KR100278819B1

KR100278819B1 - 형질전환식물에서웅성불임성을위한가역적핵유전시스템

Info

Publication number: KR100278819B1
Application number: KR1019970703834A
Authority: KR
Inventors: 엠. 시그난 앤드류; 씨. 앨버트슨 마크
Original assignee: 저비스 허버트 에이치; 파이어니어 하이-브레드 인터내셔날 인코포레이티드
Priority date: 1994-12-08
Filing date: 1995-12-07
Publication date: 2001-01-15
Also published as: US5689051A; ES2355966T3; DE69536126D1; BR9510456A; US6248935B1; US6072102A; US5792853A; US5750868A; CA2207264C; ATE490328T1; CA2207264A1; US5689049A

Abstract

화분 형성 또는 작용을 저해하여 형질전환된 식물을 가역적으로 웅성-불임성이 되도록하기 위해 캐스케이드 방식으로 작용할 수 있는, 조절 요소와 DNA 서열을 포함하는 유전 구조체로 식물을 형질전환시킴으로써 식물 발생이 변화될 수 있다. 특히, 본 발명은 우성 네가티브 유전자와 꽃밥-특이적 프로모터의 이용에 관련된다. 웅성 불임성은 우성 네가티브 유전자를 억제하는 두 번째 유전 구조체를 식물에 혼입시킴으로써 역전된다. 본 발명은 또한 식물에서 꽃밥-특이적 프로모터로 작용하는 능력를 나타내는 신규의 DNA 서열에 관련된다.

Description

형질 전환 식물에 있어서 웅성 불임성을 위한 가역적 핵 유전 시스템{REVERSIBLE NUCLEAR GENETIC SYSTEM FOR MALE STERILITY IN TRANSGENIC PLANTS}

식물의 생장은, 본 발명에 따라, 식물 표현 형질에 가역적 효과를 생성하기 위해 캐스케이드(cascading) 방식으로 작용할 수 있는 조절 인자와 구조 유전자를 포함하는 유전 구조체로 식물을 형질 전환시킴으로써 바뀔 수 있다. 적절한 구조체는 조직 특이적 프로모터, 우성의 네가티브 유전자, 그리고 DNA 결합 단백질에 연결된 전사 활성 인자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특히, 본 발명은 가역적으로 수술이 없는 형질 전환 식물을 생산하기 위해 DAM-메틸라아제(methylase) 유전자를 우성의 네가티브 유전자로 이용하고 꽃밥 특이적 프로모터를 이용하는 것에 관련된다.

자연 종자로 오염되지 않은 잡종 종자를 생산하려면, 수분 조절 방법을 수행하여 타가 수분을 보장하고 자가 수분(受紛)을 방지하여야 한다. 수분 조절 기작에는 기계적, 화학적 및 유전적 수단이 있다.

대상 식물에 공간적으로 분리된 수꽃과 암꽃 또는 분리된 웅성(雄性) 식물과 자성(雌性) 식물이 있을 경우에는, 잡종 종자 생산을 위한 기계적 수단을 이용할 수 있다. 예를 들어, 옥수수는 식물의 꼭대기에 개화시 화분을 생성하는 수꽃이 있고, 줄기를 따라 잎의 엽축에 암꽃이 있다. 옥수수의 이계 교배는 자가 교배를 방지하기 위해 암 옥수수를 기계적으로 웅수 절제함으로써 보장된다. 현재 옥수수와 같은 식물을 위한 잡종 종자 생산에 웅수 절제법이 이용되고 있지만, 그 과정은 자성 식물의 웅수 절제 결과로서, 실제적인 웅수 절제 비용과 수율 손실의 관점에서 보면 노동과 비용이 많이 요구된다.

그러나, 대부분의 주요 경작물은 같은 꽃 안에 기능적인 암수 기관을 모두 갖추고 있으므로, 웅수 절제는 간단한 과정이 아니다. 화분이 떨어지기 전에 손으로 화분 형성 기관을 제거하는 것이 가능하나, 이러한 형태의 잡종 생산은 극히 많은 노동력과 비용을 요구한다. 회수되는 종자의 값과 양이 그 노력을 보상할 때에만 이러한 방법으로 종자가 생산된다.

잡종 종자를 생산하는 일반적인 제2의 수단은 생존 능력이 있는 화분을 죽이거나 그 형성을 막는 화학제를 이용하는 것이다. 배우자 불임 유기제라고 하는 이들 화학제는 웅성 불임성(不姙性)을 일시적으로 생성하기 위해 이용된다. 배우자 불임 유기제의 이용에 의한 잡종 종자의 상업적 생산은 화학제의 비용과 이용 가능성 그리고 적용시 작용의 신뢰도와 작용 기간에 의해 제한된다. 배우자 불임 유기제의 심각한 제한은 그들이 식물 독성 효과를 가진다는 것이며, 그 효과의 심각성은 유전형에 의존한다. 다른 제한은 생성된 새로운 꽃들은 영향을 받지 않을 수도 있으므로 연장된 개화 기간을 가진 경작물에는 이들 화학제가 비효과적일 수도 있다는 것이다. 결과적으로, 화학제의 반복적 이용이 요구된다.

농작물을 위한 많은 현재의 상업적 잡종 종자 생산 체계는 수분 조절의 유전적 수단에 의존한다. 자성 식물로 이용되는 식물은 화분을 만들지 못하거나, 화분을 떨어뜨리지 못하거나, 또는 생화학적으로 자가 수분에 영향을 줄 수 없는 화분을 생산한다. 자가 수분하지 못하는 식물은 "자기 불화"(self-incompatible)(SI)라고 말해진다. 자기 불화 체계의 이용과 관련된 어려움은 자기 불화 자성 계열의 이용 가능성과 번식, 그리고 자기 불화의 안정성을 포함한다. 몇 가지 예에 있어서, 자기 불화는 화학적으로 극복될 수 있으며, 또는 미숙한 눈은 수분을 막는 생화학적 기작이 활성화되기 전에 수작업으로 수분될 수 있다. 불활성화할 수 있는 자기 불화 체계는 종종 자가 수분에 대한 생화학적 저해의 효과를 깨뜨리거나 감소시키는 긴장성 기후조건에 매우 예민하다.

상업적 종자 생산을 위해 더욱 광범위한 관심의 대상은 웅성 불임성을 야기하는 수분 조절에 기초한 유전적 기작의 체계이다. 이들 체계에는 두 가지 일반적인 유형이 있다. 즉, (a) 하나 또는 그 이상의 핵 유전자로 인한 화분 형성의 실패인 유전적 웅성 불임성, 또는 (b) 일반적으로 "세포질 웅성 불임성"이라 부르는 세포질 및 유전적 웅성 불임성으로, 이 경우 화분 형성은 세포질 기관, 일반적으로 미토콘드리아에서의 변화로 인해 저해되거나 실패하게 된다.

CMS의 이용과 관련된 잡종 형성 계획이 있는데도 불구하고, 그것의 상업적 가치에 대해서는 제한이 있다. CMS 체계의 한가지 예는 세포질에 위치한 미토콘드리아에서의 돌연 변이로써, 이것은 적절한 핵 배경에 있을 때, 성숙한 화분 형성의 실패로 이끌 수 있다. 몇 가지 예에 있어서, 핵 배경은 세포질 돌연 변이를 보상해 정상적인 수분 형성이 일어난다. 특이적인 핵의 "회복 유전자(restorer gene)"는 CMS 미토콘드리아를 가진 식물에서 화분 형성을 가능하게 한다. 일반적으로, 상업적인 종자 생산을 위한 CMS의 이용은 세 가지 육종 계통의 이용에 관련된다. 즉, 웅성 불임 계통(자성 교배친), 웅성 불임 계통과 동계이나 완전한 기능을 가진 미토콘드리아를 함유한 유지 계통(maintainer line), 그리고 웅성 교배친 계통이다. 우성 교배친 계통은 특이적인 회복 유전자를 가질 수 있으며, 따라서 일반적으로 "회복 계통"(restorer line)으로 표현되며, 이는 잡종 종자에 수정 능력을 부여한다.

잡종으로부터의 종자 회수가 중요하지 않은 식물 경작물과 같은 농작물에 있어서는, CMS 체계가 복원 없이 이용될 수 있다. 잡종의 열매 또는 종자가 상업적 산물인 농작물의 경우, 웅성 교배친의 특이적 회복 유전자에 의해 잡종 종자의 수정 능력이 회복되거나 또는 웅성 불임 잡종이 수분되어야만 한다. 회복되지 않은 잡종의 수분은 수분을 일으키기 위해 소량의 웅성의 가임 식물을 잡종에 포함시킴으로써 이루어질 수 있다. 대부분의 종(種)에 있어서, CMS 형질은 모든 세포질 기관이 단지 난자로부터만 유전되므로 모계 유전되며, 이것이 그 시스템의 사용을 제한한다.

CMS 체계에는 제한이 있어서, 웅성 불임 식물의 생성에 대한 유일한 해결책으로서 그들을 이용하는 것을 방해한다. 예를 들어, 옥수수에서의 한 가지 특정 CMS 유형(T-세포질)은 특정 균류에 의한 감염으로 생성되는 독소에 대한 민감성을 부여한다. 여전히 많은 농작물을 위해 이용되는 데도 불구하고, CMS 체계는 어떤 환경 조건하에서 깨어질 수도 있다.

핵(유전적) 불임성은 우성일 수도 열성일 수도 있다. 우성 불임성은 모계의 증식이 가능하면(예를 들어, 생체외 영양 번식을 통해) 잡종 종자 형성을 위해 이용될 수 있다. 만일, 불임성 식물과 가임성 식물이 쉽게 구별될 수 있으면 열성 불임성이 이용될 수 있다. 유전적 불임 시스템의 상업적 이용은 영양 번식과 자가 임성 식물의 제거 비용에 의해 제한된다.

웅수 절제, CMS 및 SI를 포함하는 기타 이용 가능한 방법에는 단점이 있으므로, 식물 발생을 변화시키는 유전자의 발견은 특히 웅성 불임성을 유발시키기 위한 유전적 방법을 개발하는 데 유용하다.

유전학적 방법을 이용하여 식물에 있어서의 발생을 변화시키는 방법에 대한 연구는 본 발명의 메틸라아제 유전자를 낳게하였다. 특정 유전자 또는 프로모터의 DNA 메틸화 패턴의 변화는 유전자 발현의 변화 이유를 밝혀내었다. DNA의 메틸화는 식물과 동물 양쪽의 발생 도중의 유전자의 조절 요소이다.

메틸화 패턴은 메틸에 민감하고 CpG 함유 프로모터(유전자)를 이용하는 방법 등에 의해 확립된다. 일반적으로, 활발하게 전사되고 있는 서열은 메틸화되어 있다. 동물에 있어서, 메틸화의 위치는 CpG 위치에서 수정된다. 아데닌(A)과 시토신(C)(DNA에 존재하는 뉴클레오티드)의 메틸화의 유전적 조절은 세균류와 포유류 종에서는 유전자에 의해 영향을 받는다. 그러나, 식물에서는, 메틸기가 서열 CXG에 존재하며, 이 때 X는 A, C 또는 T일 수 있고, C가 메틸화되는 잔기이다. A의 메틸화에 기인하는 불활성화는 식물에서는 알려져 있지 않으며, 특히 기타의 시스템 내에서 메틸화되는 것으로 알려진 GATC 위치 내에서는 알려져 있지 않다.

종전에는 조직 내에서 특이적으로 또는 이와 달리 형질 전환된 식물에서 원하는 목적을 이루기 위해 메틸화가 유도하여야 한다는 제안은 없으나, 프로모터 메틸화가 유전자의 불활성화를 야기할 수 있고 형질 전환된 유기체에서 표현형을 바꿀수도 있다는 것은 알려져 있다.

식물 발생의 조절을 위한 수단으로서, 예를 들어 웅성 불임성에 영향을 주기 위해, 관리된 메틸화를 생각하는 것은, 편재하는 표적 내에서 일반화된 불활성화 효과가 있는 유전자, 예컨대 GATC가 표적인 이. 콜리 DNA 아데닌 메틸라아제(DAM)와 같은 메틸라아제 유전자의 발현을 그 식물에 달리 해로운 영향을 주는 일이 없이 특이적 발생 단계를 조절하기 위한 수단으로 이용하는 데 있어서 예상되는 곤란성에 의해 위축된다. DAM 표적은 다수의 프로모터에 존재하며, 따라서 프로모터 및/또는 세포 생존성에 중요한 유전자를 불활성화시키는 것으로부터 식물의 생존성을 유지하는 문제가 예상된다. 외래성 벡터에 의해 숙주계 내에 삽입되는 메틸화를 분획화(compartmentalize)시키는 방법이 없다면, 유전적 수단으로 웅성 불임성을 생성하기 위한 접근으로서의 메틸화는 성공이 기대되지 않았을 것이다. 본 발명은 식물 발생에서의 변화에 영향을 주기 위해 DAM와 같은 유전자를 분획화하고 조작하기 위한 방법과 조성물을 제공한다.

본 발명은 DNA 분자가 재조합 DNA 구조체의 일부일 때 꽃밥 조직에서 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자에 관련된다.

도 1(서열 번호: 1)은 5126을 위한 게놈성 클론의 암호화 부위로부터의 상류 부위를 포함하는 뉴클레오티드 서열로서, 5126프로모터의 프로모터 요소의 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 나열한 것이다. 클론 5126의 암호화 서열은 1488 위치에서 ATG 시작 코돈으로 시작한다.

도 2는 반딧불 루시퍼라아제 유전자에 융합된 옥수수 5126 프로모터의 NheI 결실을 보여주는 DP5130 플라스미드의 지도를 보여주고 있다.

도 3은 P5126 결실의 상대적인 활성을 설명하는 것이다. 나타낸 좌표는 번역 시작 코돈에 관련된다.

도 4는 5126 프로모터의 조직 특이성과 그 프로모터의 결실된 절편에 대한 정보를 제공한다.

도 5는 DP5814 플라스미드에서 이용되는 -503 P5126 결실의 단계 특이성의 도식이다. Pre=감수 분열 전; Mei1=감수 분열 I; Mei2=감수 분열 II; Q=사중체(Quartet); QR=사중체 방출; EU=초기 단핵; EMU=초기-중기 단핵; LMU=후기-중기 단핵.

도 6은 DP5814 플라스미드의 지도를 나타내는데, 이 플라스미드는 이. 콜리 DAM 메틸라아제에 융합된 5126 결실 프로모터를 함유하며, 또한 이중 CaMV 35S 프로모터, 유전자 BAR에 융합된 ADHI 인트론과 pinII 터미네이터를 함유한다.

도 7은 신규의 BspHI 절단 위치 내에서 돌연 변이를 일으킨 ATG 코돈을 함유한 이. 콜리 lexA202 유전자를 포함하는 L87BspHI 플라스미드의 지도를 보여준다.

도 8은 이중 CaMV 35S프로모터, lexA202 옥수수 C1 유전자 하이브리드에 융합된 ADHI 인트론과 pinII터미네이터를 포함하는 L121 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 9는 이중 CaMV 35S 프로모터, lexA202 유전자에 융합된 ADHI 인트론과 pinII 터미네이터를 포함하는 DP5817 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 10은 lexA 결합 부위를 함유하는 최소의 CaMV 35S프로모터(-33), ADH1 인트론, 반딧불 루시퍼라아제 및 pinII 터미네이터를 포함하는 DP6232 플라스미드의 지도를 보여준다.

도 11은 최소의 -33 CaMV 35S 프로모터를 가진 lexA 결합 부위, ADH1 인트론, DAM 메틸라아제 및 pinII 터미네이터를 포함하는 DP6509 플라스미드의 지도를 나타내며, 이 플라스미드는 또한 lexA202-C1에 융합된 5126 프로모터와 선별 가능한 표식 구조체, CaMV 35S::BAR을 포함한다.

도 12는 다양한 DNA 투여량(보여지는 수는 DNA의 상대적인 양을 나타낸다)에서, 옥수수 배발생 현탁 세포에서 lexA202-C1 활성화와 lexA 매개 억제를 보여주는 막대 그래프이다.

