok létrehozása céljából; és (b) keresztezzük a fenti módon kapott hímsteril utódokat egy szelektált termékeny vonallal, hogy hibrid magokat kapjunk.
így tehát a találmány szerint hibrid vetőmagokat állíthatunk elő a fent leírt módon.
A találmány továbbá kompozíciókat és módszereket szolgáltat heterológ gének növényekben való magas szintű expressziójára. Ezen a módon, az első szerkezet magában foglalja a kívánt 5’ szabályozórégiót, működőképesen kapcsolva egy T7 polimerázt kódoló nukleotidszekvenciával. A második szerkezet hordozza a kívánt polipeptidet kódoló régiót, működőképesen kapcsolva a T7 5’ szabályozórégióhoz. Amikor a növényt transzformáljuk mindkét szerkezettel, a kívánt polipeptid magas szintű expresszióját a T7 polimeráz szabályozza. Specifikus növényi promotereket használva a T7 polimeráz expressziója irányítható, a kívánt polipeptid vagy az RNS magas szinten nyerhető bizonyos szövetekben vagy specifikus fejlődési fokozatoknál.
A fentiek alapján a találmány olyan transzgenikus növényekre vonatkozik, amelyeket mindkét fenti szerkezettel transzformáltunk. A találmány szerinti transzgenikus növény lehet kétszikű vagy egyszikű. Előnyösek a Graminaceae családhoz tartozó egyszikű növények, melyek közé tartoznak a Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale és Setaria.
Különösen előnyösek a transzgén kukorica, búza és árpa.
A találmány egy kétlépéses eljárást nyújt a hímsteril növények előállítására. Az eljárás magában foglalja két genetikusán transzformált növény keresztezését, melyekre mint szülő 1 és 2 hivatkozunk. A szülő 1-t transzformáljuk egy expressziós kazettával, mely tartalmaz egy nukleotidszekvenciát, mely a portokokban lévő, első polipeptid expresszióját irányítja. Ez az első polipeptid képes a második nukleotidszekvencia, a kívánt (target) DNS transzkripcióját szabályozni, amely az RNS vagy polipeptid expresszióját irányítja, melyek képesek megakadályozni az életképes pollenek termelődését. A szülő 2-t transzformáljuk egy expressziós kazettával, amely tartalmazza a target-nukleotidszekvenciát, működőképesen kapcsolva az RNS-t, vagy egy polipeptidet kódoló szekvenciával, melyek képesek az életképes pollenek képződését diszruptálni.
Amint említettük, az RNS-t vagy a második polipeptidet csak abban az esetben lehet kifejezni, ha jelen van az első polipeptid, a transzaktivátor. így mindkét szülő, az 1 és 2, hímtermékeny. Azonban a szülő 1-t keresztezve a szülő 2-vel, a transzaktivátor szabályozza az RNS vagy a polipeptid 2 expresszióját a target-DNSszekvencia útján. Az eredmény életképtelen pollenek
HU 220 358 Β termelődése. A kapott utódok, melyek mindkét expressziós kazettát hordozzák, hímsterilek lesznek.
A hímsterilitás hibát vagy képtelenséget jelent a funkcionális vagy életképes pollenek termelésében. A hímsterilitás eredhet hibákból, melyek a pollenképződés elmaradásához vagy - ha képződnek - a pollenben a funkcionális képesség elmaradásához vezetnek. Ezért vagy a pollen nem képződik, vagy - ha képződik - az vagy nem életképes vagy képtelen normálkörülmények között a hatékony megtermékenyítésre.
A találmány szerinti hímsteril növények nőnemű termékenyek. Azaz a növények nem képesek termékeny polleneket termelni, sőt képtelenek a kívánt eredeti szülőből származó pollen felvételére, ezzel megtermékenyítést és magképződést eredményezve.
Léteznek bizonyos transzaktivátor polipeptidek, melyeket a jelen kétlépcsős sterilitási szisztémában alkalmazhatunk. Lényeges szempont, hogy az RNS vagy a második polipeptid, amely diszruptálja a pollenképződést, ne fejeződjön ki az első, transzaktivátor polipeptid hiányában.
A találmány szerinti transzaktivátorok képesek a target-nukleotidszekvenciát aktiválni, amely működőképesen kapcsolódik az RNS-t vagy egy második polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, mely mindkettő képes az életképes pollenek termelődését diszruptálni. így, a target-szekvenciához működőképesen kapcsolt nukleotidszekvencia csak a transzaktivátor jelenlétében tud kifejeződni.
A találmány szerinti transzaktivátorok közé tartoznak, de nem korlátozódnak ezekre, a polimerázok, DNSkötő fehéijék, természetesen előforduló és szintetikus aktivátorok, transzlációs aktivátorok, poszttranszkripcionális aktivátorok és hasonlók. Ilyen transzaktivátor polipeptidek használatát szemléltetik egy másik nukleotidszekvencia kifejeződésének irányításában a T7 RNSpolimeráz által: lásd 5,122,457 számú, 5,126,251 számú és 5,135,855 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírások; Lassner és munkatársai: Plánt Molecular Biology 17, 229-234 (1991); Rodrigez és munkatársai: Journal of Virology 64,4851-4857 (1990); Vennema és munkatársai: Gene 108, 201-210 (1991); Benton és munkatársai: Molecular and Cellular Biology 10, 353-360 (1990); Elroy-Stein és Moss: Proceedings, Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 87, 6743-6747 (1990); Moss és munkatársai: Natúré 348, 91-92 (1990); ElroyStein és munkatársai: Proceedings, Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 86,6126-6130 (1989); és Rosenberg és munkatársai: Gene 56,125-135 (1987).
A szabályozópolipeptidek vagy -transzaktivátorok közé tartoznak a DNS-kötő fehérjék is, amelyek szükségesek a specifikus promoterek transzkripciós aktiválásához. Az egyik protein kötő doménjeit fuzionálhatjuk a másik protein aktív doménjeihez az ilyen DNS-kötő fehérjék kiméráinak létrehozása céljából, mint például a GAL4/VP16 (Carey és munkatársai: J. Mól. Bioi. 209, 423-432 (1989); Cress és munkatársai: Science 251, 87-90 (1991); és Sadowski és munkatársai: Natúré 335, 563-564 (1988). Hasonlóképpen más fehérjék kötő doménjeit, i.e. Lex A, is használhatjuk [Brent és
Ptashne: Cell 43, 729-736 (1985), amelyet Lex a/GAL4 transzkripciós aktivátorként írtak le].
Transzlációs aktivátorokat vizsgáltak a karfiol mozaikvírus transzlációs aktivátorán (TÁV) keresztül [lásd például Fuetterer és Hohn: EMBO J. 10, 3887-3896 (1991)]. Ebben a rendszerben egy kétcisztronos mRNS képződött, azaz két kódolórégió íródott át ugyanarra a mRNS-re ugyanarról a promoterről. TÁV távollétében csak az egyik cisztron íródik át a riboszóma által. Azonban, ha a sejtben TÁV fejeződik ki, mindkét cisztron átiródik. Egy polipeptidet kódoló régió képes diszruptálni az életképes pollen képződését azáltal, hogy elfoglalja a második cisztron helyét.
Az expressziós kazetta 1-gyel transzformáljuk a szülő 1-et, amely tartalmaz egy portok 5’ szabályozórégiót működőképesen kapcsolva az első, transzaktivátor polipeptidhez. A találmány szerinti 5’ szabályozórégiók magukban foglalják az expresszióhoz szükséges nukleotidszekvenciákat, azaz a promoter régiót. A szerkezet magában foglalhat más szükséges szabályozókat is, úgy mint terminátorokat [Guerineau és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 226, 141-144 (1991); Proudfoot: Cell, 64, 671-674 (1991); Sanfacon és munkatársai: Genes Dev. 5, 141-149 (1991); Mogen és munkatársai: Plánt Cell 2, 1261-1272 (1990); Munroe és munkatársai: Gene 91,151-158 (1990); Ballas és munkatársai: Nucleic Acids Rés. 17, 7891-7903 (1989); Joshi és munkatársai: Nucleic Acid Rés. 15, 9627-9639 (1987)]; nukleáris lokalizációs szignálok [Kalderon és munkatársai: Cell 39, 499-509 (1984); és Lassner és munkatársai: Plánt Molecular Biology 17,229-234 (1991)]; növényi transzlációs konszenzusszekvenciák [Joshi, C. P.: Nucleic Acids Research 15, 6643-6653 (1987)]; intronok [Luehrsen és Walbot: Mól. Gén. Génét. 225, 81-93 (1991)] és hasonlók, melyek működőképesen vannak kapcsolva a transzaktivátor nukleotidszekvenciájához.
Az expressziós kazetta 2-vel transzformáljuk a szülő 2-t, amely kazetta hordoz egy nukleotidszekvenciát, melyen a transzaktivátor hat, működőképesen kapcsolva a kívánt kódolórégióhoz.
További szabályozó-nukleotidrégiókat is magában foglalhat, így terminátorokat, promotereket, vezetőszekvenciákat és hasonlókat. Ezek a régiók működőképesen kapcsolódnak a kódolórégióhoz.
Az előnyös lehet, hogy az expressziós kazetta 2 szerkezet 5’ vezetőszekvenciákat tartalmazzon. Az ilyen vezetőszekvenciák képesek fokozni a transzlációt. A transzlációs leaderek ismertek az irodalomban és ezek közétartoznak:
A Picornavirus vezetőszekvenciák, például az EMCV leader (enkefalomiokarditisz 5’ nem kódolórégió) [Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. és Moss, B.: PNADS USA 86, 6126-6130 (1989)];
Potyvirus vezetőszekvenciák, például a TEV leader (Tobacco Etch vírus) [Allison és munkatársai (1986)];
MDMV leader (kukorica törpe mozaikvírus); (Virology 154, 9-20); és humán immunglobulin nehéz láncot kötő fehérje (BiP), [Macejak, D. G. és Samow, P.: Natúré 353, 90-94 (1991)];
HU 220 358 Β nemtranszlatálódott leader az alfalfa mozaikvírus burokfehérje-mRNS-ből (AMV RNS 4), [Jobling, S. A. és Gehrke, L.: Natúré 325,622-625 (1987)];
dohány mozaikvirus leader (TMV), [Gallie, D. R. és munkatársai: Molecular Biology of RNA, 237-256 (1989)]; és kukorica chlorotic mottle vírus leader (MCMV) [Lömmel, S. A. és munkatársai: Virology 81, 382-385 (1991). Lásd még Della-Cioppa és munkatársai: Plánt Physiology 84, 965-968 (1987)].
Vagy egy növényi terminátor, egy T7 terminátor vagy mindkettő használható az expressziós kazetta 2ben. Lásd Rosenberg és munkatársai: Gene 56, 125 (1987); Guerineau és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 226, 141-144 (1991); Proudfoot: Cell 64, 671-674 (1991); Sanfacon: Genes Dev. 5,141-149 (1991); Mogen: Plánt Cell 2, 1261-1271 (1990); Munroe: Gene 91, 151-158 (1990); Ballas: Nucleic Acids Rés. 17, 7891-7903 (1989); Joshi: Nucleic Acids Rés. 15, 9627-9639 (1987).
Az egyes expressziós kazettákat a különböző transzaktivátor-rendszerek számára részletesen leírjuk és példákkal szemléltetjük a kísérleti részben.
A találmány egy előnyös megvalósításában a T7 polimeráz rendszert alkalmazzuk. A T7 bakteriofág hordoz egy gént, mely egy RNS-polimerázt kódol, amely felismeri a fágspecifikus promotert. A polimeráz és a fág promoterek azon kivételes tulajdonságokkal rendelkeznek, melyek megakadályozzák az interferenciát a gazdagének expressziójával.
A T7 RNS-polimeráz egy 100 kD-os monomer enzim, míg a legtöbb polimeráz több komplexből áll. A T7 promoter 23 bp-ból áll, melyek nem találhatók meg más prokarióta vagy eukarióta promoterekben [lásd Dunn és munkatársai: J. Mól. Bioi. 166, 477-535 (1983); Davanloo és munkatársai: Proceedings Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 81,2035-2079 (1984); és Moffatt és munkatársai: J. Mól. Bioi. 173, 265-269 (1984)].
Ahhoz, hogy a T7 polimeráz rendszert használjuk a hímsteril növények előállítására, a szülő 1-et transzformáljuk egy expressziós kazettával, amely tartalmaz egy portok 5’ szabályozórégiót, működőképesen kapcsolva a T7 polimerázt kódoló nukleotidszekvenciához. Egy nukleáris lokációs szignált (NLS), így például az SV40 nukleáris lokációs szignált szintén beépíthetjük a szerkezetbe [lásd például Kalderon és munkatársai: Cell 39, 499-509 (1984); Dunn és munkatársai: Gene 68, 259-266 (1988); Hunt T.: Cell 59, 949-951 (1989); és Lassner és munkatársai: Plánt Molecular Biology 17, 229-234 (1991)]. Egy növényi transzlációs konszenzusszekvenciát is beépíthetünk [Joshi, C. P.: Nucleic Acid Research 15, 6643-6653 (1987)], valamint növényi terminációs szignálokat és intronokat.
A portokspecifikus promoterek ismertek a szakirodalomban. A portokspecifikus promoterek használata által a kapott transzgenikus növények a T7 polimerázt csak a növény portokjában fogják kifejezni. A portokspecifikus promoterekre kitanítás található az 1993. június 1-én benyújtott 93810455 számú európai szabadalmi bejelentésben, mely kitanítást referenciaként beépítjük ezen bejelentésbe.
Portokspecifikus genomiális kiónokat kaphatunk portokspecifikus cDNS-klónok mint próbák felhasználásával, kiválasztva a megfelelő genomiális kiónokat. A megfelelő genomiális kiónok azok, melyek átíródnak messenger RNS-sé, amely komplementer az adott cDNS-sel és átíródik az adott cDNS-sé.
A portokspecifikus cDNS-szekvenciát megkaphatjuk portokszövetből vagy levélszövetből preparált cDNS-könyvtárakból. A levélből származó egyszálú DNS-t fotobiotiniláljuk és hibridizáljuk a portok-DNShez. A fotobiotinilált DNS-t eltávolítjuk, és hagyjuk, hogy a könyvtár a portokspecifikus cDNS-szekvenciákban dúsuljon. A portokspecifikus cDNS-eket különböző módszerekkel screeneljük. A portokspecifikus cDNSeket kereszthibridizáljuk, hogy egyetlen cDNS-t azonosítsunk. A portokspecifikus expressziót RNS biot hibridizációval, különböző növényi szövetekkel és in situ hibridizációval ellenőrizzük. A kifejlődő expressziét, szekvenciákat és a portokspecifikus cDNS-klónok génmásolatainak számát szintén meghatározhatjuk.
A cDNS-szekvenciákat használhatjuk a genomiális DNS-szekvenciák izolálására. Ahol egy parciális cDNS-t kaptunk, ott a parciális cDNS-t használjuk próbaként a portok-cDNS-könyvtár átvizsgálására abból a célból, hogy egy teljes hosszúságú cDNS-klónt izoláljunk. A hibridizáló kiónokat tisztítjuk, elkészítjük a restrikciós térképet és szekvenálunk. Egy teljes hosszúságú klón üzenetértékű lesz, amint egy komplett nyitott leolvasási kerettel rendelkezik. A genomiális izolálásához a teljes hosszúságú portok-cDNS-t használjuk próbaként a genomiális könyvtár átvizsgálására. A restrikciós térkép felvételével és a portok-cDNS-hez való hibridizációval azonosítjuk a genomiális klón kódolórégióját. A klón kódolórégiójától a felfelé vezető régió a portokpromoter régió.
A portokspecifikus régiót még pontosabban meghatározhatjuk deléciós analízissel. A portokpromoter 5’ delécióit restrikciós helyek bevezetésével készítjük el, melyhez PCR oligonukleotid primereket alkalmazunk az 5’-végek restrikciós helyeinél és a portokpromoter szekvenciák 3’-végeinél. A PCR-termékeket emésztjük, tisztítjuk és klónozzuk egy alkalmas plazmidvektorba, így például pBHOl (Clontech) plazmidba. A deléciós mutánsok az 5’ nemtranszlatált vezetőszekvenciát tartalmazzák fuzionálva a GUS-gén transzlációs starthelyéhez. A portokpromoterek belső és 3’ delécióit hasonló módon készítjük PCR-módszerrel. A PCRfragmenseket a GUS-vektorba fuzionáljuk, mely a CAMV 35S minimálpromotert tartalmazza (-46-tól + l-ig; Benfey et al., 1990). A transzgén növényeket tesztelhetjük GUS-sal fluorometriás és hisztokémiai módszerekkel.