도 13은 이. 콜리 lexA 유전자에 융합된 5126 결실 프로모터를 함유하며, 또한 이중 CaMV 35S 프로모터, BAR 유전자에 융합된 옥수수 ADH1 인트론 및 pinII 터미네이터를 함유하는 PHP6522 플라스미드의 지도를 보여준다.

도 14는 옥수수 유비키틴 프로모터와 이. 콜리 lexA 유전자에 융합된 인트론을 함유하며, 또한 BAR 유전자에 융합된 옥수수 ADH1 인트론 및 pinII 터미네이터를 함유하는 PHP6555 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 15는 최소 -33 CaMV 프로모터를 가진 lexA 결합 부위, Adh1 인트론, 코리네박테리오파아지 디프테리아 독소A 서브유닛 및 유전자 7 터미네이터를 함유하며 또한 lexA202-c1에 융합된 5126프로모터와 선별 가능한 표식 구조체 CaMV 35S::BAR를 함유하는 PHP6520 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 16은 5126결실 프로모터, 최소의 -33 CaMV 프로모터를 가진 lexA 결합 부위, Adh1 인트론, 이. 콜리 Dam 메틸라아제를 포함하며, 또한 선별 가능한 표식 구조체 유비키틴:PAT를 함유하는 pinII 터미네이터를 포함하는 PHP8036 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 17은 5126 결실 프로모터, 최소의 -33 CaMV 프로모터를 가진 lexA 결합 부위, 이.콜리 Dam 메틸라아제를 포함하며 또한 선별 가능한 표식 구조체 유비키틴:PAT를 함유하는 pinII 터미네이터를 포함하는 PHP8037 플라스미드의 지도를 나타낸다.

도 18(서열 번호:23)은 5126 cDNA의 DNA 서열을 나열한다. cDNA 서열의 번역의 시작은 뉴클레오티드 위치 73이다.

분리된 분자는 DP5055의 Sca-NcoI 절편의 뉴클레오티드 서열, 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488에 있는 시작 코돈에 대하여 적어도 503 염기쌍 상류에서 연장되는 뉴클레오티드 서열, 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 위치-503부터 위치-1의 상류까지의 뉴클레오티드 서열, 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 위치-587로부터 위치-1의 상류까지의 뉴클레오티드 서열, 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 위치-890으로부터 위치-1 상류까지의 뉴클레오티드 서열, 또는 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 위치-503으로부터 위치-134의 상류까지의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

추가로 본 발명은 발현시, 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열과 이 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있는 작동 유전자(operator)와 이 작동 유전자에 결합하여 우성 네가티브 유전자의 전사를 활성화할 수 있는 DNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자와, 상기 DNA 서열에 연결되어 작동하는 조직 특이적 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 구조체에 더 관련된다.

또한, 본 발명의 재조합 DNA 구조체는 식물 내에서 발현시 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열과 이 DNA 서열의 발현을 조절하는 작동 유전자와, 상기 유전자 산물을 암호화하는 상기 DNA서열에 효과적으로 연결된 화분 형성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터를 포함할 수도 있다. 추가의 구체적인 예에 있어서, 재조합 DNA 구조체는 선별 가능한 표식 (marker) 유전자 또는 DNA 결합 부위를 암호화하는 DNA 서열, 또는 활성화 영역을 암호화하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있다.

하나의 구체적인 예에 있어서, 본 발명의 재조합 DNA 구조체의 DNA 서열에 의해 암호화되는 유전자 산물은 세포 독소일 수도 있다. 다른 예에 있어서, 프로모터는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있고, 상기 구조체는 구조체들, DP5814, DP6509, PHP8036, PHP8037, 또는 PHP6520을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서, 작동 유전자는 lexA 작동 유전자일 수 있다. 그리고, 또 다른 구체적인 예에 있어서, 재조합 DNA 구조체는 선별 가능 표식 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 구체적인 예에 있어서, 재조합 DNA 구조체는 앞에서 정의된 바와 같은 재조합 DNA 구조체의 작동 유전자에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질을 암호화하는 DNA 서열, 그리고 상기 DNA 서열의 발현을 조절하는 프로모터를 포함할 수 있다. 이 재조합 DNA 구조체는 선별 가능 유식 유전자를 더 포함할 수 있다. 하나의 구체예적인 예에 있어서, 재조합 DNA 구조체의 DNA 결합 단백질은 lexA 단백질일 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서, 프로모터는 화분 형성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적일 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서 프로모터는 앞에서 정의된 바와 같은 분리된 DNA 분자를 포함할 수도 있는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에 있어서, 상기 구조체의 프로모터는 유도성(inducible) 프로모터 또는 구조성(constitutive) 프로모터일 수 있으며, 구조성 프로모터로서는 옥수수 유비키틴 프로모터일 수 있다. 재조합 DNA 구조체는 PHP6522 또는 PHP 6555일 수 있다.

본 발명의 그 밖의 특징은 위에서 정의된 분리된 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터에 관련된다. 발현 벡터는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열을 더 포함할 수 있으며, 그 DNA 서열은 프로모터에 연결되어 있다. 하나의 구체적인 예에 있어서, 발현 벡터의 유전자 산물은 수분의 작용 또는 형성을 파괴한다. 또 다른 구체적인 예에 있어서, 발현 벡터의 DNA 서열은 프로모터에 대하여 이종성이다. 또한, 본 발명은 발현 벡터를 포함하는 형질 전환 식물에 관계된다.

본 발명의 다른 구체적인 예에는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 능력을 나타내는 프로모터 5126f의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 꽃밥 특이적 프로모터가 포함된다. 본 발명의 하나의 구체적인 예에 있어서 유전자 산물은 수분의 작용 또는 형성을 저해한다. 다른 구체적인 예에 있어서, 유전자 산물은 세포 독소를 포함한다.

본 발명의 또 다른 특징은 식물에 있어서 가역적인 웅성 불임성을 생성하기 위한 방법에 관련된다. 이 방법은 (a) 제1 식물을 재조합 DNA 구조체로 형질 전환하는 단계, [이 구조체는 (i) 화분의 작용 또는 형성을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 작동 유전자로서, 그 DNA서열에 작동 가능하게 연결된 조직 특이적 프로모터에 존재하는 lexA 작동 유전자와, (ii) 상기 lexA 억제 유전자를 암호화하는 DNA 서열로서, 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 포함한다]와, (b) 상기 구조체의 웅성 불임성 효과를 역전시키기 위해 식물을 유발 물질(inducer)에 노출시키는 단계를 포함한다. 추가의 구체적인 예에 있어서 조직 특이적 프로모터는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 본 발명의 다른 구체적인 예에 있어서, 꽃밥 특이적 프로모터는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 능력을 나타내는 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서 유전자 산물은 우성의 네가티브 유전자일 수 있는데, 이것은 DAM-메틸라아제일 수 있다.

또한, 본 발명은 웅성 불임 식물과, (a) 유전적으로 형질 전환될 수 있는 화분 생성 식물의 게놈내에 (i) 식물 내에서 발현시 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열과 (ii) 이 DNA 서열의 발현을 조절하는 작동 유전자 및 (iii) 상기 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되며 화분 형성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터로 이루어지는 재조합 DNA 분자를 삽입하는 단계와, (b) 웅성 불임성이 상기 DNA서열의 발현의 결과 이루어지는 조건하에서 상기 화분 생성 식물을 성장시키는 단계를 포함하는 웅성 불임 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 특징의 다른 구체적인 예에 있어서, 유전자 산물은 세포 독소일 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서, 본 발명의 프로모터는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서, 꽃밥 특이적 프로모터는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 능력을 보여주는 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서, 작동 유전자는 lexA작동 유전자일 수 있다. 웅성 불임성 식물을 생산하는 방법은 선별 가능 표식 유전자를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 잡종 종자에 더 관련되며, (a) 유전학적으로 형질 전환될 수 있는 화분 생성 식물의 게놈 내에 (i) 식물에서 발현시 화분 생성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열과 (ii) 이 DNA 서열의 발현을 조절하는 작동 유전자 및 (iii) 상기 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되며 화분 생성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터로 이루어진 재조합 DNA 분자를 삽입하는 단계, (b) 상기 웅성 불임성이 상기 DNA 서열의 발현 결과 이루어지는 조건하에서 상기 화분 생성 식물을 성장시키는 단계, (c) 웅성 불임성 식물을 웅성 가임성 계통으로부터 얻은, 수분과 교배시키는 단계(여기서, 수분은 DNA결합 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 이 DNA 서열의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 게놈 내에 삽입시킨 수분이고, 상기 단백질은 웅성 불임성 식물의 재조합 DNA의 작동 유전자에 결합할 수 있는 단백질이다), 그리고 (d) 회복된 가임성을 가진 잡종 종자를 경작하는 단계를 포함하는 웅성 불임성 식물로부터 잡종 종자를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 특징의 다른 구체적인 예에 있어서, 유전자 산물은 세포 독소일 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서, 본 발명의 프로모터는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서는, 꽃밥 특이적 프로모터는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 능력을 보여주는 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서, 작동 유전자는 lexA 작동 유전자일 수 있다. 웅성 불임성 식물을 생산하는 방법은 선별 가능 표식 유전자를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 한 가지 관점은 (a) 유전학적으로 형질 전환될 수 있는 화분 생성 식물의 게놈 내에 (i) 식물에서 발현시 화분 생성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA서열과 (ii) 이 DNA서열의 발현을 조절하는 작동 유전자 및 (iii) 상기 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결되며 화분 생성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터로 이루어지는 재조합 DNA 분자를 삽입하는 단계, (b) 웅성 불임성이 상기 DNA 서열의 발현 결과 이루어지는 조건하에서 상기 화분 생성 식물을 성장시키는 단계, (c) 상기 웅성 불임성 식물을 웅성 가임성 계통으로부터 얻은 화분과 교배시키는 단계(여기서, 화분은 DNA결합 단백질을 암호화하는 DNA 서열과 이 DNA서열의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하는 재조합 DNA 분자를 게놈내에 삽입시킨 화분이고, 상기 단백질은 웅성 불임성 식물의 재조합 DNA의 작동 유전자에 결합할 수 있는 단백질이다)를 포함하는 가역적인 웅성 불임성을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 양상의 다른 구체적인 예에 있어서, 유전자 산물은 세포 독소일 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서 본 발명의 프로모터는 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서 꽃밥 특이적 프로모터는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열의 발현을 조절하는 능력을 보여주는 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 구체적인 예에 있어서, 작동 유전자는 lexA 작동 유전자일 수 있다. 하나의 구체적인 예에 있어서 첫째의 재조합 분자 또는 둘째의 재조합 DNA 분자는 선별 가능 유식 유전자를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체적인 예에 있어서, DNA 결합 단백질은 lexA 단백질일 수 있다. 또 다른 구체적인 예에 있어서, 두째의 재조합 DNA 분자의 프로모터는 화분 생성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터이고, 꽃밥 특이적 프로모터일 수 있다. 꽃밥 특이적 프로모터는 DNA 분자가 작동 가능한 재조합 DNA 구조체의 일부일 때 꽃밥 조직에서 DNA서열의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자를 포함할 수 있다. 두째의 재조합 DNA 분자의 프로모터는 유도성 프로모터 또는 구조성 프로모터일 수 도 있으며, 구조성 프로모터는 옥수수 유비키틴 프로모터일 수 있다.

본 발명의 또 다른 특징은 DNA 분자가 조절 가능한 재조합 DNA 구조체의 일부일 때 꽃밥 조직에서 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 분리된 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 형질 전환된 식물 세포, 그리고 그러한 식물 세포로부터 재생된 식물이다. 발현 벡터는 유전자 산물을 암호화하는 프로모터에 연결되어 조절될 수 있는 DNA서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 잡종 종자에 관련되며, 본 발명의 방법에 의해 생산된 불임성 식물을 만든다.

본 발명에 따르면, 식물 생장에 영향을 주기 위한 케스케이드 기작을 만들기 위해 형질 전환 유전 구조체 내에 두 가지 유형의 유전 시스템을 결합시켰다. 첫째 시스템은 유전자 발현, 예를 들어 전사 활성 인자의 발현을 조절하는 조직 특이적 프로모터를 강조한다. 두째 시스템은 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열, 예를 들어 메틸라아제 유전자와 같은 우성 네가티브 유전자를 포함하며, 이들 발현 산물은 화분 생성 및 작용을 방해한다.

본 발명의 특이적 요소는 이들 두가지 시스템의 요소를 모두 포함하는 형질 전환하는 유전 구조체로서, 존재하는 특이적 조절 인자와 유전자에 의존하여 특정 의 표현형을 발생하기 위해 상호 작용할 수 있는 조절 요소와 구조 유전자를 포함한다. 한 가지 교배친 식물 내에서의 이 구조체의 존재에 힘입어, 본 발명의 장점이 생긴다. 예를 들어, 웅성 불임성을 달성하기 위한 1단계 접근법이 이용된다. 예를 들어, 본 발명은 식물에서 가역적인 웅성 불임성을 생성하는 데 있어서 조직 특이적 프로모터, 우성 네가티브 유전자, 그리고 우성 네가티브 유전자를 활성화시킬 수 있는 전사 활성 인자가 들어 있는 DNA의 특정의 신장부(伸張部)를 포함하는 유전 구조체의 이용을 예시해 주고 있다. 따라서, 한 가지 관점에 있어서, 본 발명은 웅성 불임성을 조절하기 위한 새로운 핵의 기초를 제공해준다.

더욱 자세하게는, 본 발명에 적합한 유전 구조체는 우성 네가티브 유전자와, 이 우성 네가티브 유전자의 상류에 위치할 때, DNA 결합 유전자 및 발생시 특이적 시기에 발현을 조절하는 프로모터 관련하여 상기 우성 네가티브 유전자의 발현을 조절하는 DNA의 특정의 신장부를 포함하고 있다.

우성 네가티브 유전자는, 발현시 식물에서 우성 표현형에 영향을 주는 유전자이다. 헤르스코비츠(Herskowitz)(1987)는, 과다하게 발현시 야생형 유전자의 활성을 파괴하는 돌연 변이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 지칭하여 "우성 네가티브"라는 개념을 사용하였다. 야생형 유전자는 돌연 변이가 유도되는 유전자이다. 본 명세서에 있어서 "우성 네가티브 유전자"라는 어구는 그 유전자를 수용하는 숙주 세포의 내인성 유전적 과정을 파괴하고, 하나의 카피(copy)만 존재하여도 효과를 나타내며 또는 유전자 산물의 증산(增産)에 의해, 또는 그 유전자의 다수의 카피의 공동 발현에 의해 그 유전자를 과다 발현함으로써 효과를 나타낼 수 있는 산물을 암호화하는 유전자에 적용된다. 우성 네가티브 유전자류의 예로는 세포 독성 유전자, 메틸라아제 유전자, 그리고 생장 저해 유전자가 있다. 우성 네가티브 유전자는 디프테리아 독소 A-사슬 유전자(Czako and An, 1991), 옥수수에서의 CDC(Colasanti, et al., 1991) WT 유전자(Farmer, et al., 1994) 그리고 P68(Chen, et al., 1991)과 같은 세포 주기 세포 분열 돌연 변이체를 포함한다. 본 발명의 유전 구조체에 있어서 우성 네가티브 유전자의 후보 유전자는 또한 이. 콜리로부터 분리된 DAM-메틸라아제 유전자 등을 예로 들 수 있다. 후보 유전자는 그것이 유도된 공급원에 대해 해로울 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 사실상, 후보 유전자는 그것의 공급원에서 필수적인 작용을 할 수도 있다.

예로든 구체적인 예에 있어서 특이적 식물 조직의 발생을 바꾸기위해 유전적 메틸화를 이용하는 후보 우성 네가티브 유전자는 DAM-메틸라아제 유전자이다. 이 유전자는 화분 형성 또는 작용에 중요한 유전적 부분을 불활성화시켜 웅성 불임성 식물을 만드는 데 이용된다.