A promoter-DNS-szekvenciák esetében a „portokspecifikus” olyan szabályozószekvenciákat jelent, amelyek az asszociált kódolószekvenciák transzkripcióját irányítják úgy, hogy a portokszövetben a megfelelő messenger RNS-koncentrációja legalább 100-szorosa az egyéb szövetekben megfigyelt koncentrációknak.
HU 220 358 Β
A szülő 2 transzformálásához használt expressziós kazetta tartalmazza a T7 promotert működőképesen kapcsolva egy nukleotidszekvenciához, mely az életképes pollenképződést diszruptáló RNS-t vagy polipeptidet kódolja. Ilyen polipeptidek közé tartoznak, de nem korlátozódnak ezekre, az alábbiak:
Diftériatoxin-A-lánc (DTA), mely a fehérjeszintézist gátolja [Greenfield és munkatársai: Proc. Natl. acad. Sci.: USA 80, 6853 (1983)];
Pektinliáz pelE az Erwinia chrysanthemi EC 16-ból, amely lebontja a pektint lizálva a sejteket [Keen és munkatársai: J. Bacteriology 168, 595 (1986)];
T-urfl3 (TURF-13) a cms-T kukorica mitokondriális genomjából; ez a gén kódolja az URF13-mal jelzett polipeptidet, amely diszruptálja a mitokondriális vagy plazmamembránokat [Braun és munkatársai: Plánt Cell 2,153 (1990); Dewey és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 84,5374 (1987); Dewey és munkatársai: Cell 44, 439 (1986)]; Gin rekombináz egy gén a Mu-fágból, mely a helyspecifikus DNS-rekombinázt kódolja, amely a genom átrendeződését és a sejtaktivitás elvesztését okozza, amikor a növények sejtjeiben kifejeződik [Maeser és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 230,170-176 (1991)];
Indol-ecetsav-lizin-szintetáz (iaaL) a Pseudomonas syringae-ből, mely a lizint az indol-ecetsavhoz (IAA) konjugáló enzimet kódolja. Amikor a növényi sejtekben kifejeződik, megváltozott fejlődést okoz az IAAnak a sejtből konjugáció útján való eltávolításával [Romano és munkatársai: Genes and Development 5, 438-446 (1991); Spena és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 227, 205-212 (1991); Roberto és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 87, 5795-5801; és
CytA toxingén a Bacillus thuringiensis Israeliensisből, mely egy moszkitocid és hemolitikus fehérjét kódol. Amikor ez a növényi sejtekben kifejeződik, a sejtek halálát okozza a sejtmembrán széttörése által [McLean és munkatársai: J. Bacteriology, 169, 1017-1023 (1987); Ellar és munkatársai: 4,918,006 számú egyesült államokbeli szabadalmi leírás].
Ilyen polipeptidek közé tartozik az adenin-foszforibozil-transzferáz (APRT) is [Moffatt és Somerville: Plánt Physiol. 86, 1150-1154 (1988)]; DNS-áz, RNSáz, proteáz, szalicilát-hidroxiláz stb.
Megállapítottuk, hogy a T7 promoter működőképesen kapcsolható azon RNS-hez, mely az életképes pollenek képződését képes felfüggeszteni. A találmány szerinti RNS-ek közé tartozik az antiszensz RNS, valamint a ribozimok. Olyan antiszensz RNS-t lehet használni, mely képes a pollenképződésért vagy -működésért felelős génből, azaz APRT, származó mRNS-sel hibridizálni. Ily módon az antiszensz RNS meg fogja akadályozni a megfelelő gének expresszióját, a pollenképződés elmaradását eredményezve.
Hasonlóképpen a ribozimok is felhasználhatók a pollenképződésért vagy -működésért felelős génből származó cél-mRNS-sel együtt. Az ilyen ribozimok tartalmaznak egy legalább kilenc nukleotidból álló hibridizáló régiót, mely komplementer nukleotidszekvenciában a cél-RNS legalább egy részével, és egy katalitikus régiót, mely a cél-RNS hasítására van beépítve. Ilyen ribozimokat leírtak a 0 321 201 számú európai és a 88/04300 számú PCT-beli közrebocsátási iratokban, melyeket referenciaként beépítünk a bejelentésbe. Továbbá lásd még Haseloff és Gerlach: Natúré 334, 585-591 (1988); Fedor és Uhlenbeck: Proc. Natl. Acad. Sci.: USA 87, 1668-1672 (1990); Cech és Bass: Ann. Rév. Biochem. 55, 599-629 (1986); Cech, T. R.: Gene 73, 259-271 (1988); és Zang és Cech: Science 231,470-475 (1986).
Amikor a szülő 1-et keresztezzük a szülő 2-vel, az utódok mindkét kazettát tartalmazzák. Ezért a T7 polimeráz a kódolószekvencia expresszióját a T7 promoter kontrollja alatt helyezi. Egy polipeptid vagy az RNS kifejeződik megakadályozva az életképes pollenek képződését, hímsterilitást eredményezve.
A T7 polimeráz rendszer részletes leírása után a szakember számára nyilvánvaló, hogy más transzaktivátorokat is használhatunk ugyanilyen hatás elérése céljából.
Az egyéb transzaktivátorok közé tartoznak, de nem korlátozódnak ezekre, a GAL4 [Carey és munkatársai: J. Mól. Bioi. 209,423-432 (1989); Ginger és munkatársai: Cell, 40, 767-774 (1985)]; a VP16 [Cress és Triezenberg: Science 251, 87-90 (1991)]; a GAL4-VP16 [Sadowski és munkatársai: Natúré 335, 563-564 (1988)] és a többi. Lásd még Ma és Ptashne: Cell 43, 729-736 (1987); Hope és Struhl: Cell 46, 885-894 (1986); és Gill és Ptashne: Cell 51, 121-126 (1987). Ezen transzaktivátorok aktiválják a transzkripciót élesztőben, növényi, rovar- és állati sejtekben. Az ilyen proteinek tipikusan két részből állnak. Az egyik rész irányítja a DNS kötődését és a másik, az aktiváló régió valószínűleg kölcsönhatásba lép a transzaktivációs folyamat néhány komponensével. így fúziók is, mint például a GAL4-VP16; GAL4-cl használhatók.
Ha a GAL4/VP16 és a GAL4/cl transzaktivátorokat használjuk a transzaktiváláshoz, a promotemek legalább egy GAL-kötőhellyel kell rendelkeznie. Ebben a rendszerben a szülő 1-et egy olyan expressziós kazettával transzformáljuk, mely a portok 5’ szabályozórégiót a GAL4/VP 16-hoz vagy a GAL4/c 1-hez működőképesen kapcsolva tartalmazza. A szülő 2-t egy olyan expressziós kazettával transzformáljuk, mely 5’-től 3’ irányban egy GAL4 kötőhelyet, egy minimálpromotert vagy 5’ szabályozórégiót és a kívánt kódolórégiót hordozza. A minimálpromoter arra szolgál, hogy az alap promoterelemek inaktívak vagy majdnem inaktívak legyenek upstream aktiválás nélkül.
Az 1 és 2 szülő keresztezéséből származó utódok hímsterilek lesznek, mivel a GAL4 transzaktivátor fogja polipeptid vagy az antiszensz RNS expresszióját irányítani, melyek az életképes pollenképződést fogják megakadályozni.
Amint a fentiekben leírtuk, transzlációs aktivátorokat is alkalmazhatunk. Ebben az esetben a szülő 1-et egy olyan expressziós kazettával transzformáljuk, mely hordozza a portok 5 szabályozórégiót működőképesen kapcsolva a karfiol mozaikvírus transzlációs aktivátorhoz (TÁV). A szülő 2-t egy olyan expressziós kazettá7
HU 220 358 Β val transzformáljuk, mely tartalmaz egy portokspecifikus promotert működőképesen kapcsolva egy kétcisztronos mRNS-hez, ahol a második cisztron egy sejttoxint kódol. Keresztezve az 1 és 2 szülőt, hímsteril utódokat kapunk, mivel a dicisztronos mRNS mindkét cisztronja átíródik TÁV jelenlétében [lásd Bonneville és munkatársai: Cell 59, 1135-1143 (1987); Futterer és Hohn: EMBO J. 10, 3887-3896 (1991); Gowda és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9203-9207 (1988); Seholthof és munkatársai: J. Virology 66, 3131-3139 (1992) és 1987. július 10-én benyújtott európai szabadalmi bejelentés].
Némely esetben több transzaktivátort is használhatunk kombinálva egyetlen rendszerben. Például, a T7 polimeráz vagy GA14/VP16 útján történő transzkripciós aktiválást kombinálhatjuk transzlációs aktiválással. Ez a kombináció lehetővé teszi a toxingén nem kívánt expressziójának szorosabb kontrollját transzaktivátor távollétében.
A növényi expressziós kazetták megszerkesztésének metodikája, valamint idegen DNS növényekbe történő bejuttatása jól ismert a szakember számára. Általában idegen DNS növényekbe való beviteléhez a Tiplazmid-vektorokat használják az idegen DNS átadására, valamint a közvetlen DNS-felvételt, a liposzómákat, elektroporációt, mikroinjektálást és mikrobelövéseket. Ezek a módszerek ismertek a szakirodalomban, lásd például Guerche és munkatársai: Plánt Science 52, 111-116 (1987); Neuhaus és munkatársai: Theor. Appl. Génét. 75, 30-36 (1987); Klein és munkatársai: Natúré 327, 70-73 (1987); Howell és munkatársai: Science 208, 1265 (1980); Horsch és munkatársai: Science 227,1229-1231 (1985); DeBlock és munkatársai: Plánt Physiology 91, 694-701 (1989); Methods fór Plánt Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press, Inc. (1988); és Methods inPlant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press, Inc. (1989). Az is köztudott, hogy a transzformálás módja függ a transzformálandó növényi sejttől.
Az egyik lehetséges módszer a genetikai anyag növényi sejtekbe történő bevitelére abban áll, hogy érintkezésbe hozzuk a növényi sejteket azokkal a vírusokkal vagy Agrobacteriummal, amely a beviendő DNS-t tartalmazza. Ezt elérhetjük érzékeny növényi sejtek fertőzése útján vagy növényi sejtekből származó protoplasztok egyesítése útján. A jelen találmány körében használhatjuk a karfiol mozaikvírust (CaMV) is vektorként a találmány szerinti DNS-szerkezetek inszertálására a növényekbe.
Egy másik módszer szerint növényi sejteket fertőzünk Agrobacterium tumefaciens és/vagy Agrobacterium rhizogenes-szel, melyeket előzőleg a nevezett génszerkezettel transzformáltunk. A transzgenikus növényi sejteket azután tenyésztjük alkalmas tenyésztő közegben a szakember számára ismert módon úgy, hogy azok hajtásokat és gyökeret eresszenek és végül teljes növényt formáljanak.
Egy további lehetséges módszer a növényi anyag transzformálására abban áll, hogy Agrobacterium rhizogenes-szel és transzformált Agrobacterium tumefacienc-szel együtt fertőzünk a sárgarépa transzformálására, amint azt Petit ismerteti [Mól. Gén. Génét. 202, 388 (1986)].
A találmány szerinti expressziós kazettákat tehát bevisszük alkalmas növényi sejtekbe, például az Agrobacterium tumefaciens Ti-plazmidjának vagy az Agrobacterium rhizogenes Ri-plazmidjának segítségével. A Tiplazmid vagy az Ri-plazmid átjut a növénybe agrobacteriumos fertőzéssel és stabilan integrálódik a növény genomjába.
Bármely T-DNS-t tartalmazó vektor, amely transzferálható növényi sejtekbe és lehetővé teszi a traszformált növényi sejtek szelekcióját, alkalmas a találmány oltalmi körén belül a felhasználásra. így például, egy shuttle vektort, amely a találmány szerinti DNS-szerkezetet hordozza, klónozunk a bal szegélyszekvencia (LB) és a jobb szegélyszekvencia (RB) közé, és így a vektor képes stabilan replikálódni mind E. coliban, mind A. tumefaciensben. Előnyösek az úgynevezett binervektor-rendszerek.
Egy újonnan kifejlesztett transzformációs technikát használva, lehetőség nyílik arra, hogy általában transzformáljunk in vitro olyan növényi fajokat, amelyek nem természetes gazdanövényei az Agrobacteriumnak. Például az egyszikű növények, különösen a gabonafélék és a különböző füvek, nem természetes gazdák az Agrobacterium számára.
Egyre inkább nyilvánvalóvá vált, hogy az egyszikűek transzformálhatok Agrobacteriummal úgy, hogy új kísérleti anyagokat használunk, melyek most váltak beszerezhetővé, a gabona- és füfélék tehát kezelhetők a transzformáláshoz (Grimsley és munkatársai, 0267159 számú európai közrebocsátást irat).
A DNS növényi sejtekbe Agrobacterium segítségével történő bevezetésének egyik előnyös módszere az úgynevezett levéllemez- (leaf disk) transzformáció Agrobacteriummal [Horsch és munkatársai: Science 227, 1229-1231 (1985)]. Egy alkalmas célnövény levéllemezeit inkubáljuk Agrobacterium-sejtekkel, melyek egy vagy több találmány szerinti expressziós kazettát hordoznak, és azután átvisszük egy alkalmas tápközegbe vagy közegre. Különösen alkalmasak a találmány előnyös kiviteli módja szerint az LS tápközegek, melyeket agar hozzáadásával szilárdítunk meg és növesztünk egy vagy több szokásosan alkalmazott növényi növekedési faktorral, különösen azokkal, melyeket az auxinok csoportjából választunk ki: alfa-nafitil-ecetsav, pikloram, 2,4,5-triklór-fenoxi-ecetsav, 2,4-diklórfenoxi-ecetsav, indol-3-vajsav, indol-3-tejsav, indol-3borkősav, indol-3-ecetsav és p-klór-fenoxi-ecetsav, és melyeket a citokininek csoportjából választunk ki: kinetin, 6-benzil-adenin, 2-izo-pentenil-adenin és zeatin. Az auxinok és citokininek előnyös koncentrációja 0,1-10 mg/1.
Néhány napos, előnyösen 2-3 napos 20-40 °C-on, előnyösen 23-35, még előnyösebben 25 °C-on és diffúz fényben való inkubálás után a levélkorongokat átvisszük egy alkalmas tápközegre csíraképződés céljából. Különösen előnyös a transzformánsok szelektálásá8
HU 220 358 B ra az LS tápközeg, amely nem tartalmaz auxint, de tartalmaz helyette citokinint, és amelyhez egy szelektív anyagot adunk, amely az alkalmazott markergéntől függ. A tenyészeteket fényben tartjuk és alkalmas időközönként, előnyösen hetenként friss táptalajra átvisszük. A kifejlődött zöld hajtásokat levágjuk és tovább tenyésztjük egy gyökereket indukáló tápközegben. Különösen előnyös a találmány szempontjából az LS tápközeg, mely nem tartalmaz auxint vagy citokinint, de tartalmaz egy szelektív anyagot, melyet a transzformánsok szelektálására adtunk hozzá.
Az Agrobacterium-közvetített transzformáción kívül a találmány keretén belül alkalmazhatjuk a közvetlen transzformációs módszereket is a találmány szerinti génszerkezetek növényi anyagba viteléhez.
A genetikai anyag növényi sejtbe történő közvetlen bevitelének lehetséges módszerei például a protoplasztok kezelése, melyhez plazmamembránt módosító eljárásokat használunk (például polietilénglikolos kezelés, hősokk-kezelés) vagy az elektroporáció vagy ezen eljárások kombinációja [Shillito és munkatársai: Bio Technology 3,1099-1103 (1985)].
Az elektroporációs technikában a növényi protoplasztok - a találmány szerinti expressziós kazettákat tartalmazó plazmidokkal együtt - nagyfeszültségű elektromos impulzusoknak vannak alávetve. Ez a biomembrán átjárhatóságának reverzibilis megnövekedését eredményezi és így a plazmid átjutása lehetővé válik. Az elektroporációval kezelt növényi protoplasztok megújítják a sejtfalukat és szöveti kalluszokat képeznek. A transzformált növényi sejteket szelektálhatjuk a fent leírt fenotípusos markerek segítségével.
A genetikai anyag növényi sejtekbe történő közvetlen bejuttatásának egy további módszere tisztán kémiai eljárásokon alapul, és képes a transzformációt nagy hatékonysággal és gyorsasággal végbevinni, amint azt Negrutiu és munkatársai leírták [Mól. Gén. Génét. 199, 330-337 (1987)].