특히, 본 발명의 첫째의 유전 구조체의 성분은 하기와 같다.

옥수수 C1 유전자와 같은 전사 활성 인자는 lexA과 같은 세균성 DNA 결합 단백질에 융합된다.(Brent and Ptashne, 1985). "lexA-C1"으로 표기되는 이 유전자 융합체는 5126 프로모터와 같은 꽃밥 특이적 프로모터의 조절하에 놓인다. 유전적 구조체는 5126::lexA-C1과 같이 표기된다.

DAM-메틸라아제 유전자는 lexA 결합 부위(Lex)를 포함하는 최소 35S 프로모터뒤에 놓이며 35S-lexAop::DAM와 같이 표시된다.

35S-lexAop::DAM과 5126::lexA-C1은 같은 플라스미드상의 두 개의 분리된 전사 단위이며, 이 플라스미드는 선별 가능 표식 유전자를 포함하는 것이 좋다.

본 발명의 구조체를 함유하는 형질 전환된 식물은 관련된 식물종이 재생을 허용하는 한, 동일한 구조체로 형질 전환된 배양체로부터 재생될 수 있다.

식물은 본 명세서에서 개시된 방법과 당업자에게 공지된 방법에 의해 형질 전환된 세포 또는 배양체 또는 체외 배양체로부터 재생될 수 있다. 본 명세서에 있어서 "배양체"라는 말에는 배양에 적합한 세포의 응집체, 유합 조직(callus), 또는 이들의 유도체가 함축되어 있다. 식물종에 따라 다양한 방법들이 있다. 종자는 재생된 식물로부터, 또는 당업자에게 공지된 교배법을 이용한 재생된 식물과 동일한 종의 적절한 식물 사이의 교배로부터 얻었다.

전술한 바와 같이, 첫째의 구조체가 식물로 형질 전환되면, 그 결과는 전사가 DAM-메틸라아제 유전자의 꽃밥 특이적 프로모터에 의해서만 조절되는 경우와 비교할 때 증가된 발현으로 나타난다. 증가된 발현은 Lex 작동 유전자에 특이적으로 결합하고 DAM-메틸라아제 유전자의 발현을 조절하여, 웅성 불임성을 생성하는 전사 활성 인자 lexA-C1의 생산에 기인한다. 본 발명의 방법은 특히 돌연 변이시 우성 네가티브 표현형을 부여하는 옥수수 등의 유전자의 발현에 특히 매력적이다. 그러한 유전자에 의해 암호화되는 유전자 산물은 일반적으로 야생형 단백질의 작용을 방해하기 위해서는 높은 발현을 요구하는데, 이러한 유전자의 예로 옥수수 CDC21 유전자가 있다.

이러한 효과를 역전시키기 위해, 첫째의 구조체를 가진 첫 번째 식물을 DNA 결합 단백질 lexA만을 발현하는 lexA 유전자에 융합시킨, 5126 또는 다른 적절한 프로모터를 포함하고 있는 두째의 구조체를 포함하는 두 번째 식물과 교배시키는데, 다른 프로모터에는 5126 결실 돌연 변이 프로모터 또는 구조성 프로모터와 같은 다른 꽃밥 특이적 프로모터가 포함된다. 이 단백질은 특이적으로 LexA 작동 유전자에 결합하지만 유전자 발현을 활성화시키지 않는다. 오히려, 그것은 발현을 억제하여 DAM-메틸라아제 유전자 발현을 중단시키고 첫째 및 두째의 유전 구조체가 모두 있는 식물을 웅성 가임성으로 만든다.

본 발명에 따라서, 이 시스템의 성분을 이용하는 다른 방법은 lexA DNA 결합 부위(즉, lexA 작동 유전자)를 조직 특이적 프로모터 5126 내로 삽입하고 lexA 억제 인자의 발현을 유도성 프로모터에 결합시키는 것이다. 5126 프로모터의 전사로 인하여 발현되는 임의의 유전자는 lexA 발현을 야기하는 화학제를 적용하여 소멸시킨다(억제시킨다). LexA 억제 인자 단백질은 5126 프로모터 내에 위치한 lexAop에 결합하며, DNA의 이 부위에의 결합 결과 리포터(reporter) 유전자의 발현을 소멸시킨다. 만일, 예를 들어, 이 시스템이 DAM-메틸라아제 유전자와 함께 이용될 때, 화학적 유도 물질(inducer)의 적용은 불임성 표현형을 역전시켜 식물을 웅성 가임성으로 만든다.

예컨대, 적절한 유전 구조체는 하기 성분을 함유한다.

1. 5126::lexAop::DAM 메틸라아제

2. [호르몬(옥신, 살리실산), 화학적 독성완화제 등에 의해 유도가능한 프로모터]::lexA

3. 선별 가능 표식, 예를 들어 제초제 또는 항생제 내성을 부여하거나, 또는 아미노산 또는 핵산 영양 요구 변이주의 상보성을 나타내는 것이 있다. 이러한 구조체가 식물에서 형질 전환될 때, 그 결과의 표현형은 화학적 유도물질 부재하에서 웅성 불임성이다. 그러나, 적절한 시기에 유도제를 가하면 웅성 가임성 식물이 되고, 가임성을 회복하기위해 불임성 구조체를 함유한 식물과 억제 인자 구조체를 함유한 식물을 유전적으로 교배시킬 필요성을 제거한다.(미국 특허 출원 제 07/848,465호를 참조할 것). 제초제 내성 유전자의 예는 글루포시네이트(비아로포스) 저항성을 위한 BAR과 PAT를 포함한다.본 발명의 구조체가 제초제 내성 유전자와 같은 선별 가능 표식과 연결될 때, 그 결과 생성되는 구조체는 웅성 불임성 식물을 웅성 가임성 식물로부터 얻은 화분과 교배함으로써 얻은 식물에 제초제를 가함으로써 웅성 가임성 식물을 분리하는 것을 파괴하는 방법을 가능하게 한다. 단지 웅성 불임성 식물만이 생존하게 될 것이다.

식물을 형질 전환하기 위해 이용되는 재조합 DNA 구조체에 있어서, 이 시스템의 성분을 이용하는 또 다른 방법은 조직 특이적 프로모터(예, 꽃밥 특이적 프로모터 5126)에 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있는 작동 유전자(예, lexA 작동유전자)를 삽입하는 것인데, 여기서, 이 조직 특이적 프로모터는 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 생산하는 DNA 서열, 예컨대 DAM-메틸라아제와 같은 우성 네가티브 유전자에 작동 가능하게 연결된 조직 특이적 프로모터이다. 그러한 작동 유전자를 내재시키는 것은 그것을 본 발명의 프로모터의 뉴클레오티드 서열의 상류 또는 하류에 위치시키는 것(당업계에 공지된 방법으로)을 포함한다.

이 효과를 역전시키기 위해, 그러한 구조체로 형질 전환된 식물을, 첫째 구조체의 작동 유전자에 결합할 수 있는 DNA 결합 단백질 lexA를 발현하는 lexA 유전자와 같은 DNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 5126 결실 돌연 변이 프로모터 또는 구조성 프로모터와 같은 다른 꽃밥 특이적 프로모터를 포함하는 5126 또는 다른 적절한 프로모터를 함유하고 있는 두째의 구조체를 갖는 두번째 식물과 교배시킨다. 특히, DNA 결합 단백질은 첫째의 구조체의 작동 유전자에 결합하고 발현을 억제하여, 화분의 작용 또는 형성을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA의 발현을 소멸시키고, 첫째 및 두째의 구조체가 모두 있는 식물을 웅성 가임성으로 만든다.

특정의 구체적인 예에 있어서 두째의 구조체에 의해 생성된 LexA 억제 인자 단백질은 첫째의 구조체의 5126 프로모터 내에 존재하는 lexA 작동 유전자에 결합하며, DNA의 이 부분에의 결합 결과 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자, 예컨대, DAM-메틸라아제와 같은 우성 네가티브 유전자의 발현을 소멸시키며, 형질 전환된 식물을 웅성 가임성으로 만든다.

본 발명의 구조체가 제초제 내성 유전자와 같은 선별 가능한 표식 유전자와 연결될 때, 그 결과 생성되는 구조체는 웅성 불임성 식물과 웅성 가임성 식물의 화분을 교배하여 생성된 식물에 제초제를 가함으로써 분리되는 웅성 가임성 식물을 파괴하는 방법을 가능케 한다. 단지 웅성 불임성 식물만이 생존하게 될 것이다.

본 발명의 다른 구체적인 예에 따르면, 꽃밥 특이적 5126 프로모터와 같은 조직 특이적 프로모터에 연결된 우성 네가티브 유전자로서 메틸라아제 유전자를 가지는 유전적 구조체가 본 발명을 실행하는 데 적합하다. 식물의 발생을 바꾸는 방법은 본 발명의 한 가지 특징을 나타낸다. 그러한 방법은 바람직하게는 다음 단계들을 포함한다.

(a) 메틸라아제 유전자와 적절한 프로모터를 포함하는 유전 구조체로 식물을 형질 전환시키는 단계,

(b) 메틸라아제 유전자가 발현되어, 프로모터의 메틸화에 의해 발생 과정에 필수적인 하나의 유전자 또는 유전자들의 발현을 바꾸는 환경에서 식물을 성장시키는 단계.

웅성 불임성 식물을 생성하기 위해, 프로모터는 단지 특이적 조직에서만, 바람직하게는 융단층, 꽃밥 또는 소포자와 같은 화분 형성 또는 작용에 중요한 조직에서만 유전자 발현을 가능하게 한다. 구조체는 화분 형성 또는 작용을 저해할 수 있는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열로서 메틸라아제 유전자도 역시 포함할 수 있다. 적절한 메틸라아제 유전자는 세균의 DAM(DNA 아데닌 메틸화) 유전자이다. 세균원은 이. 콜리를 포함한다. DAM 유전자류는 뉴클레오티드 서열 GATC에서 아데닌의 N6 위치를 메틸화한다. 상기 구조체는 표적 DNA를 포함하며 표적 DNA에 의한 mRNA합성을 억제하므로 우성 네가티브이다.

조직 특이적 프로모터는 특이적 조직에서 DNA서열, 예를 들어 유전자의 발현을 조절할 수 있는 프로모터이다. 식물에서 가역적인 웅성 불임성을 야기시키려면 화분 구조 및/또는 작용에 직접 또는 간접으로 영향을 주는 조직에서 활성이 있는 프로모터가 특히 바람직하다.

조직 특이적 프로모터에 대한 연구는 본 발명에 있어서 흥미 있는 기능인 꽃밥 발생에 특히 관련된 게놈 영역에 있어서 정상 식물과는 상이한 mRNA로 되도록 정상 식물 mRNA로부터 돌연 변이체를 감(減)한다는, 식물 유전학에 있어서 새로운 개념으로부터 이익을 얻었다. 본 발명에 적합한 구체적인예는 꽃밥 특이적인 프로모터, 예를 들어 5126으로 나타내는 신규한 식물 프로모터의 활성 DNA 서열이다.

메틸라아제 유전자와 적절한 프로모터를 포함하는 유전 구조체의 이용에 의한 웅성 불임성 계통의 생성 방법과 조성을 이하에서 설명한다.

본 발명의 유전 구조체의 식물 핵 게놈에의 삽입을 식물의 웅성 불임성 표현형과 관련시키기 위하여, 식물 DNA의 서던 블랏(Southern blot)을 분석하였다. 이 분석에 의하여, 웅성 불임성은 본 발명의 유전 구조체의 존재와 상관 관계가 있다는 것이 판명되었다.

본 발명의 구체적인 예에 있어서 분리 중인 웅성 가임성 식물을 파괴하여 이들이 들에서 자라지 않도록 하기 위해 구조성 프로모터를 선별 가능한 표식 인자에 연결시키고, 프로모터에 의해 조절되는 메틸화 유전자를 포함하는 유전 구조체를 가진 식물 내에 도입시킨다. 이 시스템은 웅성 가임성 자손 계통 식물을 동일 유형의 웅성 불임성 식물에 교배하는 경우 불임성 자손 계통을 유지하는 데 유용하다. 웅성 불임성 자성 식물로부터 얻어진 종자는 선별제에 대한 내성에 있어서 1:1로 나뉘게 될 것이다. 식물에 선별제를 분무할 수 있는데 그 결과 단지 선별 가능한 유식 유전자를 유지한 식물만이 생존한다. 이들 식물들은 메틸화 구조체로 형질 전환된 것들이다.

또한, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생성된 웅성 불임성 식물과 그러한 식물의 종자에 관련된다.

본 발명에 따르면, 식물 발생에 영향을 주는 캐스케이드 기작을 만들기 위해 형질 전환 유전 구조체 내에서 두 가지 유형의 유전 시스템이 결합시켰다. 첫째 시스템은 유전자 발현, 예를 들어 전사 활성 인자의 발현을 조절하는 조직 특이적 프로모터를 강조한다. 두 번째 시스템은 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열, 예를 들어 메틸라아제 유전자와 같은 우성 네가티브 유전자를 포함하며, 이들 발현 산물은 화분 형성과 작용을 파괴한다.

본 발명의 특이적 요소는 이들 두가지 시스템의 요소를 모두 포함하는 형질 전환하는 유전 구조체로서, 존재하는 특이적 조절인자와 유전자에 의존하여 특정의 표현형을 발생하기 위해 상호 작용할 수 있는 조절 요소와 구조 유전자를 포함한다. 한 가지 교배친 식물 내에서의 이 구조체의 존재에 힘입어, 본 발명의 장점이 생긴다. 예를 들어, 웅성 불임성을 달성하기 위한 1단계 접근법이 이용된다. 예를 들어, 본 발명은 식물에서 가역적인 웅성 불임성을 생성하는 데 있어서 조직 특이적 프로모터, 우성 네가티브 유전자, 그리고 우성 네가티브 유전자를 활성화시킬 수 있는 전사 활성 인자가 들어 있는 DNA의 특정의 신장부를 포함하는 유전 구조체의 이용을 예견해주고 있다. 한 가지 관점에 있어서, 본 발명은 웅성 불임성을 조절하기 위한 새로운 핵의 기초를 제공한다.

더욱 자세하게는, 본 발명에 적합한 유전 구조체는 우성 네가티브 유전자와, 우성 네가티브 유전자의 상류에 위치할 때, DNA 결합 유전자 및 발생시 특이적 시기에 발현을 조절하는 프로모터와 관련하여 우성 네가티브 유전자의 발현을 조절하는 DNA의 특정의 신장부를 포함하고 있다.

우성 네가티브 유전자는, 발현시 식물에서 우성 표현형에 영향을 주는 유전자이다. 헤르스코비츠(Herskowitz, J. 1987)는, 과다하게 발현시 야생형 유전자의 활성을 파괴하는 돌연 변이 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 지칭하여 "우성 네가티브"라는 개념을 사용하였다. 야생형 유전자는 돌연 변이가 유도되는 유전자이다. 본 명세서에 있어서 "우성 네가티브 유전자"라는 어구는 그 유전자를 수용하는 숙주 세포의 내인성 유전적 과정을 파괴하고 하나의 카피만 존재하여도 효과를 나타내며, 또는 유전자 산물의 증산에 의해 또는 그 유전자의 다수의 카피의 공동 발현에 의해 그 유전자를 과다 발현함으로써 효과를 나타낼 수 있는 산물을 암호화하는 유전자에 적용된다. 우성 네가티브 유전자류의 예로는 세포 독성 유전자, 메틸라아제 유전자, 그리고 생장 저해 유전자가 있다. 우성 네가티브 유전자는 디프테리아 독소 A-사슬 유전자(Czako and An, 1991), 옥수수에서의 CDC(Colasanti, et al., 1991) WT 유전자(Farmer, et al., 1994), 그리고 P68(Chen, et al., 1991)과 같은 세포 주기 세포 분열 돌연 변이체를 포함한다. 본 발명의 유전 구조체에서 우성 네가티브 유전자를 위한 후보 유전자는 이. 콜리로부터 분리된 유전자와 같은 DAM-메틸라아제 유전자를 예로 들 수 있다. 후보 유전자는 그것이 유도된 공급원에 대해 해로울 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 사실상, 후보 유전자는 그것의 공급원에서 필수적인 작용을 할 수도 있다.

특히, 본 발명의 첫째의 유전 구조체의 성분은 하기와 같다.

예컨대, 적절한 유전 구조체는 하기 성분을 함유한다.

1. 5126::lexAop::DAM 메틸라아제

본 발명은 전사 활성 인자와, 우성 네가티브 유전자를 활성화시키기 위해 DNA 결합 부위에 작용할 수 있는 유전자, 우성 네가티브 유전자 및 적절한 프로모터를 포함하는 유전 구조체의 이용에 관련되며, 상기 프로모터는 식물 발생에 영향을 주기 위해,예컨대 웅성 불임성을 얻기 위해, DNA 결합 부위에 작용하는 유전자를 조절하는 조직 특이적 프로모터를 포함한다. 형질 전환된 식물에 있어서, 적절한 우성 네가티브 유전자는 세포 독소 유전자, 메틸라아제 유전자, 성장 저해 유전자를 포함한다. 우성 네가티브 유전자는 디프테리아 독소 A-사슬 유전자(Czako and An, 1991), 옥수수에서의 CDC(Colasanti, et al., 1991)와 같은 세포 주기 분열 사이클 돌연 변이, WT 유전자(Farmer, et al., 1994), 그리고 P68(Chen, et al., 1991)을 포함한다. 예시된 구체적인 예에 있어서 그 발현 산물이 식물의 DNA에서 아데닌 잔기의 메틸화를 촉매하는 DAM-메틸라아제 유전자가 이용된다. 메틸화된 아데닌은 세포의 생존력에 영향을 주지 않게 되며, 메틸화 잔기는 식물 DNA에서 내인성으로는 발견되지 않으므로 DAM-메틸라아제가 발현되는 조직에서만 발견되게 된다. DNA 결합을 위한 적절한 시스템은 lexA-C1 시스템이다. 일반적으로, 그 구조체는 외인성이며 적절한 프로모터를 포함한다.

발생을 변화시키는 것은 특히 웅성 불임성 식물을 생성하기 위해 유용하다. 웅성 불임성 식물을 생성하는 방법은 식물 세포를 메틸라아제 단백질을 위한 센스 유전자를 함유하는 재조합 분자(유전 구조체)로 형질 전환시키는 것이다. 적절한 프로모터는 발생 조절을 위한 전략에 따라 선택된다. 예를 들어, 하나의 전략은 꽃밥 특이적 프로모터를 이용하여 꽃밥 조직에서 메틸라아제 유전자를 선택적으로 발현하는 것이다. 웅성 불임성 식물을 생성하기 위해, 형질 전환된 세포는 통상적인 방법에 따라 식물로 재생되게 된다(재료와 방법 참조).

본 발명의 다른 구체적인 예에 있어서, 웅성 불임성 식물은 화분 형성 및/또는 작용에 중요한 세포에서 선택적으로 발현되는 프로모터의 조절하에 메틸라아제 유전자를 위치시킴으로써 생성된다.

본 명세서에서 사용된 "외인성"이란 그 환경에 대해 외래인 몇 가지 항목을 가리키는데, 특히 여기서는 숙주 식물의 정상적인 유전 물질 전체에서 발현되지 않거나 또는 내인성 상태에서보다 더 높은 정도로 발현되는 유전 구조체의 1종에 적용된다.

"적절한 프로모터"란 융단층 세포, 화분 모세포 및 초기 소포자를 포함하는, 화분 형성 또는 작용에 중요한 세포에서 유전자 발현을 조절하는 조직 특이적 또는 세포 특이적 프로모터를 포함한다.

화분 발생 또는 작용에 중요한 세포에 선택적으로 영향을 주도록 된 구체적인 예에 있어서, 융단층 세포와 같은 특정 세포 또는 조직에서 유전자 발현을 조절하는 프로모터는 DNA 결합 단백질을 암호화하는 유전자 또는 메틸화 센스 유전자를 조절하기 위해 이용된다.

본 명세서에서 적절한 프로모터는 융단층 조직에서만 발현에 영향을 주는 조직 특이적 조절 요소이다. 그러한 적절한 프로모터는 전술한 5126 프로모터로, DNA 서열의 발현을 꽃밥 조직에 제한하는 5126 클론으로부터 유도된다. 5126 프로모터는 도 1에 나타난 것처럼, 5126을 위한 게놈성 클론의 암호화 부위의 상류 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 꽃밥 조직에서 DNA 서열의 발현을 조절할 수 있다. 다음의 절 (B)에서 특정한 바와 같이, 5126 프로모터의 결실 돌연 변이는 또한 꽃밥 조직에서의 원하는 선택적 발현을 나타내는 5126 프로모터 뉴클레오티드 서열의 특이적 부위에 더하여 본 발명에서의 이용에 적합하다. 5126 프로모터의 그러한 특정 부위는 특성이 밝혀져 있고 다음의 절 (B)에서 설명된다. 다른 적절한 프로모터는 G9, SGB6, 및 TA39를 포함한다. TA39 프로모터의 분리와 이용의 세부 사항은 본 명세서의 재료와 방법 절에 나타나 있다.

본 발명에 있어서, "식물에서의 웅성 불임성"의 상태는 생존력을 갖춘 화분이 전혀 떨어지지 않는 100% 불임성을 의미한다. 그러한 상태는 화분이 떨어졌는지 여부 그리고 발아 시험과 같은 방법들을 포함하는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 확인될 수 있다.

"꽃밥 특이적 프로모터"는 식물의 일부 또는 모든 기타 조직에서보다 꽃밥 조직에서의 관련된 유전자의 전사가 더 높은 정도로 일어나도록 하는 DNA 서열이다. 바람직하게는, 상기 프로모터는 단지 꽃밥에서의 발현만을 지시한다. 예를 들어, 5126 프로모터는 꽃밥 세포에서 발현된다. 하나의 유전자의 꽃밥 특이적 프로모터는 꽃밥 조직에서 유전자의 발현을 지시하지만, 뿌리와 초엽같은 다른 조직에서의 발현은 지시하지 않는다. 이러한 특이성의 프로모터는 예컨대, 유럽 출원 제93810455.1호에 개시되어있다.

"작동 유전자"(또는 "DNA 결합 부위")는 구조 유전자의 5'말단에 위치하며, 활성화 또는 억제 기능을 가진 DNA 결합 단백질에 의해 인지되고 결합되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 분자이다. 그 동족의 작동 유전자와 억제 단백질의 결합은 구조 유전자의 전사의 저해로 귀결된다. 예를 들어, lexA 유전자는 lexA 작동 유전자에 결합하는 억제 단백질을 암호화한다.

"분리된 DNA 분자"는 유기체의 게놈성 DNA에 혼입되지 않는 DNA 절편이다. 분리된 DNA 분자는 화학적으로 합성될 수도 있다.

"발현"이라는 개념은 유전자 산물의 생화학적 합성을 의미한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우, 발현은 구조 유전자의 mRNA로의 전사와 mRNA의 1 또는 2 이상의 폴리펩티드로의 번역에 관련된다.

"클로닝 벡터"는 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 능력을 가진, 플라스미드, 코스미드, 또는 박테리오파아지와 같은 DNA 분자이다. 클로닝 벡터는 일반적으로 하나 또는 소수의 제한 효소 인지 부위를 가지고 있는데, 이러한 제한 효소 인지 부위에는 외래 DNA 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 소실 없이 결정할 수 있는 방법으로 도입될 수 있으며, 또한 벡터는 클로닝 벡터로 형질 전환된 세포의 동정과 선별에 이용하기에 적합한 표식 유전자를 포함한다. 표식 유전자는 일반적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.

"발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 일반적으로, 유전자 발현은 구조성 또는 유도성 프로모터, 조직 특이적 조절 요소, 및 인핸서(enhancer)를 포함하는 일부 조절 요소의 조절하에 놓여진다. 그러한 유전자는 조절 요소에 "작동 가능하게 연결된(operably linked to)"이라고 얘기한다.

하기 실시예는 본 발명의 특이적이고 바람직한 구체적인 예의 대표로 설명된다. 이들 실시예는 어떤 방식으로든지 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 발명의 정신과 범위 내에 존재하는 한 다수의 변형 및 수정을 행할 수 있다.

실시예 1. 5126 프로모터의 분리와 동정

(A) 방법

꽃밥 특이적 프로모터의 분리에 사용된 방법들은 옥수수에 대해서는 신규한 것이었다. 유전자 분리의 추출법은, 성장시 적절한 꽃밥 특이적 유전자가 발현되는 시기가 결정된 후에야 유용하여, 성장이 시작되며 전과 후에 적절한 유전자를 분리하기 위해 mRNA를 모을 수 있다.

웅성 가임성 옥수수로부터의 꽃밥과 웅성 불임성 옥수수로부터의 꽃밥 성장의 광범위한 비교는 소포자 퇴화 직전의 꽃밥 mRNA 추출이 독특한, 꽃밥 특이적 mRNA를 생산한다는 것을 암시하는 것이었다. 제안했다. 총RNA는 소포자가 분해되기 직전에 웅성 불임성 식물로부터의 꽃밥으로부터 분리시켰다. 우성 웅성 불임성 돌연 변이 Ms44에 있어서, 이것은 소포자 형성의 4 단계 근처의 꽃밥의 수집을 의미하였다. 가임성의 동기 식물로부터의 꽃밥 역시 이 단계에서 수집하였다. 웅성 가임성과 웅성 불임성 식물을 mRNA의 공급원으로 수집하였다.

(1)RNA 분리:당업자에게 공지된 구아니딘 이소티오시아네이트법으로 수행하였다.

(2)mRNA 분리:인비트로겐(Invitrogen)에 의한 올리고 dT 칼럼을 이용해 수행하였다.

(3)cDNA 라이브러리(library) 형성: 우성 웅성 불임성 돌연 변이(Ms 44)와 그것의 웅성 가임성 동기(ms 44)의 옥수수 줄기 수염(tassel) mRNA(일리노이 대학의 옥수수 줄기 센터로부터 구득함)로부터 만들었다. 라이브러리는 pCDNAII 벡터로 양방향 클로닝과 BstXI 위치에서의 클로닝을 이용한 인비트로겐에 의해 만들었다.

(4)추출: 추출은 드라이버(driver)로써 웅성 불임성 우성 라이브러리로부터 얻은 표지를 붙인 cDNA를 이용하고, 시험자(tester)로서 무표지의 웅성 가임성 라이브러리를 이용하여, 인비트로겐 2.3판의 "추출기 I(the subtractor I)" 교재에 설명된 대로 수행하였다. 이 신규의 라이브러리를 #5로 표지하였으며, 독특한 웅성 가임성 cDNA를 함유할 것으로 생각되었다.

(5)독특한 클론: 클론을 라이브러리 #5로부터 임의로 분리하여 삽입체를 겔 정제하고, P32로 표지하여 니트로셀룰로오즈에 슬롯 블라팅(slot blotting)하였다. 중복되는 클론은 교차 혼성화(cross hybridization)에 의해 회피하였다. 5126은 추출된 라이브러리 #5로부터 선발된 하나의 클론이었다. 클론의 꽃밥 특이성을 보장하기 위해 비(非)수염 cDNA로 클론을 혼성화하였다.

(6)총 길이 cDNA 분리: 총길이 5126 cDNA를 얻기 위해 부분 5126 cDNA 클론을 분리하고 m13 프라이머 5'TGTAAAACGACGGCCAGT3'(M13 UP)(서열 번호:2)와 m13 역방향 프라이머 5'CAGGAAACAGCTATGACC3' (M13 RP)를 이용해 서열을 밝혀냈었다. 이 부분 5126 cDNA 클론에는 27 뉴클레오티드의 폴리 A+ 말단을 포함하는 594 염기의 삽입체가 포함된다. 총RNA와 mRNA를 라이브러리 형성을 위해 분리하였다. cDNA 라이브러리를 Uni-Zap XR 디렉셔날 클로닝 시스템(directional cloning system)(EcoR I에서 Xho I)을 이용하여 스트라타진(Stratagene)에 의해 만들었다. 부분 5126 cDNA로부터 얻은 EagI 절편으로 1 x 10⁶PFU를 스크리닝하여 총길이 5126 cDNA를 얻었다. ER1647(NEB)을 숙주 세균으로 이용하였다. 10개의 양성 클론을 동질성을 얻을 때까지 정제하였다. Uni-Zap XR 벡터로부터의 pBluescript SK(-)파지미드(phagemid)의 생체내 절단에 의해 플라스미드를 만들었다(스트라타진 람다(Lambda) Zap 사용 설명서, 14 페이지). 클론 p5126-5에 대한 서열 결정은 미국 생화학 회사(United States Biochemical Company)에 의해 이루어졌다. 서열은 도 18에 나타나 있다. 2가닥을 모두 완전히 서열 결정을 하였으며, 이 서열은 부분 cDNA의 서열과 일치하였다. 약 1.5 Kb의 전사 길이를 나타내는 부분 cDNA를 노던 블롯(Northern blot) 처리하였다. p5126-5는 길이가 1.485 Kb이며, 이것은 그 플라스미드가 전체 또는 거의 전체 길이의 cDNA를 나타냄을 보여준다.

(7)게놈 분리: 게놈성 라이브러리를 Sau3A1으로 부분 절단하여 λ DASH II(스트라타진)의 BamHI 부위에 복제된 옥수수 자손 계통 B73 DNA로부터 만들었다. 부분 5126 cDNA로부터 얻은 EagI 절편으로 1 x 10⁶PFU를 스크리닝하였다. ER1647(NEB)를 숙주 세균으로 이용하였다. 3회의 스크리닝 후 동질성을 가진 3개의 클론을 분리하였다. 이들 λ 클론으로부터의 DNA를 벨로미(Bellomy)와 레코드(Record)에 의해 보고된 방법(1989)을 이용해 분리하고, 제한 효소에 의한 절단 부위를 결정하였다. 3개의 클론 모두 동일하였으며, 대략 18Kb 정도이었다.

(B)프로모터 5126의 특성분석

(1) 노던 분석 :

부분 5126 cDNA로부터 유래된 EagI 절편을 이용하여, 퇴색한 잎, 뿌리, 그리고 6일된 묘목의 푸른 잎, 감수 분열 단계의 꽃밥을 가진 옥수수 수염, 사분을 거친 단핵 소포자 단계의 꽃밥을 가진 옥수수 수염 및 옥수수 열매 새싹의 옥수수 폴리A⁺mRNA를 함유하는 노던 막(Nothern membrane)을 조사(paobe)하였다. EagI 절편을 아머샴(Amersham)의 인핸스드 케미루미네슨스(Enhanced Chemiluminescence)(ECL)시스템을 이용하여 고추냉이 과산화 효소로 표지하였다. 프로브의 혼성화와 막 세척은 ECL시스템의 제조자 설명서를 따랐다. cDNA 프로브는 사분을 거친 단핵 소포자 단계 꽃밥을 가진 옥수수 수염의 mRNA에만 존재하는, 대략 1.6 Kb의 전사물에 혼성화시켰다.

(2)서열 분석:

5126 cDNA 프로브에 혼성화한, 람다 DASHII 내의 3개의 게놈성 클론들을 분리하였다. 이들 클론은 5125.4, 5126.5, 5126.8이다.