Szintén alkalmas a növényi anyag transzformálására a direkt génbevitel kotranszformációval [Schocher RJ és munkatársai: Bio/Technology 4, 1093-1096 (1986)].
A kotranszformáció az a módszer, mely a különféle DNS-molekulák (nem szelektálható és szelektálható gének) szimultán felvételén és a növény genomjába való integrálódásán alapul, és ezáltal lehetőség van a nem szelektálható génekkel transzformált sejtek detektálására.
További lehetőségek a vektorban lévő genetikai anyagnak közvetlenül a növényi sejtbe juttatására, a tisztán fizikai módszerek, például a mikroinjekció finoman beosztott mikropipettával [Neuhaus és munkatársai : Theor. Appl. Génét.: 75,30-36 (1987)] vagy a sejtek bombázása mikrolövedékekkel, melyek töltve vannak a transzformáló DNS-sel „Microprojectile Bombardment” [Wang Y-C és munkatársai: Plánt Mól. Bioi.: 11, 433-439 (1988)] vagy fel vannak gyorsítva egy DNS-t tartalmazó oldaton keresztül a sejtek irányában, melyek a nyomás hatására transzformálódnak, melynek során végül köddé atomizálódnak a nyomás alatti ütközések eredményeképpen (434 616 számú európai közrebocsátási irat).
A mikrolövedékes bombázás előnye, hogy hatékony transzformációs technika a sejtek számára, beleértve a növényi sejteket is. Sanford és munkatársai közölték, hogy a mikrolövedékes bombázással hatékonyan tudtak felszabaduló nukleinsavakat az Album cepa (onion) növényi sejtek citoplazmájába bejuttatni [Particule Science and Technology 5, 27-37 (1987)]. Christou és munkatársai leírták a szójababkallusz stabil transzformációját kanamicinrezisztencia génnel mikrolövedékes bombázás útján [Plánt Physiol. 87, 671-674 (1988)]. Ők azt közölték, hogy a sejtekbe hatolás körülbelül 0,1% és 5% közötti. Christou továbbá közölte az NPTII enzim aktivitásának megfigyelhető szintjeit és a transzformáit kalluszok rezisztenciáját 400 mg/1 kanamicinre. McCabe és munkatársai a Glycine max (soybean) stabil transzformációját írták le mikrolövedékes bombázással [Bio/Technology 6,923-926 (1988)]. McCabe továbbá beszámolt egy transzformált R növény visszanyeréséről egy R kiméranövényből.
A kukoricanövények transzformációja, beleértve az elit kukoricanövényeket is, mikrolövedékes bombázással kivitelezhető általános eljárás szerint, melyet például a 478 502 számú európai közrebocsátási irat ismertet, melyet beépítünk referenciaként ezen bejelentésbe.
A lehetséges transzformáló eljárásokat a példák során adjuk meg, nem igényelve a teljességet és nem is korlátozva ezekre a találmányt.
Továbbá megállapítottuk, hogy az expressziós kazetta komponenseit módosíthatjuk, hogy növeljük az expressziót. így például csonkított szekvenciákat, nukleotidszubsztitúciókat vagy egyéb modifikációkat alkalmazhatunk.
Az is előnyös lehet, hogy eltávolítunk nukleotidokat a T7 promoter szekvenciában, hogy megakadályozzunk egy lehetséges törzs-hurok (stem-loop) szerkezetet az RNS-ben. Ilyen nukleotidokat el lehet távolítani például PCR-technológiával a kísérleti részben leírtak szerint. Hasonló módon, egy poli-A-láncot beépíthetünk az expressziós kazettába közvetlenül a terminátorhoz. Például az expressziós kazetta 2-be, körülbelül a 25-90 A nukleotidokat inszertálhatjuk a T7 terminátorhoz.
Egyéb módszereket, úgymint átkötés (transplicing), is alkalmazhatunk, felhasználva az ismert gének, mint például a kukorica Adhl gén összekötő donor és összekötő akceptor helyeit [lásd Dennis és munkatársai: Nucleic Acids Research 12, 3983-4000 (1984)]. Az ilyen rendszerek három expressziós kazettát foglalnak magukban. A következők tipikus kazetták, melyeket használhatunk a T7 rendszerben. A kazetta 1 tartalmaz egy portokspecifíkus promotert működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort, például T7 polimeráz, kódoló nukleotidszekvenciához.
A kazetta 2 tartalmazza a cél-nukleotidszekvenciát, a T7 promotert, működőképesen kapcsolva az összekötő akceptor helyet tartalmazó nukleotidszekvenciához. Az akceptorhely működőképesen kapcsolódik egy polipeptidet vagy RNS-t kódoló régió 3 részét hordozó nukleotidszekvenciához, melyek megakadályozzák az életképes pollenképződést.
HU 220 358 Β
A kazetta 3 tartalmaz egy promotert kódoló nukleotidszekvenciát, amely képes egy másik szövetbe irányítani az expressziót, működőképesen kapcsolva egy - az életképes pollenképződést megakadályozó polipeptidet vagy RNS-t kódoló régió 5-részét tartalmazó nukleotidszekvenciához, mely működőképesen kapcsolódik az összekötő donorhelyhez. Amint a fentiekben leírtuk, a kazetták hordozhatnak vezetőszekvenciákat, terminátorokat stb. A szülő 1 stabilan transzformálható a kazetta 1-gyel, vagy alternatív módon, a kazetta 1-gyel és 3-mal, míg a szülő 2 fogja tartalmazni a kazetta 2-t és 3-t, illetőleg a kazetta 2-t. Mindegyik esetben keresztezzük a szülő 1-et és 2-t, melynek eredményeképpen hímsteril utódokat kapunk.
A transzformált növényeket regeneráljuk. A transzformáit növényekben lévő, stabilan integrálódott expressziós kazetta jelenlétét megállapíthatjuk southemhibridizációval vagy PCR-analízissel, ismert módon. A transzaktivátor expresszióját meghatározhatjuk northem-blot technikákat alkalmazva.
A fentiek alapján ezzel a szisztémával bármely növény transzformálható és regenerálható. Ez előnyösen magában foglalja a kétszikűek és egyszikűek osztályát. Különösen előnyösek a találmány szerinti eljárásban a Graminaceae családba tartozó egyszikű növények, úgymint a Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale és Setaria.
A fentiek alapján a találmány tehát elsősorban Graminaceae családba tartozó növények felhasználására vonatkozik, magában foglalva a szexuális és aszexuális utódokat, amelyek növényi anyagokból, például protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, magok, embriók, pollenek, peték, zigóták stb. regenerálhatok hímsteril transzgenikus növények előállításához.
A találmány szerinti eljárás eliminálja a virágos szerkezetekkel való manipulációt, és elkerüli a kézi emaszkuláció és megtermékenyítés szükségességét.
A szülőnövények, melyek a stabilan integrálódott expressziós kazettákat tartalmazzák, mind hímtermékenyek és homozigótákká tehetők és határozatlan ideig fenntarthatok. Ahhoz, hogy hímsteril magokat nyerjünk, a szülő 1 és 2 homozigóta vonalait keresztezzük felhasználva azt a technikát, hogy az egyik vonalból eltávolítjuk a kukoricahajat és a másik vonalat pollenadóként használjuk, úgyhogy saját mag nem képződik. A hímsteril utódokat azután női szülőkként alkalmazhatjuk bármilyen keresztezési eljárásban hibrid magok termelése céljából. A kapott hibrid magok körülbelül 75%-a fog hímtermékeny növénnyé válni. így hibrid mag termelése céljából elvégezzük a különböző vonalak standard keresztezését hímsteril növényekkel és az utódok ezt követő analízisét egy kiemelkedő agronómiái tulajdonságú vonal szelektálására [lásd általánosan WO 90/08828 számú PCT-beli közrebocsátást iratot].
Amikor a T7 polimeráz rendszert alkalmazzuk a fent leírt kettős rendszerben hímsteril növények előállítására, azt is megállapíthatjuk, hogy a T7 expressziós rendszer használható a nukleotidszekvenciák növényekben történő magas szintű expressziójára. Ez a rendszer tehát egy növényben a kódolószekvencia szövetspecifikus vagy egyéb szelektív expresszióját teszi lehetővé.
Ezen a módon egyetlen növényt transzformálhatunk két expressziós kazettával. Az első expressziós kazetta tartalmazza a T7 polimerázt működőképesen kapcsolva egy promoterhez, mely az expressziót a növényi sejtbe irányítja. Bármely, az expresszió irányítására képes promotert használhatunk és kiválaszhatunk a specifikus expresszióhoz; például szövetspecifikus promoter, fejlődési állapotspecifikus promoter, indukáló promoter stb. Specifikus promoterek közé tartoznak például a kémiai indukáló promoterek (0 332 104 számú európai közrebocsátást irat) és a magspecifikus promoterek [Ellis és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 10, 203-214(1988)].
Különösen alkalmasak az expressziós szignálok, melyek növények vagy növényi vírusok génjeiből származnak. Alkalmas promoterek és terminátorok a karfiol mozaikvírus (CaMV) génjeiből származók vagy ezekkel homológ szekvenciák, melyek még rendelkeznek az említett expressziós szignálok jellemző tulajdonságaival. Alkalmasak a bakteriális expressziós szignálok is, különösen az Agrobacterium tumefaciens Tiplazmidjaiból származó nopalin-szintáz gének (nos) vagy az opin-szintáz gének (öcs). Továbbá megemlíthetjük például az ubiquitinpromotereket, az aktinpromotereket, hisztonpromotereket és a tubulinpromotereket. Egyéb alkalmas promoter egy amilázpromoter (a-amilázpromoter) és egy ABA (abscisic sav) indukáló promoter.
Az expressziós szignálok közé tartoznak a szöveteket előnyben részesítő (tissue-preferential) vagy szövetspecifikus promoterek is. Ezt a kifejezést, hogy „tissuepreferential” promoter, annak jelzésére használjuk, hogy egy adott expressziós szignál egy hozzákapcsolt kifejezendő DNS transzkripcióját, vagy a nevezett DNS termékének kifejezését magasabb szinten fogja előmozdítani, mint az bármelyik konvencionális RNSvagy proteinassay-vel elérhető, vagy hogy egy adott DNS-szekvencia néhány különböző hatást fog mutatni; azaz, hogy a kapcsolt DNS-szekvenciák transzkripciója nagyobb bizonyos szövetekben, mint minden más növényi szövetben. Például a szövetorientált promoter a kapcsolt gén magasabb expresszióját irányíthatja a levelekbe, szárakba, gyökerekbe és/vagy pollenbe, mint a magba. A szövetorientált promoterre példa a szárbelet (pith) preferáló promoter, melyet a találmány keretein belül alkalmazhatunk és amelyet a kukorica TrpA génből a 93/07278 számú PCT-beli közrebocsátási iratban leírtak szerint izoláltunk.
A szövetspecifikus promoter kifejezést annak jelölésére használjuk, hogy egy adott regulátor DNS-szekvencia a kapcsolt kifejeződő DNS-szekvencia transzkripcióját teljesen egy vagy több növényi szövetbe vagy az egyik típusú szövetbe fogja irányítani, mivel a kapcsolt kódoló-DNS-szekvencia lényegében nem fog kifejeződni a többi szövetben vagy az egyéb típusú növényi szövetekben. Számos promoter, melyek expressziója szövetspecifikus, ismert a szakirodalomban. így például a kukorica foszfoenol-piruvát-karboxiláz (PEPC), amely
HU 220 358 Β zöldszövet-specifikus. Egyéb zöldszövet-specifikus promoterek közé tartoznak a klorofill-a/b-kötő fehérje promoterek és a RubisCo kis alegység promoterek. Továbbá megemlíthetjük a pollenspecifikus promotereket, amelyek egy növényi kalciumfüggő foszfát-kináz (CDPK) génből nyerhetők.
Egy fejlődést szabályozó promotert szintén használhatunk. Természetesen - a jelen találmányban - bármely promoter, amely működőképes a kívánt gazdanövényben, felhasználható a kapcsolt gén expresszálásának irányítására.
Gyakran az is előnyös, hogy beépítsünk egy vezetőszekvenciát a promoter szekvencia és a szomszédos kódoló-DNS-szekvencia közé. A vezetőszekvencia hosszúságát úgy választjuk meg, hogy a távolság a promoter és a találmány szerinti DNS-szekvencia között optimális legyen a kapcsolt szerkezeti gén kifejezésére. Alkalmas vezetőszekvenciák lehetnek a különböző hosszúságú, 35S CaMV-génből izolált vezetőszekvenciák [Pierce és munkatársai: Plánt Gene Systems and their Biology (Alán R. Liss, Inc.) 301-310 oldal]. Előnyös vezetőszekvenciák azok, melyeket a 35S CaMV-génből izoláltunk és körülbelül 50-130 nukleotidhosszüságúak. Egyéb vezetőszekvenciákat is azonosítottak [lásd DellaCioppa és munkatársai: Plánt Physiology 84, 965-968 (1987)].
További szabályozó-DNS-szekvenciaként használhatjuk a kimér génszerkezeteket, melyek magukban foglalnak például olyan szekvenciákat, melyek a kapcsolt DNS-szekvencia transzkripcióját szabályozzák a növényi szövetekben indukció vagy represszió értelmében.
Bizonyos növényi gének is ismertek, melyek különféle belső és külső faktorokkal, úgymint növényi hormonok, hősokk, kemikáliák, patogének, oxigénhiány, fény, stressz stb. indukálhatok.
A növényekben alkalmazható gének egy másik osztályába tartoznak a fényszabályozott gének, különösen a ribulóz-l,5-bifoszfát-karboxiláz (RUBISCO) kis alegység nukleárisan kódolt génje. Morelli és munkatársai [Natúré 315, 200-204 (1985)] kimutatták, hogy a borsóból származó RUBISCO gén 5’-végi szekvenciája képes fényindukcióval transzferálódni egy reporter génhez, ezáltal az utóbbi kapcsolódik kimér formában a génszekvenciához. Ez a megállapítás kiterjeszthető más fény-indukált génekre is, például a klorofill-a/bkötő fehérjére.
A szabályozó-DNS-szekvenciák egy további csoportját alkotják a kémiai úton szabályozó szekvenciák, amelyek például a dohány PR- (pathogenesis-related) fehérjegénekben vannak jelen és kémiai regulátorok segítségével indukálhatok. Ilyeneket ismertetnek a 332 104 számú európai közrebocsátási iratban.
A fent említett szabályozó-DNS-szekvenciák mind természetes, mind szintetikus eredetűek lehetnek, vagy tartalmazhatják a természetes és mesterséges DNS-szekvenciák keverékét.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciák tartalmazhatnak továbbá egy szignálszekvenciát, amely működőképesen kapcsolódik a kódoló-DNSszekvenciához. A szignálszekvencia a felelős a növényi sejten belül a kísérőpeptid specializált transzportjáért.
A találmány szerinti szignálszekvencia bármely DNS-szekvencia lehet, amely képes a kisegítőpolipeptid transzportját egy vagy több növényi részbe irányítani. A szignálszekvencia előnyösen egy olyan szekvencia, amely lefordítódik egy szignálpeptiddé, mely elválik a pepiidtől és a peptid tranzitja után lesz teljes. Szignálszekvenciákat használunk a DNS-szekvencia által kódolt polipeptidtermék irányítására a kívánt helyre a sejten belül, így a mitokondriumba vagy az endoplazmatikus retikulumba, vagy a közvetlen extracelluláris transzport irányítására a sejten kívül.
Itt megemlíthetjük például az N-terminális szignálpeptideket, melyek az intracelluláris transzportban játszanak szerepet és amelyek megtalálhatók a transzportált fehéqék N-terminálisán az endomembrán rendszerben. Ezek a szignálszekvenciák gondoskodnak arról, hogy a nevezett fehérjék először az endoplazmatikus retikulumba jussanak be, ahol a szignálpeptid proteolitikusan lehasad a prekurzor fehérjéről, ezzel az aktívvá válik. A specifikus hatása alapján, a szignálpeptidszekvenciának ez a típusa magas fokon konzerválódott az evolúció során minden élő sejtben, tekintet nélkül arra, hogy baktérium, élesztő, gomba, állati vagy növényi sejtek-e.
A vakuoláris fehérjék C-terminálisán, a másik oldalon, olyan szekvenciák találhatók, melyek a növényi vakuóla kapcsolt kódolórészének expressziójának irányításában vesznek részt. Az ilyen úgynevezett „vacuolar targeting” szekvenciákra szolgáltatnak példákat a 462 065 számú európai közrebocsátási iratban.
Továbbá a DNS-molekulák hordozhatnak további szekvenciarészeket, melyek peptidfragmenseket kódolnak, melyek még hozzájárulnak ahhoz, hogy jobban alkalmassá tegyék a DNS-t a vakuólába való bejutásra, például a Matsuoka K. és Nakamura K. által leírt propeptidffagmens a sporamin N-terminálisának kiterjesztésében [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 834-838 (1991)].
Egyéb szignálszekvenciák is felhasználhatók a találmányhoz, például a dohány patogenezisszerű génjéből (PR-1) a szignálszekvencia, melyet Comellison és munkatársai írtak le [EMBO 5, 37-40 (1986)]; az élesztő mitokondriális preszekvenciája [Schmitz és munkatársai: Plánt Cell 1, 783-791 (1989)]; szignálszekvencia a növényi mitokondriális Rieske vas-kén fehéijéből [Hung és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10716-10720 (1991); mitokondriális és kloroplaszt hordozó peptidek [von Heijne és munkatársai: Eur. J. Biochem. 180, 535-545 (1989)].
Amint korábban leírtuk, a első expressziós kazetta tartalmazhat ráadásul nukleáris lokációs szignálokat, terminátor szekvenciákat, növényi transzlációs konszenzusszekvenciákat stb.
A második expressziós kazetta tartalmaz egy kódolószekvenciát működőképesen kapcsolva a T7 promotert kódoló nukleotidszekvenciához. A második expressziós kazetta tartalmazhat 5 vezetőszekvenciákat, terminátor szekvenciákat stb. is.
HU 220 358 Β
Ha mindkét expressziós kazetta stabilan integrálódott egyetlen növénybe, a T7 polimeráz fogja irányítani a T7 promoterrel működőképesen kapcsolt kódolószekvencia expresszióját.
Megállapítottuk, hogy a két expressziós kazetta lehet egyetlen vektornak vagy nukleinsavnak a része, vagy tartozhat két szeparált vektorhoz. Hasonlóképpen, mivel legtöbb esetben egyetlen növényt transzformálunk az egyik kazettával, előnyös lehet, hogy az egyik növényt, a szülő 1-et transzformáljuk az expressziós kazetta 1-gyel és a másik növényt, a szülő 2-t az expressziós kazetta 2-vel, és a szülő 1 és 2 keresztezésével olyan utódokat kapunk, melyek mindkét expressziós kazettát tartalmazzák.
Mivel a T7 RNS-polimeráz általi transzkripció magasan aktív, ez a rendszer használható specifikus géntermékek termelésének növelésére, melyek alacsony mennyiségben képződnek növényekben. Ez a módszer tehát felhasználható szövet- vagy egyéb spefícikus géntermékek növelésére. Általánosan, legalább 2-100szor, pontosabban 4-50-szer nagyobb az expresszió mértéke a T7 rendszer alkalmazásakor.
A T7 RNS-polimeráz nagyon szelektív specifikus promoterekre, amelyek ritkán fordulnak elő a T7 DNSsel nem rokon DNS-ben. Hatékony terminációs szignálok ugyancsak ritkák. Ezért a T7 RNS-polimeráz expressziós rendszer teljessé teheti majdnem minden DNS transzkripcióját, amely a T7 promoter kontrollja alatt áll. Ezek szerint a T7 expressziós szisztémát a termékek széles körének expressziójához felhasználhatjuk, így például előnyös aminosavkompozícióval rendelkező tároló mag fehérjék; gyógyhatású fehérjék; fehérjék, melyek a keményítőben, zsírok vagy fehérjék szintézisében szerepelnek; inszekticid vagy betegségrezisztens fehérjék; fehérjék, melyek a növények vagy magok tápértékét növelik; antifungicid, antibakteriális vagy antivirális fehérjék; fehérjék, melyek egyéb, az inszekticidekkel vagy betegségekkel szembeni növényrezisztenciáért felelős fehérjék termeléséhez vezetnek; kapcsolt proteinek vagy proteinek, melyek egyéb fehérjék termelését teszik szükségessé és hasonlók.
Különösen alkalmazható a találmány szerinti T7 RNS-polimeráz expressziós rendszerben minden olyan strukturális gén, amely az expresszió után a transzformáit növényi sejtekben, az abból kifejlődő növényi szövetekben és különösen a regenerált növényekben is védőhatást fejt ki, például megnöveli a rezisztenciát a patogénekkel szemben (például fitopatogén gombák, baktériumok, vírusok stb.); rezisztenciát nyújt a vegyszerekkel szemben, [például herbicidek (például triazinok, szulfonil-karbamidok, imidazolinonok, triazolpirimidinek, bialafos, glifozát stb.), inszekticidek vagy egyéb biocidek]; rezisztenciát kölcsönöz a káros környezeti faktorokkal szemben (például hő, hideg, szél, káros napsugárzás, nedvesség, szárazság stb.).
A találmány oltalmi körébe tartoznak és külön megemlítjük azokat a strukturális géneket, melyek kapcsolatban vannak a növényi patogének és paraziták kontrolljával.
A rovarokkal szembeni rezisztencia keletkezhet például egy olyan polipeptidet kódoló gén által, amely toxikus a rovarokra és/vagy lárváikra, például a Bacillus thuringiensis kristályos fehérjéje (B. t.). Különösen alkalmas a szintetikus B. t.-gén, melyet például Köziéi MG. és munkatársai írtak le [Bio/Technology 11, 194-200 (1993)].
A rovarokkal szembeni rezisztenciát közvetítő fehérjék második csoportját a proteázinhibitorok alkotják. A proteázinihibitorok a növényi raktározórendszerek szokásos alkotói, és ezért normálkörülmények között a vakuólákban vagy a fehérjerészecskékben helyezkednek el. Megállapították, hogy a Bowman-Birk-féle proteázinhibitor, melyet a szójababból izoláltak és tisztítottak, gátolja a Tenebrio lárvák bélproteázát. A marhaborsóból származó tripszininhibitort kódoló gént Hilder és munkatársai írták le [Natúré 330, 160-163 (1987)].
A rovarok legnagyobb része rendelkezik egy kutikulavázzal, amelyben lamelláris rétegekben kitinmicellák vannak beágyazódva egy alapszubsztanciába. Számos növénypatogén gomba tartalmaz kitint, mint a hífa- vagy spóraszerkezetének integrális alkotórészét, ilyen gombák például a Basidiomycetes (üszöggombák és rozsdagombák), az Ascomycetes és Fungi imperfecti (ide értve az Altemariat és Bipolist, az Exerophilum turcicumot, Colletotricumot, Gleocercosporát és Cercosporát). A kitináz képes arra, hogy bizonyos patogének micéliumának kifejlődését mind in vitro mind in vivő meggátolja. Egy növényi szerv vagy szövet, amely konstitutív módon vagy egy patogén behatolására adott válaszként kitináz kifejezésére képes, nagy számú különböző gomba támadása ellen tud oltalmat nyújtani.
Egy másik gén, amely egy enzimet kódol, feltehetően központi szerepet játszik a növényi védekező mechanizmusban a patogénekkel szemben, a béta-l,3-glukanáz gén, melyet ezért szintén felhasználhatunk a gombák elleni védekezésben, egyedül vagy a kitináz génnel kombinálva.
A T7 RNS-polimeráz expressziós rendszerben alkalmazható gének egy további osztályát alkotják az úgynevezett litikus peptideket kódoló gének. Ezek a peptidek antipatogén aktivitással rendelkező természetes vagy szintetikus peptidek, amelyek képesek a patogének sejtmembránján áthatolni, lizálni vagy más módon károsítani. Az ilyen litikus peptidek képviselői, melyeket a találmány keretén belül alkalmazhatunk, ismertek és mind állati (beleértve a rovarokat), mind növényi és mikrobiális forrásokból származhatnak. Ezek közé tartoznak az emlősdefenzinek, -cecropinok, tioninok és -mellitinek, és rovardefenzinek, -magaininek, -attakinek, -dipterinek, -szapekinek, cerulinok és -xenopszinok, és ezek hibridjei. A különféle litikus peptidek aminosavszekvenciái a következő publikációkban találhatók: WO 89/11291; WO 86/04356; WO 88/05826; US 4,810,777; WO 89/04371.
Litikus peptidek alatt a legszélesebben olyan peptideket értünk, amelyek képesek a sejtmembránokon átjutni, lizálni vagy károsítani azokat enzimaktivitásuk alapján, például lizozim és foszfolipáz.
Ezenfelül, az expresszió és az exogén alkalmazás reciprok felhasználásával szintén lehet számolni, a litikus
HU 220 358 B peptidek különösen alkalmasak ez utóbbi célra, a szokásosan erre a célra alkalmazott segédanyagokkal és additivekkel együtt.
A találmány oltalmi körén belül alkalmazható gének egy másik osztályát alkotják a foszfolipidet átvivő fehérjéket kódoló gének, melyeket a WO 92/20801 számú PCT-beli közrebocsátási iratban írtak le.
A gének - melyek a találmány megvalósításához felhasználhatók - egy további osztályába tartoznak a patogenezisszerű fehérjéket (PRPs) kódoló gének. Ilyen fehérjék a PR-1A, PR-1B, PR-1C, nagy PR-R, kis PR-R, PR-P, PR-Q, PR-2, PR-2, PR-2, PR-N, PR-0, PR-0, PR-4, SAR8.2a-e, uborka kitináz/lizozim, uborka bázikus peroxidáz, dohány bázikus glukanáz és dohány bázikus kitináz/lizozim, dohány savas kitináz/lizozim. A fenti génekre és fehérjékre, valamint kiméra genetikus szerkezetekre, melyek a nevezett géneket tartalmazzák, példák találhatók a 392,225 számú európai közrebocsátási iratban.
A találmány szerinti DNS-szekvenciát tehát felhasználhatjuk a kívánt és felhasználható vegyületek termelésére növényi sejtekben vagy magasabb szervezetek egységének egy részében, például szövetben, kalluszban, szervben, embrióban vagy a teljes növényben.
A gének, melyeket tehát a találmány szerinti T7 RNS-polimeráz expressziós rendszerben alkalmazhatunk, azok például, melyek a levelekben, magokban, gumókban, gyökerekben, szárakban stb. vagy a magok fehérjetestecskéiben rezervált és tárolt anyagok megnövekedett vagy lecsökkent képződéséhez vezetnek. A transzgenikus növényekkel termelhető kívánatos anyagok közé tartoznak például a fehérjék, szénhidrátok, aminosavak, vitaminok, alkaloidok, flavinok, parfümök, színezőanyagok, zsírok stb.
Ezek összekapcsolhatók a találmány szerinti DNSszekvenciával strukturális génszerkezetekké, amelyek a gyógyászatilag elfogadható aktív anyagokat, például hormonokat, immunmodulátorokat és más fiziológiailag aktív vegyületeket kódolnak.
Azon gének közé, melyek a találmány szempontjából tekintetbe jöhetnek, de nem korlátozódnak ezekre, tartoznak például a növényspecifikus gének, mint a zeingén a kukoricából, az aveningén a zabból, a glutelingén a rizsből stb.; emlós-fajlagosgének, mint az inzulingén, a szomatosztatingén, az interleukingén, a tPA-gén stb. vagy mikrobiológiai eredetű gének, mint az NPTII gén stb. és szintetikus gének, mint az inzulingén stb.
A természetes módon előforduló struktúrgének mellett, amelyek kívánt és hasznos tulajdonságokat kódolnak, a jelen találmány keretében olyan géneket is alkalmazhatunk, amelyeket előzőleg kémiai vagy géntechnológiai eljárások segítségével célzottan módosítottunk.
Továbbá a jelen találmány szélesebb koncepciója magában foglalja azokat a géneket is, melyeket teljesen kémiai szintézissel állítunk elő. A találmány keretében alkalmazható gének vagy DNS-szekvenciákként szóba jöhetnek akár homológ, akár heterológ gének vagy DNS-ek, valamint mindazok a szintetikus gének vagy DNS-ek, amelyek a jelen találmányban definiált feltételeknek megfelelnek. Szintetikus génre itt az inzulingént nevezzük meg.
Amint azt korábban leírtuk, a nukleinsavszekvenciák manipulálására és a növények transzformálására és regenerálására szolgáló módszerek a szakember számára jól ismertek.
Az általános kitanítás után a találmányt az alábbi példákon mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kört ezekre korlátoznánk.
Kiviteli példák
Általános rekombináns DNS-technika
Mivel a jelen találmányban alkalmazott rekombináns DNS-technikák többsége a szakemberek számára rutineljárásnak tekinthető, itt ezeknek az általánosan alkalmazott technikáknak csak rövid leírását adjuk meg, és később újuk le azokat ott, ahol előfordulnak. Kivéve, ahol specifikus eljárásokat alkalmazunk, ezek mind le vannak írva Maniatis és munkatársai (1982) összefoglaló munkájában.
A) Hasítás restrikciós endonukleázokkal
Tipikusan a reakciókeverékben mintegy
50-500 pg/ml DNS található, a gyártó New England
Biolabs (Beverly, Massachussets) által ajánlott pufferoldatban. Minden pg DNS-hez 2-5 egység restrikciós endonukleázt adunk és a reakciókeveréket a gyártó által ajánlott hőmérsékleten 1-3 órán át inkubáljuk. A reakciót 10 perces, 65 °C hőmérsékletű melegítéssel vagy fenolos extrakcióval állítjuk le, amelyet a DNS kicsapása követ. Ezt a technikát leírja a Maniatis és munkatársai idézett könyve (1982), a 104-106. oldalon.
B) A DNS kezelése polimerázzal, hogy tompa végeket hozzunk létre
50-500 pg/ml DNS-fragmentumot adunk egy reakciókeverékhez a gyártó cég, vagyis a New England Biolabs által javasolt pufferben. A reakciókeverék tartalmazza mind a négy dezoxinukleotid-trifoszfátot 0,2 mmol/1 koncentrációban. A reakció 15 °C hőmérsékleten 30 perc alatt megy végbe, azután a reakciót 10 perces, 65 °C-on történő melegítéssel állítjuk le. Azokhoz a fragmentumokhoz, amelyeket 5’ ragadós végeket létrehozó endonukleázokkal való hasítással kapunk meg, a DNS-polimeráz nagy fragmentumát, más néven Klenow fragmentumát alkalmazzuk. Azokhoz a fragmensekhez, amelyeket a 3’ ragadós végeket létrehozó endonukleázokkal, például Pstl-gyel és Sacl-gyel kapunk meg, T4-DNSpolimerázt alkalmazunk. Ennek a két enzimnek az alkalmazását Maniatis és munkatársai korábban idézett könyvének (1982) 113-121. oldala írja le.
C) Agaróz-gélelektroforézis és DNS-fragmensek tisztítása gélekből
Az agaróz-gélelektroforézist horizontális berendezésen végezzük, például olyanon, melyet Maniatis korábban idézett könyvének (1982) 150-163. oldala ismertet. Az alkalmazott puffer az ott leírt trisz-borátpuffer. A DNS-fragmenseket 0,5 pg/ml etidiumbromiddal színezzük, amely vagy a gél- vagy a tartálypufferben van, vagy az elektroforézis során vagy
HU 220 358 Β után adjuk hozzá. A DNS-t hosszúhullámú ibolyántúli fénnyel való átvilágítással tesszük láthatóvá. Amikor a ffagmenst a gélből ki akarjuk nyerni, alacsony hőmérsékleten gélesedő agarózt alkalmazunk, mely a Sigma Chemical-tól (St. Louis, Missouri) szerezhető be. Az elektroforézis után a kívánt fragmenst kivágjuk, műanyag csövecskébe visszük, mintegy 15 percig 65 °C hőmérsékleten melegítjük, háromszor extraháljuk fenollal és kétszer kicsapjuk etanollal. Ez az eljárás valamelyest eltér az idézett, Maniatis és munkatársai könyvének 170. oldalán található eljárástól.
Egy másik eljárással a DNS-t az agarózról a Geneclean Kit készlet (Bio 101 Inc., La Jolla, Kalifornia, USA) segítségével lehet izolálni.