게놈성 클론 중의 하나인 5126.8로부터 대략 5 Kb의 HindIII 절편을 분리하고, 벡터 블루스크립트(Bluescript)II KS+(스트라타진)의 HindIII 부위에 서브클론(subclone)하였다. 2가지 다른 방향으로 삽입된 HindIII 절편을 함유하는 2개의 플라스미드인 DP4769와 DP4770가 생성되었다. 이들 플라스미드 DP4769와 DP4770을 m13 유니버셜(universal) 프라이머, m13 리버스(reverse) 프라이머를 이용하여, 그리고 올리고뉴클레오티드 5'CCTTCATCAGCTTCTGGCAG 3'(D0776)(서열 번호: 4)로 단일 가닥의 서열을 부분적으로 결정하였다. D0776의 서열은 5126 cDNA 삽입물의 5' 부위의 서열로부터 얻었다. DP4770의 이중 가닥 서열은 하기 올리고뉴클레오티드(각각, 서열 번호 5-8), 5'AGATCTCGGCCAGGCCCTTG3'(D0990), 5'GAGTTGATGAAGTGA3' (CWG4770), 5'GAGATCAATCAGCTAGAGG3'(PG2-2), 및 5'TAAACCTAAGGCC3'(PG2-3)으로 "프라이머 워킹(primer walking)하여 얻었다. HindIII 부위로부터 D0990 서열에 바로 이웃한 부분까지의 DP4770의 서열은 1594 염기이다.

대략 길이가 6 Kb인 SacI 절편을 게놈 클론 5126.8로부터 분리하여 벡터 블루스크립트II KS+(스트라타진)의 SacI 부위로 삽입시켰다. 2개의 플라스미드인 DP5053과 DP5054를 2 가지 다른 방향으로 삽입된 SacI 절편으로 생성하였다. SacI 절편은 DP4769와 DP4770용으로 이용된 HindIII 절편과 1207 염기쌍이 겹친다. 이 겹치는 부위는 5126의 cDNA 삽입물에 대해 상동성을 가지는 DP4769와 DP4770의 영역의 5'이다. DP5053의 2106 염기의 서열은 DP 4770의 서열을 결정하기 위해 이용된 것과 같은 올리고뉴클레오티드로, 그리고 또한 올리고뉴클레오티드 5'AATAGCCTAATTTATTAG3'(PG2-4), 올리고뉴클레오티드 5'ACATGTTTCAAGTTCAA3'(PG2-5) 올리고뉴클레오티드 5'CTTGTCAGAAGTTGTC3'(PG2-5C) 및 5'CAACCATTACCGATGAA3' (PG2-6C)(각각 서열 번호: 9-12)로 프라이머 워킹하여 얻었다.

5126 유전자의 추가의 암호화 서열을 얻기 위해 5'RACE를 이용하였다. 옥수수 수염의 폴리A RNA로 프라이머 신장을 위해, DP4770의 서열로부터 유래된 올리고뉴클레오티드 5'ACGAGCGGACGCACGACAG3'(DO1168)(서열 번호: 13)으로 5'RACE 시스템(Gibco BRL)을 이용하여 5'RACE 프라이머 신장을 수행하였다. 또한, DP4770 서열(서열 번호: 14)로부터 얻어진 네스티드 프라이머(nested primer) 5'TCCGTCGCCATCTGCGTCAC3', 그리고 부착 프라이머(anchor primer) 5'CACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG3'(서열 번호: 15)(DO805)(5'RACE 시스템에 포함된 부착 프라이머로부터 변형됨)를 TaqI DNA 중합 효소(Perkin Elmer)를 이용한 PCR 증폭을 위해 이용하였다. 5'RACE 산물을 pT7Blue(R) 벡터(Novagen에서 구입)에 서브클론했다. PCR 산물을 포함한 클론을 CGR3B로 명명하였다. 이 플라스미드를 DO805, DO1398 및 m13 유니버셜 프라이머를 이용하여 서열을 결정하였다. 5'RACE PCR 삽입물은 412 염기 길이이었다. B73 라이브러리의 게놈성 클론과 원래의 클론에 비교할 때, 신규의 A632 라이브러리의 거의 전체 길이의 cDNA 사이에는 다형성이 있다.

CGR3B로부터의 서열은 게놈 서열에 존재하는 123 염기 인트론을 가진 DP4770의 586 염기와 일치한다. 인트론은 잘 보전된 인트론 스플라이스 사이트 모티프(highly conserved intron splice site motifs)(5'GT 와 3'AG)를 함유한다. 나머지 서열과 틀이 맞는 추정되는 시작 코돈이 보여진다. 이 시작 코돈은 합리적인 시작 코돈 모티프(CGATGG)를 가진다. 이 추정된 시작 코돈의 바로 상류에서, CGR3B의 서열은 상대적으로 AT가 풍부한데, 이는 5'-비번역 cDNA 서열의 특징이다. 추정된 시작 코돈의 CGR3B 상류에는 90뉴클레오티드가 있으며, 이는 식물에서 5' 비번역 부위를 위해 합리적인 길이이다. 더욱이, DP4770에서 CGR3B 서열 상동성의 5' 말단은 합리적인 TATA box(TATATA)의 35 염기 하류이다. 5126-5서열은, CGR3B의 서열에 겹치는 데, 여기서 CGR3B는 상류에 추가의 43 염기가 있다.

이 크기는 노던 혼성화로부터 추정되는 대략 1.6Kb의 전사물 크기와 합리적으로 관련된다.

(3)부위-특이적 돌연 변이 유발

올리고뉴클레오티드 5'GCTGCTCACCATGGCAAAGCAAC3'(DO1398)(서열 번호: 16)를 가지고 부위 특이적 돌연 변이 유발(Su 와 El-Gewely, 1988)을 이용하여 DP5053의 상정된 번역 시작 코돈에서 NcoI 부위를 얻어, DP5055를 생성하였다.

(4)리포터 구조체

5126 암호화 부위의 5'인 대략 4Kb의 ScaI-NcoI 절편을 DP5055로부터 분리하고, 벡터, 반딧불 루시퍼라아제 부위 및 프로테나아제 II 유전자(pinII) 비번역 부위를 함유한 DP1672의 SmaI-NcoI 절편과 결합시켜서 리포터 구조체 DP5062를 생성하였다. 폴리클로닝(polycloning) 부위의 HindIII위치로부터 ATG 시작 코돈의 587염기 상류 HindIII 위치까지의 서열을 제거하거나(DP5121), 또는 폴리클로닝 부위의 PstI위치부터 ATG 시작 코돈의 170 염기 상류의 PstI까지의 서열을 제거함으로써(DP5122) DP5062의 5126 프로모터 절편의 5'말단의 결실을 생성했다. 번역 시작 코돈의 855 염기쌍 상류의 SphI 위치, 시작 코돈의 503 염기쌍 상류의 NdeI 위치, 또는 시작 코돈의 216 염기쌍 상류의 K pnI 위치를 이용하여, 프로모터 절편의 5'-말단의 추가의 결실을 얻었다. DO5062를 SphI 또는 NdeI으로 절단하여, T4 DNA 중합 효소로 평활 말단을 형성하고, 그 중합 효소를 불활성화시킨 후 NcoI으로 절단하였다. 그 결과 생성되는 절편을 그 PinII 3' 부위에 융합된 루시퍼라아제 리포터의 벡터를 함유하는 DP1672의 SmaI/NcoI 절편에 클로닝시켰다. 이에 의해 DP5131(SphI 결실)과 DP5130(NdeI 결실)을 얻었다(도 2). (1)프로모터/루시퍼라아제 결합부를 함유하는 KpnI/ClaI 절편, (2)ClaI/AlwNI 루시퍼라아제/PinII-3'/벡터 절편, 그리고 (3) DP5062로부터의 나머지 벡터 조각의 AlwNI/KpnI 절편의 3 조각 결찰에 의해 KpnI 결실(DP5164)을 얻었다.

(5)일시적 분석

도 3은 전체 길이의 5126 프로모터-루시퍼라아제 구조체(DP5062) 또는 프로모터 결실 유도체로 형질 전환될 때, 사분에서 초기 단핵 단계의 꽃밥에서 얻은 루시퍼라아제의 고유 활성도(specific activity)를 나타낸다. 본질적으로, 완전한 활성은 번역 시작 코돈의 503bp 상류의 NdeI 위치까지의 결실에서 관찰되지만, 시작 코돈의 216bp 상류의 KpnI 위치까지의 결실에서는 거의 모든 활성이 소실된다. 시작 코돈의 170bp 상류의 PstI 위치까지의 결실에서는 활성이 전혀 남아있지 않다. 따라서, 중요한 요소는 번역 시작 코돈의 170 과 503 bp 상류 사이에 존재할 가능성이 높다.

도 4는 양성 및 조직 특이적 대조군( "구성적" CaMV 35S 프로모터에 의해 작동되는 루시퍼라아제 리포터 유전자를 함유한 DP1528, 그리고 꽃밥 특이적 프로모터 SGB6에 의해 작동되는 루시퍼라아제 레포터를 함유한 DP2516)과 비교하여 원래의 5126 프로모터 절편 리포터 구조체(DP5062)와 두 개의 중요한 결실물(DP5130과 DP5164)의 꽃밥, 초엽, 뿌리 및 배발생 현탁 배양 세포에서 얻어진 루시퍼라아제 비활성도를 보여준다. 전체 길이의 프로모터 절편에 대해 관찰되는 조직 특이성은 NdeI 결실에서 유지되었다.

도 5는 5126(-503)프로모터의 꽃밥 활성의 시기를 보여준다. 이 결실 프로모터는 활성이 중기 단핵 소포자 단계를 거쳐 감수 분열 단계까지 존재하지만, 초기 단핵 소포자 단계에서 가장 활발하다.

실시예 2. DAM-메틸라아제 플라스미드의 형성

DAM-메틸라아제 유전자를 이. 콜리로부터 얻었다. 임의의 식물로부터 유래된 메틸라아제 유전자도 또한 적합하다.

DAM-메틸라아제 유전자(Brooks, et al., 1983으로부터의 뉴클레오티드 195-1132)를 부위 특이적 돌연 변이 유발(Su and ElGewley, 1988)에 의해 변형시키고, SmaI 위치를 시작 코돈 ATG에 대해 9 뉴클레오티드 5'인 뉴클레오티드 186에 삽입하였다. DP5814(도 6)는 꽃밥 특이적 DAM-메틸라아제 유전자를 구조적으로 발현하는 BAR 유전자에 대해 시스 위치로(in cis) 함유하는 옥수수 형질 전환에 이용되는 플라스미드이다. 이 플라스미드는 DP5130(도2)의 5126 꽃밥 특이적 프로모터 부위의 NdeI-NcoI 결실을 함유하는 500bp XhoI/NcoI 절편을 전술한 변형된 DAM-메틸라아제 서열을 함유하는 1.0Kb SmaI/BamHI 절편에 연결시켜 형성하였다. XhoI/NcoI 5126 프로모터 절편에 함유된 NcoI 위치는 클로닝을 위한 평활 말단을 생성하기 위해 확립된 방법(Sambrook et al., 1989)에 따라 T4 DNA 중합 효소(Boeringer-Mannheim)를 이용하여 dNTP들로 채웠다. 프로모터/유전자 결합은 하기 서열에 의해 암호화되는 3 N-말단 잔기의 첨가로 귀결되었다 (천연의 DAM-메틸라아제 유전자의 시작 메티오닌은 밑줄로 표시되며 Brooks et al.,1083에서 뉴클레오티드 195-197에 상응한다).

5'CCATGGGGACAATG 3'(서열 번호: 17)

DAM-메틸라아제 발현은 감자 단백질 분해 효소 저해제 II 유전자로부터의 3' PinII 서열(An et al., 1989로부터 뉴클레오티드 2-310)을 함유하는 320bp BamHI-NotI 절편을 결찰함으로써 종결된다. 1.6Kb XhoI-NotI DNA 절편에 함유된 이 혼성 유전자를 증진된 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(뉴클레오티드 -421 내지 +2, 세로로 일렬로 -421 내지 -90을 반복, Gardner et al., 1981), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 리더(79 염기쌍 HindIII-SalI 절편, Gallie dt al., 1987), 옥수수 알콜 탈수소효소 유전자의 Adh-S 대립 유전자로부터의 인트론 1을 함유하는 579 염기쌍 절편(Dennis et al, 1984), 효소 포스피노트리신 아세틸-트랜스퍼라아제를 암호화하는 BAR 유전자(톰슨 등, 1987로부터의 뉴클레오티드 160-704, 여기에서 뉴클레오티드 160은 메티오닌 시작 코돈을 형성하기 위해 G를 A로 바꾸었다), 그리고 감자 단백질 분해 효소 저해제 II 유전자로부터의 종결 서열(An et al., 1989으로부터의 뉴클레오티드 2-310)을 pBluescript(스트라타진) 골격에 함유하는 외떡잎 식물 발현 플라스미드의 XhoI-NotI 절단 위치에 클론시켰다.

실시예 3. 웅성 불임성 식물의 생성

DP5814로 식물을 형질 전환시켰다. DP5814는 이. 콜리 DAM-메틸라아제 유전자에 융합된 5126 프로모터의 NdeI 결실 유도체와 PINII 전사 종결 인자를 함유한다. 이 플라스미드는 또한 BAR 유전자에 융합된 이중 355 꽃 양배추 모자이크 바이러스 프로모터를 함유한다(톰슨 등, 1987).

구조체 PHP6522(도 13)은 DAM-메틸라아제 유전자의 암호화 서열이 아미노산 1부터 202까지의 lexA 암호화 부분으로 대체되었다는 것을 제외하고는 DP5814에 대해 설명된 바와 같다(골레미스, 1992).

구조체 PHP6555(도 14)는, 5126 프로모터가 옥수수 유비키틴 프로모터와 1.9Kb PstI DNA 절편에 함유된 인트론에 의해 대체되는 것을 제외하고는 PHP6522에 대해 설명된 바와 같다.

DP5814를 비아로포스 내성 식물이 재생되는 Hi 유형 II(B 73 x A188) 유합 조직 세포계 내에 가하였다(암스트롱 1991). 웅성 불임성을 위한 대조군으로 이용하기 위해, 형질 전환되지 않은 식물을 또한 생성시켰다. 형질 전환된 유합 조직과 대조군 유합 조직을 PCR로 분석하였다.

메틸라아제 유전자 구조체를 포함하는 형질 전환된 식물은 관련되는 식물종과 이용되는 배양 유형이 재생을 허용하는 한, 동일 구조체로 형질 전환된 배양체로부터 재생될 수 있다. 본 명세서에서 "배양체"는 세포, 유합 조직, 또는 배양에 적합한 그들의 유도체의 응집체를 의미한다.

식물은 당업자에게 공지되고, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 형질 전환시킨 세포 또는 배양체, 또는 체외 배양체로부터 재생된다. 종자는 재생된 식물로부터 또는 당업자에게 공지된 교배 방법을 이용하여 재생된 식물과 같은 종의 적절한 식물사이의 교배로부터 얻는다.

실시예 4. 옥수수 식물의 가임성에 대한 5126::DAM-메틸라아제의 효과

DP5814 구조체로 형질 전환된 재생된 옥수수 식물을 DAM-메틸라아제 암호화 부위의 존재 여부에 대하여 PCR로 분석하고, 이들이 가임성 화분을 생성하는 능력을 평가하였다.

당업자에게 공지된 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 이. 콜리 DAM-메틸라아제 유전자의 존재를 결정하기 위해 이용하였다. 이용된 올리고 뉴클레오티드는 DO1266과 DO1267이었다.

올리고뉴클레오티드의 서열은 다음과 같다.

DO1266(서열 번호: 18) :

5'-ATG AAG AAA AAT CGC GCT TTT TTG AAG TGG GC-3'

DO1267(서열 번호: 19) :

5'-TCA CCC AGG CGG GCA AAA TCA GCC GAC A-3'

이들 올리고뉴클레오티드는 이. 콜리 DAM-메틸라아제 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위해 PCR에서 프라이머로 이용되었다.