D) Szintetikus kapcsolóffagmenseknek a DNS-végekre csatolása
Amikor az kívánatos, hogy egy DNS-molekula végére egy új endonukleáz hasítási helyet illesszünk, a molekulát adott esetben először DNS-polimerázzal kezeljük, hogy tompa végeket hozzunk létre, amint ezt az előző fejezetben leírtuk. Ebből a fragmensből mintegy 0,1-1,0 pg-ot mintegy 10 ng, New England Biolabs-tól beszerzett foszforilezett kapcsoló DNS-hez adunk, 20-30 pl térfogatban 2 pl, New England Biolabs-tól beszerzett T4 DNS-ligázzal és 1 mmol/1 ATP-vel együtt a gyártó által javasolt pufferben. Egy éjszakán át 15 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a reakciót 10 perces, 65 °C hőmérsékleten végzett melegítéssel állítjuk le. A reakcióelegyet mintegy 100 μΐ-re hígítjuk a szintetikus kapcsolószekvenciát hasító restrikciós endonukleázhoz való pufferral. Ebből az endonukleázból mintegy 50-200 egységet adunk a keverékbe. A keveréket 2-6 órán át alkalmas hőmérsékleten inkubáljuk, azután a fragmenst agaróz-gélelektroforézisnek vetjük alá, ahogy fentebb leírtuk. Az így létrejött fragmens végül olyan végződésekkel bír, amelyek a restrikciós endonukleázos hasítással jöttek létre. Ezek a végek általában ragadósak, úgyhogy a létrejövő fragmenst könnyen össze lehet kapcsolni egy azonos ragadós véggel bíró másik fragmenssel.
E) Az 5-terminális foszfátok eltávolítása a DNS-fragmensekről
A plazmidklónozási lépés során a vektorplazmid kezelése foszfatázzal csökkenti a vektorplazmid újból körré alakulását (lásd Maniatis és munkatársai idézett könyvének 13. oldalát).
A DNS megfelelő restrikciós endonukleázzal történő hasítása után 1 egység borjúból alkalikus foszfatázt adunk a hasított termékhez, ezt a foszfatázt a Boehringer-Mannheimtől (Mannheim) szerezzük be. A DNS-t 1 órán át inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, majd kétszer extraháljuk fenollal, végül etanollal kicsapjuk.
F) A DNS-fragmensek összekapcsolása
Amikor komplementer ragadós végekkel bíró fragmenseket kapcsolunk össze egymással, egy 20-40 μΐ-es reakciókeverékben mintegy 100-100 ng-ot keverünk össze az egyes fragmensekből mintegy 0,2 egység T4 DNS-ligázzal (New
England Biolabs) a gyártó által megadott pufferben, majd inkubáljuk az elegyet. Az inkubálást 1-20 órán át végezzük 15 °C hőmérsékleten. Amikor tompa végű DNS-fragmenseket akarunk összekapcsolni, szintén a fentiek szerint végezzük az inkubálást, azzal a különbséggel, hogy a T4 ligáz mennyiségét 2-4 egységre emeljük.
G) A DNS transzformálása E. coliba
A legtöbb kísérletben az E. coli HB101 törzset alkalmazzuk. A DNS-t a kalcium-kloridos eljárással vezetjük be az E. coli törzsbe, amint ezt Maniatis és munkatársai idézett könyvük 250-251. oldalán leírják.
H) Az E. coli átvizsgálása a plazmidra
A transzformálás után a kívánt plazmid jelenlétére az E. coli telepeket egy gyors plazmidizolálási eljárással vizsgáljuk át. Maniatis és munkatársai idézett könyvük 366-369. oldalán két alkalmas eljárást is leírnak.
I) A plazmid-DNS izolálása nagyobb léptékben
A plazmid nagy léptékben izolálására E. coliból Maniatis és munkatársai írnak le eljárást idézett könyvük 88-94. oldalán.
J) Klónozás M13 fág vektorba
Az ezután következő példákban a klónozáshoz az M13 fág-származékok kétszálú, replikatív formáját alkalmazzuk, és ehhez olyan rutineljárásokat hajtunk végre, mint a hasítás restrikciós endonukleázokkal, kapcsolás stb.
Az enzimeket, hacsak másképp nem jelezzük, a Boehringer Biolabs-tól (BRC) szerezzük be. Ezeket a gyártó utasításainak megfelelően alkalmazzuk, hacsak külön másképp nem jelezzük.
K) Southem-folt analízis
A kivont DNS-t itt először restrikciós enzimekkel kezeljük, majd elektroforézisnek vetjük alá 0,8-l,0%os agarózgélen, nitrocellulózmembránra [Southern E. M. (1975)] visszük át, és a „nyomravezető” DNS-sel, amelyet előzőleg nick (hézag) transzlációnak vetettünk alá (DNS-specifíkus aktivitás 5108-10108 cpm/pg), hibridizáljuk. Jelen esetben a pCHN50 dohány kitináz cDNS-klón [Shinshi és munkatársai (1987)] egy 3 AluI-PstI fragmense, melyet 32P-vel jeleztünk egy „Random Primer” jelzőkészlet (Boehringer-Mannheim) alkalmazásával, szolgál hibridizációs vizsgálómintaként (próbaként). A szűrőt háromszor mossuk 65 °C hőmérsékleten 1-1 óra hosszat 0,03 mol/1 nátrium-citrátot és 0,3 mol/1 nátrium-kloridot tartalmazó oldattal. A hibridizált DNS-t röntgenfilm 24-48 óra alatti feketedésével tesszük láthatóvá.
1. példa
Egy növényi transzlációs konszenzusszekvencia kapcsolása a T7 RNS-polimeráz génhez A pAR3283 [Dunn és munkatársai: Gene 68,
259-255 (1988)] T7 RNS-polimeráz génjének [az SV40 nukleáris lokációs szignállal (NLS) együtt] a transzlációs starthelyét úgy módosítjuk, hogy magában foglaljon egy növényi transzlációs konszenzusszekvenciát [Joshi, C. P.: NAR 15, 6643-6653 (1987)]. A pAR3283 plazmid BglII - Nrul fragmensét helyette14
HU 220 358 Β sítjük egy BglII - Nrul PCR-létrehozott fragmenssel, amelyben a TAAACAATG szekvencia - a BglII helyet követően - helyettesíti a T7 transzlációs starthely előtti szekvenciát, A transzlációs starthely utáni nukleotidokat nem módosítjuk, hogy konformak legyenek a növényi konszenzusszekvenciával (TAAACAATGGCT), mert ez az aszparaginnak alaninra való cserélését jelentené.
2. példa
A 35S CaMV-promoter fúziója a T7 RNS-polimeráz génhez
A T7 RNS-polimeráz gén, amely az SV40 nukleáris lokációs szignált (NLS) és a növényi transzlációs konszenzusszekvenciát tartalmazza, egy BglII-BamHI fragmens formájában kivágjuk és klónozzuk a pCIB710 [Rothstein és munkatársai: Gene 53,153-161 (1987)] BamHI helyére. A kapott pJS175 jelű plazmid tartalmazza a 35S CaMV-promotert, a T7 RNS-polimeráz gént (SV40 NLS, növényi transzlációs konszenzusszekvencia) és a 35S CaMV poliA toldalékot.
3. példa
T7 promoter/terminátor szerkezetek és fúziójuk a
GUS-génhez
A ρΕΤ-3-ból [Rosenberg és munkatársai: Gene 56, 125 (1987)] a T7 promotert és T7 terminátort BglII fragmensként behelyezzük a BamHI-gyel hasított puC 19-be [New England Biolabs, Beverly, Maryland, USA], létrehozva így a pAT26-ot és a BamHI-gyel hasított SK-ba [Stratagene Cloning System, La Jolla, California, USA], megalkotva így a pATlO-et. A pBI121-ből származó (Clontech) GUS-gén 3 SacI helyét hozzáillesztjük a BamHI helyhez és klónozzuk a ρΑΤΙΟ-be a BamHI helyre a T7 promoter és a terminátor közé, így a pATll-et kapjuk. A pAT27-ben, a T7 promoter +9-+26 nukleotidjait eltávolítjuk PCRrel a pAT26-ból a célból, hogy elimináljuk a potenciális „stem-loop” (törzs-hurok) szerkezetet az RNSben. A 35S CaMV poliA addíciós szignált inszertáljuk a pAT27 BamHI helyére egy PCR-rel kialakított BglII hely hozzáadásával a fragmens 3 végén, így a pAT28at kapjuk. A pATll-ből származó GUS-gént inszertáljuk a pAT28 BamHI helyére, megalkotva a pAT30-at, és a pAT27 BamHI helyére, megalkotva a pAT32-t. A pJS261-et úgy szerkesztjük meg, hogy a pAT26 T7 terminátorát helyettesítjük a BamHI-EcoRI fragmenssel, amely tartalmazza a 35S terminátort és a T7 terminátort a pAT28-ból. Egy BamHI fragmenst, amely tartalmazza a TEV vezető-GUS-gént a pAT31ből inszertáljuk aztán a BamHI helyre.
4. példa
Transzlációs szerkezetek a dohány karcvírus vezetőszekvencia használatával
A dohány karcvírus 5’ nem transzlatált vezetőszekvenciáját [a genomiális RNS +6- + 743 nukleotidjai, Allison és munkatársai: Virology 154, 9-20 (1986)] az 5-végen a BamHI hellyel és a 3-végen egy Ncol hellyel, leolvashatóan fuzionáljuk a GUS-génhez (Ncol
- SacI fragmens) a „bluescript” SK-ba, megalkotva a pAT29-et. A pAT29 SacI helyét hozzáillesztjük a BamHI-hez és a TEV vezető-GUS-gént tartalmazó BamHI fragmenst inszertáljuk a pAT28 BamHI helyére, megalkotva a pAT31-et.
4. példa
Protoplaszttranszformáció és GUS fluorometriás assay
Nicotiana tabacum protoplasztokat transzformálunk Negrutiu, I. és munkatársai szerint [PMB 8, 363-373 (1987)] és GUS fluorometriás vizsgálatot végzünk Jefferson, R. A. szerint [PMB Reporter 5, 387-405 (1987)]. Kukoricaprotoplasztok termelésének módszerét leírták például a WO 93/07278 számú PCT-beli közrebocsátási irat 6. és 43. példájában, melyet beépítünk referenciaként a találmányba.
Kukoricaprotoplasztok izolálása:
1. Tíz darab kétnapos kukorica 2717 vonal 6 szuszpenziótenyészetet pipettázunk egy 50 ml-es kémcsőbe és hagyjuk leülepedni. Ezután az egész tenyészközeget eltávolítjuk és eldobjuk.
2. A sejteket (3-5 ml sejttérfogat) reszuszpendáljuk 30 ml protoplaszt enzim oldatban, melynek összetétele a következő:
3% celluláz RS
1% maceráló enzim RIO KMC pufferben (recept 1 literre megadva)
KC1 8,65 g
MgCl2.6H2O 16,47 g
CaCl2.2H2O 12,50 g
MES 5,0 g
PH 5,6, szűrő sterilizálva.
3. A sejteket jól összekeverjük és 15 ml aliquotokat 100x25 mm-es Petri-csészékbe szétosztunk. Rázatjuk 4 órán keresztül körbeforgó rázógépen, hogy emésztődjenek.
4.10 ml KMC-t pipettázunk minden egyes 100 mikronos szűrőn keresztül, melyeket használni fogunk. Atszútjük a csészék tartalmát a szűrőkön. Mossuk a szűrőket azonos térfogatú KMC-vel.
5. A szűrt protoplasztokat óvatosan 50 ml-es csövekbe pipettázzuk és Beckman TJ-6 centrifugán 10 percen keresztül 1000 fordulat/perc (500 xg) fordulatszámon centrifugáljuk.
6. Eltávolítjuk a felülúszót, és a csapadékot reszuszpendáljuk óvatosan 10 ml KMC-ben. Három cső tartalmát egyesítjük egy csőbe és kiegészítjük a térfogatot 50 ml-re KMC-vel.
7. Centrifugáljuk és ismét mossuk megismételve a fenti lépéseket.
8. Reszuszpendáljuk az összes mosott protoplasztot 50 ml KMC-ben. Hemocitométerben megszámoljuk őket, majd centrifugáljuk a protoplasztokat és reszuszpendáljuk 8 χ 106/ml reszuszpendáló RS pufferben.
RS puffer (recept 500 ml-re megadva) mannitol 27,33 g
CaCl2. (0,1 M) 75 ml
MES 0,5 g
PH 5,8, szűrő sterilizálva.
HU 220 358 Β
6. példa
A T7 promoterből eredő transzkripció az összehasonlító kísérletekben
A kukoricaprotoplasztokat kotranszformáljuk a 35S promoterrel, mely a T7 polimerázt irányítja (pJS175) és a T7 promoter/GUS-gén/T7 terminátorral (pATll). Negatív kontrollként a protoplasztokat transzformáljuk a 35S promoter/luciferáz génnel (pCIB1700) és a pATllgyel is. A 35S/GUS-sal transzformált protoplasztok (pCIB246) voltak a pozitív GUS-kontrollok. A pCIB246 plazmidot az alábbiak szerint szerkesztjük meg.
A CaMV genomjának 7482. nukleotidpozíciójában a Ddel restrikciós helyet [Franck és munkatársai: Cell 21, 285-294 (1980)] módosítjuk egy 48 bp oligonukleotid inszerciója által, mely bizonyos restrikciós enzim helyeket tartalmazott, beleértve a Ncol helyet (CCATGG), a Sáli helyet (GTCGAC) és egy SstI helyet (GAGCTC). Az így módosított CaMV-promotert behelyezzük a pUC19 vektorba, melyet előzőleg módosítottunk a vektor SstI és Sáli helyeinek széttörésével. Ezáltal a pCIB1500 plazmid CaMV 35S promotere egyetlen SstI és Sáli helyet tartalmaz a klónozáshoz. A pCIB1500-at emésztjük Sstl/NcoI-gyel és ligáljuk GUS-génnel, melyet a pBI221-ből nyertünk ki (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). A Ncol helyet fuzionáljuk a GUS-génhez úgy, hogy az Ncol funkciók ATG-je mint startkodon szerepeljen a GUS-gén transzlációjához. A CaMV 35S poliadenilációs és terminációs szignálokat használjuk a kiméra gének 3’-végéhez.
A protoplasztokból az RNS-t a guanidin-tiocianátfenol-kloroform módszerrel izoláljuk Goodall és munkatársai szerint: Methods in Enzymology 181, 148-161 (1990). Ismételt northem próbát végzünk egy T7 RNSpolimerázzal és egy GUS-génnel. A pJS175-tel és pATll-gyel transzformált protoplasztokból csak az RNS hibridizál a T7 RNS-polimeráz próbához. Az egyedül pJS175-tel és a pJS175/pATl 1-gyel együtt transzformáit protoplasztokból az RNS hibridizál a GUS-próbához, jelezve, hogy a T7 RNS-polimeráz átíródik a T7 promoter alatt a növényi sejtekben. A T7 promoterből átíródott GUS-RNS-szint 10-szer magasabb, mint a pCIB246 kontroll.
7. példa
GUS-expresszió dohány karcvirus vezetőszekvenciát használva a T7 transzkriptumok átírásához A dohányprotoplasztokat kotranszformáljuk a
T7 RNS-polimerázt irányító 35S CaMV-promoterrel (pJSl 75) és a T7 promoter - GUS-fuziókkal TEV vezetőszekvenciával együtt vagy anélkül (pAT31, pJS261). A GUS fluorometriás vizsgálatát az I. táblázatban adjuk meg.
GUS-enzimaktivitás (4-szer magasabb mint a 35S/GUS-kontrollé) csak akkor látható a T7 szerkezetekben, ha a TEV vezetőszekvencia jelen van.
I. táblázat
- Expressziós kísérletek TEV leadert alkalmazva pCIB246 - 35S/GUS pJS175 - 35S/T7 RNS-polimeráz pJS179 - 35S/luciferáz pATll - T7 promoter/GUS/T7 terminátor pJS261 - T7 promoter/TEV leader/GUS/35S terminátor/T7 terminátor pAT31 - T7 promoter (stem-loop eltávolítva)]TEV leader/GUS/35S terminátor/T7 terminátor
Specifikus GUS-akti vitás (nm MU pg fehérje/perc) x-szeres növekedés a pCIB246-hez képest
pBIB246 20,5+4
pJS179/pATll 0,021+0,007
pJS175/pATll 0,013+0,004
pJS175/pJS261 14,17+0,45 0,7
pJS175/pAT31 80,8+5 3,9
8. példa
Egy portokspecifikus promoter fúziója a T7 RNSpolimeráz génhez
A T7 RNS-polimeráz gént, amely tartalmazza a zSV40 nukleáris lokációs szignált és egy növényi transzlációs konszenzusszekvenciát, egy BglII-BamHI ffagmensként kivágjuk, és klónozzuk pLC250 BamHI helyére, amely szerkezetet leírták az 1993. június 24-én benyújtott 93810455.1 számú európai szabadalmi bejelentés 17. példájában, melyet beépítünk referenciaként. A pLC250-ben, egy tapetal-specifíkus dohányportokpromoter, az ant32 van klónozva az Agrobacterium biner plazmidvektor pBIlOl Sall-Xba helyére (Clontech, Palo Alto, CA). A GUS-gént előzőleg eltávolítottuk a ρΒΙΙΟΙ-ből Smal-gyel és SacI helyet tompává tettük. A kapott plazmid, a pAT20 tartalmazza az ant32 dohányportok-promotert, a T7 RNS-polimeráz gént (SV40 NLS, növényi transzlációs konszenzusszekvencia) és egy nos terminátort.
Az ant32 promotert lehet kapni az ant32 klón 2,0 kb-ú 5’-végű régiójából, amelyet az 1993. június 24-én benyújtott 93812455.1 számú európai szabadalmi bejelentésben leírtak szerint készítünk el, mely kitanítást beépítjük ezen bejelentésbe. Az ant32 genomiális klón DNS-szekvenciáját a SEQ ID NO: 1-ben mutatjuk be.
9. példa
Növényi transzformációs vektorok megszerkesztése
A pClB710 és származékainak megszerkesztése
A pBIB710 megszerkesztését a WO 93/07278 számú PCT-beli közrebocsátási irat 4. példája írja le. A pCIB709 és pCIB710 promoter kazetta plazmidok megszerkesztését Rothstein és munkatársai írják le [Gene 53, 153-161 (1987)]. A pCIB710 tartalmazza a CaMV-promotert és transzkripciós terminátor szekvenciákat a 35S RNS transzkriptumhoz [Covey és munkatársai: Nucl. Acids. Rés. 9, 6735-6747 (1981)]. A CaMV DNS 1149 bp BglII restrikciós fragmensét (bp 6494-7643, Hohn és munkatársai: Current Topics in Microbiology and Immunology 96, 194-220 és
HU 220 358 Β
Appendices A-G (1982)] izoláljuk a CaMV DNS-ből preparatív gélelektroforézissel, mint azt korábban leírtuk. A fragmenst összekeverjük a BamHI-gyel hasított pUC19 plazmid-DNS-sel, kezeljük T4 DNS-ligázzal és E. coliba transzformáljuk. (Megjegyezzük, hogy a kapott plazmidban a BamHl restrikciós helyet szétroncsoljuk a BglI kohezív végek ligálásával a BamHl kohezív végekhez.)
Az így kapott plazmidot, melyet pUC19/35S-sel jelölünk, ezután oligonukleotid-irányított in vitro mutagenezisben felhasználjuk a BamHI-t felismerő szekvencia GGATCC beépítésére közvetlenül a CaMV 7483. nukleotidja után a Hohn-féle referencia szerint. Az így kapott plazmid a pCIB710, mely tartalmazza a CaMVpromoter régiót és transzkripciós terminátor régiót a BamHl hasítóhely által szétválasztva. Ezen BamHl hasítóhelyre behelyezett DNS-szekvenciák ki fognak fejeződni növényekben ezen CaMV transzkripciós szabályozó szekvenciák által. (Azt is meg kell jegyezni, hogy a pCIB710 nem tartalmaz semmiféle ATG transzlációs iniciációs kodonokat a transzkripció starthelye és a BamHl hely között.)
A pCIB709-et a pCIB710 módosításával kapjuk úgy, hogy beépítünk egy BamHI-fragmenst, amely tartalmazza a higromicin-foszfotranszferázt kódoló szekvenciát a pLG90-ből [Rothstein és munkatársai: Gene 53,153-161 (1987)] a BamHl helyre.
A pCIB709 módosításával a pCIB996-ot kapjuk, eltávolítva a higromicin foszfotranszferáz gén iniciációs kodonjától felfelé lévő ATG-t standard mutagenezis technika alkalmazásával, mivel egy BglII restrikciós helyet építünk be erre a helyre.
Növényi transzformáló vektorok megszerkesztése, melyek egy, a T7 RNS-polimerázt irányító portokspecifikus promotert és a Diphtheria toxingént irányító T7 promotert tartalmazzák
Megszerkesztünk egy növényi transzformációs vektort, amely tartalmaz egy, a T7 RNS-polimerázt irányító portokspecifikus promotert és egy, a Diphtheria taxin A-láncát irányító T7 promotert (DTA) kódoló szekvenciát (Palmiter és munkatársai: Cell 50, 435-443). A T7 promoter/TEV leader/DTA kódolószekvencia/35S terminátor/T7 terminátor kazettát a következőképpen állítjuk össze: a PAT30-ból kivágjuk a GUSgént a BamHI-gyel és beépítjük egy TEV vezető BamHI-NcoI fragmensbe a pAT29-ből és egy DTA kódoló szekvenciát tartalmazó NcoI-BglII fragmenst, így a pTG28-at kapjuk. A pTG32 egy növényi transzformáló vektor, amely mindkét komponenst tartalmazza és úgy szerkesztjük meg, hogy a pTG28 3 EcoRI helyét hozzáillesztjük a HindlII-hoz és a Hindlll fragmenst beépítjük a pAT20-ba. A T7 RNS-polimerázt szabályozó portokspecifikus promotert és a DTA-t szabályozó T7 promotert szintén transzformáljuk egymástól függetlenül a növényekbe és ezután keresztezzük a növényeket, hogy hímsteril növényeket kapjunk. A pTG35 csak a DTA-t szabályozó T7 promotert tartalmazza a növényi transzformáló vektorban és ezt úgy szerkesztjük meg, hogy a pAT28 3’ EcoRI helyét hozzáillesztjük és klónozzuk a pCIB905 növényi transzformáló vektor Sáli helyére. A pCIB905 megszerkesztéséhez a 35S promotert, a higromicinrezisztens gént (Hy), és a 35S 3’ terminátort eltávolítjuk a pCIB996-ból egy KpnI, Sáli fragmens formájában és inszertáljuk a pCIB200 megfelelő helyére. Ezt a szerkezetet a 0462065 számú európai közrebocsátást irat 14.1 példája ismerteti, melyet referenciaként beépítünk a bejelentésbe. A pTG35-tel transzformált növényeket keresztezzük a pAT20 transzformánsokkal.
10. példa
Transzgenikus növények előállítása
Dohánylevéllemezeket transzformálunk pTG32vel, pAT20-szal és pTG35-tel Horsch és munkatársai által leírtak szerint [Science 227, 1229-1231 (1985)] és a transzformálódó DNS jelenlétét PCR-rel igazoljuk.
11. példa
A T7 RNS-polimerázt szabályozó portokspecifikus promoterrel és a DTA-t szabályozó T7 promoterrel transzformált növények analízise pTG32-vel transzformált növény virágának morfológiáját tanulmányoztuk. 11 növény volt hímsteril és 11-ből 9 mutatkozott nő-termékenynek vad típusú dohánnyal keresztezve.
12. példa
Növényi transzformáló vektorok a GUS kifejezésére a T7promoterből
A T7 RNS-polimerázt szabályozó 35S CaMV-promotert és a GUS-gént szabályozó T7 promotert egy növényi transzformáló vektorba klónozzuk. Kontrollként a luciferázt szabályozó 35S CaMV-promotert és a GUS-gént szabályozó T7 promotert szintén klónozzuk. A T7 promoter (stem-loop eltávolítva)/TEV vezető/ GUS-gén/35S terminátor/T7 terminátort eltávolítjuk a pAT31-ből Xba, EcoRI-gyel és klónozzuk a pCIB200 növényi transzformáló vektorba a pAT34-ben. A 35S promoter/T7 RNS-polimeráz/nos terminátor fragmens 5 SacI helyét hozzáillesztjük az Xbal helyhez (SacI hely törölve) és klónozzuk a pAT34 Xbal helyére, kialakítva ezáltal a pAT35-t. A kontrolihoz a luciferáz gént klónozzuk a pCIB770 [Rothstein: Gene 53, 153-161 (1987)] BamHl helyére a pAT36-ban. A pAT37-ben a pAT31 EcoRI helyét hozzáillesztjük a Sáli helyhez (EcoRI hely törölve) és a Sáli fragmenst, mely a T7 promoter/TEV leader/GUS-gén/35S terminátor/T7 terminátort tartalmazza, klónozzuk a pAT36 Sáli helyére. Mind a pAT3 5-ben mind a pAT3 7-ben kiválasztjuk azokat a kiónokat, melyekben a két gén transzkripciója egymáshoz viszonyítva ellentétes orientációjú.
13. példa
Antiszensz-gátlás T7 polimeráz és T7 promoterek segítségévéi
A pCIB3217-ben a T7 promotert inszertáljuk antiszensz irányban a pUC 19-ben lévő 35S promoter/ /GUS/35S terminátor kazetta után. Ezt a kazettát klónozzuk egy növényi transzformáló vektorba és keresztezzük, hogy egy 35S promoter/T7 RNS-polimeráz
HU 220 358 Β (pCIB3210)-zal transzformált növényt kapjunk. A T7 polimeráz és a GUS-gén/antiszensz T7 promotert is hordozó utódok GUS-enzimaktivitását összehasonlítottuk a csak GUS-gén/antiszensz T7 promotert hordozó utódokéval.
14. példa
Vektorok szerkesztése, melyek a GAL4 kötőhely/minimál 35S CaMV-promotert a GUS- és Diphtheriatoxinhoz fuzionálva tartalmazzák
A GAL4 konszenzus kötőhelyet [Giniger és munkatársai: Cell 40, 767-774 (1985)] fuzionáljuk a CaMV 35S minimálpromoterhez (-46-tól + l-ig, Benfey és munkatársai: EMBO 9,1677-1684 (1990)] beépítve a kötőhelyet egy PCR primerbe. A PCR-primer, melyet a GAL4 kötőhely megtoldására használunk felfelé (upstream) a minimál -46 CaMV-promoterben, a következő szekvenciával rendelkezik: 5’GCGAAGCTTCGGAAGA CTCTCCTCCGCTCGAAGCAAGACCCTTCCTCTCTATATA 3’. Ez az 54 bp primer áll a HindlII helyből, a 17 bp GAL4 kötőhelyből, az Xhol helyből és a CaMV-promoter 23 bp-ából kezdve a -46 pozíciótól. Egy másik primert is használunk a reakcióban, melynek szekvenciája a következő: 5’ GCGATCTAGAATGGTCGACTAAGGGTTTCTT 3’. Ez a 31 bp primer tartalmazza a 35S leader 21 bp-ját a végén a +130-at követően egy Xbal hely által. A GAL4 kötőhelynek a hozzáadását a minimál 35S promoterhez (-46-tól + 130-ig) kíséri egy PCR-reakció is a pCIB246-on (templátként használva a minimál 35S promoterhez).
A kötőhelyet és a minimálpromotert tartalmazó PCR-származékok tartalmazzák a HindlII, Xbal végeket, és klónozzuk őket a pBHOl plazmidvektorba. A pLP3 tartalmazza a GAL4 kötőhely/minimál 35S promoter/GUS-gén/nos terminátort a pBHOl növényi transzformáló vektorban (eltávolított GUS-sal). Ezt a kazettát a pLP3-ból Hindii, EcoRI-gyel vágjuk ki és klónozzuk a „bluescript”-be, létrehozva a pLP4-et. A GAL4 kötőhely/minimál 35S promotert fuzionáljuk a DTA kódolószekvenciához. A GUS-gént először eltávolítjuk a pBI101-ből, Smal és Sacl-gyel történő kivágással, tompává tesszük a SacI helyet és újraligáljuk a plazmidba. A GAL4 kötőhely/minimál 35S promotert klónozzuk a HindlII, Xbal helyekre és a DTA gént klónozzuk egy BglII fragmensként a pBHOl plazmidvektor BamHI helyére. A pLPl tartalmazza a GAL4 kötőhely/35S minimálpromoter/DTA kódolószekvencia/nos terminátort a pBIlOl növényi transzformáló vektorban (eltávolított GUS-sal).
15. példa
GUS expressziója GAL4/VP16 transzaktivátor segítségével
Kukoricaprotoplasztokat kotranszformálunk egy 35S promoter/ GAL4/VP16 génnel (pGAL4/VPl Goff és munkatársai: Genes and Development 5, 298-309 (1991) és egy GAL4 kötőhely/minimál 35S promoter/GUS-génnel (pLP4). GUS fluorometriás vizsgálatot végzünk (II. táblázat). A GUS-enzimaktivitás 20-szor magasabb a GAL4 kötőhely/minimál 35S promoterrel, ha a GAL4/VP16 transzaktivátor jelen van.
11. táblázat
Expressziós kísérletek a GAL4/VP16 transzaktivátor felhasználásával pLP4 - GAL4 kötőhely/minimál 35S promoter/GUS pGAL4/VPl - 35S promoter/Adhl intron/GAL4/VP16
Specifikus GUS-aktivitás (nm MU/pg fehéije) x-szeres növekedés a pLP4-hez képest
nincs DNS 0,20+0,0
pLP4 0,26+0,15
pLP4/pGAL4/VPl 5,25+1,20 20
16. példa
Egy portokspecifikus promoter fúziója a
GAL4/VP16-hoz
A GAL4/VP16 fúziót a pGAL4/VPl-ból egy BamHI fragmensként vágjuk ki, és behelyezzük a pLC250 BamHI helyére. A kapott plazmid a pLP2, mely tartalmaz egy portokspecifikus promoter/GAL4/VP16/nos terminátort a pBIlOl növényi transzformáló vektorban (eltávolított GUS-sal). A pLP2-t hordozó transzformánsokat keresztezhetjük a pLP3-mal transzformált növényekkel a célból, hogy aktiváljuk a GUS-gént vagy keresztezhetjük a pLPl-gyel transzformált növényekkel, hogy hímsteril növényeket kapjunk.
Bár a jelen találmányt részletesen leírtuk és példákkal illusztráltuk a jobb megértés céljából, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körén belül bizonyos változtatások és módosítások lehetségesek.
A leírásban említett összes publikáció és szabadalmi bejelentés a területen jártas szakember tudásszintjére utal, amely területhez ez a bejelentés tartozik. Minden publikációt és szabadalmi bejelentést referenciaként beépítünk olyan mértékben, amint azt az egyes publikációknál vagy szabadalmi bejelentéseknél speciálisan és egyenként jeleztük.