DAM-메틸라아제 유전자에 대해 PCR 양성인 25개의 독립적인 일차 형질 전환 옥수수 식물을 분석하였다. 이들 DAM-메틸라아제 PCR 양성 식물 중 22개가 웅성 불임성이었다. 이들 식물에 행해진 서던 블럿은 한 개 내지 여러 개의 카피 삽입의 존재를 감지했다. PCR 음성 또는 형질 전환되지 않은 식물과 비교된 이들 웅성-불임성 식물에서 화분 발생의 현미경 검토에 의하여 감수 분열 전과 감수 분열시의 소포자가 모든 식물에서 관찰될 수 있음이 밝혀졌으나, 사분 소포자는 DAM-메틸라아제 유전자에 대해 PCR 양성이고 웅성 불임성인 식물로부터 유래된 어느 꽃밥에서도 관찰되지 않았다. 이러한 소포자 발생의 파괴는 루시퍼라아제 활성이 5126NdeI 결실 프로모터의 조절하에 발현될 때 유사한 발생 단계에서 먼저 감지될 수 있다는 관찰과 일치하며, 이는 초기 소포자 발생 동안 DAM-메틸라아제 유전자의 발현이 정상적인 화분 형성을 방해한다는 것을 암시한다.

웅성 불임성 옥수수 식물은 형질 전환되지 않은 옥수수 식물로부터 유래된 화분으로 수분하여, 종자를 발아시키고, 메틸라아제 유전자와 웅성 불임성의 존재의 상관성을 확립하기 위해 제초제 내성 웅성 불임성 식물의 35S:Bar-5126:DAM-메틸라아제 구조체의 존재와의 공분리(cosegregation)에 대해 분석하였다. 13개의 독립적인 웅성 불임성 T0 이벤트(events)로부터 유래된 T1 집단의 서던 분석은 모든 웅성 불임성 비아로포스 내성 식물이 이. 콜리 DAM-메틸라아제와 BAR 유전자를 함유하며, 반면 웅성 가임성, 비아로포스 민감성 분리자는 이들 유전자를 함유하지 않음이 밝혀졌다.

T0 식물에서 행해진 관찰에 유사하게, 소포자 발생 파괴는 감수 열 I과 사분 단계 사이에서 일어났다.

실시예 5. 식물에서 웅성 불임성 표현형과 메틸화할 수 있는 유전 구조체의 삽입의 관련성을 위한 서던 블랏

CTAB 추출 완충 용액((100mM Tris pH7.5), 1% 헥사데실 트리메틸-암모늄 브로마이드(Hexadecyl trimethyl-Ammonium bromide), 0.7M 염화나트륨, 10mM EDTA 9ml를 300㎎의 동결건조된 잎 조직에 첨가하여 와동시키고 65℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 클로로포름/옥탄올(24:1) 용액 5ml을 첨가하고 5분 동안 섞었다. 추출액을 2500 rpm에서 30분 동안 회전시켰다. 위층을 제거하여 새 튜브에 넣고, CTAB 침전 완충 용액(CTAB 추출 완충 용액에서 염화나트륨을 뺀 것) 11ml을 첨가하고, 거꾸로 하여 30분 동안 방치하였다. 시료를 2000 rpm에서 10분 동안 회전시켰다. 침전물을 재현탁하기 위해, 100mM Tris (pH 7.5), 10mM EDTA, 0.7M NaCl 2ml을 첨가하고 60℃에서 15분 동안 가열하였다. RNAse A(10㎎/ml) 10㎕를 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 차가운 100% 에탄올 5ml을 튜브에 첨가하여 부드럽게 혼합하고, DNA를 굽은 9 인치 파스퇴르 피펫을 이용하여 감아올려, 76% 에탄올, 0.2M 아세트산나트륨이 함유된 튜브에 넣고, 20분 동안 방치했다. DNA를 76% 에탄올, 0.2M 암모늄 아세테이트가 함유된 새 튜브로 옮겨 1분 동안 방치한 후, 건조시키고 TE(10mM Tris [pH 7.5], 1mM EDTA) 300㎕에 재현탁하였다. 제한 효소로 절단한 게놈 DNA 5㎍을 트리스-아세테이트 완충 용액이 함유된 0.8% 아가로즈 겔에서 전기 영동시켰다; 겔을 0.25M HCl 500ml 중에서 20분, 0.4M NaOH, 0.6M NaCl 500ml 중에서 40분, 0.5M Tris(pH 7.5), 1.5M NaCl 중에서 30분 동안 배양함으로써 막으로 옮길 준비를 하였다. 이동은 pH 6.5의 25mM 인산나트륨 완충 용액 이용하여 아머샴 나일론 에프피 막(Amersham Nylon FP membrane)에서 수행하였다. 이동 후, 막을 진공하에서 80℃에서 구웠다. 사용하기 전에, 막은 0.1X SCP(1X SCP; 0.1M 염화나트륨, 16mM 인산나트륨, pH 7.0)와 0.1% SDS가 함유된 용액 내에서 65℃로 30분 동안 배양하였다. P32-dCTP로 표지된 DNA 프로브를 아머샴에 의해 제공되는 랜덤 프라이머-라벨링 키트(random primer-labelling kit)를 사용하여 제조자 설명서에 따라 생성하였다. DAM-메틸라아제 특이적 프로브를 생성하기 위해, 635bp BamHI DNA 절편을 DP5814로부터 분리하여 표지하였다. BAR 특이적 프로브를 생성하기 위해, 560bp NcoI-BamHI DNA 절편을 DP5814로부터 분리하여 표지하였다. 표지된 프로브를 95℃에서 10분 동안 변성시키고, 혼성화 완충 용액(0.1X 덱스트란 설페이트를 함유한 0.1XSCP) 20ml 내의 막에 첨가하고 65℃에서 밤새 배양하였다. 막을 0.1% SDS가 함유된 0.1 X SCP로 65℃에서 3회 세척하였다. 막을 스크린이 있는 X선 필름(Dupont)에 -70℃에서 노출시켰다.

실시예 6. 일시적인 분석 플라스미드의 형성

LexA202 유전자(골레미스와 브렌트,1992에서 pEG202의 뉴클레오티드 734-1406)를 함유한 HindIII/XhoI 절편을 pBluescriptSK+(스트라타진)로 클로닝하여 플라스미드 L87을 생성하였다. 올리고 DO2326(서열 번호: 20)의 5'CCGTTAACGCTTTCATGACGCCCGGAATTAAGC 3'를 이용한 이 플라스미드의 부위 특이적 돌연 변이 유발(Su and El Gewley, 1988)은 LexA-202 리딩프레임(reading frame)의 시작 ATG(뉴클레오티드754, Golemis 및 Brent, 1992)에 BspHI 위치를 삽입시켜 플라스미드 L87BspHI(도 7)를 생성하였다. L87BspHI의 BspHI/EcoRI 절편의 1-202 잔기를 암호화하는 LexA 서열을 함유한 혼성 유전자를, 전술한 옥수수 C1으로부터의 EcoRI/HpaI 절편 잔기 144-273과 일렬로, 증진된 꽃양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터(뉴클레오티드 -421 내지 +2, 세로로 일렬로 -421 내지 -90을 반복, Gardner et al., 1981), 담배 모자이크 바이러스(TMV) 리더(79 염기쌍 HindIII-SalI 절편, Gallie dt al., 1987), 옥수수 알콜 탈수소 효소 유전자의 Adh-S 대립 유전자로부터의 인트론 1을 함유하는 579 염기쌍 절편(데니스 등 1984), 그리고 감자 단백질 분해 효소 저해제 II 유전자로부터의 종결 서열(An et al., 1989로부터의 뉴클레오티드 2-310)을 pBluescript(스트라타진) 골격에 함유하는 외떡잎 식물 발현 벡터에 융합하여 플라스미드 L121(도 8)을 생성하였다.

구조체 DP5817(도 9)은 전술한 증진된 CaMV 프로모터, TMV 리더 Adh 인트론 및 PinII 종결 서열을 함유한다. L87BspHI으로부터의 BspHI/SmaI 절편에 있는 LexA 단백질의 1-202 잔기를 암호화하는 서열(골레미스와 브렌트, 1992에서 pEG202의 뉴클레오티드 754-1382)을 Adh 인트론의 하부에 클로닝하여 L121에서 발견되는 LexA-C1 혼성 유전자를 대체하였다.

리포터 플라스미드, DP6232(도 10)는 하기 뉴클레오티드 서열을 가진 상보성 올리고뉴클레오티드 DO2448과 DO2449에 존재하는 3개의 직렬식으로 반복 배열된 lexA DNA 결합 부위를 함유한다.

DO2448 (서열 번호: 21):

5'GATCTACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACTGCTGTATATAAAACCAGTGGTTATATGTACAGTACGGATG 3'

DO2449 (서열 번호: 22):

3'ACGACATATATTTTGGTCACCAATATACATGTCATGACGACATATATTTTGGTCACCAATATACATGTCATGCCGATG 5'

올리고뉴클레오티드들을 어닐링(annealing)하고 절단형의 CaMV 프로모터(뉴클레오티드 -33 내지 +2; Gardner et al., 1981 참고), TMV 리더, ADH 인트론, 반딧불 루시퍼라아제 유전자의 암호화 부위(+53 내지 +1708, deWet et al., 1987), 그리고 PinII 종결 서열의 상류의 BgIII/NdeI 절편으로 pBluescript 골격에 클로닝 시켰다.

구조체 DP6509(도 11)는 옥수수 식물에서의 발현을 위하여 고안된 3개의 혼성 유전자를 함유하는 플라스미드이다. 또한, 이 플라스미드는 또한, 루시퍼라아제 암호화 서열 대신에 전술한 9bp 첨가를 유지하면서, DAM-메틸라아제 유전자를 가진 DP6232에 대해 전술한 절단형 CaMV 프로모터 상류의 lexA 결합 부위, TMV 리더 그리고 ADH 인트론 및 PinII 종결 서열을 함유한다. 꽃밥 특이적 전사 활성 인자 5126::LexA-C1을 암호화하는 유전자 서열은 전술한 DAM-메틸라아제 리포터 유전자의 바로 하류에 위치한다. 이 유전자는 DP5130으로부터의 5126 프로모터 서열, L121에 대해 전술한 LexA202-C1 혼성체 및 PinII 서열을 가진 XhoI/NcoI 절편을 함유한다. 이 플라스미드에 의해 암호화되는 세 번째 유전자는 증진된 CaMV 프로모터, TMV 리더, Adh 인트론, BAR 암호화 서열 및 DP5814에 대해 전술한 pBluescript 골격상에 PinII 종결 인자를 포함한다. 구조체 PHP6520( 도 15)는 Dam 메틸라아제 유전자와 pinII 종결 인자를 위한 암호화 서열이 디프테리아 독소 암호화 부위와 유전자 7 종결 인자에 의해 대체된 것을 제외하고는 PHP6509에 대해 설명한 바와 동일하다(Czako and An, 1990).

구조체 PHP8036(도 16)은 DP6509에 대해 설명한 것처럼, 최소 -33 CaMV 프로모터 상류의 lexA 결합 부위에 융합된 위치 -503부터 -134까지의 5126 프로모터, TMV 리더, ADH1 인트론, Dam 메틸라아제의 암호화 부위 및 pinII 종결인자를 포함한다. 또한, 이 플라스미드는 또한 선별 가능 표식 구조체 Ubi-Pat를 포함하는데, 이것은 1.9Kb 옥수수 유비키틴 프로모터와 인트론을 스트렙토마이세스 비리도크로마겐스(Streptomyces viridochromagenes)의 변형된 포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자(Pat)와 노팔린 합성 효소 유전자에 융합시킴으로써 만들어졌다(Droge, et al.).

구조체 PHP8037(도 17)은 650bp SalI/BamHI DNA 절편내에 함유된 옥수수 AdhI 인트론이 그 플라스미드의 5126:lexA:Dam 메틸라아제 부분으로부터 제거시켰다는 것을 제외하고는 PHP8036과 동일하다.

실시예 7. lexA-C1, lexA 또는 이들 양쪽의 일시적인 공동 발현시 lexA 결합 부위를 함유한 루시퍼라아제 리포터의 발현

두 가지 의문을 해결하기 위한 실험들을 행하였다. 첫째, 세균성 DNA 결합 단백질 lexA는 식물 세포에서 유전자 발현을 촉진하고 증진시킬 수 있는가? 두째, 전사 활성 인자 lexA-C1과 lexA 단백질의 공동 발현이 활성 인자 매개 유전자 발현의 억제를 일으키는가?

lexA 단백질은 lexA DNA 결합 부위("lexA 작동 유전자")를 함유한 DNA 부위에는 결합하지만, mRNA 합성을 시작하기 위해 필요한 식물 유래 전사 성분을 보급하지 않을 것이다. 그러나, 전사 활성 인자로 작용할 수 있는 단백질 부위를 DNA 결합 단백질에 병치시키는 것은 리포터 유전자의 발현 증가를 가져왔다(Ruden et al., 1991). lexA 유전자가 옥수수 세포에서 리포터 유전자의 발현을 증진시키는 능력을 시험하기 위해, 전사 활성 인자 부위를 암호화하는 옥수수 C1 유전자 부위를 DNA 결합 단백질 lexA에 상응하는 DNA 부위와 틀을 맞추어 융합하여 혼성 유전자, LexA202-C1을 생성하였다. 도 8에 나타난 것처럼 플라스미드 L121을 생성하기 위해 혼성 유전자를 구조성 프로모터 35S의 전사 조절하에 위치시켰다.

이 구조체를 lexA 결합 부위, 플라스미드 DP6232를 함유하는 루시퍼라아제 리포터 유전자 일정량과 함께 다양한 양을 옥수수 배발생(胚發生) 현탁 세포에 가했다. 도 12에 나타난 것처럼, 리포터만으로는 매우 낮은 활성을 낳지만(총 단백질 마이크로그람당 14 광단위량(14lu/㎍)), lexA-C1 전사 활성 인자를 투여당 5ng 이상의 양으로 가할 때에는 높은 루시퍼라아제 활성(>9000 lu/㎍)이 검출된다.

lexA 단백질이 루시퍼라아제의 높은 발현을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 도 9에 나타난 35S:lexA 구조체를 함유한 플라스미드 DP5817을, L121 또는 DP5817의 양을 달리하면서 DP6232와 L121과 함께 가하였다. 도 12에 나타난 것처럼, lexA-C1 구조체와 리포터를 함유하는 처리에 DP5817을 첨가하는 것은 루시퍼라아제 활성을 감소시켰다. 이들 자료는 lexA-C1 융합 단백질이 공동 발현될 때 옥수수 배발생 현탁 세포에서 lexA DNA 결합 부위를 함유한 유전자의 증가된 발현이 검출되고, 이러한 발현은 lexA 단백질에 의해 억제될 수도 있다는 것을 암시하는 것이다.

실시예 8. 웅성-가임성 식물로의 전환

본 발명에 따라서, 웅성 불임성 식물을 웅성 가임성 식물로 전환하는 몇 가지 방법이 있다. 융단층 특이적 프로모터 5126와 같은, 프로모터가 전사 활성 인자 LexA-C1 유전자(5126::LEXA-C1이라 부름)에 융합되고, 이 때 그 유전자의 LexA 부위는 LexA 작동 유전자(LexAop)라고 부르는 DNA 부위에 결합하는 세균성 LexA 단백질을 암호화하고, 그 유전자의 C1 부위는 유전자의 전사 활성을 증진하기 위해 옥수수 전사 장치와 상호 작용하는 옥수수 C1 단백질을 암호화하며, 이 때 전사 활성이 증진되는 유전자는 예를 들어 최소 35S 프로모터와 같은 최소 프로모터 요소 내에 LexAop를 함유하는 것과 같은 캐스케이드 효과가 나타난다.

웅성 불임성 옥수수 식물을 생성하기 위해 DAM-메틸라아제 유전자를 최소의 CAMV 35S 프로모터에 융합된 LexAop의 조절하에 위치시킨다. 5126::LexA-C1 부위와 선별 가능 표지인 35S:BAR 도 동일한 플라스미드에 존재한다(도 11, DP6509). 이구조체의 삽입은 꽃밥에서의 DAM-메틸라아제 유전자의 발현으로 인해 식물을 웅성-불임성으로 만든다. LexA-C1은 5126 프로모터에 의해 조절된다.

웅성 불임성 5126:LexA-C1, LexAop::DAM-메틸라아제 함유 식물의 가임성을 회복시키기 위해, 그러한 식물을 5126 프로모터 또는 LexA DNA 부분에 융합된 다른 적절한 프로모터를 함유하는 식물과 교배시켰다. 5126:LexA를 함유하는 유전 구조체의 존재는 웅성 가임성과 일치한다. LexAop에 결합하지만 DAM-메틸라아제 유전자의 전사를 활성화시키지 않는 단백질을 발현하는 유전자의 존재하에서, DAM-메틸라아제 단백질의 합성은 억제되고 따라서 그 식물은 웅성 가임성이 된다.

형질 전환된 옥수수 식물을 플라스미드 PHP6522, PHP6555 및 PHP6520을 함유하도록 본 명세서에서 설명된 바와 같이 하여 생성시켰다. 웅성 불임성 구조체 PHP6520을 함유하는 형질 전환된 옥수수 식물을 생성한 형질 전환 중에서, 다섯 경우가 T0 세대에서 웅성 불임성 식물이고, 세 경우는 웅성 가임성인 것으로 나타났다. 웅성 불임성의 경우 중 세 경우를 웅성 불임성 표현형과 이그나이트(Ignite) 내성의 공동 분리에 대해 T1 세대에서 분석하였다. 그 결과는 표1에 나타나 있다:

경우	이그나이트 내성웅성 불임성 식물	이그나이트 민감성웅성 가임성 식물
937.59.35.2	17	13
937.63.25.1	2	28
937.59.35.1	1	0

웅성 불임성의 경우인 937.59.35.2와 937.63.25.1을 유비키틴 프로모터(PHP6555) 또는 꽃밥 특이적 프로모터(PHP6522)의 조절하에 lexA 유전자를 함유하는 식물로부터 유래된 화분을 이용하여 교배시켰다. 그 결과, 불임성 구조체(PHP6520)와 억제 인자 구조체(PHP6522 또는 6555)를 모두 함유하는 식물은 웅성 가임성인 반면, 단지 불임성 구조체 PHP6520만을 함유한 식물은 웅성 불임성이라는 것이다.

변형된 5126 프로모터(도 1에 나타나 있는 바와 같이, 1488 위치의 시작 코돈에 대하여 -503 위치부터 -134 위치의 뉴클레오티드 서열)를 함유하는 구조체를 이용하여 형질 전환체를 전술한 바와 같이 생성하였는데, 상기 변형된 5126 프로모터는 최소 CaMV 프로모터 (PHP8036 과 PHP8037)에 병치된 lexA 결합 부위를 가지고 있다. 그러한 구조체의 삽입은 DAM-메틸라아제 유전자의 발현으로 인해 식물을 웅성 불임성으로 만든다. PHP8036 또는 PHP8037을 함유하는 그러한 웅성 불임성 식물을 구조적으로(PHP6555) 또는 조직 특이적으로(PHP6522) lexA 억제 인자를 발현하는 식물에 교배시킨다. 그 결과 불임성 구조체(PHP8036 또는 PHP8037)와 억제 인자 구조체(PHP6522 또는 PHP6555)를 모두 함유하는 식물은 웅성 가임성으로 되고, 단지 불임성 구조체 PHP8036 또는 PHP8037만을 함유하는 식물은 웅성 불임성으로 될 것이라는 것이다.

재료와 방법

추출 프로브(subtraction probe) 과정(인비트로겐으로부터):

추출 cDNA 프로브의 생성을 추출 라이브러리의 생성을 위한 방법과 유사한 방법으로 실행하였다. 그 방법의 도식적 개요를 하기에 나타내었다. 이 과정에서, 표지된 cDNA를 mRNA의 유도된(메세지 +) 풀(pool)로부터 합성하였다. 그 결과 형성된 cDNA-RNA 혼성체를 염기 처리하여 원형 mRNA를 제거하고, 이어서 풀 B(메세지-)로부터의 광바이오티닐화 mRNA 과량에 혼성화시켰다. 형성된 광바이오티닐화 RNA/cDNA 혼성체를 자유 스트렙트아비딘(streptavidin)과 복합체를 형성시키고 선택적 페놀/클로로포름 추출에 의해 혼성화 혼합물로부터 제거하엿다. 추출 라이브러리 과정에서와 같이, 스트렙트아비딘-광바이오티닐화 핵산 복합체를 추출하여 혼성화되지 않은(유도된) cDNA만을 남겼다. 그 결과, 추출된 cDNA 프로브는 혼성화 블롯 내에서 또는 선별 라이브러리용으로 직접 이용될 수 있다.

추출 cDNA 프로브의 이용은 조직 특이적인, 희귀한 전사체에 상응하는 cDNA 클론을 찾을 기회를 증가시킨다. 일반적인 cDNA 프로브에서, 그 표시는 mRNA의 풍부함에 비례한다. 차별적으로 발현되는 유전자에 특이적인 서열을 위한 cDNA 프로브를 풍부하게 함으로써, 프로브는 라이브러리의 선별을 간단하게 만드는 의도된 클론에 대해 더욱 특이적이 된다. 추출 cDNA 라이브러리는 특정한 조직 또는 유도된 세포 상태에 독특한 저빈도 mRNA를 나타내는 cDNA 클론을 찾기 위해 추출된 프로브와 함께 이용될 수 있다. 추출된 cDNA 라이브러리를 추출되지 않은 cDNA 라이브러리 대신 이용할 때의 잇점은 선별되어야 할 클론의 수가 적다는 것이다.

과도(過度) 분석 방법:

옥수수 배발생 현탁 세포 배양체를 미성숙 배로부터 얻어, 설명된 것처럼 액체 현탁액에 유지하고(Bowen, 1992) 매 3일 내지 4일마다 계대 배양하였다. 계대 배양후 2일째에 세포를 모아 충격에 앞서, 0.25M 만니톨을 50㎎/㎖의 농도로 함유하는 배양 배지에서 밤새 처리하였다. 각 충격을 위해, 세포 25㎎을 배양 배지 1㎖로 미리 적신 여과지에 놓았다. 리포터 플라스미드 DNA(DP6232) 3㎍과 다양한 양의 DP5817 및/또는 L121(0.01-3㎍)을 1.8-㎛ 텅스텐 입자 0.75㎎에서 침전시키고, 세포를 제조자(Dupont) 설명서에 따라, PDS1000 헬륨 건(gun)을 이용하여 이 혼합물 1/6로 충격을 가하였다. 24시간 후, 세포를 모아 1.5㎖ 스크류캡 마이크로센트리퓨즈 튜브(screwcap microcentrifuge tube)에 옮기고 모든 나머지 과정 중에 4℃에서 유지하였다. 시료를 0.㎖ GUS 분해 완충 용액(Rao and Flynn, 1990: 모든 계면 활성제를 생략하여 방법을 변형시킴)에서 균질화시키고 원심 분리에 의하여 맑게 하였다. 루시퍼라아제 분석을 루미노미터(luminometer)(Model 2010; Analytical Lumenescene, San Diego, CA)에서 10초의 통합 시간을 이용해 Callis et al., (1987)에 의해 설명된 바와 같이 실행하였다. 단백질 농도는 바이오라드(BioRad) 단백질 분석 키트를 이용해 결정했다. 추출물은 일반적으로 추출당 단백질 0.75-1.5㎍이었다. 루시퍼라아제 비활성도(1μ/㎍)는 추출물 25㎕에서 루시퍼라아제 광단위를 측정하여 계산하고, 그 값은 추출물 ㎕당 상응하는 단백질 농도에 대해 보정하였다. 표 1에 나타난 루시퍼라아제 활성은 각 처리의 세 번의 충격의 평균으로 나타낸다.

소포자 특이적 mRNA에 상동성인 서열을 포함하는 TA39 게놈 클론의 분리; TA39 프로모터

이 실시예는 핵산 프로브가 이용 가능한 소포자 특이적 mRNA에 상동성인 서열을 포함하는 게놈 DNA 클론의 분리 방법을 제공한다. 설명된 접근법은 그러한 이용 가능한 프로브에 상동성인 소포자 특이적 mRNA를 가진 임의의 식물종으로부터 소포자 특이적 조절 서열을 분리하는 데 유용하다.

담배 꽃밥 특이적 cDNA 클론인 TA39를 UCLA의 로버트 골드버그(Robert Goldberg) 박사로부터 얻었다. TA39는 몇 가지 융단층 특이적 전사체에 의하여 알 수 있는 바와 같이 유사한 시간적 방식(temporal pattern)으로 꽃밥으로부터 mRNA에 혼성화시킨다. (Kultunow et al., 1990) 현장(in situ) 혼성화 결과 TA39가 단계 -1 내지 +1의 도중에 소포자와 결합 조직 중에 저농도로 존재하며, 단계 1에서 단계 6까지의 융단층에서는 고농도로 존재한다는 것이 나타났다.(Goldberg et al., 1993).

선택된 식물의 게놈 라이브러리, 예를 들어, MboI에 의하여 부분적으로 대사(代謝)시켜 플라스미드 EMBL-3에 클로닝한,N.tabacum, var.NK326의 DNA 절편의 상업적으로 이용 가능한 라이브러리(Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, California; catalog FL1070D)를 cDNA 클론 TA39에 대해 상동성이 있는 클론 선별하였다. 논문(Sambrook et al., 1989)에 기재된 바와 같은 표준 혼성화 방법을 이용하였다. 일관되게 혼성화하는 플라크(plaque)가 정제되거나, 또는 존재하지 않는 것으로 나타날 때까지, 플라크를 정선하여 재도말하고, TA39 cDNA 삽입물로 재프로브하는 과정을 3회 또는 그 이상 반복함으로써 후보 클론을 정제하였다.

TA39 cDNA 클론에 관련된 게놈성 담배 DNA 클론의 두 가지 구별 가능한 계통군(系統群)이 확인되었는데, 이들은 각각 각 계통군 중 2가지 겹치는 클론에 의해 표시된다. 각 계통군 중 하나의 클론을 자세한 특성 규명을 위하여 선택하여 클론 8B3과 14B1이라고 명명하였다. 이들 게놈성 클론의 각각에서 TA39와 상동성이 있는 부위와, 이들 상동성 부위의 바로 상류 및 하류를 제한 효소 절단 분석과 DNA 혼성화에 의해 지도를 만들었다.

이들 암호화 서열 및 관련된 5' 추정 조절 부위를 서브클론으로서 분리하고, 이어서 추가로 서브클론하여 서열을 결정하였다. 따라서, 스트라타진에 의해 키트 내에 공급되는 exoIII와 녹두 뉴클레아제를 이용하여 각 게놈성 클론의 포개진 결실 세트를 얻었다. 포개진 결실 돌연 변이체를 아이오와 주립대학의 핵산 기관에서 자동화 DNA 서열 분석기(Applied Biosystems 373A)를 이용하여 생거(Sanger)의 디데옥시 사슬 종결법에 의해 서열을 결정하였다. 비교용으로 TA39의 cDNA 삽입물도 역시 서열을 결정하였다. 소포자 특이적 mRNA의 TA39 cDNA와 상동성인 부위 내에서, 게놈 클론 8B3은 TA39와 완전히 상동성이지만, 게놈 클론 14B1의 비교할 수 있는 부분은 TA39와 약 90%의 상동성을 나타낸다.

14B1과 8b3 게놈 클론의 전사 개시 점은 프라이머 신장 실험에 의해 단일 뉴클레오티드인 추정되는 번역 개시 위치의 83 염기 상류에 개한 지도를 작성하였다. 완벽한 TATA 박스가 각 클론에서 지도로 작성된 전사 개시 위치의 31bp 상류에 나타나며, 110 아미노산의 주요 전사 해독 프레임은 양쪽 클론 내의 전사 개시점의 바로 하류이다(즉, 전사 개시 위치에 관하여 "+83"으로 표시되는 위치). 이들 양쪽 클론에는 역시 클론 14B1과 8B3 내에서 각각 번역 정지 코돈의 29bp와 37bp 하류인 폴리아데닐화 인지 위치가 있다.

형질 전환법

쌍떡잎 식물용의 형질 전환법에는 잘 알려져 있는 다수의 상이한 직접 DNA 전달법이 있다. 바람직한 것은 잎 체외 배양체의 입자 바이오리스틱스 충격법(biolistics bombardment)이다. 기타의 방법에는 체외 배양체에 대한 아그로박테리움(Agrobacterium) 전달법, 프로토플라스트의 아그로박테리움 공동 배양법, 일렉트로포레이션법(electroporation), PEG 흡수법 또는 프로토플라스트 내에 대하여 직접 DNA를 전달하는 기타의 방법 등이 있다. 옥수수와 같은 외떡잎 식물에 양호한 방법은 처리된 세포에 충격에 의해 DNA를 전달하는 것이지만, 일렉트로포레이션과 같은 다른 방법도 역시 이용될 수 있다.

식물 세포는 통상적인 방법으로 본 발명의 외래 DNA 서열에 의하여 형질 전환된다. 형질 전환시킬 식물이 아그로박테리움 감염에 민감하다면, 외래 DNA 서열을 함유하는 벡터, 즉 위험 요소가 제거된 Ti-플라스미드를 이용하는 것이 좋다. 형질 전환은 예를 들어 유럽 특허 제0 116 718호와 유럽 특허 제0 270 822호에 기재되어 있는 과정에 의해 수행될 수 있다. 양호한 Ti-플라스미드 벡터는 경계 서열 사이에 위치하는, 또는 적어도 우측 경계 서열의 상류에 위치하는 외래 DNA 서열을 함유한다. 다른 종류의 벡터, 그 중에서도 직접 유전자 전달법(예컨대, 유럽 특허 제0 237 356호, PCT 공개 WO/85/01856 및 유럽 특허 제0 275 069호 참고), 예를 들면, 미국 특허 제4,684,611호에 개시된 생체외 프로토플라스트 형질 전환법; 유럽특허 제0 067 553호 및 미국 특허 기재되어 있는 생체외에 기재되어 있는 식물 바이러스 매개 형질 전환법 및 미국특허 제4,536,475에 기재되어 있는 리포좀 매개 형질 전환법과 같은 과정을 사용하여 식물 세포를 형질 전환하는 데 이용될 수 있다.

형질 전환시킬 식물이 옥수수라면, 논문(Fromme et al., 1990과 Gordon-Kamm et al., 1990)에 의해 어떤 계통의 옥수수에 대하여 설명된 방법과 같은 최근에 개발된 형질 전환법이 적절하다.

형질 전환시킬 식물이 벼라면, 문헌(Shimamoto et al., 1990, Datta et al., 1990, Christou et al., 1991, 및 Lee et al., 1991)에 의해 어떤 계통의 벼에 관하여 설명된 방법과 같은 최근에 개발된 형질 전환법이 이용될 수 있다.

형질 전환될 식물이 밀이라면, 옥수수 또는 벼에 관하여 전술한 방법과 유사한 방법이 이용될 수 있다. 바람직하게는 단자엽 식물, 특히 벼, 옥수수 또는 밀과 같은 곡류의 형질 전환을 위해서는, 바이오리스틱 형질 전환법 또는 일렉트로포레이션법과 같은 직접적인 DNA 전달법이 이용된다. 그러한 직접 전달 방법을 이용할 때, 기본적으로 본 발명의 DNA인 QM 옥수수 유전자와 관련된 조절 부위만이 식물 게놈에 통합되도록, 전달되는 DNA 서열을 최소화시키는 것이 좋다. 이러한 점에서, 본 발명의 DNA 서열이 세균성 숙주에서 만들어지고 플라스미드로 증식될 때, DNA 서열로 식물을 형질 전환시키기에 앞서, 복제 기원, 숙주 유기체의 선별을 위한 항생제 내성 유전자 등과 같은 세균성 숙주 유기체 내에서 증식하는 데 요구되는 플라스미드 서열은 외래 DNA 서열을 함유하는 플라스미드 부분으로부터 분리시키는 것이 좋다.

듀퐁 헬륨 건(Dupont HELIUM GUN)을 위한 텅스텐/DNA 실험 계획(입자 바이오리스틱 충격법에 의한 형질 전환법)

1.8㎛ 텅스텐 60㎎을 무게를 단다: 15㎖ 원심 분리 튜브에 넣는다.

0.1M HNO₃2㎖을 첨가한다: 20분 동안 얼음 위에서 초음파 처리한다.

HNO₃를 제거한다: 살균 증류수 1㎖을 첨가하고 시료를 2㎖ 살스테트(Sarstedt) 튜브에 옮긴다. 잠시 초음파 처리하고 원심 분리하여 입자를 침전시킨다.

H₂O를 제거한다: 100% 에탄올 1㎖을 첨가한다-잠시 초음파 처리하고 원심 분리하여 입자를 침전시킨다.

에탄올을 제거한다: 살균 증류수 1㎖을 첨가한다. 초음파 처리한다.

현탁액 250㎕를 피펫으로 4개의 2㎖ 튜브에 옮긴다.

살균 증류수 750㎕를 각 튜브에 첨가한다.

사용간에 텅스텐 시료를 얼린다.

50㎕ 텅스텐/물 현탁액을 피펫으로 1.5㎖ 튜브에 옮긴다(먼저 초음파 처리한다)

10㎍ DNA를 첨가하여 섞는다.

2.5M CaCl₂50㎕를 첨가하여 섞는다.

0.1M 스퍼미딘(Spermidine) 20㎕를 첨가하여 섞는다.

잠시 초음파 처리한다. 10000 RPM에서 10초동안 원심 분리한다.

상등액을 제거한다. 100% 에탄올 250㎕를 첨가한다. 간단하게 잠시 초음파 처리한다.

10000 RPM에서 10초 동안 원심 분리한다.

상등액을 제거한다. 100% 에탄올 60㎕를 첨가한다.

옥수수의 형질 전환

무른 배발생 타입 II 유합 조직(Armstrong, 1991)은 B73으로 수분시킨 A188 식물로부터 분리한 1-2mm 접합체 배로부터 시작되고, Reigister et al., 1994에서 개시된 바대로 유지되었다. 유합조직을 형질 전환하기에 앞서 4-6개월동안 격주로 배양했다. 형질 전환을 위해, 유합조직을 액체 배양 배지에 현탁하고 710㎛ 여과망을 통해 거르고, 40mg/ml의 밀도로 재현탁했다. 유합조직 세포 200mg을 유리섬유 여과기에 균등하게 분포하고, 1.0㎛ 텅스텐 입자를 금대신 이용하는 것을 제외하고는 Reigister et al., 1994에 개시된 바대로 입자 충격을 위해 이용했다. 형질 전환체 선별과 식물 재생을 Reigister et al.에 개시된 바대로 실행하였다; 하지만, 비아로포스의 농도는 모든 적절한 배양 배지에서 3mg/L로 증가시켰다.

안정한 형질 전환 식물을 회수하기 위한 옥수수 형질 전환의 실험계획

1일째 세포를 액체 배지에 놓고 걸렀다(710㎛). 세포 100-200mg을 3.5cm 면적에 걸친 5.5cm 유리 섬유 여과기에서 모았다. 세포를 배지로 옮기고 밤새 배양했다.

8일째 여과기와 세포를 배지로부터 제거하고, 건조하고 충격을 가했다. 여과기와 세포를 배지에서 뒤집어 놓았다.

5일째 여과기위에 있는 세포를 선별 배지(3 mg 비아로포스)로 옮긴다.

12일째 여과기상의 세포를 새로운 선별 배지로 옮긴다.

19일째 세포를 여과기로부터 모으고 8.6% 저융점 한천을 함유하는 선별 배지 5ml에 분산시켰다. 세포와 배지를 20ml의 겔-라이트(gel-rite) 고화 배지를 함유하는 두 개의 100mm x 15mm 판의 표면에 펴 바른다.

40일째 추정되는 형질 전환체를 판으로부터 취한다.

61일째 판을 새로운 군체에 대해 조사한다.

웅성-불임성 식물을 생성하기 위한 가역적 유전적 체계가 필요하며, 특히 자화수분 식물을 위해 필요하다. 상업적인 판매를 위한 잡종종자의 생성은 크고 중요한 산업이다. 잡종 종자로부터 자란 잡종 식물은 두가지 유전적으로 다른 육종 계열을 교배시키는 잡종 효과로부터 이익을 본다. 잡종 자손의 상업적으로 바람직한 작물학적 형질은 생장력, 수율 및 단일성에서 교배친보다 우수하다. 개방 수분된 변종과 비교하여 잡종 종자 변종의 더 나은 형질은 잡종 종자를 농부들이 경작하기에 더욱 매력적이며 그래서 시장에서 높은 가격에 팔린다.

인용 문헌

An, G., Mitra, A., Choi, H.K., Costa, M.A., An, K., Thornburg, R.W., and Ryan, C.A. (1989). Functional analysis of the 3' control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene. Plant Cell 1:115-122.

Armstrong, C.L., Green C.E., and Phillips, R.L., (1991). Development and availability of germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics Cooperative Newsletter. 65:92.

Bellomy, G. and Record, M. Jr. (1989) Biotechniques 7:1

Brooks, J.E., Blumenthal. R.M., and Gingeras, T.R., (1993). The isolation and characteization of the Escherichia coli DNA adenine methylase (DAM) gene. Nucl Acids Res. 11:837-851.

Bowen, B. (1992). Anthocyanin genes as visual markers in tansformed maize tissues. In GUS Protocols: Using the GUS Gene as a Reporter of Plant Gene Expression, S.R. Gallagher, ed. (New York: Academic Press, Inc.), pp. 163-177.

Brent, R. and Ptashne, M. (1985) A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor, Cell 43; 729-736.

Chen, J.J., Pal, J.K., Petryshyn, R., Kuo, I., Yang, J.M., Throop, M.S., Gehrke, L. and London, I.M. (1991). Eukaryotic translation initiation kinases. PNAs88, 315-319.

Colasanti, J., Tyers, M. and Sundaresan, V., 1991. Isolation and Characterization of cDNA clones encoding a functional P34 cdc2 homologue from Zca mags PNAs88, 3377-3381.

Czako, M. and An, G. (1991) Expression of DNA coding for Diptheria toxin Chain A is toxic to plant cells. Plant Physiol.95687-692.

Dennis, E., Gerlach W., Pryor, A., Bennetzen, J., Inglis, A., Llewellyn, D., Sachs, M., Ferl, R., and Peacock, W. (1994). Molecular characterization of the maize Adhl gene. Nucl. Acids Res. 12:3983-3990.

DeWet, J.R., Wood, K.V., DeLuca, M., Helinski, D.R., and Subramani, S. (1987). Firefly luciferase gene: Structure and expression in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 7:25-737.

Droge, W., Broer, I., and Puhler, A. (1992) Transgenic plants containing the phoshinothricin-N-acetyltransferase gene methbolize the herbicide L-phosphinothricin (glufosinate) differently form untransformed plants. Planta 187:142-151.

Farmer, A.A., Loftus, T.M., Mills, A.A., Sato, K.V., Neill, J., Yang, M., Tron, T., Trumpower, B.L. and Stanbridge, E.G. (1994) Hum. Mol. Genet. 3, 723-728.

Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833.

Gallie, D.R., Sleat, D.E., Watts J.W., Truner P.C., and Wilson, T.M.A. (1987). The 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreing gene transcripts in vitro and in vivo. Nucl. Acids Res. 15:3257-3273.

Gardner, R.C., Howarth, A.J., Hahn, P., Brow-Lue야, M., Shepherd R.J., and Messing, J.C. (1981). Ther complete nucleotide sequence of and infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun sequencing. Nucl. Acids Res. 9:2871-2888.

Goldberg, R.B., Beals, T.P. and Sanders, P.M.., (1993). Anther development: basic principles and practical applications. Plant Cell 5:1217-1229.

Golemis, E.A., and Brent, R.(1992). Fused protein domains inhibits DNA binding by LexA. Mol. & Cell Biol. 12:3006-3014.

Gordon-Kamm et al. (1990) Transformation of maize cells and regeneration of fertile transgenic plants, The Plant Cell 2:603-618.

Herskowitz, J. (1987). Functional inactivation of genes by dominant negative mutations, Nature 329:219-222.

Invitrogen, Subtractor^TMI Subtraction Kit for cDNA probe Generation, Instruction Manual, version 2.3.

Koltunow et al. (1990) "Different temporal and spatial gene expression patterns occur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224.

Register, J.C., Peterson, D.J., Bell, P.J., Bullock, W.P., Evans I.J., Frame, B., Greenland, A.J., Higgs, N.S., Jepson, I., Jiao, S., Lewn며, C.J., Sillick, J.M., and Wilson, H.M. (1994). Structure and function of selectable and non-selectable transgenes in maize after introduction by particle bombardment. Plant Mol. Biol. 25:951-961.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T, (1989). Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press.

Shimamoto et al. (1990) Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts, Nature 338:274.

Su, T. Z., and El-Gewely, M.R., (1988). A multisite-directed mutagenesis procedure using T7 DNA polymerase: Application for reconstructing a mammalian gene. Gene69:81-89.

Goff, S.A., Cone, K.C., and Fromm, M.E., (1991). Identification of functional domains in the maize transcriptional activator C1: Comparison of wild-type and cominant inhibitor proteins. Genes Dev. 5,289-309.

Thompson, C.J., Movva, N.R., Tizard, R., Crameri R., Davies, J.E. Lauwereys, M., and Botterman, J. (1987). Characterization of the herbicideresistance gene bar form Streptomyces hygroscopicus. EMBO J. 6:2519-2523.

EP 0 116 718

EP 0 270 822

EP 0 237 356

EP 0 275 069

EP 0 067 553

WO/85/01856

U.S. Patent No. 4,684,611

U.S. Patent No. 4,407,956

U.S. Patent No. 4,536,475

서열 목록

(1) 일반정보:

(i) 출원인:

(A)명칭: 파이오니어 하이-브레드 인터내셔날, 인코오퍼레이티드

(B)거리명: 400 로쿠스트 스트리트 700 캐피탈 스퀘어

(C)도시명: 데스 모인스

(D)주명: 아이오와

(E)국가명: 미국

(F)우편 번호: 50309

(ii) 발명의 명칭: 형질 전환 식물에 있어서 웅성 불임성을 위한 가역적 핵 유전 시스템

(iii) 서열수: 23

(iv) 서신 주소:

(A) 수신인: 폴레이와 라드너

(B) 거리명: 스윗 500, 엔.더블류., 3000 케이 스트리트

(C) 도시명:워싱턴

(D) 주명: 디.씨.

(E) 국가명: 미국

(F) 우편번호: 20007-5109

(v) 컴퓨터 판독형:

(A) 매체형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 운영체계: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 패턴트인 릴리스 #1.0, 버전 #1.30

(vi) 현출원인 데이터:

(A) 출원번호: 미정

(B) 출원일:

(vii) 우선 출원 데이터:

(A) 출원 번호: US 08/351,899

(B) 출원일: 1994년 12월 8일

(viii) 대리인/회사 정보:

(A) 명칭: 스테판 에이. 벤트

(B) 등록번호: 29,768

(C) 참조/서류 번호: 33229/377/PIHI

(ix) 원거리 통신 정보:

(A) 전화: (202)672-5300

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(i) 서열 특성:

(A) 길이: 17 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 12

[서열 12]

(2) 서열번호 13 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 19 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 13

[서열 13]

(2) 서열번호 14 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 20 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 14

[서열 14]

(2) 서열번호 15 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ix) 서열의 특징:

(A) 특징을 나타내는 기호: misc_ feature

(B) 존재 위치: group(21..22, 26..27, 31..32)

(D) 기타 정보: /주의="N 은 I를 나타냄"

(xi) 서열: 서열번호 15

[서열 15]

(2) 서열번호 16 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 23 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 16

[서열 16]

(2) 서열번호 17 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 14 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 17

[서열 17]

(2) 서열번호 18 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 32 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 18

[서열 18]

(2) 서열번호 19 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 28 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 19

[서열 19]

(2) 서열번호 20 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 33 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 20

[서열 20]

(2) 서열번호 21 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 84 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(xi) 서열: 서열번호 21

[서열 21]

(2) 서열번호 22 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 78 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 게놈 DNA

(iii) 앤티센스: 예

(xi) 서열: 서열번호 22

[서열 22]

(2) 서열번호 23 대한 정보:

(i) 서열 특성:

(A) 길이: 1485 염기쌍

(B) 서열의 형: 핵산

(C) 쇄의 수: 1본쇄

(D) 형태: 직쇄상

(ii) 서열의 종류: 게놈 DNA

(xi) 서열: 서열번호 23

[서열 23]

Claims

(a) (i)식물에서 발현될 때 화분 형성 또는 작용을 저해하는 유전자 산물을 암호화하는 DNA서열,

(ii)그 DNA서열의 발현을 조절하는 작동 유전자, 및

(iii)유전자 산물을 암호화하는 상기 DNA서열에 작동가능하게 연결된, 화분 형성 또는 작용에 중요한 세포에 특이적인 프로모터를 포함하는 첫 번째 재조합 DNA 분자를 유전적으로 형질 전환될 수 있는 화분 생성 식물의 게놈내로 삽입하는 단계;

(b)상기 DNA 서열의 발현의 결과로서 웅성 불임성이 얻어지는 조건하에서 상기 화분-생성 식물을 성장시키는 단계; 및

(c) 웅성 불임성 식물의 재조합 DNA의 작동유전자에 결합할 수 있고 전사의 억제를 일으킬 수 있는 DNA 결합 단백질을 암호화하고 전사의 억제를 일으키는 DNA 서열, 및 상기 DNA 서열의 발현을 조절하는 프로모터를 포함하는 두 번째 재조합 DNA 분자를 게놈속에 삽입시킨 웅성 가임성 계통으로부터 얻은 화분과, 상기 웅성 불임성 식물을 교배시켜서, 웅성 가임성인 하이브리드 식물을 형성하는 단계를 포함하는 식물에서 가역적인 웅성 불임성을 생성하는 방법:.
제1항에 있어서, 상기 첫 번째 재조합 분자의 상기 유전자 산물이 세포독소인 방법.
제1항에 있어서, 상기 첫 번째 재조합 분자의 상기 프로모터가 꽃밥 특이적 프로모터인 방법.
제3항에 있어서, 상기 꽃밥 특이적 프로모터가 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 작동 유전자가 lexA 작동 유전자인 방법.
제1항에 있어서, 상기 첫 번째 재조합 분자 또는 상기 두 번째 재조합 DNA 분자가 선별 가능 표식 유전자를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA-결합 단백질이 lexA 단백질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 두 번째 재조합 DNA 분자의 상기 프로모터가 화분 형성 또는 작용에 있어서 중요한 세포에 특이적인 프로모터인 방법.
제8항에 있어서, 상기 두 번째 재조합 DNA 분자의 상기 프로모터가 꽃밥 특이적 프로모터인 방법.
제9항에 있어서, 상기 꽃밥 특이적 프로모터가 프로모터 5126의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 두 번째 재조합 DNA 분자의 상기 프로모터가 유도성 프로모터인 방법.
제1항에 있어서, 상기 두 번째 재조합 DNA 분자의 상기 프로모터가 구조성 프로모터인 방법.
제12항에 있어서, 상기 구조성 프로모터가 옥수수 유비키틴 프로모터인 방법.
제13항에 있어서, 상기 구조체가 PHP6522인 방법.
제10항에 있어서, 상기 구조체가 PHP6555인 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 DP5055의 Sca-NcoI 단편의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 적어도 503 염기쌍 상류까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -503부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -587부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -890부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -503부터 위치 -134까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 프로모터가 DP5055의 Sca-NcoI 단편의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 적어도 503 염기쌍 상류까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -503부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10 항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -587부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -890부터 위치 -1까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 프로모터가 도 1의 뉴클레오티드 위치 1488의 시작 코돈에 대하여 상류의 위치 -503부터 위치 -134까지 연장되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 세포독소가 DAM-메틸라아제인 방법.