SZEKVENCIALISTA (1) GENERAL INFORMATION:
(i) APPLICANT:
(A) NAME: CIBA-GEIGY AG (B) STREET: Klybeckstr. 141 (C) CITY: Basel (E) COUNTRY: SCHWEIZ (F) POSTAL CODE (ZIP): 4002 (G) TELEPHONÉ: +41 61 69 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX : 962 991 (ii) TITLE OF INVENTION: Methods fór the production of hybrid seed
Sequences and Recombinant DNA Sequences (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 1
HU 220 358 Β (iv) COMPUTER READABLE FORM:
(A) MÉDIUM ΤΥΡΕ: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) INFORMATION FÓR SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:
(A)LENGTH: 3706 base pairs (Β) ΤΥΡΕ: nucleic acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE ΤΥΡΕ: DNA (genomic) (iii) HYPOTHETICAL: NO (iv) ANTI-SENSE: NO (vi) ORIGINAL SOURCE:
(A) ORGANISM: Nicotiana tabacum (C) INDIVIDUALISOLATE: Ant32 genomic clone (vii) IMMEDIATE SOURCE:
(B) CLONE: pCIB950 (ix)FEATURE:
(A) NAME/KEY: TATA signal (B) LOCATION: 1971... 1975 (ix)FEATURE:
(A) NAME/KEY: CDS (B) LOCATION: 2076...3422 (ix)FEATURE:
(A) NAME/KEY: miscfeature (B) LOCATION: 2009 (D) OTHER INFORMATION: /note=„Putative transcription start site” (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQIDNO: 1:
CTGCAGTAAG GGGGATATTC AGAGACTCAA CTTAATCAAT ATTTGGCCCA AATTTGGCCT 60
GCCGCGTCAC CCAAGGCATC GCATCAGTGT AATTCTCTTC GCAATCTGAT TTTTGCTCTG 120
CTACCCTTCA TGAAAAAAGT CATAACTTCT TGTAGGAAAT ATTGGAATGA TAAATGGTTT 180
GATGTTCTGG AAACTAGACT CACAGAAAAT TCATTTGATA TATAGCTAAT AGCTCAATTC 240
GTAATGCATT CGGAGATATG ATTGTTTGAA GTTACATCAT ATGCGAGTAT GCTCGCTTTC 300
TTCTCTTAAA CCTTTTCTAT TTGTTCCAAA CTACTTCTTC TCACTTATAG ATGTCCATAT 360
AACTTTACAA ACATGAGATT TAGGTATTAC ACACCTTCAA AACTTTTCGA ACACACGTGT 420
GTCTACTTAG GGCTTGAACC AGAACGTAAT ACTTAACGAT TTTCGGGGCA TTACATGCAT 480
ACACCACTGT TAACAGGAAA ATTGCTTTCA TTAAATTATA ACATTGGATT TGGTGTGCAC 540
TAAGTTCCTA TGCTTAATTG TTATGAACAT GAGTACTTTG CTTTCTCCCT TTGGTGGTGC 600
ATACTTGTTT GTGGATATAT ATCGAGAATA ATAATGTGAG TGAATAGATA TTGTCTATTA 660
TTTAACTTTA ATTTGCACCG CTACTTGTTC ACCACATTGG GATTCAATTG GGTGACTCGG 720
CATATTTATC AATTAATATT CATCTAATGA GAACTCTTGC AAATTCTGTT ATAGGTTCTT 780
AGTAGCATCA GCTGCATATC ATGTAAACTA AGAGTCAATA TGCTCACTTG TCAGTAAAAA 840
AGAGTCATTA TCCTCACTTA TGTCATTTAC TCTATAGCTA TATTGGAGGC ATTATGTTAA 900
HU 220 358 Β
TGGATTCCTA ATAATACCAA ATTACACCTT ATATGAGTCA TTGTTGGACA GAGTTTATCA 960
ATACCTATAT ATTAGTGTAC TCTTATTCTT GCTCTTTGTG AGTATTAATA TGATGACTAT 1020
ATTGACAGCA TTTGCATGAT GATGAGTGGG GCAGGAGACG CACAAAGTTT GTACCATAGA 1080
GGAAGTTCGA GTTCTGTGAT AATCTTGGAA GAAAGTATAG TTATATTCTT TCTCCCCACC 1140
TTGTTGATTT CCGACTTGTT TGAAGTTTGC TCCTTGTTGC TGTCACAATT GTATTCATGT 1200
TAAGTTCTTT ATGAAGTTGG GTTGACGTTC AAATCTCATA CGCATGTTTG TTGCCTCTTT 1260
TTATTTGTCT ATGGGGGTTG CATCAGTTGT CTCAGATCAA GATGGGAGCA TATTACTGCT 1320
CCAAAGGTTT GGTTGTCCTT GGTAGTAACT AGTTCATGTG CAGGTTGGCT GCTCTGTTTG 1380
ATTCTGCTTT GAGAACTTAA AGCTTTCATT TACTCAATTA TCAAATATCT GGGGTTTAAT 1440
GGGCTCAAAT CACCCTTATA CAAACACCTT TTGTTTCCCT TATCAATGAA TGAACGAATT 1500
TCCTTTGAGT TGTGAATGTA ATAAGGGTGT GAAAGAGGAG TTTTCGTTGT TAAATTGGCG 1560
TTTGAAAGGT TCTCCCTTTT GTTCTTTTTT CGGCTTTTAC TTTTATATAC TGATAGTCTA 1620
AGAAACTTTT TACACTATCA AGTTGCCTAA AAGATAGCTA CATGAGTAAC TTGTTACAAC 1680
CGGTTAAATT ACACTAATAT TACAAATAAA AGTAAATCAG TAATATAAAA GTTATTTACA 1740
TAGTCAATAT ATATAATTTA AATCCTTTTC TATTTTTTCT CGAGGGGTTT GGATTTTTAT 1800
TTTAGTTGGC TCTTAAGACT TGTGCATGTA CATTCTTGAG AAAATAACTC TGTTCATGAG 1860
AAAGCTACCT TAACTAACTA ACGTACTTCA CGGCCGAAAC AAAATCATAC AAATAACACA 1920
TTTCTTTGTG GTTACCTTAA AATTTGGCCA TGAAACTTGG TCTGTTCGAT TATATCTTTA 1980
AATACTACTA CCATCTACCA CACACTCTCC TCTGTCAAGA TAACAATAAA AGAATAAAAA 2040
GATTAACCAA AAACGATATA CATATTTAGG ACAGA ATG AAG GTT AGC Met Lys Val Ser TTG AAG Leu Lys 2093
5
CAC Hi s CAC TGG GTA Val 10 GTG AAG CCA GCA GAG GCA ACA TGG AAT GGC ACT GTC 2141
Hi s Trp Val Ly s Pro Alá Glu 15 Al a Thr Trp Asn Gly 20 Thr Val
TCC TTA TCG GAG TGT GAT CAA ACT TTT GCT GTA ACT CAT GTA CCA ACC 2189
Ser Leu Ser Glu Cy s Asp Gin Thr Phe Al a Va 1 Thr Hi s Val Pro Thr
25 30 35
ATT TAT TAC TAC AGG TTT TGC CAT GAT TGT CTT CCA TCA ACA GAC AAT 2237
Ile Tyr Tyr Tyr Arg Phe Cys Hi s Asp Cys Leu Pro Ser Thr As p Asn
40 45 50
ATC ATC AAA ACC CTC AGG ACC TCA CTA AGC AAA GCA TTA GTA CAC TTC 2285
Ile Ile Lys Thr Leu Arg Thr Ser Leu Ser Ly s Al a Leu Val Hi s Phe
55 60 65 70
HU 220 358 B
TAT CCA TTG TCT GGT CGT TTG CGA TGG ATC GCT GGG TCC CGC CTC GAG
Tyr Pro Leu Ser Gly 75 Arg Leu Arg Trp I le 80 Al a Gly Ser Arg Leu 85 Glu
CTC GAC TGT AAT GCC TCG GGA ATC GTG CTC ATG GAA GCT GAA ACC GAA
Leu Asp Cys Asn 90 Al a Ser Gly I le Val 95 Leu Me t Glu Al a Glu 100 Thr Glu
GCC AAA CTA GAT GAT CTT GGC GAT TTC TCG CCA TCC CCT GAC TTG AAC
Al a Ly s Leu 105 As p As p Leu Gly As p 110 Phe Ser Pro Ser Pro 115 As p Leu Asn
AGC TTG TTT CCC CGT GTA GAC TAC ACA ATC CCA ATT GAT GAA CTC CCT
Ser Leu 120 Phe Pro Arg Val Asp 125 Tyr Thr I le Pro I le 130 As p Glu Leu Pro
TTG TTG TTT GTT CAG CTT ACT AAG TTT CAG TGT GGT GGT ATT GCT CTG
Leu 135 Leu Phe Val G1 n Leu 140 Thr Lys Phe Gin Cy s 145 Gly Gly I le Al a Leu 150
AGT TTT GCA ATA TCA CAT GCT GTA GTT GAT GGC CAA AGT GCT CTT TAC
Ser Phe Al a 11 e Ser 155 Hi s Al a Va 1 Val As p 160 Gly Gin Ser Al a Leu 165 Tyr
TTC CTC ACC GAA TGG GCT AGC CTT GCT CGC GGA GAG CCA TTA GGG AAC
Phe Leu Thr Glu 170 Trp Al a Ser Leu Al a 175 Arg Gly Glu Pro Leu 180 Gly Asn
GAA CCT TTT CAT GAT CGA AAA TTC CTC CGA GCA GGG GAA CCT CCA ATT
Glu Pro Phe 185 Hi s As p Arg Ly s Phe 190 Leu Arg Al a Gly Glu 195 Pro Pro I le
GCA TAT CCA ACG TTT GAG CAT TTA CAG TTT AAT CCA CCA CCA CTT TTG
Al a Tyr 200 Pro Thr Phe Glu Hi s 205 Leu Gin Phe Asn Pro 210 Pro Pro Leu Leu
CTT GGA CAG TCC AGC AGT GAA GAG GAG AAG AAA AAT GAA ACA AAG GGT
Leu 215 Gly Gin Ser Ser Ser 220 Glu Glu Glu Ly s Ly s 225 Asn Glu Thr Ly s Gly 230
TCC ATG CTA AAA CTT ACA AAA CAT CAA GTT GAA ATG TTG AGA AAA AAG
Ser Me t Leu Lys Leu 235 Thr Lys Hi s Gin Val 240 Glu Me t Leu Arg Lys 245 Lys
GCG AAC CAA GGT AAT CAA GGG CGT AGT TAC ACA CGT TAT GAA GTT GTG
Al a Asn Gin Gly 250 As n Gin Gly Arg Ser 255 Tyr Thr Arg Tyr Glu 260 Va 1 Val
ACT GCA CAT ATA TGG AGA TGT GCA TGC AAG GCA AGA GGT CAT AAA TTT
Thr Al a Hi s 265 11 e Trp Arg Cys Al a 270 Cy s Ly s Al a Arg Gly 275 Hi s Lys Phe
GAG CAG CCT ACT AAT TTA TGC ATT TGT GTT AAC ATA CGC AAT ATA ATG
Glu Gin 280 Pro Thr As n Leu Cy s 285 I le Cys Val Asn I le 290 Arg Asn I le Me t
CAA CCA CCT TTG CCT AAA TCC TAT TTT GGC AAT GCC ATA GTT GAT GTT
Gin 295 Pro Pro Leu Pro Lys 300 Ser Tyr Phe Gly Asn 305 Al a I le Va 1 Asp Val 310
2333
2381
2429
2477
2525
2573
2621
2669
2717
2765
2813
2861
2909
2957
3005
HU 220 358 Β
ATT I le GCC AAT GGC GTC TCG GGT GAC ATT ACC Thr 320 TCG Ser AGG CCA TTG GAG TAT 3053
Al a Asn Gly Val 315 Ser Gly Asp I le Arg Pro Leu Glu 325 Tyr
GTT GCT CGA AGG GTG CGA GCA GCC ATT AAA ATG GTG ACG AGT GAT TAC 3101
Val Al a Arg Arg Val Arg Al a Al a I le Ly s Me t Val Thr Ser Asp Tyr
330 335 340
GCA AAC TCG ACG ATT GAT TTC TTA AAA AAC CAG GAG GAT TTG TCA AAA 3149
Al a Asn Ser Thr I le Asp Phe Leu Ly s Asn Gin Glu Asp Leu Ser Ly s
345 350 355
TAT CAA GAT ATT CAT GCA TTT AGA AGC AAG GAA GGT CCT TTT TAT GGA 3197
Tyr Gin As p 11 e Hi s Al a Phe Arg Ser Ly s Glu Gly Pro Phe Tyr G1 y
360 365 370
AAC CCT AAT CTT GGG GTT ATA AGT TGG ATA AGT TTG CCA TTA TTA GGA 3245
Asn Pro Asn Leu Gly Val I le Ser Trp I le Ser Leu Pro Leu Leu Gly
375 380 385 390
TTG GAT TTT GGG TGG GGA AAA GAG ATA CAT ATG AGC CCT GGA ACT CAT 3293
Leu Asp Phe Gly Trp Gly Ly s Glu I le Hi s Me t Ser Pro Gly Thr Hi s
395 400 405
GAA TAT GAT GGT GAT TGT GTG ATA CTT CCA GGA AAA GAA GGG GAT GGA 3341
Glu Tyr Asp Gly As p Cy s Val I le Leu Pro Gly Ly s G1 u Gly As p Gly
410 415 420
TCT TTG ACT GTT GCA ATC ATT CTT CAA GCT GTT CAT GTG GAT GCT TTC 3389
Ser Leu Thr Val Al a I le 11 e Leu Gin Al a Val Hi s Val Asp Al a Phe
425 430 435
AAG AAC TTC TTC TAT GAA GAA ATT GAA TGT TGAAAAACAT AAGTGTTTTA 3439
Ly s As n Phe Phe Tyr Glu Glu I le Glu Cy s
440 445
TGAGAAGAAA GGAAACAAAT TAAGAACATG TAGCTTTTCC TAAATTGACA TTGTTAGTCA 3499
TGGTCTAAGC AAAATAAACT CTTTATCTAC ACATTATTTC AATATATTTT CCTTATTTTC 3559
TATCAGATTT CTCATATGTT TATTTGATGT TCTTAATTTT ACGAACAATA ATCGGTCATA 3619
AATGGTTTGA AAATCAATAA CCAAAACTGG AACTATATTG ATTGTTTGGA AGCTAAGCAC 3679 TTTTTTTCTT CTTTTTTCGC AAAGCAC 3706

Claims (37)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás hímsteril növények előállítására, azzal jellemezve, hogy transzformálunk egy első szülő növényi sejtet egy első expressziós kazettával, amely egy portokspecifikus 5 szabályozórégiót kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva egy transzaktivátor polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához;
    regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 1-et a nevezett első transzformált növényi sejtből;
    transzformálunk egy második szülő növényi sejtet egy második expressziós kazettával, mely a fent említett transzaktivátor polipeptid által aktiválódni képes cél-nukleotidszekvenciát tartalmazza, működőképesen kapcsolva egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, melyek képesek az életképes pollenek képződését diszruptálni;
    regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 2-t a nevezett második transzformált növényi sejtből; és keresztezzük a szülő 1-et a szülő 2-vel, hogy hímsteril utódokat kapjunk.
    HU 220 358 Β
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzaktivátor polipeptid egy T7 polimeráz.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél-nukleotidszekvencia egy T7 5’ szabályozórégió.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett szülő 1 transzformálására használt első expressziós kazetta tartalmaz továbbá egy nukleáris lokalizációs szignálszekvenciát.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nukleáris lokalizációs szignálként egy vírus nukleáris lokalizációs szignált használunk a SV40-ből.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzaktivátor polipeptid egy DNS-kötő fehétje.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett DNS-kötő fehérje a GAL4/VP16 vagy aGAU/cl.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antiszensz RNS képes hibridizálni a kódolószekvencia azon részéhez, amely meggátolja a pollenképződést vagy funkciót.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az életképes pollenképződést diszruptáló polipeptid az alábbiak egyike: diphtheria toxin A, pektinliáz, T-urfl3, boróka rekombináz, indol-ecetsav-lizinszintetáz, cytA toxin, APRT, RNS-áz DNS-áz vagy proteáz.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett polipeptid a diphtheria toxin A.
  11. 11. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szülő 2 nevezett expressziós kazettája tartalmaz egy, a minimál 35S promoterhez kapcsolt GAL4 kötőhelyet, amely működőképesen kapcsolódik a nevezett nukleotidszekvenciához, mely egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódol, melyek diszruptálni fogják az életképes pollenek képződését.
  12. 12. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szülő 2 nevezett expressziós kazettája tartalmaz egy további T7 terminátor szekvenciát.
  13. 13. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szülő 2 nevezett expressziós kazettája tartalmaz egy további növényi terminátor szekvenciát.
  14. 14. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szülő 2 nevezett expressziós kazettája tartalmaz egy további növényi terminátor szekvenciát.
  15. 15. Eljárás hibrid vetőmagok előállítására pollent termelő növények azon fajtáiból szelektált növényekből, amelyek genetikailag transzformálhatok az alábbi módon, melyre jellemző, hogy (a) hímsteril növényeket állítunk elő úgy, hogy (i) transzformálunk egy első növényi sejtet egy első expressziós kazettával, mely egy 5’ szabályozórégiót kódoló nukleotidszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához;
    (ii) regeneráljuk a transzformált növényt, a szülő 1et a nevezett első transzformált növényi sejtből;
    (iii) transzformálunk egy második növényi sejtet egy expressziós kazettával, mely a transzaktivátort aktiváló cél-nukleotidszekvenciát hordozza, működőképesen kapcsolva egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, melyek gátolni fogják az életképes pollenek képződését;
    (iv) regeneráljuk a transzformált sejtet, a szülő 2-t a nevezett második transzformált növényi sejtből; és (v) keresztezzük a szülő 1-et a szülő 2-vel, hogy hímsteril utódokat kapjunk;
    (b) keresztezzük a kapott hímsteril utódokat egy szelektált termékeny vonallal, így hibrid magokat kapunk.
  16. 16. Egy transzgenikus növény és annak utódai, azzal jellemezve, hogy egy stabilan integrálódott expressziós kazettát tartalmaz, amely kazetta egy portokspeciftkus promotert kódoló nukelotidszekvenciát tartalmaz működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához.
  17. 17. Egy transzgenikus növény és annak utódai, azzal jellemezve, hogy egy stabilan integrálódott expressziós kazettát tartalmaz, amely kazetta hordoz egy, a transzaktivátor által aktiválódni képes cél-nukleinsavszekvenciát, működőképesen kapcsolva egy antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet kódoló nukleotidszekvenciához, melyek az életképes pollenképződést fogják megakadályozni.
  18. 18. Egy transzgenikus himsteril növény és annak utódai, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy stabilan integrálódott első expressziós kazettát, amely hordoz egy portokspecifikus promotert kódoló nukleotidszekvenciát, működőképesen kapcsolva egy transzaktivátort kódoló nukleotidszekvenciához és egy második expressziós kazettát, amely hordozza a transzaktivátor által aktiválható cél-nukleotidszekvenciát működőképesen kapcsolva egy nukleotidszekvenciához, mely kódolja az antiszensz RNS-t vagy egy polipeptidet, melyek diszruptálni fogják az életképes pollenképződést.
  19. 19. Hibrid vetőmag előállítva a 15. igénypont szerinti eljárással.
  20. 20. Egy hímsteril növény előállítva az 1. igénypont szerinti eljárással.
  21. 21. Eljárás egy kívánt kódolórégió magas szintű expressziójára egy növényben, mely eljárásra jellemző, hogy transzformálunk egy növényi sejtet:
    (i) egy első expressziós kazettával, mely az 5’ szabályozórégiót tartalmazza működőképesen kapcsolva a T7 polimerázt kódoló nukleotidszekvenciához, ahol az említett 5 szabályozórégió képes a T7 polimeráz expressziójának irányítására egy növényi sejtben; és (ii) egy második expressziós kazettával, mely a T7 promotert kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza működőképesen kapcsolva a tárgyi körben említett kívánt kódolórégióhoz; és regenerálunk a transzformált növényi sejtből egy genetikailag transzformált növényt.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első és második expressziós kazetta egyetlen növényi vektor része.
  23. 23. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 5’ szabályozórégió egy promoter, amely
    HU 220 358 B szövetspecifikus, fejlődés szerint specifikus vagy kémiailag indukálható promoter.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a promoter egy szövetspecifikus promoter.
  25. 25. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első expressziós kazetta egy további nukleáris lokalizációs szignált tartalmaz.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nukleáris lokalizációs szignál egy SV40 nukleáris lokalizációs szignál.
  27. 27. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a második expressziós kazetta továbbá egy növényi vezetőszekvenciát.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vezetőszekvencia a következők egyike: pikomavírus vezetőszekvenciák, poty-vírus vezetők, dohány mozaikvírus vezetők, kukorica chlorotic mottle vírus és alfalfa mozaikvírus vezetők.
  29. 29. Egy vektor, azzal jellemezve, hogy tartalmaz egy első expressziós kazettát, mely hordoz egy 5’ szabályozórégiót működőképesen kapcsolva a T7 polimerázt kódoló nukleotidszekvenciához és egy második expressziós kazettát, amely hordoz egy T7 5’ szabályozórégiót működőképesen kapcsolva a kívánt kódolórégióhoz.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a 5’ szabályozórégió egy szövetspecifikus promoter.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a kódolórégió egy toxint kódol a d-endo Bacillus thuringiensisből.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti vektor, azzal jellemezve, hogy a promoter egy pollen promoter.
  33. 33. Egy növényi sejt a 29. igénypont szerinti eljárással transzformálva.
  34. 34. Egy stabilan transzformált növény vagy utódai, azzal jellemezve, hogy a 33. igénypont szerinti növényi sejtből lett regenerálva.
  35. 35. A 16-18. vagy a 34. igénypont szerinti transzgenikus növény és utódai, amely egy kukoricanövény.
  36. 36. A 16-18. vagy 34. igénypont szerinti transzgenikus növény és utódai, amely egy búzanövény.
  37. 37. A 16-18. vagy 34. igénypont szerinti transzgenikus növény és utódai, amely egy árpanövény.
HU9302688A 1992-09-24 1993-09-23 Eljárás hibrid vetőmagok előállítására HU220358B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/950,348 US5409823A (en) 1992-09-24 1992-09-24 Methods for the production of hybrid seed

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9302688D0 HU9302688D0 (en) 1993-12-28
HUT69965A HUT69965A (en) 1995-09-28
HU220358B true HU220358B (hu) 2001-12-28

Family

ID=25490314

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9302688A HU220358B (hu) 1992-09-24 1993-09-23 Eljárás hibrid vetőmagok előállítására

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5409823A (hu)
EP (1) EP0589841B1 (hu)
AT (1) ATE294873T1 (hu)
BR (1) BR9303877A (hu)
CA (1) CA2106718C (hu)
DE (1) DE69333801T2 (hu)
DK (1) DK0589841T3 (hu)
ES (1) ES2242180T3 (hu)
HU (1) HU220358B (hu)
MX (1) MX9305700A (hu)
PT (1) PT589841E (hu)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8901677D0 (en) 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
US5728926A (en) * 1988-02-03 1998-03-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
US6198023B1 (en) 1988-02-03 2001-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US6198026B1 (en) 1988-02-03 2001-03-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US5356799A (en) 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NZ314630A (en) * 1991-01-17 2000-11-24 Harvard College Use of trans-splicing ribozymes for genetic modification and cell ablation in a host cell
US5576198A (en) * 1993-12-14 1996-11-19 Calgene, Inc. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
GB9401780D0 (en) 1994-01-31 1994-03-23 Nickerson Biocem Ltd Modified plants
US5545817A (en) * 1994-03-11 1996-08-13 Calgene, Inc. Enhanced expression in a plant plastid
US5545818A (en) * 1994-03-11 1996-08-13 Calgene Inc. Expression of Bacillus thuringiensis cry proteins in plant plastids
US5470359A (en) * 1994-04-21 1995-11-28 Pioneer Hi-Bred Internation, Inc. Regulatory element conferring tapetum specificity
US5767373A (en) 1994-06-16 1998-06-16 Novartis Finance Corporation Manipulation of protoporphyrinogen oxidase enzyme activity in eukaryotic organisms
US5623054A (en) * 1994-06-23 1997-04-22 The General Hospital Corporation Crucifer AFT proteins and uses thereof
US6013859A (en) * 1994-07-14 2000-01-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US5837851A (en) * 1994-12-08 1998-11-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. DNA promoter 5126 and constructs useful in a reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
US5750868A (en) * 1994-12-08 1998-05-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants
GB9502456D0 (en) * 1995-02-08 1995-03-29 Univ Warwick Control of genes in transgenic plants
US6127606A (en) * 1995-02-08 2000-10-03 University Of Warwick Method of using transactivation proteins to control expression in transgenic plants
CA2213340C (en) * 1995-03-03 2011-07-26 Novartis Ag Control of gene expression in plants by receptor mediated transactivation in the presence of a chemical ligand
US6084155A (en) * 1995-06-06 2000-07-04 Novartis Ag Herbicide-tolerant protoporphyrinogen oxidase ("protox") genes
US5925806A (en) * 1995-06-06 1999-07-20 Mcbride; Kevin E. Controlled expression of transgenic constructs in plant plastids
IL123796A0 (en) * 1995-10-10 1998-10-30 Novartis Ag Juvenile hormone or one of its agonists as a chemical ligand to control gene expression in plants by receptor mediated transactivation
GB9603069D0 (en) * 1996-02-14 1996-04-10 Medical Res Council Improvements in or relating to gene expression
US6255558B1 (en) 1996-02-14 2001-07-03 Btg International Limited Gene expression
US7285700B2 (en) 1996-03-06 2007-10-23 Rutgers, The State University Of New Jersey Plastid directed DNA constructs comprising chimeric plastid targeting regions, vectors containing same and methods of use thereof
AU732479B2 (en) 1996-03-06 2001-04-26 Rutgers University Plastid transformation in arabidopsis thaliana
US5994526A (en) * 1996-06-21 1999-11-30 Plant Genetic Systems Gene expression in plants
CA2255057A1 (en) * 1996-06-21 1997-12-31 Plant Genetic Systems, N.V. Gene expression in plants
CA2263726C (en) 1996-09-12 2009-12-29 Novartis Ag Transgenic plants expressing cellulolytic enzymes
GB9703681D0 (en) * 1997-02-21 1997-04-09 Gene Shears Pty Ltd Protein complemention
CN1187292A (zh) * 1997-05-09 1998-07-15 严文贵 提高作物和植物杂种优势的方法
CA2285579A1 (en) * 1997-04-28 1998-11-05 Wengui Yan Crop heterosis and herbicide
US5968793A (en) * 1997-06-24 1999-10-19 E. I. Du Pont De Nemours And Company Specific gene activation by chimeric Gal4 transcription factors in stable transgenic plants
EP1002088A1 (en) * 1997-07-18 2000-05-24 E.I. Du Pont De Nemours And Company A plant homolog of yeast ada2, a transcription adaptor
CN1280623A (zh) * 1997-11-26 2001-01-17 诺瓦提斯公司 用于激活沉默转基因的方法和物质
US7303917B2 (en) * 1998-03-20 2007-12-04 Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Eastern Cereal & Oilseed, Research Center Modification of pollen coat protein composition
US6395892B1 (en) 1998-04-06 2002-05-28 The State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University Floral homeotic genes for manipulation of flowering in poplar and other plant species
US6251668B1 (en) 1998-07-13 2001-06-26 E. I. Du Pont De Nemours & Company Transcription coactivators
AU5005499A (en) * 1998-07-22 2000-02-14 E.I. Du Pont De Nemours And Company Pc4 transcriptional coactivators
IL128111A (en) 1999-01-18 2007-03-08 Yissum Res Dev Co A method of silencing expression of a target sequence in a plant genome
US6852911B1 (en) * 1999-08-31 2005-02-08 Fertiseed Ltd. Method of producing a male sterile plant by exogenic allelism
US7267964B2 (en) 2000-03-31 2007-09-11 Merial Limited DNA molecules encoding ligand gated ion channels from Dermacentor variabilis
US7612251B2 (en) * 2000-09-26 2009-11-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same
EP2351838A1 (en) * 2000-10-20 2011-08-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Crosslinking agonistic antibodies
US7230168B2 (en) * 2001-12-20 2007-06-12 The Curators Of The University Of Missouri Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase
US7057087B2 (en) * 2002-07-26 2006-06-06 Board Of Control Of Michigan Technological University Application of aspen MADS-box genes to alter reproduction and development in trees
CN104293826A (zh) * 2003-12-16 2015-01-21 先锋高级育种国际公司 显性基因抑制性转基因及其使用方法
US20070169227A1 (en) * 2003-12-16 2007-07-19 Pioneer Hi-Bred International Inc. Dominant Gene Suppression Transgenes and Methods of Using Same
US20080244765A1 (en) * 2004-12-16 2008-10-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions for pollination disruption
US7919676B2 (en) 2007-08-03 2011-04-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
US7910802B2 (en) * 2007-08-03 2011-03-22 Pioneer Hi-Bred International, Inc. MSCA1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
US7915478B2 (en) 2007-08-03 2011-03-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Msca1 nucleotide sequences impacting plant male fertility and method of using same
WO2010046423A2 (en) 2008-10-22 2010-04-29 Basf Se Use of sulfonylurea herbicides on cultivated plants
AR075466A1 (es) 2008-10-22 2011-04-06 Basf Se Uso de herbicidas tipo auxina en plantas cultivadas
EP2257076B1 (en) * 2009-05-28 2015-02-25 Advanced Digital Broadcast S.A. Video data signal, system and method for controlling shutter glasses
RU2764586C2 (ru) * 2009-11-23 2022-01-18 Монсанто Текнолоджи Ллс Трансгенное событие mon 87427 маиса и относительная шкала развития
IN2015DN00911A (hu) 2012-08-21 2015-06-12 Du Pont
MX2015004175A (es) 2012-10-01 2015-06-10 Basf Se Uso de compuestos de n-tio-antranilamida en plantas cultivadas.
WO2014079820A1 (en) 2012-11-22 2014-05-30 Basf Se Use of anthranilamide compounds for reducing insect-vectored viral infections
EP3028573A1 (en) 2014-12-05 2016-06-08 Basf Se Use of a triazole fungicide on transgenic plants
WO2016091674A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Basf Se Use of cyclaniliprole on cultivated plants
US11064696B2 (en) 2015-04-07 2021-07-20 Basf Agrochemical Products B.V. Use of an insecticidal carboxamide compound against pests on cultivated plants
CN109790546A (zh) 2016-07-18 2019-05-21 不莱梅大学 产生多倍体植物的方法
EP3338552A1 (en) 2016-12-21 2018-06-27 Basf Se Use of a tetrazolinone fungicide on transgenic plants

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4820639A (en) * 1985-12-04 1989-04-11 Massachusetts Institute Of Technology Process for enhancing translational efficiency of eukaryotic mRNA
US4833080A (en) * 1985-12-12 1989-05-23 President And Fellows Of Harvard College Regulation of eucaryotic gene expression
US5135855A (en) * 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US5126251A (en) * 1986-09-03 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Stable mammalian cell line expressing a bacteriophage RNA polymerase
US4987071A (en) * 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
GB8901677D0 (en) * 1989-01-26 1989-03-15 Ici Plc Hybrid seed production
WO1989005852A1 (en) * 1987-12-15 1989-06-29 Macphillamy Cummins & Gibson Ribozymes
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
EP0456706B1 (en) * 1989-02-02 2005-05-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
US4990607A (en) * 1989-03-14 1991-02-05 The Rockefeller University Alteration of gene expression in plants
AU5664090A (en) * 1989-05-05 1990-11-29 Biosource Genetics Corporation Male sterility in plants
ATE197816T1 (de) * 1989-08-04 2000-12-15 Aventis Cropscience Nv Pflanzen mit modifizierten blüten, samen oder embryos
US5212296A (en) * 1989-09-11 1993-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Expression of herbicide metabolizing cytochromes
US5122457A (en) * 1989-10-19 1992-06-16 Schering Corporation Expression systems utilizing bacteriophage t7 promoters, gene sequences, and t7 rna polymerase
WO1991013994A1 (en) * 1990-03-13 1991-09-19 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Gene expression
EP0540561B1 (en) * 1990-07-20 1998-11-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production
AU8723791A (en) * 1990-09-06 1992-03-30 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compounds and constructs for producing male sterile plants

Also Published As

Publication number Publication date
EP0589841A2 (en) 1994-03-30
US5409823A (en) 1995-04-25
DK0589841T3 (da) 2005-09-05
US5824542A (en) 1998-10-20
MX9305700A (es) 1994-03-31
DE69333801T2 (de) 2006-01-19
EP0589841B1 (en) 2005-05-04
CA2106718C (en) 2005-06-14
HUT69965A (en) 1995-09-28
CA2106718A1 (en) 1994-03-25
BR9303877A (pt) 1994-03-29
ES2242180T3 (es) 2005-11-01
US5659124A (en) 1997-08-19
DE69333801D1 (de) 2005-06-09
HU9302688D0 (en) 1993-12-28
PT589841E (pt) 2005-08-31
EP0589841A3 (en) 1995-04-26
ATE294873T1 (de) 2005-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0589841B1 (en) Methods for the production of hybrid seed
US5929307A (en) Method for the production of hybrid plants
RU2170255C2 (ru) Полинуклеотид, способы получения растений, геном растения, клетки, плоды, семена, способы получения семян, применения олигонуклеотида, плазмида, микроорганизм
CA2008700C (en) Hybrid seed production
US5925808A (en) Control of plant gene expression
KR100278819B1 (ko) 형질전환식물에서웅성불임성을위한가역적핵유전시스템
JP2000507808A (ja) 植物における鱗翅目制御のための修飾バチルス・サーリンジェンシス遺伝子
JP4642239B2 (ja) 作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物
JP2002354954A (ja) トランスジェニック植物における雄性不稔のための可逆的核遺伝システム
JP2000037146A (ja) 改変雄蕊細胞を有する植物
EP0972058B1 (en) Method of hybrid seed production using conditional female sterility
MXPA99008098A (en) Method of hybrid seed production using conditional female sterility
US6603064B1 (en) Nuclear male sterile plants, method of producing same and methods to restore fertility
JP4603882B2 (ja) 子孫への形質分配が制御されているトランスジェニック植物
US6395963B1 (en) Nematode-inducible regulatory DNA sequences
CA2335651A1 (en) Gene switch
HU224706B1 (en) Novel uses of male sterility in plants
JP2001514856A (ja) 植物における遺伝子の選択的発現
AU716327B2 (en) Process for producing female-sterile plants

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH