JP2003527833A - 花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法 - Google Patents

花虫類に由来する発色団／蛍光体、およびそれらの使用法

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JP2003527833A JP2001530368A JP2001530368A JP2003527833A JP 2003527833 A JP2003527833 A JP 2003527833A JP 2001530368 A JP2001530368 A JP 2001530368A JP 2001530368 A JP2001530368 A JP 2001530368A JP 2003527833 A JP2003527833 A JP 2003527833A
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アルカディ フィドロビッチ フラドコフ
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Abstract

(57)【要約】 花虫類に由来する色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体と同様に、それらをコードする核酸組成物が提供される。関心対象の特異的なタンパク質は、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質を含む：アネモニア・マジャノ（Anemonia majano）、ハナヅタ（Clavularia）種、ゾアンサス（Zoanthus）種、ディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata）、ディスコソマ（Discosoma）種「赤色」、アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）、ディスコソマ（Discosoma）種「緑色」、ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」、およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片と、それらをコードする核酸と同様に、対象タンパク質に対する抗体、およびトランスジェニック細胞および生物も提供される。対象タンパク質および核酸組成物は多種多様な応用に使用される。最後に、対象タンパク質を含むような応用に使用されるキットが提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】関連出願の相互参照 本出願は、以下の出願の一部継続出願である： 1999年10月14日に出願された特許出願第09/418,529号； 1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,917号； 1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,922号； 1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,338号； 1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,341号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,556号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,477号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,144号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,898号；ならびに 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,627号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,687号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,609号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,626号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,880号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,607号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,766号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,888号；および 2000年6月14日に出願された特許出願第60/212/070号；以上の出願の開示は参照
として本明細書に組み入れられる。本出願はまた1999年12月10日に出願された米
国特許第99/29405号に対して優先権を主張する。
【０００２】序論 発明の分野 本発明の分野は色素タンパク質、特に蛍光タンパク質である。
【０００３】発明の背景 標識付け（labeling）は、対象となるタンパク質、細胞、または関心対象の生
物に印を付ける手段であり、多くの生化学的、分子生物学的、および医学的な診
断の応用に重要な役割を果たす。放射性標識、色素標識、蛍光標識、化学発光標
識などを含む多種多様な標識が現在まで開発されてきた一方で、新たな標識の開
発には引き続き関心が寄せられている。なかでも色素タンパク質および蛍光タン
パク質の標識を含む新たなタンパク質の標識の開発に特に関心が寄せられている
。
【０００４】関連文献 関心対象となる米国特許は、以下を含む：第6,066,476号；第6,020,192号；第
5,985,577号；第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号
；第5,919,445号および第5,874,304号。以下も関心対象である：マッツ（Matz）
、M.V.ら（1999）Nature Biotechnol.、17：969〜973；「生体色の赤色蛍光タン
パク質（Living Colors Red Fluolescent Protein）」（1999年10月） CLONTECH
niques XIV（4）：2〜6；「生体色はGFPベクターを増強した（Living Colors En
hanced GFP Vectors）」（1996年4月）CLONTECHniques XI（2）：2-3；ハース（
Haas）、J.ら（1996）Curr. Biol. 6：315〜324；リッツート（Rizzuto）、R.ら
（1996）Curr. Biol. 6：183〜188；およびコザク（Kozak）、M.（1987）Nuclei
c Acids Res. 15：8125〜8148；ルキヤノフ（Lukyanov）、K.ら（2000）J. Biol
. Chemistry 275（34）：25879〜25882。
【０００５】発明の概要 花虫類に由来する色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体だけでなく、そ
れらをコードする核酸組成物が提供される。関心対象の特異的なタンパク質には
、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質が含まれる：アネモニ
ア・マジャノ（Anemonia majano）、ハナヅタ（Clavularia）種、ゾアンサス（Z
oanthus）種、ディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata）、ディスコソマ
（Discosoma）種「赤色」、アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）、ディ
スコソマ（Discosoma）種「緑色」、ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」、
およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片およびそれらをコードする核酸だ
けでなく、対象タンパク質に対する抗体およびトランスジェニック細胞および生
物も提供される。対象タンパク質および核酸組成物は、多種多様な応用で使用さ
れる。最後に、対象タンパク質を含むような応用で使用されるキットが提供され
る。
【０００６】定義 本発明に従って、当技術分野における従来の分子生物学、微生物学、および組
換えDNA技術の知見を用いることができる。これらの技術は文献で詳しく説明さ
れている。例えば以下の文献を参照されたい：マニアティス（Maniatis）、フリ
ッツ（Fritsch）およびサンブルック（Sambrook）、「分子クローニング：実験
マニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」（1982）；「DNAク
ローニング：実践的アプローチ（DNA Cloning A Practical Approach）」、第I
巻および第II巻（D.N. Glover編、1985）；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonu
cleotide Synthesis）」（M.J. Gait編、1984）；「核酸ハイブリダイゼーショ
ン（Nucleic Acid Hybridization）」（B.D. HamesおよびS.J. Higgins編（1985
））；「転写および翻訳（Transcription and Translation）」（B.D. Hamesお
よびS.J. Higgins編、（1984））；「動物細胞の培養（Animal Cell Culture）
」（R.I. Freshney編、（1986））；「固定化された細胞および酵素（Immobiliz
ed Cells and Enzymes）」（IRL Press、（1986））；B. Perbal、「分子クロー
ニングの実践的手引書（A Practical Guide To Molecular Cloning）」（1984）
。
【０００７】 「ベクター」は、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどのレプリコン（
replicon）であり、ベクターに別のDNAセグメント(segment)を結合させて、結合
させたセグメントを複製させることが可能である。
【０００８】 「DNA分子」は、1本鎖状または2本鎖らせん状である、デオキシリボヌクレオ
チド（アデニン、グアニン、チミン、またはシトシン）の重合体（polymeric fo
rm）を意味する。この用語は分子の1次構造および2次構造のみを意味し、任意の
特定の3次構造に制限しない。したがって、この用語は特に線状（linear）DNA分
子（例えば制限酵素切断断片）、ウイルス、プラスミド、および染色体にみられ
る2本鎖DNAを含む。
【０００９】 DNAの「コード配列」は、適切な調節配列の制御下において、インビボでポリ
ペプチドに転写されて翻訳されるDNA配列である。コード配列の境界は、5'（ア
ミノ）末端側に位置する開始コドンと、3'（カルボキシル）末端に位置する翻訳
停止コドンで決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核生物のmRNAに由
来するcDNA、真核生物（例えば哺乳類）のゲノムDNA配列、および合成DNA配列を
含むことができるがこれらに限定されない。ポリアデニル化のシグナルおよび転
写終結配列は、コード配列に対して3'側に位置する場合がある。
【００１０】 本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、2本の核酸鎖が
結合して、反対側の核酸鎖の残基間の水素結合によって安定化された逆平行2重
鎖（duplex）を形成する過程を意味する。
【００１１】 「オリゴヌクレオチド」という用語は短い（長さが100塩基未満）の核酸分子
を意味する。
【００１２】 本明細書で用いる「DNA調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、ポリア
デニル化シグナル、ターミネーター（terminator）およびその類似物などの、宿
主細胞におけるコード配列の発現に備えるまたは調節する、転写および翻訳の制
御配列である。
【００１３】 「プロモーター配列」は、細胞内でRNAポリメラーゼを結合させ、下流（3'方
向）にあるコード配列の転写を開始することが可能な、DNA調節領域である。本
発明を定義するため、プロモーター配列は3'末端では転写開始部位に接し、上流
（5'方向）に向かって伸び、バックグ回に対して検出可能なレベルで転写を開始
する必要最小限の塩基または配列を含む。プロモーター配列内には、RNAポリメ
ラーゼの結合を担う転写開始部位ならびにタンパク質結合領域がある。真核生物
のプロモーターは、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含むことが多い
が、常に含むわけではない。誘導可能なプロモーターを含む様々なプロモーター
を用いて、本発明の様々なベクターを駆動することができる。
【００１４】 本明細書で用いる「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語
は細菌の酵素を意味し、いずれも2本鎖DNAを特定のヌクレオチド配列またはその
近傍で切断する。
【００１５】 細胞は、外因性または異種のDNAを細胞内に導入すると、これらのDNAにより「
形質転換」または「トランスフェクト」される。形質転換用のDNAは、細胞のゲ
ノム中に（共有結合を介して）組み込まれる場合もあれば組み込まれない場合も
ある。例えば真核生物、酵母、および哺乳動物の細胞では、形質転換用のDNAは
プラスミドなどのエピソーム要素として維持される場合がある。真核細胞に関し
ては、安定に形質転換された細胞では、形質転換用DNAが染色体上に組み込まれ
て、染色体の複製に伴って娘細胞に受け継がれる。このような安定性は、真核細
胞が形質転換用DNAを含む娘細胞の集団からなる細胞系列またはコロニーを確立
する能力によって明らかにされる。「クローン」とは、有糸分裂により1個の細
胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞系列」とは、インビト
ロで数世代にわたって安定に成長可能な初代細胞のクローンである。
【００１６】 DNA構築物の「異種」領域は、自然界に存在するより大きな分子と関連せずに
見出されるより大きなDNA分子中に存在する、同定可能なDNAセグメントである。
したがって、異種領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合、この遺伝子は通常、
供給源の生物のゲノム中では哺乳類のゲノムDNAに隣接しないDNAに隣接する。別
の例では、異種DNAは2種の異なる供給源に由来する遺伝子の一部分がまとめられ
た融合タンパク質産物を作製する構築物中における、コード配列を含む。対立遺
伝子の変異または天然に起こる変異事象は、本明細書で定義するような異種DNA
領域を生じない。
【００１７】 本明細書で用いる「レポーター遺伝子」は異種プロモーターまたはエンハンサ
ー配列に結合するコード配列を意味し、その構築物を組織または細胞に導入する
ことで、レポーター遺伝子の産物を容易かつ定量的にアッセイすることができる
。
【００１８】 本明細書に記載したアミノ酸は「L型」異性体であることが好ましい。アミノ
酸配列は1文字表記法で記載する（A：アラニン；C：システイン；D：アスパラギ
ン酸；E：グルタミン酸；F：フェニルアラニン；G：グリシン；H：ヒスチジン；
I：イソロイシン：K：リシン；L：ロイシン；M：メチオニン；N：アスパラギン
；P：プロリン；Q：グルタミン；R：アルギニン；S：セリン；T：スレオニン；V
：バリン；W：トリプトファン；Y：チロシン；X：任意の残基）。NH2は、ポリペ
プチドのアミノ末端に存在する結合相手をもたない状態のアミノ基を意味する。
COOHは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する結合相手をもたない状態のカ
ルボキシ基を意味する。標準的なポリペプチドの命名法は、J. Biol. Chem.、24
3（1969）、3552〜59に準拠する。
【００１９】 「免疫学的に活性のある」という用語は、天然、組換え型、または合成の色素
/蛍光タンパク質、またはそれらの任意のオリゴペプチドがもつ、適切な動物ま
たは細胞で特異的な免疫応答を誘導して、特定の抗体と結合する能力を意味する
。本明細書で用いる「抗原性アミノ酸配列」は、単独または担体分子と結合した
アミノ酸配列を意味し、哺乳類で抗体応答を誘発することができる。抗体が抗原
に結合する文脈における「特異的な結合」という用語は、当技術分野で十分に理
解される用語であり、他の無関係の抗原ではなく抗体が生成された対象の抗原へ
の、抗体の結合を意味する。
【００２０】 本明細書で用いる「単離された」という用語は、天然に存在するポリヌクレオ
チド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞とは異なる環境に存在するポリヌク
レオチド、ポリペプチド、抗体、または宿主細胞を記述するために用いられる。
【００２１】具体的な態様の説明 花虫類に由来する色素/蛍光タンパク質およびそれらの変異体だけでなく、そ
れらをコードする核酸組成物が提供される。関心対象の特異的なタンパク質には
、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光タンパク質が含まれる：アネモニ
ア・マジャノ（Anemonia majano）、ハナヅタ（Clavularia）種、ゾアンサス（Z
oanthus）種、ディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata）、ディスコソマ
（Discosoma）種「赤色」、アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）、ディ
スコソマ（Discosoma）種「緑色」、ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」、
およびそれらの変異体。対象タンパク質の断片およびそれらをコードする核酸だ
けでなく、対象タンパク質に対する抗体およびトランスジェニック細胞および生
物も提供される。対象タンパク質および核酸組成物は、多種多様な応用で使用さ
れる。最後に、対象タンパク質を含むような応用で使用されるキットが提供され
る。本発明をさらに詳しく説明するために、対象となる核酸組成物を最初に説明
し、次に対象タンパク質組成物、抗体組成物、およびトランスジェニック細胞/
生物について討論する。その次に、対象タンパク質が使用される代表的な方法を
概説する。
【００２２】 本発明をさらに説明する前に、特定の態様の変更は添付された特許請求の範囲
内でなされ、この範囲内にあるため、本発明が以下に説明する発明の特定の態様
に制限されないことは理解されるべきである。また使用する専門用語は特定の態
様を説明することを目的とするものであって、限定的であるように意図されるも
のではないことも理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は添付した特
許請求の範囲により設定される。
【００２３】 本明細書および添付した特許請求の範囲では、単数形の「一つの（a、an）」
および「その（the）」は、文中で特に断らない限り複数形を含む。特に明記し
た部分を除いて本明細書で用いるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術
分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味をもつ。
【００２４】 核酸組成物 上述した通り、本発明は花虫類の色素タンパク質および蛍光タンパク質、なら
びにそれらの変異体と同様に、それらのタンパク質の断片および相同体をコード
する核酸組成物を提供する。核酸組成物とは、本発明の花虫類の色素/蛍光ポリ
ペプチドをコードする読み枠（open reading frame）（すなわち花虫類の色素/
蛍光タンパク質遺伝子）を有するDNA配列を含む組成物を意味し、適切な条件で
は、本発明の花虫類の色素/蛍光タンパク質として発現される能力がある。また
この用語には、本発明のタンパク質をコードする核酸と相同であり、実質的に同
様または同一である核酸が含まれる。したがって本発明は、本発明のタンパク質
と同様にそれらの相同体をコードする遺伝子およびそのコード配列を提供する。
対象核酸は分離され、例えば天然の環境以外で存在する。
【００２５】 関心対象の特定の核酸組成物は、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光
タンパク質（およびそれらの変異体）をコードする：アネモニア・マジャノ（An
emonia majano）、ハナヅタ（Clavularia）種、ゾアンサス（Zoanthus）種、デ
ィスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata）、ディスコソマ（Discosoma）種
「赤色」、アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）、ディスコソマ（Discos
oma）種「緑色」、ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」。これらの特定の型
の関心対象の核酸組成物については個別により詳しく説明する。
【００２６】 アネモニア・マジャノ（Anemonia majano） これらの態様において、核酸組成物はゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多く
はアクチニアリア（Actiniaria）目、さらに多くはエンドミアリア（Endomyaria
）亜目、一般的にはアクチニイダエ（Actiniidae）科であることが多く、さらに
一般的にはアネモニア（Anemonia）属由来の生物に見出される核酸中に見出され
るか、またはその核酸に由来し、多くの態様においてこの生物はアネモニア・マ
ジャノ（Anemonia majano）であり、アネモニア・マジャノに由来する特異的な
関心対象のタンパク質はamFP486（すなわちNFP-1）であり、その相同体/変異体
（例えばMut15、Mut32）は多くの態様において特に関心対象である。amFP486の
野生型cDNAコード配列を配列番号：01に示す。
【００２７】 ハナヅタ（Clavularia）種 これらの態様において、核酸はアルシオナリア（Alcyonaria）、多くは亜綱（
根生類（Stolonifera）目、さらに多くはクラブラリデ（Clavulariidae）科由来
の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、生物は一
般的にはハナヅタ（Clavularia）属に由来し、特定の態様においては、生物はハ
ナヅタ（Clavularia）種であり、ハナヅタ（Clavularia）種に由来する特異的な
蛍光タンパク質はcFP484（別名NFP-2）であり、かつその相同体/変異体（例えば
Δ19 cFP484およびΔ38 cFP484）は多くの態様において特に関心対象である。cF
P484の野生型のcDNAコード配列を配列番号：03に示す。
【００２８】 ゾアンサス（Zoanthus）種I これらの態様において、核酸はゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはゾア
ンシデア（Zoanthidea）目、さらに多くはブラチクネミア（Brachycnemia）亜目
、一般的にはゾアンシデア（Zoanthidae）科、より一般的にはゾアンサス（Zoan
thus）属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、
ある態様においては、この生物はゾアンサス（Zoanthus）種であり、特異的な蛍
光タンパク質はzFP506（別名NFP-3）、およびその相同体/変異体（例えばzFP506
のN65M異型）であり、多くの態様において特に関心対象である。zFP506の野生型
のcDNAコード配列を配列番号：05に示す。
【００２９】 ゾアンサス（Zoanthus）種II これらの態様において、核酸はゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはゾア
ンシデア（Zoanthidea）目、さらに多くはブラチクネミア（Brachycnemia）亜目
、一般的はゾアンシデア（Zoanthidae）科、より一般的にはゾアンサス（Zoanth
us）属の生物に見出される核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来する。
ある態様においては、この生物はゾアンサス（Zoanthus）種であり、特異的な蛍
光タンパク質はzFP538（NFP-4）、およびその相同体/変異体（例えばzFP538のM1
28異型）であり、多くの態様において特に関心対象である。zFP538の野生型のcD
NAコード配列を配列番号：07に示す。
【００３０】 ディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata） これらの態様において核酸はゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはコラリ
モファリア（Corallimopharia）目、さらに多くはディスコソマティダエ（Disco
somatidae）科、一般的にはディスコソマ（Discosoma）属の生物に見出される核
酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この生物
はディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata）であり、特異的な蛍光タン
パク質はdsFP483（NFP-5）であって、その相同体/変異体は多くの態様において
特に関心対象である。dsFP483の野生型のcDNAコード配列を配列番号：09に示す
。
【００３１】 ディスコソマ（Discosoma）種「赤色」 これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはコ
ラリモファリア（Corallimopharia）目、さらに多くはディスコソマティダエ（D
iscosomatidae）科、一般的にはディスコソマ（Discosoma）属）の生物に見出さ
れる核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、こ
の生物はディスコソマ（Discosoma）種「赤色」であり、特異的な蛍光タンパク
質はdrFP583（NFP-6であって）、その相同体/変異体（例えばE5、E8、E5up、E5d
own、E57、AG4、AG4H）であり、多くの態様において特に関心対象である。drFP5
83の野生型のcDNAコード配列を配列番号：11に示す。
【００３２】 アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata） これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはイ
ソギンチャク（Actiniaria）目、さらに多くはエンドミアリア（Endomyaria）亜
目、一般的にはアクチニイダエ（Actiniidae）科であり、またさらに一般的には
アネモニア（Anemonia）属の生物の核酸中に見出されるか、またはその核酸に由
来し、例えばある態様においてこの生物はアネモニア・スルカタ（Anemonia sul
cata）であり、特異的な蛍光タンパク質asFP600（NFP-7）、およびその相同体/
変異体（例えばMut1）は多くの態様において関心対象である。asFP600の野生型
のcDNAコード配列を配列番号：14に示す。
【００３３】 ディスコソマ（Discosoma）種「緑色」 これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはコ
ラリモファリア（Corallimopharia）目、さらに多くはディスコソマティダエ（D
iscosomatidae）科、一般的にはディスコソマ（Discosoma）属の生物に見出され
る核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この
生物はディスコソマ（Discosoma）種「緑色」であり、特異的な蛍光タンパク質
はdmFP592（NFP-8）であり、その相同体/変異体は多くの態様において特に関心
対象である。dgFP512の野生型のcDNAコード配列を配列番号：15に示す。
【００３４】 ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」 これらの態様において、核酸は、ゾアンサリア（Zoantharia）亜綱、多くはコ
ラリモファリア（Corallimopharia）目、さらに多くはディスコソマティダエ（D
iscosomatidae）科、一般的にはディスコソマ（Discosoma）属の生物に見出され
る核酸中に見出されるか、またはその核酸に由来し、ある態様においては、この
生物はディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」であり、特異的な蛍光タンパク
質はdmFP592（NFP-9）であり、その相同体/変異体は多くの態様において特に関
心対象である。dmFP592の野生型のcDNAコード配列を配列番号：17に示す。
【００３５】 上記の特定の核酸組成物に加えて、上記配列の相同体も対象となる。対象核酸
の相同体に関しては、相同遺伝子の供給源は植物および動物の任意の種である。
ある態様においては、相同体間の配列類似性は少なくとも約20％であり、ときに
は少なくとも約25％であり、30％、35％、40％、50％、60％、70％またはそれ以
上の場合があり、75％、80％、85％、90％および95％またはそれ以上を含む場合
もある。配列類似性は、保存モチーフ、コード領域、隣接領域などの、より長い
配列の亜集団の場合がある標準配列を元に計算される。標準配列の長さは通常少
なくとも約18ヌクレオチドであり、より一般的には少なくとも約30ヌクレオチド
であり、比較されている全配列に伸張しうる。配列解析に用いるアルゴリズムは
当技術分野で公知であり、例えばBLASTはアルチュール（Altschul）ら（1990）
、J. Mol. Biol. 215：403〜10（デフォルトの設定、例えばパラメータとしてw=
4やT=17を使用する）に記載されている。本明細書に記載した配列は、データベ
ースの検索において関連性および相同性のある核酸を認識する必須の配列である
。ある態様において特に関心対象であるのは、配列番号：01〜17に示した核酸と
実質的に同じ長さの核酸である。実質的に同じ長さであるとは、長さの任意の差
が約20個％を超えず、一般的には約10個％を超えず、さらに一般的には約5個％
を超えないことを意味し；これらの任意の配列に対して、核酸の全長にわたって
少なくとも約90％、一般的には約95％、さらに一般的には少なくとも約99％以上
の配列同一性を有することを意味する。多くの態様においては、このような核酸
は配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、または17の配列と実質的に同様
（すなわち同じ）か、または同一である。実質的に同様であるとは、配列同一性
が一般的には少なくとも約60％、一般的には少なくとも約75％、また多くの場合
少なくとも約80％、85％、90％、さらには95％であることを意味する。
【００３６】 本発明の色素/蛍光タンパク質の変異体をコードする核酸もまた提供される。
変異型の核酸は、当技術分野において日常的な作業であり、十分に公知の手法で
ある、無作為変異導入法（mutagenesis）または標的変異導入法で作製すること
ができる。
【００３７】 いくつかの態様においては、相同体または変異体をコードする核酸にコードさ
れた色素タンパク質または蛍光タンパク質は、野生型蛍光タンパク質と同じ蛍光
特性をもつ。他の態様においては、相同体または変異型の核酸は、本明細書で詳
しく説明するようにスペクトル特性が変化した色素タンパク質または蛍光タンパ
ク質をコードする。
【００３８】 本発明の核酸は、cDNAもしくはゲノムDNA、またはそれらの断片であってもよ
い。ある態様においては、本発明の核酸は特異的な蛍光タンパク質およびポリペ
プチドコードする一つまたは複数の読み枠、ならびにイントロンと同様に、発現
の調節にかかわり、コード領域を超えてさらにどちらの方向でもありうる約20 k
bまでの5'側および3'側に隣接する非コードヌクレオチド配列を含む。対象とな
る核酸は、染色体外に維持するため、または宿主ゲノムに組み込むために、適切
なベクターに導入されることが可能であり、これについてはより詳しく後述する
。
【００３９】 本明細書で用いる「cDNA」という用語は、天然の成熟型mRNA種（species）に
見出される配列要素の配置を共有する、すべての核酸を含める（配列要素とはエ
キソンならびに5'側および3'側にある非コード領域である）。通常mRNA種は連続
したエキソンを有し、介在するイントロンが存在する場合は、核のRNAスプライ
シングにより除去されて、タンパク質をコードする連続した読み枠が作製される
。
【００４０】 関心対象のゲノム配列は、開始コドンと停止コドンの間に存在し、表に記載し
た配列で定義される核酸を含み、通常は天然の染色体上に存在するすべてのイン
トロンを含む。これはさらに、成熟型mRNAに見出される5'側または3'側の非翻訳
領域を含む場合がある。またさらに、プロモーターやエンハンサーなどで約1 kb
またはそれ以上である場合がある、転写領域の5'端または3'端のいずれかにおい
て隣接するゲノムDNAの特異的な転写および翻訳の調節配列を含む場合もある。
ゲノムDNAを100 kbpまたはそれ未満の断片として単離することが可能であり、隣
接する染色体配列を実質的に含まない場合がある。3'端もしくは5'端にある、コ
ード領域に隣接するゲノムDNA、またはイントロン中に見出される調節配列は、
組織および段階に特異的である適切な発現に必要な配列を含む。
【００４１】 本発明の核酸組成物は、対象となる色素/蛍光タンパク質のすべてまたは一部
をコードしうる。2本鎖または1本鎖の標準的な断片は、DNA配列から従来の方法
に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成したり、制限酵素で切断したり、PC
Rで増幅するなどして得られる。多くの場合DNA断片は少なくとも15ヌクレオチド
であり、一般的には少なくとも18ヌクレオチドまたは25ヌクレオチドであり、少
なくとも約50ヌクレオチドの場合もある。一部の態様においては、対象となる核
酸分子の長さは、約100ヌクレオチド、約200ヌクレオチド、約300ヌクレオチド
、約400ヌクレオチド、約500ヌクレオチド、約600ヌクレオチド、約700ヌクレオ
チド、または約720ヌクレオチドである。対象となる核酸は、対象となるタンパ
ク質の断片または完全長のタンパク質をコードする場合がある。例えば、対象と
なる核酸は、約25アミノ酸、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、約1
25アミノ酸、約150アミノ酸、約200アミノ酸、約210アミノ酸、約220アミノ酸、
約230アミノ酸、または約240アミノ酸、全タンパク質までのポリペプチドをコー
ドしうる。
【００４２】 対象となる核酸は、実質的に純粋な状態で、一般的には完全な染色体とは別物
として単離され、得られる。一般的には、このDNAは本発明の核酸またはその断
片を含まない他の核酸配列を実質的に含まない状態で得られ、通常は少なくとも
約50％、一般的には少なくとも約90％の純度であり、また典型的には「組換え型
である」、すなわち、天然の染色体上では通常は結合していない一つまたは複数
のヌクレオチドに隣接する。
【００４３】 対象となるポリヌクレオチド（例えば配列番号：01〜17などの配列を有するポ
リヌクレオチド）、対応するcDNA、完全長の遺伝子、および対象ポリヌクレオチ
ドの構築物が提供される。これらの分子は当技術分野で公知であるいくつかの異
なるプロトコルによって合成的に作製することができる。適切なポリヌクレオチ
ド構築物は、例えばサムブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マ
ニュアル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」第2版、（1989）Cold
Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NYに記載された標準的な組換えDNA
技術、および米国HHSの国立予防衛生研究所（NIH）の組換えDNA研究に関する指
針に記載された現行の規制に基づいて精製されることができる。
【００４４】 また、第2のタンパク質、例えば分解配列（degradation sequence）やシグナ
ルペプチドなどに融合させた、対象タンパク質の融合タンパク質またはその断片
をコードする核酸も提供される。融合タンパク質には、対象のポリペプチド、ま
たはその断片、および対象ポリペプチドのN末端および/またはC末端においてイ
ンフレームで（in-frame）融合させた、花虫類ではないポリペプチド（「融合相
手」）が含まれうる。融合相手には、融合相手に特異的な抗体に結合可能なポリ
ペプチド（例えばエピトープタグ）；抗体またはその結合断片；触媒機能を提供
して細胞応答を誘導するポリペプチド；リガンドもしくは受容体、またはそれら
の模倣物などが含まれるがこれらに限定されない。このような融合タンパク質で
は、融合相手は一般に天然の状態では融合タンパク質の対象花虫類部分に結合せ
ず、典型的には花虫類タンパク質またはそれらの誘導体/断片ではない、すなわ
ち花虫類種には見出されない。
【００４５】 ベクターに挿入した対象核酸からなる構築物もまた提供される。このような構
築物は、増殖やタンパク質産生などを含む、いくつかの異なる応用に使用するこ
とができる。プラスミドを含む、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを
調製して使用することができる。ベクターの選択は、増殖が望ましい細胞の種類
、および増殖の目的に応じて行う。あるベクターは、大量の所望のDNA配列の増
幅および作製に有用である。培養中の細胞における発現に適したベクターもある
。また、動物全体またはの、細胞における伝達および発現に適したベクターもあ
る。適切なベクターの選択法は当技術分野で公知である。このようなベクターの
多くは市販されている。構築物を調製する際には、ポリヌクレオチドの一部また
は全体を一般的にはベクター中の切断済みの制限酵素部位にDNAリガーゼで結合
させることで、ベクター中に挿入する。あるいは所望のヌクレオチド配列を、相
同組換えによりインビボで挿入することができる。これは通常、相同性のある領
域を、所望のヌクレオチド配列に隣接させてベクターに結合させることによって
なされる。相同性のある領域は、オリゴヌクレオチドの連結によって、または、
例えば相同性のある領域と所望のヌクレオチド配列部分の両方を含むプライマー
を用いたポリメラーゼ連鎖反応によって添加する。
【００４６】 また、他の応用の中でも、対象タンパク質の合成で使用される、発現カセット
または発現系も提供される。発現に関しては、本発明のポリヌクレオチドにコー
ドされた遺伝子産物は、例えば細菌、酵母、両生類、および哺乳類の系を含む任
意の簡便な発現系で発現される。適切なベクターおよび宿主細胞は米国特許第5,
654,173号に記載されている。発現ベクター中では、例えば、配列番号：01〜17
に記載されるように、対象ポリヌクレオチドを、所望の発現特性が適切に得られ
るように調節配列に連結する。このような調節配列には、プロモーター（センス
鎖の5'端またはアンチセンス鎖の3'端に結合される）、エンハンサー、ターミネ
ーター、オペレーター、リプレッサー、およびインデューサーが含まれうる。プ
ロモーターは、調節型または構成型（constitutive）でありうる。状況によって
は、組織特異的なプロモーターまたは発生段階に特異的なプロモーターなどの条
件的に活性であるプロモーターを使用することが望ましい場合がある。これらは
、ベクターへの連結に関して上述した手法を用いて、所望のヌクレオチド配列に
連結させる。当技術分野で公知の任意の手法を用いることができる。言い換える
と、発現ベクターは誘導型または構成型の転写および翻訳の開始領域を提供し、
コード領域は転写開始領域ならびに転写および翻訳の終結領域の転写制御下で使
用可能なように連結される。このような制御領域は、対象核酸が得られる対象種
に対して天然でありうるか、または外因性の供給源に由来しうる。
【００４７】 発現ベクターには一般に、プロモーター配列の近傍に好都合な制限酵素切断部
位があり、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入が可能となる。発現宿主
内で作用する選択マーカーが存在しうる。発現ベクターは特に、上述したように
融合タンパク質の産生に使用されうる。
【００４８】 転写開始領域、遺伝子またはその断片、および転写終結領域を含むように発現
カセットを調製することができる。特に関心対象であるのは、一般的には長さが
少なくとも約8アミノ酸であり、より一般的には長さが少なくとも約15アミノ酸
であり、約25アミノ酸さらに遺伝子の読み枠の完全長までである、機能性エピト
ープまたは領域の発現を可能とする、配列の使用である。DNAを導入後、この構
築物を含む細胞を選択マーカーによって選択し、細胞を増殖させた後に発現に使
用する。
【００４９】 上述の発現系は、発現の目的に応じて従来の方法で原核生物または真核生物で
使用することができる。タンパク質を大規模に産生させる場合は、大腸菌、枯草
菌、分裂酵母などの単細胞生物、バキュロウイルスベクターを組み合わせた昆虫
細胞、または脊椎動物などの高等生物の細胞、例えばCOS 7細胞、HEK293、CHO、
アフリカツメガエル（Xenopus）の卵母細胞などを発現宿主細胞として使用する
ことができる。状況によっては、真核細胞で遺伝子を発現させることが望ましく
、この場合、発現させるタンパク質は、天然の折りたたみ（folding）および翻
訳後修飾による恩典を得る。小ペプチドを研究室で合成することもできる。完全
なタンパク質配列の亜集団であるポリペプチドを、機能上重要なタンパク質の一
部分を同定して調査するために使用することができる。
【００５０】 対象となる特異的な発現系には、細菌、酵母、昆虫細胞、および哺乳類細胞に
由来する発現系が含まれる。これら各分類の代表的な系を以下に提供する：
【００５１】細菌 細菌を用いた発現系は以下の文献で説明されたものを含む：チャン（Chang）
ら、Nature（1978）275：615；ゴーデル（Goeddel）ら、Nature（1979）281：54
4；ゴーデルら、Nucleic Acids Res.（1980）8：4057；欧州特許第0 036,776号
；米国特許第4,551,433号；デボア（DeBoer）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA
）（1983）80：21〜25；およびシーベンリスト（Siebenlist）ら、Cell（1980）
20：269。
【００５２】酵母 酵母を用いた発現系は以下の文献に記載されたものを含む：ヒネン（Hinnen）
ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1978）75：1929；イトウ（Ito）ら、J. B
acteriol.（1983）153：163；カーツ（Kurtz）ら、Mol. Cell Biol.（1986）6：
142；クンゼ（Kunze）ら、J. Basic Microbial.（1985）25：141；グリーソン（
Gleeson）ら、J. Gen. Microbial.（1986）132：3459；ローゲンカンプ（Roggen
kamp）ら、Mol. Gen. Genet.（1986）202：302；ダス（Das）ら、J. Bacteriol.
（1984）158：1165；デ・ルーベンコート（De Louvencourt）ら、J. Bacterial.
（1983）154：737；ファン・デン・バーグ（Van den Berg）ら、Bio/Technology
（1990）8：135；クンゼ（Kunze）ら、J. Basic Microbial.（1985）25：141；
クレッグ（Cregg）ら、Mol. Cell. Biol. （1985）5：3376；米国特許第4,837,1
48号および第4,929,555号；ビーチ（Beach）およびナース（Nurse）、Nature（1
981）300：706；ダビドウ（Davidow）ら、Curr. Genet.（1985）10：380；ガイ
ジャーディン（Gaillardin）ら、Curr. Genet.（1985）10：49；バランス（Ball
ance）ら、Biochem. Biophys. Res. Commun.（1983） 112：284〜289；ティルバ
ーン（Tilburn）ら、Gene（1983）26：205〜221；イェルトン（Yelton）ら、Pro
c. Natl. Acad. Sci.（USA）（1984）81：1470〜1474；ケリー（Kelly）および
ハインズ（Hynes）、EMBO J.（1985）4：475〜479；欧州特許第0 244,234号；お
よび国際公開公報第91/00357号。
【００５３】昆虫細胞 昆虫における異種遺伝子の発現は以下の文献に記載されたようになされる：米
国特許第4,745,051号；フリーセン（Friesen）ら、「バキュロウイルス遺伝子発
現の調節（The Regulation of Baculovirus Gene Expression）」「バキュロウ
イルスの分子生物学（The Molecular Biology Of Baculoviruses）」（1986）（
W. Doerfler編））；欧州特許第0 127,839号；欧州特許第0 155,476号；および
ブラク（Vlak）ら、J. Gen. Virol.（1988）69：765〜776；ミラー（Miller）ら
、Ann. Rev. Microbiol.（1988）42：177；カーボネル（Carbonell）ら、Gene（
1988）73：409；マエダ（Maeda）ら、Nature（1985）315：592〜594；レバック-
ベルヘイデン（Lebacq-Verheyden）ら、Mol.Cell.Biol.（1988）8：3129；スミ
ス（Smith）ら、Proc. Natl. Acad. Sci.（USA）（1985）82：8844；ミヤジマ（
Miyajima）ら、Gene（1987）58：273；およびマーティン（Martin）ら、DNA（19
88）7：99。数多くのバキュロウイルス株および異型ならびに宿主に由来する対
応する許容昆虫宿主細胞は、ルコウ（Luckow）ら、Bio/Technology（1988）6：4
7〜55、ミラー（Miller）ら、Generic Engineering（1986）8：277〜279、およ
びマエダ（Maeda）ら、Nature（1985）315：592〜594に記載されている。
【００５４】哺乳類細胞 哺乳類における発現は以下の文献に記載されるようになされる：ディケマ（Di
jkema）ら、EMBO J.（1985）4：761、ゴルマン（Gorman）ら、Proc. Natl. Acad
. Sci.（USA）（1982）79：6777、ボシャート（Boshart）ら、Cell （1985）41
：521、および米国特許第4,399,216号。哺乳類における発現の他の特徴は、以下
の文献に記載されるように促進される：ハム（Ham）およびウォレス（Wallace）
、Meth. Enz.（1979）58：44、バーンズ（Barnes）およびサトウ（Sato）、Anal
. Biochem.（1980）102：255、米国特許第4,767,704号、第4,657,866号、第4,92
7,762号、第4,560,655号、国際公開公報第90/103430号、国際公開公報第87/0019
5号、および米国再発行特許第30,985号。
【００５５】 上述の任意の宿主細胞、または他の適切な宿主細胞または生物を用いて本発明
のポリヌクレオチドまたは核酸を複製および/または発現させた際に、結果とし
て得られる複製された核酸、RNA、発現されたタンパク質またはポリペプチドは
、宿主細胞または生物の産物として本発明の範囲内にある。このような産物は当
技術分野で公知の任意の適切な方法で回収される。
【００５６】 選択されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子を同定すると、その発現を該遺
伝子が天然に存在する細胞内で制御することができる。例えば細胞の内因性遺伝
子は、細胞ゲノムの、細胞内における遺伝子発現を少なくとも増強するのに十分
な位置に挿入した外因性調節配列で調節することができる。調節配列は、参照と
して本明細書に組み入れられる米国特許第5,641,670号および第5,733,761号に記
載された相同組換えを介してゲノムに組み込まれるように設計することが可能で
あり、または参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第99/15650号に
記載された非相同組換えを介してゲノムに組み込まれるように設計することがで
きる。したがって、コードする核酸そのものを操作しない代わりに、上述の本明
細書に組み入れられる特許文書に記載されているように、所望のタンパク質をコ
ードする遺伝子を既に含む細胞のゲノムへ調節配列を組み込むことによって対象
タンパク質を産生する段階も本発明に含まれる。
【００５７】 対象となる核酸の相同体も提供する。相同体は多数の任意の方法で同定される
。提供されたcDNA断片を、関心対象の標的生物から回収したcDNAライブラリーに
対するハイブリダイゼーションプローブとして使用することができ、ストリンジ
ェンシーの低い条件を使用する。このプローブは一つの大きな断片であっても、
一つまたは複数の短い縮重プライマーであってもよい。配列が類似した核酸は、
ストリンジェンシーの低い条件（例えば50℃で6×SSC（0.9 Mの塩化ナトリウム/
0.09 Mのクエン酸ナトリウム））でハイブリダイゼーションを行って検出し、1
×SSC（0.15 Mの塩化ナトリウム/0.015 Mのクエン酸ナトリウム）中で55℃で洗
浄した場合に結合状態が維持される。配列同一性は、例えば50℃またはそれ以上
および0.1×SSC（15 mMの塩化ナトリウム/1.5 mMのクエン酸ナトリウム）のスト
リンジェンシーの高い条件でハイブリダイゼーションを行うことで決定すること
ができる。提供された配列（例えば対立遺伝子異型や遺伝学的に変化させた遺伝
子など）と実質的に同一な領域を有する核酸は、ストリンジェンシーの高いハイ
ブリダイゼーション条件で提供された配列と結合する。プローブ、特にDNA配列
の標識プローブを用いることで相同遺伝子または関連遺伝子を単離することがで
きる。
【００５８】 また、対象となるゲノム配列のプロモーター配列も関心対象である。5'隣接領
域の配列をエンハンサー結合配列を含み、例えば対象タンパク質遺伝子を発現さ
せる細胞/組織における発現を調節可能とする、プロモーター要素に使用するこ
とができる。
【００５９】 断片がPCRやハイブリダイゼーションによるスクリーニング用のプローブなど
として有用な対象核酸の短いDNA断片も提供される。より長いDNA断片（100ヌク
レオチドを超えるもの）は、上の項に記載したように、コードされたポリペプチ
ドの産生に有用である。幾何級数的PCRのような幾何級数的な増幅反応にはプラ
イマー対を使用する。プライマー配列の正確な組成は本発明に重要ではないが、
多くの応用でプライマーは、当技術分野で公知であるようにストリンジェンシー
の高い条件で対象配列とハイブリッドを形成する。少なくとも約50ヌクレオチド
、好ましくは少なくとも約100ヌクレオチドの増幅産物を生成するプライマー対
を選択することが好ましい。プライマー配列の選択に用いられるアルゴリズムは
一般的に知られており、市販のソフトウェアパッケージを利用することができる
。増幅用プライマーはDNAの相補鎖とハイブリッドを形成し、互いの方向にプラ
イムする（prime）。
【００６０】 DNAはまた、生物試料中の遺伝子発現を同定する際に使用することもできる。
細胞を対象に、ゲノムDNAまたはmRNAのような特定のヌクレオチド配列の存在に
関して細胞を調査する方法は文献に詳しく記載されている。手短に説明すると、
DNAまたはRNAを細胞試料から単離する。逆転写酵素を用いてmRNAをRT-PCRで増幅
し、相補的なDNA鎖を形成させた後に、対象DNA配列に特異的なプライマーを用い
てポリメラーゼ連鎖反応による増幅を行う。またmRNA試料をゲル電気泳動法で分
離し、適切な支持体（例えばニトロセルロースやナイロンなど）に移した後に、
対象DNAの断片をプローブとして調査した。オリゴヌクレオチド連結アッセイ法
、インサイチューハイブリダイゼーション法、および固体チップ上に整列させた
DNAプローブに対するハイブリダイゼーションなどの他の手法を使用することも
できる。対象配列とハイブリッドを形成したmRNAを検出することにより、試料中
における花虫類タンパク質の遺伝子発現が示される。
【００６１】 隣接するプロモーター領域およびコード領域を含む対象核酸に、当技術分野で
公知のさまざまな方法で変異を導入することで、プロモーター強度、コードタン
パク質配列、コードタンパク質の性質（コードタンパク質の蛍光の性質を含む）
などにおける、目標とした変化を導入することができる。このような変異をもつ
DNA配列またはタンパク質産物は通常、本明細書に記載される配列と実質的に同
様であり、例えば、それぞれ少なくとも1個のヌクレオチドまたはアミノ酸が異
なり、かつ少なくとも2個（ただし約10個のヌクレオチドまたはアミノ酸を超え
ない）が異なる場合がある。配列の変化は、置換、挿入、欠失、またはこれらの
組み合わせの場合がある。欠失にはさらに、領域またはエキソン（例えば10、20
、50、75、150、またはそれ以上のアミノ酸残基）の欠失などの大規模な変化が
含まれうる。クローン化した遺伝子のインビトロにおける変異導入法は公知であ
る。部位特異的変異導入法（site specific mutagenesis）のプロトコルの例は
以下の文献に記載されている：グスタン（Gustin）ら（1993）、Biotechniques
14：22；バラニー（Barany）（1985）、Gene 37：111〜23；コリチェリ（Colice
lli）ら、（1985）Mol. Gen. Genet. 199：537〜9；およびプレンキ（Prentki）
ら、（1984）、Gene 29：303〜13。部位特異的変異導入法は、以下の文献に記載
されている：サンブルック（Sambrook）ら、「分子クローニング：実験マニュア
ル（Molecular Cloning：A Laboratory Manual）」、CSH Press 1989、pp. 15.3
〜15.108；ワイナー（Weiner）ら、（1993）、Gene 126：35〜41；セイヤーズ（
Sayers）ら、（1992）、Biotechniques 13：592〜6；ジョーンズ（Jones）およ
びウィニストーファー（Winistorfer）（1992）、Biotechniques 12：528〜30；
バートン（Barton）ら、（1990）、Nucleic Acids Res. 18：7349〜55；マロッ
ティ（Marotti）およびトミック（Tomich）、（1989）、Gene Anal. Tech. 6：6
7〜70；およびチュー（Zhu）、（1989）、Anal. Biochem. 177：120〜4。このよ
うな変異型核酸の誘導体は、特定の色素/蛍光タンパク質の構造-機能関係を検討
するために、または、機能または調節に影響を及ぼすタンパク質の性質を変化さ
せるために使用することができる。
【００６２】 多くの態様の中で特に関心対象であるのは、色素タンパク質に変異を導入して
蛍光変異体とする段階に用いられる、下記の特異的な変異プロトコルである。こ
のプロトコルでは、候補タンパク質の配列を、マッツ（Matz）らによって報告さ
れたプロトコル「非生体発光性の花虫類種由来の蛍光タンパク質（Fluolescent
proteins from nonbioluminescent Anthozoa species）」、Nature Biotechnolo
gy（1999年10月）17：969〜973）にしたがってオワンクラゲ（Aequorea victori
a）の野生型GFPのアミノ酸とともに整列させる。色素タンパク質の148位の残基
を同定した後に、それを例えば部位特異的変異導入法でセリンに変える。こうす
ることで野生型色素タンパク質の蛍光変異体が得られる。これについては下記の
NFP-7を参照されたい。この場合、野生型のタンパク質は148位における元の状態
のアラニン残基がセリンに置換されて蛍光タンパク質に変異が導入された色素タ
ンパク質である。
【００６３】 対象となる核酸がヒト化された変形も関心対象である。本明細書で使用する「
ヒト化された（humanized）」という用語は、ヒト細胞におけるタンパク質発現
用のコドンを最適化させるために、核酸配列を対象になされる変更を意味する（
Yangら、Nucleic Acids Research 24（1996）、4592〜4593）。
【００６４】 多くの態様においては、生物発光性の種にみられるタンパク質は本発明の範囲
に含まれない。ある態様においては、GFP相同体およびウミシイタケ（Renilla r
eniformis）に由来する相同体をコードする核酸は本発明の範囲に含まれない。
【００６５】 タンパク質/ポリペプチド組成物 本発明では、花虫類の色素タンパク質および蛍光タンパク質ならびにそれらの
変異体と同様に、それらに関連するポリペプチド組成物も提供される。対象タン
パク質は色素タンパク質であるので、色の付いたタンパク質であり、蛍光性を有
する場合があるほか、低蛍光性、または非蛍光性である場合もある。本明細書で
使用する色素タンパク質および蛍光タンパク質という用語は、ウミシイタケ（Re
nilla）ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼを含まない。本明細書で使用する
ポリペプチド組成物という用語は、完全長のタンパク質、ならびにその一部分ま
たは断片の両方を意味する。また、この用語には天然タンパク質の変化も含まれ
る。このような変化は、天然のタンパク質と相同的、または実質的に同様であり
、かつ詳しく後述するように天然のタンパク質の変異体である。対象となるポリ
ペプチドは天然の環境以外に存在する。
【００６６】 多くの態様においては、対象となるタンパク質は約300 nm〜700 nm、一般的に
は約350 nm〜650 nm、またさらに一般的には約400 nm〜600 nmに吸収極大の範囲
をもつ。対象タンパク質が蛍光タンパク質の場合、それは光の一波長で励起可能
であり、その後に別の波長で光を放出することを意味する。対象タンパク質の励
起スペクトルは典型的には約300 nm〜700 nm、一般的には約350 nm〜650 nm、ま
たさらに一般的には約400 nm〜600 nmの範囲にあり、対象タンパク質の発光スペ
クトルは、典型的には約400 nm〜800 nm、一般的には約425 nm〜775 nm、またさ
らに一般的には約450 nm〜750 nmの範囲にある。対象となるタンパク質の最大吸
光係数は通常約10,000〜50,000であり、一般的には約15,000〜45,000である。対
象タンパク質の長さの範囲は典型的には約150〜300アミノ酸残基であり、一般的
には約200〜300アミノ酸残基である。また分子量の範囲は通常約15 kDa〜35 kDa
であり、一般的には17.5 kDa〜32.5 kDaである。
【００６７】 ある態様においては対象タンパク質は明るい。明るいとは、色素タンパク質お
よびその蛍光変異体が一般的な方法（例えば視覚的スクリーニング法、分光光度
法、分光蛍光法、蛍光顕微鏡、FACS装置など）で検出可能であることを意味する
。特定の蛍光タンパク質の蛍光輝度は、その量子収量に最大吸光係数を乗じた値
によって決定される。色素タンパク質の輝度は、その最大吸光係数で表すことが
できる。
【００６８】 ある態様においては、対象となるタンパク質は、宿主細胞内で発現させると速
やかに折りたたまれる。速やかに折りたたまれるとは、タンパク質がその3次構
造をとり、短時間のうちに色素または蛍光の性質を獲得することを意味する。こ
れらの態様においては、タンパク質は、一般的に約3日を超えない時間で、一般
的には約2日で、またさらに一般的には約1日を超えない時間で折りたたまれる。
【００６９】 対象となる特定のタンパク質は、以下の特定の花虫類種に由来する色素/蛍光
タンパク質（およびそれらの変異体）である：アネモニア・マジャノ（Anemonia
majano）、ハナヅタ（Clavularia）種、ゾアンサス（Zoanthus）種、ディスコ
ソマ・ストリアタ（Discosoma striata）、ディスコソマ（Discosoma）種「赤色
」、アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata）、ディスコソマ（Discosoma）
種「緑色」、ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」。対象となるこれら特定
の種類のポリペプチド組成物について個別に詳しく説明する。
【００７０】 アネモニア・マジャノ（Anemonia majano） この態様のタンパク質の吸収極大は約250 nm〜650 nmの範囲にあり、一般的に
は約400 nm〜500 nmの範囲にあり、さらに一般的には約440 nm〜480 nmの範囲に
ある。また放射極大は典型的には約270 nm〜670 nmの範囲にあり、一般的には約
420 nm〜520 nmの範囲にあり、さらに一般的には約460 nm〜500 nmの範囲にある
。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ酸残
基であり、一般的には約210アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量の範
囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaである。
多くの態様の中で特に関心対象であるのは、配列番号：02に示すアミノ酸配列を
有するamFP486（NFP-1）である。また、この配列の変異型（例えばMut15やMut32
など）も関心対象である。
【００７１】 ハナヅタ（Clavularia）種 この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約250 nm〜650 nmの範囲にあり
、一般的には約400 nm〜500 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約440 nm〜
480 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約270 nm〜670 nmの範囲にあり、一
般的には約420 nm〜520 nmの範囲にあり、さらに一般的には約460 nm〜500 nmの
範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約225アミノ酸〜300アミ
ノ酸であり、一般的には約250アミノ酸残基〜275アミノ酸残基である。分子量の
範囲は通常約25 kDa〜35 kDaであり、一般的には約27.50 kDa〜32.50 kDaである
。特に関心対象であるのは、配列番号：04に示す配列を有するcFP484タンパク質
ならびにその変異体（例えばΔ19 cFP484およびΔ38 cFP484（NFP-2）など）で
ある。
【００７２】 ゾアンサス（Zoanthus）種I この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約300 nm〜700 nmの範囲にあり
、一般的には約450 nm〜550 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約480 nm〜
510 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約320 nm〜720 nmの範囲にあり、一
般的には約470 nm〜570 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜530
nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基
〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基で
ある。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜2
7.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号：06に示すアミノ酸残基を
有するタンパク質zFP506（NFP-3）ならびにこのタンパク質の変異体（例えばN65
M異型など）である。
【００７３】 ゾアンサス（Zoanthus）種II この態様のタンパク質の励起極大は典型的には約300 nm〜650 nmの範囲にあり
、一般的には約475 nm〜575 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜
550 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約310 nm〜660 nmの範囲にあり、一
般的には約485 nm〜585 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約510 nm〜560
nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基
〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基で
ある。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜2
7.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号：08に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質sFP538（NFP-4）ならびにその変異体（例えばM128異型など）
である。
【００７４】 ディスコソマ・ストリアタ（Discosoma striata） この態様のタンパク質の励起極大は典型的には約240 nm〜640 nmの範囲にあり
、一般的には約500 nm〜600 nmの範囲にあり、さらに一般的には約530 nm〜560
nmの範囲にある。放射極大は典型的には約280 nm〜680 nmの範囲にあり、一般的
には約540 nm〜640 nmにあり、またさらに一般的には約570 nm〜600 nmの範囲に
ある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250アミノ
酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分子量
の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDaであ
る。多くの態様において特に関心対象であるのは、配列番号：10に示すアミノ酸
配列を有するタンパク質dsFP483（NFP-5）ならびにその変異体である。
【００７５】 ディスコソマ（Discosoma）種「赤色」 この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約250 nm〜750 nmの範囲にあり
、一般的には約500 nm〜600 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約540 nm〜
580 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約275 nm〜775 nmの範囲にあり、一
般的には約525 nm〜625 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約565 nm〜605
nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基
〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基で
ある。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜2
7.50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号：12に示すアミノ酸配列を
有するdrFP583（NFP-6）タンパク質ならびにその変異体（例えばE5、E8、E5up、
E5down、E57、AG4、AG4Hなど）である。
【００７６】 アネモニア・スルカタ（Anemonia sulcata） この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約370 nm〜770 nmの範囲にあり
、一般的には約520 nm〜620 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約560 nm〜
580 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約395 nm〜795 nmの範囲にあり、一
般的には約545 nm〜645 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約585 nm〜605
nmの範囲にある。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基
〜250アミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基で
ある。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には22.50 kDa〜27.
50 kDaである。特に関心対象であるのは、配列番号：14に示すアミノ酸配列を有
するasFP600（NFP-7）タンパク質ならびにその変異体（例えばMut1など）である
。
【００７７】 ディスコソマ（Discosoma）種「緑色」 この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約300 nm〜700 nmの範囲にあり
、一般的には約450 nm〜650 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約490 nm〜
510 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約310 nm〜710 nmの範囲にあり、一
般的には約460 nm〜660 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約500 nm〜520
nmの範囲にある。対象タンパク質の長さはの範囲は典型的には約200アミノ酸残
基〜250アミノ酸残基であり、一般的には220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基で
ある。分子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜2
7.50 kDdである。特に関心対象であるのは、配列番号：16に示すアミノ酸配列を
有するdgFP512タンパク質（NFP-8）ならびにその変異体である。
【００７８】 ディスコソマ（Discosoma）種「深紅色」 この態様のタンパク質の吸収極大は典型的には約375 nm〜775 nmの範囲にあり
、一般的には約525 nm〜625 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約560 nm〜
590 nmの範囲にある。放射極大は典型的には約395 nm〜795 nmの範囲にあり、一
般的には約545 nm〜645 nmの範囲にあり、またさらに一般的には約580 nm〜610
nmである。対象タンパク質の長さの範囲は典型的には約200アミノ酸残基〜250ア
ミノ酸残基であり、一般的には約220アミノ酸残基〜240アミノ酸残基である。分
子量の範囲は通常約20 kDa〜30 kDaであり、一般的には約22.50 kDa〜27.50 kDa
である。特に関心対象であるのは、配列番号：18に示すアミノ酸配列を有するdm
FP592（NFP-9）タンパク質ならびにその変異体である。
【００７９】 本発明の上述の特定のアミノ酸配列（すなわち配列番号：02〜18）とは配列が
異なる、相同体およびタンパク質（またはそれらの断片）が提供される。相同体
とは、MegAlign、DNAstar（1998）clustalアルゴリズム（ヒギンス（D.G. Higgi
ns）およびシャープ（P.M. Sharp）、「マイクロコンピューター上における、迅
速かつ高感度の複数配列整列（Fast and Sensitive multiple Sequence Alignme
nts on a Microcomputer）」（1989）CABIOS、5：151〜153（使用パラメータはk
tuple 1、gap penalty 3、window 5、およびdiagonals saved 5である）に記載
されている）を用いて決定される、本発明のタンパク質に対して少なくとも約10
％、一般的には約20％、またさらに一般的には少なくとも約30％、また多くの態
様においては少なくとも約35％、一般的には少なくとも約40％、またさらに一般
的には約60％のアミノ酸配列の同一性を有する、タンパク質を意味する。多くの
態様においては、関心対象である相同体には極めて高い配列同一性がある（例え
ば65％、70％、75％、80％、85％、90％、またはそれ以上）。
【００８０】 また、野生型タンパク質と実質的に同一なタンパク質も提供される。実質的に
同一であるとは、タンパク質のアミノ酸配列と野生型のタンパク質の配列との同
一性が少なくとも約60％、一般的には少なくとも約65％、またさらに一般的には
少なくとも約70％であることを意味する。場合によってはこの同一性はさらに高
くなる（例えば75％、80％、85％、90％、95％、またはそれ以上）。
【００８１】 多くの態様においては、対象となる相同体には上述の特定の配列に構造的特徴
がある。このような構造的な特徴にはβカンフォールド（β-can fold）が含ま
れる。
【００８２】 上述した天然のタンパク質の変異体であるタンパク質もまた提供される。変異
体は、野生型（例えば天然の）タンパク質の生物学的特性を保持している場合が
あり、または野生型のタンパク質とは異なる生物学的特性をもつ場合がある。対
象タンパク質の「生物学的特性」という用語には、吸収極大、放射極大、最大吸
光係数、輝度（例えば野生型タンパク質またはオワンクラゲ（A. victoria）の
緑色蛍光タンパク質などの他の標準的なタンパク質と比較する）などのスペクト
ル特性；インビボおよび/またはインビトロにおける安定性（例えば半減期）な
どが含まれるがこれらに限定されない。変異体には、1アミノ酸残基の変化、1残
基または複数の残基のアミノ酸の欠失、N末端の切断、C末端の切断、挿入などが
含まれる。
【００８３】 変異体は、分子生物学の標準的な手法（例えば無作為変異導入法や標的変異導
入法）で作製することができる。本明細書ではいくつかの変異体が提供される。
実施例で代表例を示すことで、また標準的な手法を用いることで、当業者であれ
ば多種多様な付加的な変異体を容易に作製して、生物学的特性が変化したか否か
を調べることができる。例えば蛍光強度は、分光光度計を用いてさまざまな励起
波長で測定することができる。
【００８４】 天然のタンパク質である本発明のタンパク質は、天然の環境以外で存在する（
例えば天然の環境から分離される）。ある態様においては、対象タンパク質は天
然の環境と比較して対象タンパク質が濃縮されている組成物中に存在する。例え
ば精製されたタンパク質が提供される。精製されたとは、タンパク質が非花虫類
の色素/蛍光タンパク質に由来するタンパク質を実質的に含まない組成物中に存
在することを意味する。実質的に含まないとは、組成物の90％未満、一般的には
60％未満、またさらに一般的には50％未満が非花虫類由来の色素タンパク質また
はその変異体で構成されることを意味する。本発明のタンパク質はまた、単離さ
れた状態で存在する場合もある。単離された状態とは、該当するタンパク質が他
のタンパク質および他の天然の生物学的分子（オリゴ糖、ポリヌクレオチド、お
よびそれらの断片など）を実質的に含まないことを意味する。この場合の「実質
的に含まない」とは、単離された状態のタンパク質を含む組成物中の70％未満、
一般的には60％未満、またさらに一般的には50％未満が、他の何らかの天然の生
物学的分子であることを意味する。ある態様においては、このようなタンパク質
は実質的に純粋な状態で存在する。実質的に純粋な状態とは、少なくとも95％、
一般的には少なくとも97％、またさらに一般的には少なくとも99％の純度である
ことを意味する。
【００８５】 天然のタンパク質に加えて、天然のタンパク質とは異なるポリペプチド（例え
ば上述の変異型タンパク質）が提供される。通常このようなポリペプチドは、花
虫類タンパク質をコードする遺伝子の読み枠（ORF）にコードされたアミノ酸配
列を含む。これには、完全長のタンパク質およびその断片、特に生物学的に活性
のある断片、および/または機能領域（例えば膜貫通領域など）に対応する断片
が含まれるほか、対象ポリペプチドと他のタンパク質またはその一部分との融合
体が含まれる。対象断片の長さは、典型的には少なくとも約10アミノ酸であり、
一般的には少なくとも約50アミノ酸であり、また長くて300アミノ酸またはそれ
以上となる場合もあるが一般的には約1000アミノ酸を超えない。この場合、断片
は対象タンパク質と同一のアミノ酸を少なくとも約10アミノ酸、一般的には少な
くとも約15アミノ酸、また多くの態様においては少なくとも約50アミノ酸の長さ
で有する。いくつかの態様においては、対象ポリペプチドの長さは約25アミノ酸
、約50アミノ酸、約75アミノ酸、約100アミノ酸、約125アミノ酸、約150アミノ
酸、約200アミノ酸、約210アミノ酸、約220アミノ酸、約230アミノ酸、または約
240アミノ酸であり、最長でタンパク質全体となる。いくつかの態様においては
、タンパク質断片は野生型タンパク質の生物学的特性のすべてまたは実質的にす
べてを保持する。
【００８６】 対象となるタンパク質およびポリペプチドは天然の供給源から得られるほか、
合成によって得られる。例えば野生型のタンパク質は、タンパク質を発現する生
物の供給源（例えば上述した特定の花虫類種）に由来する場合がある。対象タン
パク質はまた合成で得られる場合もある。（例えば組換え遺伝子、または対象タ
ンパク質をコードする配列をコードする核酸を上述した適切な宿主で発現させる
）。任意の簡便なタンパク質精製法を使用することができる。適切なタンパク質
精製法は、「タンパク質精製の手引書（Guide to Protein Purification）」（D
euthser編）（Academic Press、1990）に記載されている。例えば溶解物は、元
の供給源から調製してHPLC、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、親和性ク
ロマトグラフィーなどで精製することができる。
【００８７】 抗体の組成 対象蛍光タンパク質に特異的に結合する抗体も提供する。適切な抗体は、対象
タンパク質のすべてまたは一部を含むペプチドで宿主動物を免疫化することで得
られる。適切な宿主には、マウス、ラット、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが含
まれる。タンパク質の免疫原の起源は通常、花虫類種である。宿主動物は一般に
、免疫原とは異なる種である（例えばマウスなど）。
【００８８】 免疫原は、完全なタンパク質、またはその断片および誘導体を含む場合がある
。好ましい免疫原はタンパク質のすべてまたは一部を含む。これらの残基は元の
標的タンパク質にみられる翻訳後調節を含む。免疫原は当技術分野で公知のさま
ざまな方法（例えば従来の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現や花虫類種
の分離など）で作られる。
【００８９】 ポリクローナル抗体の調製の第1工程は標的タンパク質による宿主動物の免疫
化である。標的タンパク質は実質的に純粋な状態のもので、含まれる混入物は約
1％未満であることが好ましい。免疫原は完全な標的タンパク質、その断片また
は誘導体を含む場合がある。宿主動物の免疫応答を昂進させるために、標的タン
パク質をアジュバントと結合させる場合がある。適切なアジュバントには、ミョ
ウバン、デキストラン、硫酸塩、高分子量の重合体陰イオン、油水エマルジョン
（例えばフロインドアジュバントやフロインド完全アジュバントなど）が含まれ
る。標的タンパク質を合成担体タンパク質または合成抗原に結合させることもで
きる。さまざまな宿主を免疫化してポリクローナル抗体を産生させることができ
る。このような宿主には、ウサギ、モルモット、齧歯類（例えばマウスやラット
）、ヒツジ、ヤギなどが含まれる。標的タンパク質を一般的には、初期量で宿主
の皮膚内に投与したあとに、1回または複数回（一般的には少なくとも2回）の追
加投与を行う。免疫化後に宿主の血液を採取して血清と血液細胞を分ける。結果
として得られた抗血清中に含まれるIgを、アンモニウム塩による分画法やDEAEク
ロマトグラフィーなどの既知の方法でさらに分画することができる。
【００９０】 モノクローナル抗体は従来の手法で作製する。通常、免疫化した宿主動物の脾
臓および/またはリンパ節が血漿細胞の供給源となる。血漿細胞を骨髄腫細胞と
融合させて不死化させてハイブリドーマ細胞を得る。個々のハイブリドーマの培
養上清を、標準的な方法でスクリーニングして所望の特異性を有する抗体を産生
するハイブリドーマを同定する。ヒトのタンパク質に対するモノクローナル抗体
を産生させるのに適切な動物には、マウス、ラット、ハムスターなどが含まれる
。マウスのタンパク質に対する抗体を産生させる場合は、このような動物は通常
ハムスター、モルモット、ウサギなどである。抗体は、ハイブリドーマ細胞の上
清または腹水から従来の手法（例えば不溶性の支持体やタンパク質Aセファロー
スなどに結合させたタンパク質を用いる親和性クロマトグラフィー）で精製する
ことができる。
【００９１】 抗体は、通常の多量体構造ではなく1本鎖として産生させることができる。1本
鎖の抗体についてはジョスト（Jost）ら（1994） J.B.C. 269：26267〜73および
他の文献に記載されている。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域をコードする
DNA配列を、小分子量の中性アミノ酸（グリシンおよび/またはセリンを含む）の
少なくとも4アミノ酸をコードするスペーサーに連結する。この融合物にコード
されるタンパク質には、元の抗体の特異性および親和性を保持する機能性の可変
領域を集合させることができる。
【００９２】 ある態様においてはヒト化された抗体も対象となる。抗体をヒト化する方法は
当技術分野で公知である。ヒト化抗体は、トランスジェニックのヒト免疫グロブ
リンの定常領域遺伝子を有する動物の産物の場合がある（例えば国際公開公報第
90/10077号および第90/04036号を参照）。また対象となる抗体は、組換えDNA技
術でCH1、CH2、CH3、ヒンジ領域、および/またはフレームワーク（framework）
領域を、対応するヒト配列で置換することで作製することができる（国際公開公
報第92/02190号を参照）。
【００９３】 IgのcDNAをキメラ免疫グロブリン遺伝子の構築に使用することは当技術分野で
公知である（Liuら（1987）P.N.A.S. 84：3439および（1987）J. Immunol. 139
：3521）。抗体を産生するハイブリドーマまたは他の細胞からmRNAを単離してcD
NA作製に用いる。対象となるcDNAは、特異的なプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応で増幅させることができる（米国特許第4,683,195号および第4,683,202
号）。またはライブラリーを作製してスクリーニングを行って対象配列を単離す
る。次に抗体の可変領域をコードするDNA配列をヒトの定常領域配列と融合させ
る。ヒトの定常領域遺伝子の配列については、カバト（Kabat）ら（1991）、Seq uences of Proteins of Immunological Interest 、N.I.H 出版番号91-3242号に
記載されている。ヒトのC領域遺伝子は既知のクローンから容易に入手できる。
アイソタイプを選択する際には、補体結合などの所望のエフェクター機能や抗体
依存性の細胞障害活性を参考とする。好ましいアイソタイプはIgG1、IgG3、およ
びIgG4である。ヒトの軽鎖の定常領域、κ鎖またはλ鎖のいずれかを使用するこ
とができる。次にキメラのヒト化抗体を従来の方法で発現させる。
【００９４】 Fv、F(ab')2、およびFabなどの抗体断片は、完全なタンパク質を例えばタンパ
ク質分解酵素または化学的な切断法で切断することで調製することができる。ま
たは先端が切断された（truncated）遺伝子を設計する。例えばF(ab')2断片の一
部をコードするキメラ遺伝子は、H鎖のCH1領域およびヒンジ領域をコードするDN
A配列と、それに続く翻訳停止コドンを含み、先端の切れた分子を作る。
【００９５】 H領域およびL J領域の共通（consensus）配列は、有用な制限酵素切断部位をJ
領域に導入して、続いてV領域セグメントをヒトのC領域セグメントに連結させる
ためのプライマーとしてのオリゴヌクレオチドを設計する際に用いられる。C領
域のcDNAは、部位特異的変異導入法でヒトの配列中の同様の位置に制限酵素切断
部位を導入して修飾することができる。
【００９６】 発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、YAC、EBV由来のエピソーム
などが含まれる。有用なベクターは、機能が損なわれていないヒトCHまたはCL免
疫グロブリン配列をコードし、任意のVH配列またはVL配列を容易に挿入して発現
させることができるような適切な制限酵素切断部位を備えたベクターである。こ
のようなベクターでは通常、挿入されたJ領域中のスプライス供与体部位と、ヒ
トのC領域の手前にあるスプライス受容体部位間でスプライシングが起こるほか
、ヒトのCHエキソン内で起こるスプライス領域でもスプライシングが起こる。ポ
リアデニル化および転写終結は、コード領域の下流にある本来の染色体部位上で
起こる。結果として生じるキメラ抗体は、レトロウイルスのLTR、例えばSV-40の
初期プロモーター（Okayamaら（1983）Mol. Cell. Bio. 3：280）、ラウス肉腫
ウイルスのLTR（Gormanら、（1982）、P.N.A.S. 79：6777）、およびモロニーマ
ウス白血病ウイルスのLTR（Grosschedlら、（1985）Cell 41：885）、天然のIg
プロモーターなどの任意の強力なプロモーターに連結することができる。
【００９７】 トランスジェニック 対象となる核酸を使用して、トランスジェニックの非ヒト植物または動物を作
製することができるほか、または細胞系列内で部位特異的な遺伝子修飾を導入す
ることができる。本発明のトランスジェニック細胞には、導入遺伝子として存在
する、本発明の一つまたは複数の核酸が含まれる。この定義には、導入遺伝子を
含むように形質転換された親細胞およびその子孫が含まれる。多くの態様におけ
るトランスジェニック細胞は、本発明の核酸を通常含まない細胞である。トラン
スジェニック細胞が天然の状態で対象核酸を含む態様においては、この核酸は細
胞内において天然の位置とは異なる場所に存在する。すなわち細胞ゲノム上の天
然とは異なる場所に組み込まれる。トランスジェニック動物は相同組換えを介し
て作製することができる。この場合、内在性の座位は変化する。あるいは核酸構
築物は、ゲノム上に無作為に組み込まれる。安定に組み込まれるベクターには、
プラスミド、レトロウイルス、および他の動物のウイルス、YACなどがある。
【００９８】 本発明のトランスジェニック生物は、内因性遺伝子の発現を消失させはしない
にせよ少なくとも低下させた、内因性遺伝子をノックアウトした細胞および多細
胞生物（例えば植物および動物）を含む。対象となるトランスジェニック生物は
また、タンパク質またはその異型が、通常は発現しないか、および/または細胞
または組織内に通常みられるレベルとは異なるレベルで発現する細胞または組織
で発現する、例えば植物および動物などの細胞および多細胞生物も含む。
【００９９】 相同組換えに用いるDNA構築物は、本発明の遺伝子の少なくとも一部を含む。
この遺伝子には所望の遺伝的修飾があり、標的座位に対して相同な領域が含まれ
る。無作為に組み込ませるためのDNA構築物は組換えに関与する相同領域を含む
必要がない。陽性または陰性の選択に用いるマーカーを含むことは有用である。
相同組換えを介した標的遺伝子修飾を有する細胞を作製する方法は当技術分野で
公知である。動物細胞をトランスフェクトするさまざまな手法は、キーオン（Ke
own）ら（1990）、Meth. Enzymol. 185：527〜537に記載されている。
【０１００】 胚幹細胞（ES細胞）を得るためには、ES細胞系列を使用するか、または宿主（
例えばマウス、ラット、モルモットなど）から新鮮な状態で胚細胞を得る。この
ような細胞を適切な線維芽細胞支持細胞層で生育させるか、または白血病抑制因
子（LIF）の存在下で生育させる。ES細胞または胚細胞を形質転換する際は、そ
れらをトランスジェニック動物を作製するために使用する場合がある。形質転換
後に細胞を適切な培地中の支持細胞層にプレーティングする。構築物を含む細胞
を選択培地を用いて検出することができる。コロニーが生育するために十分な時
間が経過した後に、構築物の相同組換えまたは組込みが起きたか否かについてコ
ロニーを選抜して検討する。次に陽性を示すコロニーを用いて胚の操作および胚
盤胞への注入を行う。胚盤胞は4週齢〜6週齢の過排卵状態の雌から回収する。ES
細胞をトリプシン処理して細胞を修飾し、胚盤胞の胞胚腔に注入する。注入後に
胚盤胞を偽妊娠状態の雌の個々の子宮角に戻す。次にこれらの雌が妊娠満期にな
るのを待ち、生まれた子孫を対象に構築物の有無についてスクリーニングを行う
。胚盤胞の異なる表現型と、遺伝学的に修飾した細胞が提供されることで、キメ
ラの子孫を容易に検出することができる。
【０１０１】 キメラ動物を対象に、修飾遺伝子の有無についてスクリーニングを行い、また
修飾を有する雄ならびに雌を交配させてホモ接合の子孫を得る。遺伝子修飾が原
因で発生のある時点で致死となる場合は、組織または器官は、同種の（allogene
ic）移植片または類遺伝子性の（congenic）移植片もしくは移植体、またはイン
ビトロ培養で維持することができる。トランスジェニック動物は実験用動物や家
畜などのヒト以外の哺乳類とすることができる。トランスジェニック動物は、機
能に関する研究や薬剤スクリーニングなどに使用することができる。トランスジ
ェニック動物の用途の代表例には後述する動物が含まれる。
【０１０２】 トランスジェニック植物を同様の方法で作製することができる。トランスジェ
ニック植物の細胞および植物体を調製する方法は、参照として開示が本明細書に
組み入れられる米国特許第5,767,367号；第5,750,870号；第5,739,409号；第5,6
89,049号；第5,689,045号；第5,674,731号；第5,656,466号；第5,633,155号；第
5,629,470号；第5,595,896号；第5,576,198号；第5,538,879号；第5,484,956号
に記載されている。トランスジェニック植物を作製する方法は「植物生化学およ
び分子生物学（Plant Biochemistry and Molecular Biology）」（LeaおよびLee
good編、John WileyおよびSons）（1993）の275〜295ページでも概説されている
。手短に言えば、植物種の性質に応じて適切な植物の細胞または組織を回収する
。したがって状況によってはプロトプラストを単離する。プロトプラストは多種
多様な植物組織（例えば葉、胚軸、根など）から単離することができる。プロト
プラストを単離する際には、細胞壁を除くために、回収した細胞をセルラーゼと
ともにインキュベートする。詳細なインキュベーションの条件は、細胞を回収す
る供給源である植物および/または組織の種類に応じて変わる。結果として得ら
れたプロトプラストを次に、ふるいにかけて遠心して細胞片から分離する。プロ
トプラストを使う代わりに、体細胞を含む胚形成外植片を用いてトランスジェニ
ック宿主を調製することができる。細胞または組織を回収した後に関心対象の外
因性DNAを植物細胞に導入する。この際、多種多様な導入法を用いることができ
る。単離されたプロトプラストを対象に、DNAを介した遺伝子導入プロトコルに
よる導入を行う。導入法は以下を含む：プロトプラストを裸のDNA（例えば多価
陽イオン（PEGまたはPLOなど）の存在下で、関心対象の外因性コード配列を含む
プラスミド）とともにインキュベートする；また、対象となる外因性配列を含む
裸のDNAの存在下でプロトプラストの電気泳動を行う。次に、外因性DNAを取り込
むことに成功したプロトプラストを選択してカルスに成長させ、最終的には、適
切な量および比率の促進因子（例えばオーキシンおよびサイトカイン）と接触さ
せてトランスジェニックの植物体に生育させる。胚形成の外移植片の場合は、標
的となる体細胞に外来DNAを簡便に導入する際に、粒子加速法すなわち「遺伝子
銃（gene-gun）」プロトコルを用いる。次いで、結果として得られた外移植片を
キメラ植物体に生育させ、交配してトランスジェニックの子孫を得る。上記の裸
のDNAを用いる方法以外の、トランスジェニック植物の別の簡便な作製法がアグ
ロバクテリウムを介した形質転換法である。アグロバクテリウムを介した形質転
換法では、外来DNAを含む融合体（co-integrative）ベクターまたはバイナリー
（binary）ベクターを調製して、それを適切なアグロバクテリウム株（例えばA.
tumefaciens）に導入する。結果として得られた細菌を次に、調製済みのプロト
プラストまたは組織移植片（例えば葉のディスク）とともにインキュベートして
カルスを生じさせる。次にカルスを選択条件で生育させ、選択して培地中で根お
よび茎頂の生育を誘導させることで最終的にトランスジェニック植物を得る。
【０１０３】 有用性 対象となる色素タンパク質およびその蛍光変異体は多種多様な応用で使用され
る。応用は、対象タンパク質が色素タンパク質かまたは蛍光タンパク質かのいず
れかによって必然的に変わる。個々の種類のタンパク質の代表的な用途を以下に
説明する。記載した用途はあくまで代表的なものであり、対象タンパク質の用途
を以下の記述に制限する意図はない。
【０１０４】 色素タンパク質 本発明で対象となる色素タンパク質は多種多様な応用で使用される。対象とな
る一つの応用は、対象タンパク質を、特定の組成物に色を付けたりまたは色素を
加えることができる着色剤として使用することである。ある態様において特に関
心対象であるのは毒性のない色素タンパク質である。対象となる色素タンパク質
は多種多様な組成物に取り込ませることができる。代表的な組成物には、食品成
分、医薬品、化粧品、生物（例えば動物や植物）などがある。着色剤または色素
として使用する場合は、十分量の色素タンパク質を組成物に取り込ませて、所望
の色または色素を付ける。色素タンパク質は、任意の簡便なプロトコルを用いて
組成物に取り込ませることができる。使用する特定のプロトコルは、少なくとも
部分的には着色対象組成物の性質に必然的に依存する。使用するプロトコルには
、混合（blending）、拡散（diffusion）、摩擦（friction）、吹きつけ（spray
ing）、注入（injection）、入れ墨（tattooing）など含まれるがこれらに限定
されない。
【０１０５】 色素タンパク質はまた、分析物の検出アッセイ法（例えば対象となる生物学的
分析物のアッセイ法）の標識としても使用される。例えば色素タンパク質は、分
析物に特異的な抗体またはその結合断片とともに付加物に取り込まれたあとに、
複合試料中で、対象分析物のイムノアッセイ法で用いられる。この手順は参照と
して開示が本明細書に組み入れられる米国特許第4,302,536号に記載されている
。抗体またはその結合断片ではなく、対象色素タンパク質またはその色素生産性
断片を、対象分析物または他の部分に特異的に結合するリガンド、成長因子、ホ
ルモンなどと結合させることができる。これらは当業者には容易に理解される。
【０１０６】 さらに別の態様においては、対象色素タンパク質は、組換えDNAの応用（例え
ば上述のトランスジェニックの細胞および生物の作製）で選択マーカーとして使
用できる。したがって、成功または不成功のプロトコルのいずれかに対する、選
択マーカーとして対象色素タンパク質の発現を利用するために、特定のトランス
ジェニック作製プロトコルを作ることができる。したがって、特定の工程で産生
されたトランスジェニック生物の表現型における対象色素タンパク質の色の外観
は、特定の生物が対象導入遺伝子を良好に保持する（多くの場合は生物において
導入遺伝子を発現するように組み込まれる）ことを示すために使用することがで
きる。選択マーカーとして使用する場合は、対象色素タンパク質をコードする核
酸を、遺伝子導入体の作製過程（既に詳述）で使用することができる。対象タン
パク質を選択マーカーとして用いる対象となる特定のトランスジェニック生物に
は、トランスジェニックの植物、動物、細菌、真菌などが含まれる。
【０１０７】 さらに別の態様においては、本発明の色素タンパク質（および蛍光タンパク質
）は、国際公開公報第00/46233号に記載されたタンパク質の使用法と同様に、選
択フィルターなどとして日焼け止め剤に使用される。
【０１０８】 蛍光タンパク質 本発明の対象となる蛍光タンパク質（ならびに上記の本発明の他の組成物）は
、多種多様な応用で使用される。応用には以下のものが含まれるがこれらに限定
されない。対象となる最初の応用では、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）への応
用で対象タンパク質を使用する。この応用では、対象タンパク質は、第2の蛍光
タンパク質または色素（例えばMatzら、Nature Biotechnology（1999年10月）17
：969〜973に記載された蛍光タンパク質）、オワンクラゲ（Aequoria victoria
）の緑色蛍光タンパク質またはその蛍光変異体（例えば参照として開示が本明細
書に組み入れられる米国特許第6,066,476号；第6,020,192号；第5,985,577号；
第5,976,796号；第5,968,750号；第5,968,738号；第5,958,713号；第5,919,445
号；第5,874,304号に記載）、他の蛍光色素（例えばクマリンおよびその誘導体
（例えば7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン）、ボディピー（Bodipy
） FLなどのボディピー色素、カスケードブルー、フルオレセイン、およびその
誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアナート）、オレゴングリーン、ロー
ダミン色素（例えばテキサスレッド、テトラメチルローダミン、エオシン、およ
びエリトロシン）、シアニド色素（例えばCy3およびCy5）、ランタノイドイオン
の大環状キレート（例えば量子色素など）、化学発光色素（例えばルシフェラー
ゼ、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,843,746号；第5,7
00,673号；第5,674,713号；第5,618,722号；第5,418,155号；第5,330,906号；第
5,229,285号；第5,221,623号；第5,182,202号に記載されたものを含む））と組
み合わせて供与体および/または受容体としてはたらく。使用される可能性のあ
る対象蛍光タンパク質を使用するFRETアッセイ法の特定の例は、以下の例を含む
がこれらに限定されない：タンパク質-タンパク質相互作用の検出（例として、
多種多様な事象に対するバイオセンサーとしてはたらく、哺乳類のツーハイブリ
ッド（two-hybrid）系、転写因子の二量体化、膜タンパク質の多量体化、多タン
パク質複合体の形成など。この場合、ペプチドまたはタンパク質は、対象蛍光タ
ンパク質および連結用のペプチドまたはタンパク質を含むFRET蛍光コンビネーシ
ョンと共有結合するし、例としてタンパク質分解酵素に特異的な基質、例として
カスパーゼによる切断では、FRETを上昇または下降させるシグナル受けて立体構
造の変化を受けるリンカー、例としてPKA調節領域（cAMPセンサー）、リン酸化
（例えばリンカー内にリン酸化部位があるか、またはリンカーに別のタンパク質
のリン酸化/脱リン酸化された領域に対する結合特異性があるか、またはリンカ
ーにCa2+結合領域がある）。対象タンパク質を使用する代表的な蛍光共鳴エネル
ギー移動すなわちFRETの応用は、以下のものを含むがこれらに限定されない：米
国特許第6,008,373号；第5,998,146号；第5,981,200号；第5,945,526号；第5,94
5,283号；第5,911,952号；第5,869,255号；第5,866,336号；第5,863,727号；第5
,728,528号；第5,707,804号；第5,688,648号；第5,439,797号、これらは参照と
して開示が本明細書に組み入れられる）。
【０１０９】 対象蛍光タンパク質はまた、原核生物および真核生物の細胞におけるバイオセ
ンサー（例えばCa2+イオンインジケーター、pHインジケーター、リン酸化インジ
ケーター、他のイオン（例えばマグネシウム、ナトリウム、カリウム、塩化物、
およびハロゲン）のインジケーター）として使用される。例えば、Caイオンを検
出する際は、EFハンドモチーフを含むタンパク質がCa2+の結合を受けて細胞質か
ら膜へ移動することが知られている。このようなタンパク質は、同タンパク質の
他の領域との疎水性相互作用により分子の奥に埋め込まれたミリストイル基を含
む。Ca2+が結合すると立体構造が変化してミリストイル基が露出し、脂質二重膜
への挿入に利用される（「Ca2+-ミリストイルスイッチ」と呼ばれる）。タンパ
ク質を含むこのようなEFハンドが蛍光タンパク質（FP）と融合すると、共焦点顕
微鏡で細胞質から形質膜への移動を追跡することで細胞内Ca2+のインジケーター
とすることができる。この系における用途に適したEFハンドをもつタンパク質に
はリカバリン（1-3）、カルシニューリンB、トロポニンC、ヴィシニン（visinin
）、ニューロカルシン、カルモジュリン、パルブアルブミンなどがあるがこれら
に限定されない。pHについては、ヒサクトフィリン（hisactophilin）を基にし
た系を用いることができる。ヒサクトフィリンはミリストイル化されたヒスチジ
ンに富むタンパク質であり、粘菌（Dictyostelium）に存在することが知られて
いる。ヒサクトフィリンとアクチンおよび酸性脂質への結合は、細胞質のpH変動
の範囲内で明確にpH依存性を示す。生細胞の膜への結合は、ヒサクトフィリンと
アクチンフィラメントの相互作用に優先すると考えられる。pHが6.5以下の場合
はそれらは形質膜および核に存在する。これとは対照的にpH 7.5では細胞質空間
全体に均等に分布する。このような分布の変化は可逆的であり、分子表面上にル
ープ状に露出したヒスチジンクラスターの影響を受ける。細胞質のpH変動の範囲
内における細胞内分布の復帰は、ヒスチジン残基のpKが6.5であることと矛盾し
ない。このような細胞内分布は、タンパク質のミリストイル化とは無関係である
。FP（蛍光タンパク質）をヒサクトフィリンに融合させることで、融合タンパク
質の細胞内分布を、レーザースキャニング、共焦点顕微鏡、または標準的な蛍光
顕微鏡で追跡することができる。定量的な蛍光分析は、細胞全体を対象としたラ
インスキャン（レーザースキャニングを用いた共焦点顕微鏡）、または他の電子
データの分析（例えばメタモルフ（metamorph）ソフトウェア（Universal Imagi
ng Corp）を用いて、細胞集団を対象に集めたデータを平均化する）を実施する
ことで行われる。細胞質から形質膜に向かう実質的にpH依存性のヒサクトフィリ
ン-FPの再分布は1分〜2分内に完了して5分〜10分後には定常状態となる。逆反応
は同様の時間尺度で起きる。したがって同様の様式ではたらくヒサクトフィリン
-蛍光タンパク質の融合タンパク質は、生きている哺乳類細胞の細胞質のpH変化
を同時進行で追跡するために使用することができる。このような方法は、高いス
ループットの応用（例えば成長因子受容体（例えば上皮または血小板由来成長因
子）の活性化、化学走性刺激/細胞移動の結果としての細胞内pH変化の検出、2次
メッセンジャーとしての細胞内pH変化の検出、pHを操作する実験における細胞内
pHのモニタリングなど）で使用される。PKC活性を検出する際には、レポーター
系は、MARCKS（ミリストイル化されたアラニンに富むCキナーゼの基質）と呼ば
れる分子がPKCの基質であるという事実を利用する。これは、ミリストイル化お
よび静電的相互作用を介して負に帯電した形質膜に結合する正に帯電したアミノ
酸（ED領域）の連続により形質膜に固定される。PKCが活性化されるとED領域はP
KCによってリン酸化されることで負に帯電するようになり、静電気的な反発の結
果としてMARCKSは形質膜から細胞質へ移動する（「ミリストイル静電的スイッチ
」と呼ばれる）。ミリストイル化モチーフからMARCKSのED領域までのMARCKSのN
末端を本発明の蛍光タンパク質と融合させると、上述したPKC活性の検出系とな
る。PKCによりリン酸化されると、融合タンパク質は形質膜から細胞質へ移動す
る。この移動は、標準的な蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡（例えばセロミックス
（Cellomics）技術または他の高コンテントスクリーニング系（High Content Sc
reening System）（例えばUniversal Imaging Corp./Becton Dickinson）を使用
）で追跡できる。上述のレポーター系は、高コンテントスクリーニング（例えば
PKC阻害剤のスクリーニング）に応用できるほか、この情報伝達経路を干渉する
と考えられる試薬に対する多くのスクリーニング条件におけるPKC活性のインジ
ケーターとして使用することができる。蛍光タンパク質をバイオセンサーとして
使用する方法は、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第972,63
8号；第5,824,485号、および第5,650,135号に記載された方法（ならびに本明細
書で引用した方法）も含む。
【０１１０】 対象蛍光タンパク質はまた、顕微鏡画像および電気的分析を用いた、蛍光レポ
ーティング基を発現する細胞アレイ（array）の自動スクリーニングが関与する
応用においても使用される。スクリーニングは、薬剤探索や機能ゲノム科学分野
で利用することができる。この場合、例えば対象タンパク質を全細胞のマーカー
として使用して、多細胞の再編成および移動（例えば内皮細胞による多細胞性細
管の形成（血管形成）、フルオロブロックインサート系（Fluoroblok Insert Sy
stem）（Becton Dickinson Co.）を介した細胞移動、創傷治癒、神経突起伸長な
ど）の変化を検出する。この場合、タンパク質はペプチド（例えば標的配列）に
融合するマーカーとして使用され、例えば細胞内活動のインジケーターとしての
細胞内局在の変化を可能とするタンパク質である。細胞内活動の例を以下に挙げ
る：キナーゼなどの情報伝達、タンパク質キナーゼC、タンパク質キナーゼA、転
写因子NF-κB、およびNFATなどの刺激を受けた結果の転写因子のトランスロケー
ション；細胞周期にかかわるタンパク質（サイクリンA、サイクリンB1、および
サイクリンE）；タンパク質分解酵素による切断とそれに続く切断後基質である
リン脂質の、高コンテントスクリーニングの手段としての小胞体、ゴルジ装置、
ミトコンドリア、ペルオキシソーム、核、核小体、形質膜、ヒストン、エンドソ
ーム、リソソーム、微小管、アクチンなどの細胞内構造のマーカーを伴う移動；
他の蛍光融合タンパク質と、細胞内蛍光融合タンパク質/ペプチドの運動を示す
インジケーターとして、またはマーカー単独としてのこれらの局在化マーカーと
の共存など。対象蛍光タンパク質を使用する細胞アレイの自動スクリーニングを
含む応用例は、参照として本明細書に含まれる米国特許第5,989,835号と同様に
、国際公開公報第00/17624号；国際公開公報第00/26408号、国際公開公報第00/1
7643号、および国際公開公報第00/03246号を含む。
【０１１１】 対象蛍光タンパク質は高いスループットのスクリーニングアッセイ法でも使用
される。対象蛍光タンパク質は半減期が24時間を上回る安定なタンパク質である
。また、半減期がより短く、薬剤探索の転写レポーターとして使用可能な対象蛍
光タンパク質の不安定化変形も提供する。例えば本発明のタンパク質を、半減期
の短いタンパク質に由来するタンパク質分解シグナル配列と推定される配列（例
えばマウスのオルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子のPEST配列やマウスのサイク
リンB1破壊ボックスおよびユビキチンなど）と融合させることができる。情報伝
達経路で作用するプロモーターを、薬剤スクリーニングを目的とした対象蛍光タ
ンパク質の不安定化された変形（例えばAP1、NFAT、NF-κB、Smad、STAT、p53、
E2F、Rb、myc、CRE、ER、GR、およびTREなど）を用いて検出することができる。
【０１１２】 対象タンパク質を2次メッセンジャー検出因子（detector）として使用するこ
とができる。この場合、例えば対象タンパク質を特定の領域（例えばPKC-γのCa
結合領域、PKC-γのDAG結合領域、SH2領域およびSH3領域など）に融合させる。
【０１１３】 分泌型の対象タンパク質は例えば、分泌型のリーディング（leading）配列を
対象タンパク質に融合させて、最終的に多種多様な応用で使用可能な分泌型の対
象タンパク質を構築することで調製することができる。
【０１１４】 対象タンパク質はまた、蛍光活性化細胞選別における応用に使用される。この
応用では、対象蛍光タンパク質を細胞集団に印を付ける標識として使用し、標識
細胞集団を次に当技術分野で公知の蛍光活性化細胞選別装置で選別する。FACS法
は、参照として開示が本明細書に組み入れられる米国特許第5,968,738号および
第5,804,387号に記載されている。
【０１１５】 対象タンパク質はまた、動物（例えばトランスジェニック動物）用のインビボ
におけるマーカーとしても使用される。例えば対象タンパク質の発現を組織特異
的なプロモーターで駆動することができる。このような方法は他の応用における
遺伝子治療の研究、例えば導入遺伝子の発現効率の試験で使用される。対象タン
パク質のこの種の応用を説明するトランスジェニック動物における蛍光タンパク
質の代表的な応用は、参照として開示が本明細書に組み入れられる国際公開公報
第00/02997号に記載されている。
【０１１６】 対象タンパク質の他の応用例は以下を含む：細胞または動物への注入後のマー
カーおよび、定量的測定の較正時に使用するマーカー（蛍光およびタンパク質）
；細胞の生死をモニタリングする酸素バイオセンサー装置におけるマーカーまた
はレポーター；動物、ペット、おもちゃ、食品などのマーカーまたは標識。
【０１１７】 対象蛍光タンパク質はタンパク質分解酵素切断アッセイ法にも使用される。例
えば、対象タンパク質を用いて、切断不活性化蛍光アッセイ法を開発することが
できる。この場合、対象タンパク質を、タンパク質の蛍光特性を無効とすること
なく、タンパク質分解酵素に特異的な切断配列を含むように作製する。活性化し
たタンパク質分解酵素により蛍光タンパク質が破壊されると、機能性発色団が破
壊されるために蛍光は急激に減少すると思われる。あるいは対象タンパク質を用
いて、切断により活性化される蛍光を開発することができる。この場合、対象タ
ンパク質を発色団の極めて近位または内部に付加的なスペーサー配列を含むよう
に作製する。このような異型の蛍光活性は、機能性発色団の一部がスペーサーで
分断されることから有意に低下すると思われる。スペーサーの両側には、2か所
の同一なタンパク質分解酵素特異的切断部位が置かれる。活性化されたタンパク
質分解酵素によって切断されると、スペーサーが切断されて、蛍光タンパク質の
2つの残存する「サブユニット（subunit）」が再集合して機能性の蛍光タンパク
質を生じると考えられる。上述の応用の両種類とも、多種多様な型のタンパク質
分解酵素（例えばカスパーゼなど）を対象としたアッセイ法で開発できると考え
られる。
【０１１８】 対象タンパク質はまた、生物学的な膜内のリン脂質組成物を決定するアッセイ
法に使用することもできる。例えば、特定のリン脂質を結合させて、生物学的な
膜におけるリン脂質分布のパターンの局在/可視化を可能とし、さらに特定のリ
ン脂質小領域における膜タンパク質の共存を可能とする対象タンパク質の融合タ
ンパク質（または対象タンパク質の共有結合または非共有結合による修飾の他の
任意の種類）は、対象タンパク質を用いて達成することができる。例えばGRP1の
PH領域は、ホスファチジルイノシトール三リン酸（PIP3）に対しては高い親和性
を示すが、PIP2には親和性を示さない。したがって、GRP1のPH領域と対象タンパ
ク質との融合タンパク質を構築することで、生物学的な膜上にPIP3に富む領域を
特異的に標識することができる。
【０１１９】 対象タンパク質のさらに別の応用は、蛍光タンパク質の加齢を伴う、一つの蛍
光色素を別の蛍光色素（例えば緑色から赤色）へ切り替える蛍光タイマーを用い
て遺伝子発現（例えば発生関連遺伝子の発現、細胞周期に依存する遺伝子の発現
、慨日リズムに特異的な遺伝子の発現など）の活性化/非活性化を判定すること
である。
【０１２０】 上述した本発明の抗体は、対象タンパク質と他の蛍光タンパク質の区別を含む
いくつかの応用でも使用される。
【０１２１】 キット 本発明では、一つまたは複数の上述の応用を実施する際に使用されるキットも
提供する。この場合、対象となるキットは、対象となる方法に用いる色素タンパ
ク質または蛍光タンパク質を含むほか、タンパク質（例えば対象タンパク質のコ
ード領域を含むベクターを含む構築物）を作製する方法を含む。したがってタン
パク質または構築物は、適切な保存用溶媒（例えば緩衝液）中に、典型的には適
切な容器内に存在する。対象キットには提供されるタンパク質に対する抗体が存
在する場合もある。ある態様においては、キットは複数の異なるベクターを含み
、各ベクターは対象タンパク質をコードする。この場合ベクターは、異なる環境
および/または異なる条件で発現するように設計される。例えばベクターが、哺
乳類細胞における強力な発現プロモーターを含む場合は構成的に発現する。この
ほかに使用者が任意のプロモーターを挿入して意図した発現を行うことができる
、マルチクローニングサイトがあってプロモーターのないベクターを含む場合も
ある。
【０１２２】 以下に挙げる実施例は、説明を目的として提供するものであって、制限する意
図はない。
【０１２３】 実験 I．野生型の花虫類タンパク質 下表に、本発明の9種の特定の野生型花虫類タンパク質の特性をまとめた：
【０１２４】
【表１】 *相対量子収量は、オワンクラゲ（A. victoria）のGFPの量子収量と比較して決
定した。 **相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria
）のGFPに関する同値で割った値である。
【０１２５】 II．amFP486の特性およびその変異体 A．amFP486変異体の構築 amFP486の2種の変異体（Mut15およびMut32）を作製した。野生型であるamFP48
6と比較して、Mut15には以下の点突然変異がある：101位におけるA→G（番号はA
TGを開始点とする）；129位におけるT→C；202位〜204位におけるAAA→TTG；240
位におけるC→T。Mut32には野生型に対して2か所のアミノ酸の置換（Asn-34→Se
r；およびLys-68→met）がある。表2にMut15およびMut32のスペクトル特性を示
す。
【０１２６】
【表２】 単離されたMut15およびMut32のスペクトル特性 *相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria）
のGFPに関する同値で割った値である。
【０１２７】 B．ベクターの構築と機能分析 Mut32のDNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクターのBamHIおよびNotI
制限酵素切断部位に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEG
FP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。
【０１２８】 作製したベクターの機能に関する試験を、293細胞に一過的にトランスフェク
トすることで行った。24時間発現させた後にpECFP-N1と並べて比較したところ、
pCNFPMut32-N1の蛍光強度がより明るく、光退色が弱いことが顕微鏡による観察
で明らかとなった。
【０１２９】 Mut32の折りたたみは迅速であり蛍光強度は強いことから、いくつかの応用に
おいて有用である。PKC-γ-CNFPを始めとするいくつかの融合タンパク質につい
て検討を行った。細胞をPMA（ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸）で処理する
とPKCが細胞質から形質膜へ移動することがわかった。
【０１３０】 C．転写レポーターとしての不安定化されたamFP486ベクターの作製 3種の不安定化されたamFP486ベクターを、d1、d2、およびd376などの異なるマ
ウスODC分解領域を野生型amFP486のC末端に融合させて構築した。このベクター
はEGFP-N1を主鎖として構築した。
【０１３１】 pCRE-d1CNFPとpNF-κB-d1CNFPの両ベクターは、d1CNFPをそれぞれcAMP応答配
列（CRE）またはNF-κB応答配列の下流に配置して構築した。d1CNFPの発現は、
これらの応答配列の活性化によって上方制御される。
【０１３２】 D．不安定化されたamFP486の機能分析 不安定化されたamFP486の機能に関する試験を、293細胞に一過的にトランスフ
ェクトすることで行った。24時間発現させた後に、蛍光強度はd2、d1、d376の順
に低下した。これは、異なるマウスODC分解領域と融合させたためである。タン
パク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで4時間処理しても、d2の蛍光強度は
それほど変化しなかったが、d1の蛍光強度は元の強度に比べてさらに50％低下し
た。d1の半減期はおよそ4時間である。
【０１３３】 MODCd1は、転写レポーターとしての応用上、有用な手段である。しかしEGFP-d
1（半減期1時間）と比べてpCNFP-MODCd1の半減期（4時間）はさらに長いため、
半減期が短い変形を得るためにはMODC分解領域にさらに変異を導入する必要があ
る。
【０１３４】 pCRE-d1CNFPとpNF-κB-d1CNFPの両ベクターの機能に関する試験を、HEK293細
胞に一過的にトランスフェクトすることで行った。トランスフェクトしてから16
時間後に10μmのフォルスコリンを添加してCREを誘導し、100 ng/mlのTNF-αを
添加してNF-κBを6時間かけて誘導した。d1CNFPの発現はFACS Caliburで分析し
た。フォルスコリン誘導性のCRE活性化による蛍光の最大7倍の上昇と、TNF-αで
誘導したNF-κB活性化による蛍光の4倍の上昇が認められた（データは示してい
ない）。
【０１３５】 E．ヒト化されたMut32（phCNFP-N1）の構築と機能試験 哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞
で良好に発現させるためには、ヒトに適したコドンを採用した変形が必要である
。ヒト化されたMut32を作製するために、最初にMut32の配列をヒトで使用される
ことの多いコドンに変えて、23のオリゴ（12Fおよび11R）を設計した。次に各回
が20サイクルからなるPCR増幅を4回にわたって行った。PCRのサイクルは以下の
ように設定した：94℃で1分間；94℃で1分間；40℃で1分間、また72℃で1分間。
この4回の内訳は以下の通りであった：第1回では2 μlの4種の各オリゴ（60 bp
）、5 μlの緩衝液、1 μlのpfu、1 μlのdNTPを混合して総容量50 μlとした。
20サイクルのPCRを行った後に、5セットの150 bp、および1セットの90 bpの4 ラ
スト（last）オリゴ産物を得た。第2回では各10 μlの新たな粗PCR産物、5 μl
の緩衝液、1 μlのpfu、1 μlのdNTPを混合して総容量50 μlとした。20サイク
ルのPCRを行った後に、2セットの270 bpおよび1セットの210 bpのPCR産物を得た
。第3回では新たな粗PCR産物を混合した。20サイクルのPCRを行った後に、1セッ
トの510 bpおよび1セットの450 bpの産物を得た。第4回では、新たな粗産物を混
合した。20サイクルのPCRを行った後に最終PCR産物（690 bp）を得た。1Fおよび
11Rのプライマーを用いてさらにPCR増幅を行った。結果としてヒト化されたMut3
2が得られた。このヒト化されたMut32をEGFP-N1を主鎖とするベクターに挿入し
た。
【０１３６】 F．哺乳類細胞における野生型および変異型のamFP486の発現 元のプラスミドamFP486 DNA（野生型、pQE30上のMut15およびMut32）を用いて
、上述したN1型のamFP486野生型、Mut15、およびMut32を構築した。このDNAを大
腸菌DH5αに導入した。カルシウムリン酸法（Clontech製品番号K2051-1）で3種
のN1構築物をHEK293細胞に移した。
【０１３７】 導入細胞の蛍光強度をFL1（510/30）検出用チャンネルを備えたFACSで分析し
た。各構築物につき5種の試料を平行して分析した。各試料のM1集団のFL1の蛍光
強度の平均値を表3にまとめる。各構築物（野生型、Mut15、およびMut32）の平
均値の補正後の平均には有意差がないことがわかる。
【０１３８】
【表３】 M1集団のFL1蛍光強度
【０１３９】 G．融合タンパク質Mut15-mdm2の作製および発現 Mut15-mdm2融合体を以下の手順で作製した：第1にヒトのMarathon cDNAライブ
ラリー（Burke'sリンパ腫）を以下のプライマーを用いて増幅することでmdm2 DN
Aを得た： （配列番号：19）および （配列番号：20）；第2に、精製後のPCR産物を以下のプライマー： （配列番号：21）および （配列番号：22） で増幅することで、コザック（Kozac）配列および制限酵素切断部位を導入した
；第3に、工程2で得た精製後のPCR産物をEcoRIとSmaIで切断し、それをNFP1Mut1
5-N1ベクターのEcoRIおよびSmaIに挿入した（このベクターはpEGFP-N1主鎖のBam
HI部位およびNotI部位を用いて作製した）。生じたMut15-mdm2融合体を次にHEK2
93細胞中で発現させた。
【０１４０】 H．タンパク質の蛍光強度の比較 PQE30 amFP486野生型、Mut15、およびMut32でDH5αを形質転換した。この細菌
を1 mMのIPTGの存在下で一晩生育させてタンパク質の発現を誘導した。細胞を10
0 mMのトリス、pH 8.0中で超音波処理を行い溶解した。室温で3000 rpmで15分間
遠心して細胞溶解物を回収した。タンパク質をTALONメタル親和性樹脂（Metal A
ffinity Resin）を用いて精製した。手短に説明すると、タンパク質を樹脂に吸
着させた後にビーズを段階的に洗浄（1回目の洗浄を行った後に1回目の溶出（50
mMのイミダゾール）を行う）した後に、100 mMのTris-HCl、pH 8.0中で2回目の
溶出（200 mMのイミダゾール）を行った。タンパク質は、大部分が2回目の工程
の溶出液中にあることがわかる。Mut32の細菌発現レベルが最も高く、Mut15が最
も低いことがわかった。
【０１４１】 各溶出分画試料をSDS-PAGEに流してタンパク質の純度を確認した。野生型のam
FP486とMut32のいずれもが単一のバンドを示すが、Mut15では高分子量の2本のマ
イナーバンドがさらに認められる（データは示していない）。
【０１４２】 タンパク質濃度（分画II-2）を確認し、標準品としてBSAを用いてブラッドフ
ォード（Bradford）アッセイ法（Bio-Radの標準アッセイ法）で測定した。スペ
クトルを図8〜11に示す。蛍光強度（分画II-2）はLS50Bルミネセンス・スペクト
ロメーター（Luminescence Spectrometer）LS50Bを用いて決定した。EXは458 nm
、EMは492 nmであり、両スリットとも2.5 nmである。表4にタンパク質濃度、相
対蛍光（FL）強度、および容量700 μlにおける強度/μgタンパク質を示す。Mut
32が野生型と同程度に明るく、Mut15は野生型と比較して最も暗いことがわかる
。
【０１４３】
【表４】
【０１４４】 III．cFP484およびその変異体の性質 A．変異体の作製 2通りの個別のPCR反応で2種の欠失変異体を作製した：一つはΔ19 cFP484であ
りcFP484のN末端の先頭の19アミノ酸を欠き、もうひとつはΔ38 cFP484でありcF
P484のN末端の先頭の38アミノ酸を欠く。蛍光タンパク質Δ19 cFP484またはΔ38
cFP484をコードするDNAを含む哺乳類用の発現ベクターを作製し、それぞれpΔ1
9 NFP2-N1とpΔ38 NFP2-N1と命名する。
【０１４５】 B．哺乳類細胞におけるcFP484の欠失変異体の一時的な発現 HeLa細胞に、蛍光タンパク質Δ19 cFP484をコードするDNAを含む哺乳類用発現
ベクターpA19 NFP2-N1を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクション
後に細胞を37℃で48時間インキュベートした後に、3.7％のホルムアルデヒド中
に固定した。細胞をマウンティング培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
モノクロームの冷却CCDカメラ（Roper Scientific）でメタモルフ（MetaMorph）
ソフトウェア（Universal Imaging Corp.）を用いてデジタル画像を得た。フィ
ルターセットXF 114（Omega Optical）を用いて、Δ19 cFP484から放出される蛍
光を画像化した。画像は擬似的に着色した。Δ38 cFP484はHeLa細胞で発現させ
ても蛍光を発した。
【０１４６】 IV．zFP506およびその変異体の性質 A．変異体の作製 zFP506の変異体、N65Mを作製した。野生型であるzFP506と比べてN65Mには「AA
C」から「ATG」への変異がある。この変異により65位における対応アミノ酸がア
スパラギン（N）からメチオニン（M）に変わる。N65Mのスペクトル特性を表5に
示す。
【０１４７】
【表５】 単離されたN65Mのスペクトル特性 *相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria）
のGFPに関する同値で割った値である。
【０１４８】 B．ベクターの構築および機能分析 ヒト化されていないzFP506 DNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖とするベクター
中に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEGFP-N1のマルチ
クローニングサイトと同じである。作製したベクターの機能に関する試験を、29
3細胞に一過的にトランスフェクトすることで行った。トランスフェクトしてか
ら24時間後にzFP506の発現を蛍光顕微鏡で調べた。zFP506の蛍光強度は良好で、
EGFP-N1と同等であることがわかった。
【０１４９】 C．転写レポーターとしての不安定化されたzFP506ベクターの作製 zFP506は極めて安定なため、タンパク質の速い代謝回転を観察するためには、
zFP506の不安定化変形を作製する必要がある。不安定化されたEGFPと同じ手法を
用いて、マウスのODC分解領域をzFP506のC末端に融合させることで2種の不安定
化されたzFP506ベクターを構築した。d2型と比べて、不安定化されたzFP506のd1
型には3か所のEからAへの変異がMODC分解領域中にあるので、MODC分解領域を融
合させたタンパク質の半減期は短くなる。不安定化されたd1zFP506およびd2zFP5
06は、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
【０１５０】 D．不安定化されたzFP506の機能分析 野生型のd1zFP506を293細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェ
クションの24時間後にCHXを添加してタンパク質合成を停止させた。この処理か
ら4時間後に蛍光顕微鏡で細胞を調べた。MODC領域をzFP506に融合させると、蛍
光強度がzFP506そのものと比べて若干低下することがわかる。処理から4時間後
に蛍光強度は50％低下する。
【０１５１】 E．転写レポーターとしての不安定化されたd1zFP506の応用 不安定化されたd1zFP506をpCRE-d1GNFPベクターとpNF-κB-d1GNFPベクター中
に構築した。その発現は、それぞれcAMP応答配列（CRE）またはNF-κB応答配列
下で調節した。これらのベクターを293細胞に一過的にトランスフェクトし、ト
ランスフェクションの24時間後にd1GNFPの発現をフォルスコリンまたはTNF-αで
誘導した。誘導の6時間後に培養物をFACSで分析した。CRE-d1GNFPの蛍光強度が7
倍誘導され、NF-κB-d1GNFPでは4倍誘導されたことが明らかとなった（データは
示していない）。これは、不安定な状態のGNFPが転写レポーターとして利用でき
ることを意味する。
【０１５２】 F．ヒト化されたzFP506とヒト化されたN65Mの構築と機能試験 哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞
で良好に発現させるためには、ヒトに適するコドンを採用した変形が必要である
。ヒトで使用される頻度の高いコドンのオリゴの各ピースを連結して、完全長の
野生型および/または変異型のzFP506を作製した（hGNFP-zFP506とhGNFP-N65M）
。このヒト化されたzFP506をEGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
【０１５３】 V．zFP538とその変異体の性質 zFP538の一つの変異体、M128 を作製した。M128Vは、65位における部位特異的
変異導入法で、正しくないヌクレオチドをPCRの過程で導入して作製した。明る
い黄色を示した1個のコロニーを回収し、このクローンの配列を決定した。この
クローンは65位に野生型のアミノ酸リジン（K）を含むが、128位においてメチオ
ニン（M）がバリン（V）で置換されていることがわかった（番号はGFPを基準と
する）。
【０１５４】 さらに調査したところ、M128Vのスペクトル特性は野生型のタンパク質であるz
FP538に極めて似ているが、より速く折りたたまれることがわかった。表6にM128
Vのスペクトル特性を示す。
【０１５５】
【表６】 単離されたM128Vのスペクトル特性 *相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria）
GFPのに関する同値で割った値である。
【０１５６】 A．ベクターの構築と機能分析 野生型（wt）および変異型zFP538のDNAをともにPCRで増幅し、EGFP-N1を主鎖
とするベクター中に再構築した。このベクターのマルチクローニングサイトはEG
FP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。pYNFPwtもpYNFPW128VもEGFP-N
1と同じマルチクローニングサイトをもつ。作製したベクターの機能試験を293細
胞に一過的にトランスフェクトして行った。24時間発現させた後に、pYNFPwt、p
YNFPM12V、およびEYFPを並べて比較したところ、pYNFPwtの蛍光強度がEYFPの蛍
光強度よりも弱いことがわかった（データは示していない）。しかしpYNFPM128V
の蛍光強度はEYFPと同程度であることが蛍光顕微鏡による観察で明らかとなった
。
【０１５７】 B．転写レポーターとしての不安定化されたzFP538ベクターの作製 不安定化されたEGFPと同じ方法で、不安定化されたzFP538ベクターをd1やd2な
どの異なるマウスODC分解領域をzFP538のC末端に融合させることで構築した。不
安定化されたYNFPのd1型にはd2型と比べて3か所のEからAへの変異がMODC分解領
域中にある。pYNFPM128V-MODCd1とpYNFPM128V-MODCd2の両ベクターをEGFP-N1を
主鎖とするベクター中に構築した。
【０１５８】 C．不安定化されたzFP538の機能分析 不安定化されたzFP538の機能試験を293細胞に一過的にトランスフェクトする
ことで行った。24時間発現させた後に、蛍光強度はd2、d1の順に低下した。これ
は異なるマウスODC分解領域と融合させたためである。タンパク質合成阻害剤で
あるシクロヘキシミドで4時間処理してもd2の蛍光強度はそれほど変化しなかっ
たが、d1の蛍光強度は元の強度に比べてさらに50％低下した。d1の半減期はおよ
そ4時間である。
【０１５９】 M128Vの折りたたみは迅速で蛍光強度は強いことから、いくつかの応用におい
て有用である。PKC-γ-YNFP （M128V）を始めとするいくつかの融合タンパク質
について検討を行った。細胞をPMA（ホルボール12-ミリスチン酸13-酢酸）で処
理するとPKC-γが細胞質から形質膜へ移行することがわかった。
【０１６０】 D．ヒト化されたM128Vの構築と機能試験 ヒト化されたM128Vを作製して、pEGFP-N1を主鎖とするベクター中に配置した
。このベクターのマルチクローニングサイトは、pEGFP-N1のマルチクローニング
サイトと同じである。C1およびpEGFPの構築は進行中である。
【０１６１】 VI．drFP583とその変異体の性質 A．哺乳類細胞における発現 HeLa細胞に、プラスミドpDsRed1-N1（drFP583をコードするDNAを含むベクター
）またはプラスミドpEGFP-C1（オワンクラゲ（Aequorea victoria）のEGFPをコ
ードする）のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション直後に細
胞を混合してカバーガラス上にプレーティングした。細胞を37℃で48時間インキ
ュベートした後に3.7％のホルムアルデヒド中に固定した。細胞をマウンティン
グ培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。EGFPにはクロマ（Chroma）フィル
ターセット31001を用い、かつ、drFP583にはフィルターセット31002を用いて、
冷却CCDカメラ（Roper Scientific）とメタモルフ（MetaMorph）ソフトウェア（
Universal Imaging）で同視野から画像を撮影した。画像を擬似的に着色してオ
ーバーレイ処理を行った。同視野から位相差を撮影してオーバーレイ処理を行っ
た。
【０１６２】 B．ヒト化されたdrFP583の作製 哺乳類における発現は極めて広く用いられている手段であるので、哺乳類細胞
で良好に発現させるためには、ヒトに適するコドンを採用した変形が必要である
。したがって、蛍光タンパク質を発現するようにコドンを最適化するために、野
生型のdrFP583のヌクレオチド配列を変えてヒト化されたdrFP583を作製した。
【０１６３】 C．哺乳類細胞におけるヒト化されたdrFP583の発現 HeLa細胞に、プラスミドpECFP-Nuc、pEYFP-Tub、およびpDsRed1-Mito（ヒト化
されたdrFP583）を一過的に同時にトランスフェクトした。トランスフェクショ
ン後に細胞を37℃で48時間インキュベートした後に3.7％のホルムアルデヒド中
に固定した。細胞をマウンティング培地にマウントして蛍光顕微鏡で観察した。
3種すべての蛍光タンパク質を同時に発現する1個の細胞の画像を、DsRed1-Mito
についてはオメガ（Omega）フィルターセットXF35を用い、EYFP-TubについてはX
F104を用い、かつECFP-NucについてはXF114を用いて冷却CCDカメラ（Roper Scie
ntific）およびメタモルフ（MetaMorph）ソフトウェア（Universal Imaging）で
撮影した。各画像を擬似的に着色してオーバーレイ処理を行い、3種すべてのシ
グナルを一つの画像として表した。タンパク質DsRed1-Mitoはミトコンドリアに
局在し、EYFP-Tubは微小管網に局在し、またECFP-Nucは核に局在する。
【０１６４】 結論として、drFP583の放出はシアン（ECFP）、緑（EGFP）、および黄緑（EYF
P）の発光チャンネル（フィルターセット）でも低い。したがって、細胞構造内
における高い発現レベルまたは高濃度のタンパク質は、他の放出波長におけるあ
る程度のブリードスルー（bleedthrough）をもたらす高いシグナル強度を生じる
。多くの場合ブリードスルーは小さいので複数の標識記録に影響を及ぼさないと
考えられる。
【０１６５】 D．ヒト化されたdrFP583の変異体 ヒト化されたdrFP583の変異体を誤りの多い（error prone）PCR法（Clontech
）で作製した。アミノ酸の42位、71位、105位、120位、161位、および197位（番
号付けの開始点は最初のメチオニン）に変異が生じた。表7に生じた変異体およ
びその特性を示す。
【０１６６】
【表７】 ヒト化されたdrFP583の変異体
【０１６７】 E．E5変異体の性質と応用 E5（V105A、S197T）の蛍光は、インビボでもインビトロでも、大腸菌および哺
乳類細胞で経時的に緑から赤に変化している。またE5は大腸菌および哺乳類細胞
の両方で野生型のdrFP583より速く折りたたまれる。
【０１６８】 プロモーター活性のモニタリングには、「2色」のレポーティングモード（す
なわち活性状態または停止状態のプロモーターの両方）が可能であり、その状態
のインジケーターとしてはたらく別の色があるので、E5は転写レポーターとして
使用することができる。「1色」モードとは異なり、「2色」モードには過程の両
状態に測定可能なシグナル（発色）がある。これに対し「1色」モード（例えば
不安定化されたGFP）では、発色しないことが第2の状態のインジケーターとなる
。すなわち新しく作製されたE5タンパク質は緑色の蛍光を発することでプロモー
ターの活性状態が継続していることを示す。時間がたつとタンパク質は成熟し、
赤の蛍光を獲得する。そのためプロモーターがもはや活性状態にない場合は、す
べてのタンパク質は最終的に成熟して赤の蛍光が支配的となる。プロモーターが
活性状態を保っている場合は赤と緑の蛍光が容易に検出される。したがって「2
色」レポーターとしてのE5では、不安定化されたGFPと同等の遺伝子発現を調べ
ることが可能となるが、これは細胞、組織、または生物全体における過去の遺伝
子発現の恒久的な「指標（signature）」を伴う。例えば組織レベルにおいては
、E5を使用することで幹細胞と分化した細胞の区別が容易になると思われる。幹
細胞でのみプロモーターが活性をもつ場合は、E5レポーターは幹細胞集団を緑お
よび赤で標識し、娘細胞はもっぱら赤で標識されると考えられ、最終分化状態で
は蛍光を発しない（細胞分裂中にタンパク質が滴定範囲外となるため）。
【０１６９】 E5は、合成されたばかりのタンパク質と蓄積された融合タンパク質との空間的
および時間的な画像化に使用することができる。すなわちE5は融合タグとして機
能すると思われる。異なる構成レベルでの応用を想定できる。細胞レベルでE5は
、外膜、微絨毛、小胞体、ゴルジ体、ミトコンドリア、核、細胞基質および焦点
接着複合体（focal adhesion complex）のさまざまな組成物などのさまざまな区
画における合成直後のタンパク質の画像化および区別を容易にすると思われる。
組織レベルでE5は、既存の構造（例えば膜結合部や細胞外基質の組成物）に対し
て形成直後のものを画像化する際に有用であると思われる。
【０１７０】 E5の最も興味深い応用の一つは、細胞の分裂および移動時における母娘細胞間
の関係の研究における応用であると思われる。発生の分野ならびに生物の成体を
対象にした、細胞の移動および分化の研究は広範囲に開けている。発現「履歴」
の画像化が可能となることから、E5により、プロモーターが実際に活性状態にあ
る母細胞と、タンパク質が蓄積していて新たなタンパク質が産生されていない娘
細胞との区別が容易になる。発生および臓器の再構築における細胞運命の研究が
可能となることで、細胞移動と細胞増殖または分化が区別される。
【０１７１】 以上をまとめると、E5はGFPがかつて使用されてきたあらゆる状況に基本的に
適用することができる。主な利点は、プロモーター活性または細胞または組織に
おけるタンパク質の局在の「履歴」をE5で追跡できる点である。GFPと比べてタ
ンパク質としての安定性が優れているE5では長期間にわたる分析が可能となる（
野生型のdrFP583はアフリカツメガエル（Xenopus）では少なくとも4週間安定で
あるが、EGFPは2週間後に退色が始まる）。
【０１７２】 F．E8変異体の性質と応用 E8（N42H）にはあらゆる時間軸で緑と赤2か所の蛍光極大があり、drFP583と比
べて極めて速く折りたたまれる（表7）。
【０１７３】 E8は緑と赤の蛍光を同時に検出するので、E8は、血液循環およびタンパク質/
細胞輸送に関連する過程を調べる際に有用であると思われる。血液は緑の蛍光を
吸収するので、タンパク質が血液中を輸送されている間は赤の蛍光のみが画像化
される。緑と赤の蛍光はいずれも血流外で検出することができると思われ、これ
により、過程全体を容易に可視化して記録することができる。赤と緑を同時にモ
ニタリングすることはまた、一部の組織または細胞に対してバックグ回の蛍光に
よる問題を小さくすると思われる。
【０１７４】 G．シャッフリング法によるdrFP583/dmFP592ハイブリッドの作製 drFP583およびdmFP592のヒト化されていない野生型コード領域の断片を、1 ng
の対応する細菌発現プラスミド（drFP583またはdmFP592の各挿入片をもつpQE-30
誘導体）をテンプレートとしてPCRで増幅した（22サイクル、95℃15秒、68℃1分
20秒）。
【０１７５】 オリゴヌクレオチド を、これらの断片を0.2 mMの濃度で増幅する際のプライマーとして使用した。
【０１７６】 次にPCR産物を、キアクイック（QIAquick） PCR 精製キット（QIAGEN）で精製
した。その後、精製した断片drFP583およびdmFP592（各300 ng〜500 ng）を制限
エンドヌクレアーゼ（EcoRI、HindIII、およびDraI（各10 U））で同時に切断し
た。反応は、BSAを添加したBamHI制限酵素緩衝液（NEB）中で37℃で3時間かけて
行った。総反応容量は30 mlとした。反応完了後、各制限酵素切断反応で結果と
して得られた制限酵素切断断片をアガロースゲル（1.5％）電気泳動で分離し、
ゲルから切り出してキアクイック（QIAquick）ゲル精製キット（QIAGEN）で精製
した。drFP583とdmFP592の両方に由来する、結果的に得られた一連の精製済み制
限酵素切断断片を混合し、その50 ngをライゲーションミックス（1×T4 DNAライ
ゲーション緩衝液、400 NEB UのT4 DNAリガーゼ）に添加して総容量を30 mlとし
た。ライゲーションを3時間室温で行い、70℃で加熱して20分以内に停止させた
。
【０１７７】 次にライゲーションミックスを水で10倍に希釈し、希釈液1 mlをテンプレート
としてPCR反応（20サイクル、95℃で15秒、68℃で1分20秒）を行った。4種のオ
リゴヌクレオチドA、B、C、およびD（それぞれ配列番号：58〜61）を同時にプラ
イマーとして使用して、これらの断片を各0.1 mMの濃度で増幅した。アガロース
ゲル（1.5％）で電気泳動を行った後、標的断片をキアクイック（QIAquick）ゲ
ル精製キット（QIAGEN）で精製し、BSAを添加したBamHI制限酵素切断緩衝液（NE
B）中で37℃で3時間にわたって制限酵素BamHIおよびXhoI（各30 U〜50 U）で同
時に切断した。精製後に得られた断片を、BamHIとSalIで線状化したpQE-30プラ
スミドにクローン化した。連結反応は、1×T4 DNAライゲーション緩衝液中で400
NEB UのT4 DNAリガーゼを用いて総容量20 mlで16℃で一晩行った。ライゲーシ
ョン容量の1/5量で大腸菌を形質転換し、100 mg/mlのアンピシリンと0.1 mMのIP
TGを添加したLB/1％寒天プレート上で37℃で一晩インキュベートした後に得られ
た大腸菌コロニーを、ローダミンフィルターセットを用いて蛍光顕微鏡下で視覚
的にスクリーニングした。最も明るい赤色のコロニーを選択して、100 mg/mlの
アンピシリンを添加した200 mlのLB培地中に置いた。OD600が0.6となった時点で
、この大腸菌培養物をIPTG（終濃度1 mM）で誘導し、培養を一晩続けた。N末端
に6×hisのタグを含む組換えタンパク質の精製は、タロン（TALON）金属親和性
樹脂を用いて製造業者のプロトコルにしたがって行った。
【０１７８】 H．drFP583/dmFP592ハイブリッドのスペクトル特性 drFP583/dmFP592ハイブリッドタンパク質の放射スペクトルおよび励起スペク
トルはdmFP592と基本的に同じである。表8にdrFP583/dmFP592ハイブリッドタン
パク質のスペクトル特性を示す。
【０１７９】
【表８】 drFP583/dmFP592ハイブリッドのスペクトル特性 *相対量子収量は、オワンクラゲ（A. victoria）のGFPの量子収量と比較して決
定した。 **相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria
）のGFPに関する同値で割った値である。
【０１８０】 I．ヒト化されたdrFP583/dmFP592ハイブリッドおよび変異体 drFP583/dmFP592ハイブリッドをヒト化した。ヒト化されたdrFP583/dmFP592を
基にさらに、drFP583/dmFP592-2GおよびdrFP583/dmFP592-Q3の2種の変異体を作
製した。drFP583/dmFP592-2Gには、K15QおよびT217Sの2か所の置換が含まれる。
この変異体は、ヒト化されたdrFP583/dmFP592ハイブリッド遺伝子から、対応プ
ロトコルにしたがった多様性 PCR 変異誘発キット（Clontech）による無作為変
異導入法で得た。drFP583/dmFP592-Q3には、K15Q、K83M、およびT217Sの3か所の
置換が含まれる。drFP583/dmFP592-Q3変異体は、drFP583/dmFP592-2G変異体から
、対応プロトコルにしたがった多様性 PCR 変異誘発キット（Clontech）による
無作為変異導入法で得た。
【０１８１】 drFP583/dmFP592-2Gの輝度および折りたたみ速度は、ヒト化されていないdrFP
583/dmFP592ハイブリッドと同等である。drFP583/dmFP592-Q3は、大腸菌細胞中
では親株の異型（例えばdrFP583/dmFP592-2G）と比べて暗い赤色で見えるが、精
製後のタンパク質溶液は紫色を呈する。drFP583/dmFP592-Q3の放射極大は616 nm
であり、励起極大は580 nmである。
【０１８２】 J．ハイブリッド変異体の応用 drFP583/dmFP592-Q3は、蛍光タンパク質drFP583またはdmFP592と似ているので
、タンパク質の発現、輸送、およびインビボにおけるタンパク質相互作用、プロ
モーター活性のモニタリングの手段として、また転写レポーターまたは融合タグ
として使用することができる。さらにdrFP583/dmFP592-Q3は、放射極大の強固な
長波長シフト、およびスペクトルのある程度の重複とバックグ回の蛍光を除いて
、スペクトルの緑色部分の励起が実際的にないことを元に、2種またはそれ以上
のタンパク質の発現をインビボで同時に検出する2種/3種の色素標識アッセイ法
において、既存の緑色蛍光タンパク質の異型の一つに対する最も簡便な相手とし
て選択することができる。
【０１８３】 drFP583/dmFP592ハイブリッドの作製法には、蛍光特性を向上させたハイブリ
ッド遺伝子（例えば異なる遺伝子部分をさまざまな組み合わせで含む遺伝子）を
作製する際に一般的な有用性がある。
【０１８４】 またdrFP583/dmFP592-Q3は最初の長波長シフト変異体であり、無作為変異導入
法でスペクトルのシフト変異体が得られることがわかる。
【０１８５】 VII．asFP600およびその変異体の性質 A．変異体の作製 asFP600の変異体Mut1を作製した。野生型のasFP600と比較してMut1には以下の
置換がある：70位におけるTからA（番号はGFPを基準とする）、および148位にお
けるAからS。標的置換であるA148Sは、変異をもつプライマーを用いたPCRで部位
特異的変異導入法で作製した。この変異導入の過程で、誤ったヌクレオチドがPC
R中に導入されて、無作為な置換であるT70Aが生じた。置換T70Aは必ずしも蛍光
に必要ではなく、また実際上、蛍光に影響を及ぼさない。表9にMut1のスペクト
ル特性を示す。asFP600の別の変異体には、184位におけるアラニンからセリンへ
の置換がある。
【０１８６】
【表９】 単離されたMut1のスペクトル特性 *相対輝度は、吸光係数に量子収量を乗じた値を、オワンクラゲ（A. victoria）
のGFPに関する同値で割った値である。
【０１８７】 B．ベクターの構築および機能分析 ヒト化されていない変異体asFP600（RNFP）のDNAをPCRで増幅し、EGFP-N1を主
鎖とするベクター中に再構築した。このベクター（pRNFP-N1）のマルチクローニ
ングサイトは、EGFP-N1のマルチクローニングサイトと同じである。
【０１８８】 作製したベクターの機能試験は、293細胞に一過的にトランスフェクトして行
った。トランスフェクションの24時間後にasFP600の発現を蛍光顕微鏡で調べた
。asFP600の蛍光強度は良好であったが、asFP600の発現は核に集中していた。
【０１８９】 C．細胞質で発現するasFP600の作製 asFP600が核に局在することは、このタンパク質の転写レポーターまたはpHセ
ンサーとしてのいくつかの応用を制限したので、こうした目的ではasFP600が細
胞質で発現する必要があると考えられた。ヒトで使用されるコドンに基づく核外
輸送配列をasFP600のN末端に融合させ、EGFP-N1ベクターに導入してpNE-RNFPを
得た。
【０１９０】 NE-RNFPの機能性試験は、pNE-RNFPを293細胞に一過的にトランスフェクトして
行う。トランスフェクションの24時間後にNE-RNFPの発現を蛍光顕微鏡で調べた
。赤色の蛍光が細胞質中に分散して見られたが核にはみられなかった。
【０１９１】 D．転写レポーターとしての不安定化されたasFP600ベクターの作製 asFP600は極めて安定なため、タンパク質の速い代謝回転を観察するためには
、asFP600の不安定化された変形を作製する必要がある。不安定化されたEGFPと
同じ手法を用いて、マウスのODC分解領域をNE-RNFPのC末端に融合させることで2
種の不安定化されたNE-RNFPベクターを構築した。d2型と比べて、不安定化され
たRNFPのd1型には3か所のEからAへの変異がMODC分解領域中にあるので、MODC分
解領域を融合させたタンパク質の半減期は短くなる。不安定化されたd1RNFPおよ
びd2RNFPは、EGFP-N1を主鎖とするベクター中に構築した。
【０１９２】 E．不安定化されたasFP600の機能分析 ヒト化されていないasFP600のd2型を293細胞に一過的にトランスフェクトした
。トランスフェクションの1日後にCHXを添加してタンパク質合成を阻害した。処
理から3時間後に細胞を蛍光顕微鏡で調べた。蛍光強度が〜50％低下しているこ
とが判明した。
【０１９３】 F．ヒト化されたMut1の構築と機能試験 ヒト化したMut1を作製して、pEGFP-N1を主鎖とするベクター中に配置した。こ
のベクターのマルチクローニングサイトは、pEGFP-N1のマルチクローニングサイ
トと同じである。C1およびpEGFPの構築は現在進行中である。
【０１９４】 上記の考察および結果から、本発明が、重要な新たな色素タンパク質および蛍
光タンパク質、ならびにそれらをコードする核酸が提供されることは明らかであ
る。対象となるタンパク質および核酸は多種多様な応用で使用される。したがっ
て本発明は当技術分野に大きく貢献する。
【０１９５】 本明細書で引用したすべての刊行物および特許出願は、個々の刊行物および特
許出願が明確かつ個別に参照として組み入れられることを示したように、参照と
して本明細書に組み入れられる。あらゆる刊行物の引用は、出願日に先立つ開示
に対して有効であり、本発明が、先願発明によってそれらの刊行物に事前の日付
を付与する権利を与えない出願であると解釈すべきではない。
【０１９６】 以上の発明は、明瞭に理解させることを目的とした例示および実施例によって
、ある程度詳細に記載されているが、本発明を教示する観点から、ある変更およ
び修正が、添付した特許請求の趣旨または範囲から離れることなく実行できるこ
とは当業者によって容易に了承されると思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 amFP486のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図２】 cFP484のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図３】 zFP506のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図４】 zFP538のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図５】 dsFP483のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図６】 drFP583のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図７】 asFP600のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図８】 dgFP512のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】 dmFP592のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月５日（２００２．６．５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００１】関連出願の相互参照 本出願は、以下の出願の一部継続出願である： 1999年10月14日に出願された特許出願第09/418,529号； 1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,917号； 1999年10月15日に出願された特許出願第09/418,922号； 1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,338号； 1999年11月19日に出願された特許出願第09/444,341号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,556号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,477号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/458,144号； 1999年12月9日に出願された特許出願第09/457,898号；ならびに 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,627号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,687号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,609号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,626号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,880号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,607号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,766号； 2000年6月14日に出願された特許出願第60/211,888号；および 2000年6月14日に出願された特許出願第60/212/070号；以上の出願の開示は参照
として本明細書に組み入れられる。本出願はまた1999年12月10日に出願された国 際出願PCT/US99/29405号 に対して優先権を主張する
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９６】 以上の発明は、明瞭に理解させることを目的とした例示および実施例によって
、ある程度詳細に記載されているが、本発明を教示する観点から、ある変更およ
び修正が、添付した特許請求の趣旨または範囲から離れることなく実行できるこ
とは当業者によって容易に了承されると思われる。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> CLONTECH LABORATORIES INC. <120> Anthozoa Derived Chromophores/Fluorophores and Methods for Using t
he Same <140> JP 2001-530368 <141> 2000-10-13 <150> US 09/418,529 <151> 1999-10-14 <150> US 09/418,917 <151> 1999-10-15 <150> US 09/418,922 <151> 1999-10-15 <150> US 09/444,341 <151> 1999-11-19 <150> US 09/444,338 <151> 1999-11-19 <150> US 09/458,477 <151> 1999-12-09 <150> US 09/457,556 <151> 1999-12-09 <150> US 09/458,144 <151> 1999-12-09 <150> US 09/457,898 <151> 1999-12-09 <150> PCT/US99/29405 <151> 1999-12-10 <150> US 60/211,627 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,687 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,609 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,626 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,880 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,607 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,766 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,888 <151> 2000-06-14 <150> US 60/211,070 <151> 2000-06-14 <160> 18 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 687 <212> DNA <213> Anemonia majano <220> <221> CDS <222> (1)...(687) <400> 1 atg gct ctt tca aac aag ttt atc gga gat gac atg aaa atg acc tac 48 Met Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ile Gly Asp Asp Met Lys Met Thr Tyr 1 5 10 15 cat atg gat ggc tgt gtc aat ggg cat tac ttt acc gtc aaa ggt gaa 96 His Met Asp Gly Cys Val Asn Gly His Tyr Phe Thr Val Lys Gly Glu 20 25 30 ggc aac ggg aag cca tac gaa ggg acg cag acc tcg act ttt aaa gtc 144 Gly Asn Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ser Thr Phe Lys Val 35 40 45 acc atg gcc aac ggt ggg ccc ctt gca ttc tcc ttt gac ata cta tct 192 Thr Met Ala Asn Gly Gly Pro Leu Ala Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser 50 55 60 aca gtg ttc aag tat gga aat cga tgc ttt act gcg tat cct acc agt 240 Thr Val Phe Lys Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Ala Tyr Pro Thr Ser 65 70 75 80 atg ccc gac tat ttc aaa caa gca ttt cct gac gga atg tca tat gaa 288 Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr Glu 85 90 95 agg act ttt acc tat gaa gat gga gga gtt gct aca gcc agt tgg gaa 336 Arg Thr Phe Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp Glu 100 105 110 ata agc ctt aaa ggc aac tgc ttt gag cac aaa tcc acg ttt cat gga 384 Ile Ser Leu Lys Gly Asn Cys Phe Glu His Lys Ser Thr Phe His Gly 115 120 125 gtg aac ttt cct gct gat gga cct gtg atg gcg aag atg aca act ggt 432 Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Ala Lys Met Thr Thr Gly 130 135 140 tgg gac cca tct ttt gag aaa atg act gtc tgc gat gga ata ttg aag 480 Trp Asp Pro Ser Phe Glu Lys Met Thr Val Cys Asp Gly Ile Leu Lys 145 150 155 160 ggt gat gtc acc gcg ttc ctc atg ctg caa gga ggt ggc aat tac aga 528 Gly Asp Val Thr Ala Phe Leu Met Leu Gln Gly Gly Gly Asn Tyr Arg 165 170 175 tgc caa ttc cac act tct tac aag aca aaa aaa ccg gtg acg atg cca 576 Cys Gln Phe His Thr Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Pro Val Thr Met Pro 180 185 190 cca aac cat gcg gtg gaa cat cgc att gcg agg acc gac ctt gac aaa 624 Pro Asn His Ala Val Glu His Arg Ile Ala Arg Thr Asp Leu Asp Lys 195 200 205 ggt ggc aac agt gtt cag ctg acg gag cac gct gtt gca cat ata acc 672 Gly Gly Asn Ser Val Gln Leu Thr Glu His Ala Val Ala His Ile Thr 210 215 220 tct gtt gtc cct ttc 687 Ser Val Val Pro Phe 225 <210> 2 <211> 229 <212> PRT <213> Anemonia majano <400> 2 Met Ala Leu Ser Asn Lys Phe Ile Gly Asp Asp Met Lys Met Thr Tyr 1 5 10 15 His Met Asp Gly Cys Val Asn Gly His Tyr Phe Thr Val Lys Gly Glu 20 25 30 Gly Asn Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ser Thr Phe Lys Val 35 40 45 Thr Met Ala Asn Gly Gly Pro Leu Ala Phe Ser Phe Asp Ile Leu Ser 50 55 60 Thr Val Phe Lys Tyr Gly Asn Arg Cys Phe Thr Ala Tyr Pro Thr Ser 65 70 75 80 Met Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly Met Ser Tyr Glu 85 90 95 Arg Thr Phe Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Ala Thr Ala Ser Trp Glu 100 105 110 Ile Ser Leu Lys Gly Asn Cys Phe Glu His Lys Ser Thr Phe His Gly 115 120 125 Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Ala Lys Met Thr Thr Gly 130 135 140 Trp Asp Pro Ser Phe Glu Lys Met Thr Val Cys Asp Gly Ile Leu Lys 145 150 155 160 Gly Asp Val Thr Ala Phe Leu Met Leu Gln Gly Gly Gly Asn Tyr Arg 165 170 175 Cys Gln Phe His Thr Ser Tyr Lys Thr Lys Lys Pro Val Thr Met Pro 180 185 190 Pro Asn His Ala Val Glu His Arg Ile Ala Arg Thr Asp Leu Asp Lys 195 200 205 Gly Gly Asn Ser Val Gln Leu Thr Glu His Ala Val Ala His Ile Thr 210 215 220 Ser Val Val Pro Phe 225 <210> 3 <211> 1116 <212> DNA <213> Clavularia sp. <220> <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (17)...(17) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (65)...(65) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (77)...(77) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (102)...(102) <223> N denote A, T, G or C <221> misc_feature <222> (104)...(104) <223> N denote A, T, G or C <400> 3 tatagganca tnngggngat tggggtccaa agcattgtaa ccaacgcaga taacccccag 60 tggtntcaaa cgcaganaac gcgggaacat tggaaaattg antnttaagg aggcaaggaa 120 tcgggagtaa agttgcgaga aactgaaaaa atgaagtgta aatttgtgtt ctgcctgtcc 180 ttcttggtcc tcgccatcac aaacgcgaac atttttttga gaaacgaggc tgacttcgaa 240 gagaagacat ttagaatacc aaaagctcta accaccatgg gtgtgattaa accagacatg 300 aagattaagc tgaagatgga aggaaatgta aacgggcatg cttttgtgat tgaaggagaa 360 ggagaaggaa agccttacga tgggacacac actttaaacc tggaagtgaa ggaaggtgcg 420 cctctgcctt tttcttacga tatcttgtca aacgcgttcc agtacggaaa cagagcattg 480 acaaaatacc cagacgatat agcagactat ttcaagcagt cgtttcccga gggatattcc 540 tgggaaagaa ccatgacttt tgaagacaaa ggcattgtca aagtgaaaag tgacataagc 600 atggaggaag actcctttat ctatgaaatt cgttttgatg ggatggactt tcctcccaat 660 ggtccggtta tgcagaaaaa aactttgaag tgggaaccat ccactgagat tatgtacgtg 720 cgtgatggag tgctggtcgg agatattagc cattctctgt tgctggaggg aggtggccat 780 taccgatgtg acttcaaaag tatttacaaa gcaaaaaaag ttgtcaaatt gccagactat 840 cactttgtgg accatcgcat tgagatcttg aaccatgaca aggattacaa caaagtaacg 900 ctgtatgaga atgcagttgc tcgctattct ttgctgccaa gtcaggccta gacaacaagg 960 atactgaaaa catatttgtc tgagggtttg tgttgttttt taaaagacat cagctcagca 1020 ttcgttagtt gtaacaaaaa atagctttaa tttttggtgg gattaaatca tagggatttg 1080 ttttagtaat cattttgctt aataaaaagt gccttg 1116 <210> 4 <211> 266 <212> PRT <213> Clavulari sp. <400> 4 Met Lys Cys Lys Phe Val Phe Cys Leu Ser Phe Leu Val Leu Ala Ile 1 5 10 15 Thr Asn Ala Asn Ile Phe Leu Arg Asn Glu Ala Asp Phe Glu Glu Lys 20 25 30 Thr Phe Arg Ile Pro Lys Ala Leu Thr Thr Met Gly Val Ile Lys Pro 35 40 45 Asp Met Lys Ile Lys Leu Lys Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala 50 55 60 Phe Val Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Lys Pro Tyr Asp Gly Thr His 65 70 75 80 Thr Leu Asn Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ser Tyr 85 90 95 Asp Ile Leu Ser Asn Ala Phe Gln Tyr Gly Asn Arg Ala Leu Thr Lys 100 105 110 Tyr Pro Asp Asp Ile Ala Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly 115 120 125 Tyr Ser Trp Glu Arg Thr Met Thr Phe Glu Asp Lys Gly Ile Val Lys 130 135 140 Val Lys Ser Asp Ile Ser Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Tyr Glu Ile 145 150 155 160 Arg Phe Asp Gly Met Asp Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys 165 170 175 Lys Thr Leu Lys Trp Glu Pro Ser Thr Glu Ile Met Tyr Val Arg Asp 180 185 190 Gly Val Leu Val Gly Asp Ile Ser His Ser Leu Leu Leu Glu Gly Gly 195 200 205 Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe Lys Ser Ile Tyr Lys Ala Lys Lys Val 210 215 220 Val Lys Leu Pro Asp Tyr His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu 225 230 235 240 Asn His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Thr Leu Tyr Glu Asn Ala Val 245 250 255 Ala Arg Tyr Ser Leu Leu Pro Ser Gln Ala 260 265 <210> 5 <211> 693 <212> DNA <213> Zoanthus sp. <220> <221> CDS <222> (1)...(693) <400> 5 atg gct cag tca aag cac ggt cta aca aaa gaa atg aca atg aaa tac 48 Met Ala Gln Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Glu Met Thr Met Lys Tyr 1 5 10 15 cgt atg gaa ggg tgc gtc gat gga cat aaa ttt gtg atc acg gga gag 96 Arg Met Glu Gly Cys Val Asp Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Glu 20 25 30 ggc att gga tat ccg ttc aaa ggg aaa cag gct att aat ctg tgt gtg 144 Gly Ile Gly Tyr Pro Phe Lys Gly Lys Gln Ala Ile Asn Leu Cys Val 35 40 45 gtc gaa ggt gga cca ttg cca ttt gcc gaa gac ata ttg tca gct gcc 192 Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Glu Asp Ile Leu Ser Ala Ala 50 55 60 ttt aac tac gga aac agg gtt ttc act gaa tat cct caa gac aaa gct 240 Phe Asn Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Glu Tyr Pro Gln Asp Lys Ala 65 70 75 80 gac tat ttc aag aac tcg tgt cct gct ggt tat aca tgg gac agg tct 288 Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Asp Arg Ser 85 90 95 ttt ctc ttt gag gat gga gca gtt tgc ata tgt aat gca gat ata aca 336 Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Ile Cys Asn Ala Asp Ile Thr 100 105 110 gtg agt gtt gaa gaa aac tgc atg tat cat gag tcc aaa ttt tat gga 384 Val Ser Val Glu Glu Asn Cys Met Tyr His Glu Ser Lys Phe Tyr Gly 115 120 125 gtg aat ttt cct gct gat gga cct gtg atg aaa aag atg aca gat aac 432 Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Asp Asn 130 135 140 tgg gag cca tcc tgc gag aag atc ata cca gta cct aag cag ggg ata 480 Trp Glu Pro Ser Cys Glu Lys Ile Ile Pro Val Pro Lys Gln Gly Ile 145 150 155 160 ttg aaa ggg gat gtc tcc atg tac ctc ctt ctg aag gat ggt ggg cgt 528 Leu Lys Gly Asp Val Ser Met Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly Arg 165 170 175 tta cgg tgc caa ttc gac aca gtt tac aaa gca aag tct gtg cca aga 576 Leu Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ser Val Pro Arg 180 185 190 aag atg ccg gac tgg cac ttc atc cag cat aag ctc acc cgt gaa gac 624 Lys Met Pro Asp Trp His Phe Ile Gln His Lys Leu Thr Arg Glu Asp 195 200 205 cgc agc gat gct aag aat cag aaa tgg cat ctg aca gaa cat gct att 672 Arg Ser Asp Ala Lys Asn Gln Lys Trp His Leu Thr Glu His Ala Ile 210 215 220 gca tcc gga tct gca ttg ccc 693 Ala Ser Gly Ser Ala Leu Pro 225 230 <210> 6 <211> 231 <212> PRT <213> Zoanthus sp. <400> 6 Met Ala Gln Ser Lys His Gly Leu Thr Lys Glu Met Thr Met Lys Tyr 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Cys Val Asp Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Glu 20 25 30 Gly Ile Gly Tyr Pro Phe Lys Gly Lys Gln Ala Ile Asn Leu Cys Val 35 40 45 Val Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Glu Asp Ile Leu Ser Ala Ala 50 55 60 Phe Asn Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Glu Tyr Pro Gln Asp Lys Ala 65 70 75 80 Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Asp Arg Ser 85 90 95 Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Ile Cys Asn Ala Asp Ile Thr 100 105 110 Val Ser Val Glu Glu Asn Cys Met Tyr His Glu Ser Lys Phe Tyr Gly 115 120 125 Val Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Asp Asn 130 135 140 Trp Glu Pro Ser Cys Glu Lys Ile Ile Pro Val Pro Lys Gln Gly Ile 145 150 155 160 Leu Lys Gly Asp Val Ser Met Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly Arg 165 170 175 Leu Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ser Val Pro Arg 180 185 190 Lys Met Pro Asp Trp His Phe Ile Gln His Lys Leu Thr Arg Glu Asp 195 200 205 Arg Ser Asp Ala Lys Asn Gln Lys Trp His Leu Thr Glu His Ala Ile 210 215 220 Ala Ser Gly Ser Ala Leu Pro 225 230 <210> 7 <211> 865 <212> DNA <213> Zoanthus sp. <220> <221> CDS <222> (62)...(754) <400> 7 gagttgagtt tctcgacttc agttgtatca attttggggc atcaagcgat ctattttcaa 60 c atg gct cat tca aag cac ggt cta aaa gaa gaa atg aca atg aaa tac 109 Met Ala His Ser Lys His Gly Leu Lys Glu Glu Met Thr Met Lys Tyr 1 5 10 15 cac atg gaa ggg tgc gtc aac gga cat aaa ttt gtg atc acg ggc gaa 157 His Met Glu Gly Cys Val Asn Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Glu 20 25 30 ggc att gga tat ccg ttc aaa ggg aaa cag act att aat ctg tgt gtg 205 Gly Ile Gly Tyr Pro Phe Lys Gly Lys Gln Thr Ile Asn Leu Cys Val 35 40 45 atc gaa ggg gga cca ttg cca ttt tcc gaa gac ata ttg tca gct ggc 253 Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Glu Asp Ile Leu Ser Ala Gly 50 55 60 ttt aag tac gga gac agg att ttc act gaa tat cct caa gac ata gta 301 Phe Lys Tyr Gly Asp Arg Ile Phe Thr Glu Tyr Pro Gln Asp Ile Val 65 70 75 80 gac tat ttc aag aac tcg tgt cct gct gga tat aca tgg ggc agg tct 349 Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Gly Arg Ser 85 90 95 ttt ctc ttt gag gat gga gca gtc tgc ata tgc aat gta gat ata aca 397 Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Ile Cys Asn Val Asp Ile Thr 100 105 110 gtg agt gtc aaa gaa aac tgc att tat cat aag agc ata ttt aat gga 445 Val Ser Val Lys Glu Asn Cys Ile Tyr His Lys Ser Ile Phe Asn Gly 115 120 125 atg aat ttt cct gct gat gga cct gtg atg aaa aag atg aca act aac 493 Met Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Thr Asn 130 135 140 tgg gaa gca tcc tgc gag aag atc atg cca gta cct aag cag ggg ata 541 Trp Glu Ala Ser Cys Glu Lys Ile Met Pro Val Pro Lys Gln Gly Ile 145 150 155 160 ctg aaa ggg gat gtc tcc atg tac ctc ctt ctg aag gat ggt ggg cgt 589 Leu Lys Gly Asp Val Ser Met Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly Arg 165 170 175 tac cgg tgc cag ttc gac aca gtt tac aaa gca aag tct gtg cca agt 637 Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ser Val Pro Ser 180 185 190 aag atg ccg gag tgg cac ttc atc cag cat aag ctc ctc cgt gaa gac 685 Lys Met Pro Glu Trp His Phe Ile Gln His Lys Leu Leu Arg Glu Asp 195 200 205 cgc agc gat gct aag aat cag aag tgg cag ctg aca gag cat gct att 733 Arg Ser Asp Ala Lys Asn Gln Lys Trp Gln Leu Thr Glu His Ala Ile 210 215 220 gca ttc cct tct gcc ttg gcc tga taagaatgta gttccaacat tttaatgcat 787 Ala Phe Pro Ser Ala Leu Ala 225 230 gtgcttgtca attattctga taaaaatgta gttgagttga aaacagacaa gtacaaataa 847 agcacatgta aatcgtct 865 <210> 8 <211> 231 <212> PRT <213> Zoanthus sp. <400> 8 Met Ala His Ser Lys His Gly Leu Lys Glu Glu Met Thr Met Lys Tyr 1 5 10 15 His Met Glu Gly Cys Val Asn Gly His Lys Phe Val Ile Thr Gly Glu 20 25 30 Gly Ile Gly Tyr Pro Phe Lys Gly Lys Gln Thr Ile Asn Leu Cys Val 35 40 45 Ile Glu Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ser Glu Asp Ile Leu Ser Ala Gly 50 55 60 Phe Lys Tyr Gly Asp Arg Ile Phe Thr Glu Tyr Pro Gln Asp Ile Val 65 70 75 80 Asp Tyr Phe Lys Asn Ser Cys Pro Ala Gly Tyr Thr Trp Gly Arg Ser 85 90 95 Phe Leu Phe Glu Asp Gly Ala Val Cys Ile Cys Asn Val Asp Ile Thr 100 105 110 Val Ser Val Lys Glu Asn Cys Ile Tyr His Lys Ser Ile Phe Asn Gly 115 120 125 Met Asn Phe Pro Ala Asp Gly Pro Val Met Lys Lys Met Thr Thr Asn 130 135 140 Trp Glu Ala Ser Cys Glu Lys Ile Met Pro Val Pro Lys Gln Gly Ile 145 150 155 160 Leu Lys Gly Asp Val Ser Met Tyr Leu Leu Leu Lys Asp Gly Gly Arg 165 170 175 Tyr Arg Cys Gln Phe Asp Thr Val Tyr Lys Ala Lys Ser Val Pro Ser 180 185 190 Lys Met Pro Glu Trp His Phe Ile Gln His Lys Leu Leu Arg Glu Asp 195 200 205 Arg Ser Asp Ala Lys Asn Gln Lys Trp Gln Leu Thr Glu His Ala Ile 210 215 220 Ala Phe Pro Ser Ala Leu Ala 225 230 <210> 9 <211> 850 <212> DNA <213> Discosoma striata <400> 9 acggtcaggg acacggtgac ccactttggt attctaacaa aatgagttgg tccaagagtg 60 tgatcaagga agaaatgttg atcgatcttc atctggaagg aacgttcaat gggcactact 120 ttgaaataaa aggcaaagga aaagggaagc ctaatgaagg caccaatacc gtcacgctcg 180 aggttaccaa gggtggacct ctgccatttg gttggcatat tttgtgccca caatttcagt 240 atggaaacaa ggcatttgtc caccaccctg acgacatacc tgattatcta aagctgtcat 300 ttccggaggg atatacatgg gaacggtcca tgcactttga agacggtggc ttgtgttgta 360 tcaccaatga tatcagtttg acaggcaact gtttcaacta cgacatcaag ttcactggct 420 tgaactttcc tccaaatgga cccgttgtgc agaagaagac aactggctgg gaaccgagca 480 ctgagcgttt gtatcctcgt gatggcgtgt tgataggaga catccatcat gctctcacag 540 tggaaggagg tggtcattac gtatgtgaca ttaaaactgt ttacagggcc aagaagcccg 600 taaagatgcc agggtatcac tatgttgaca ccaaactggt tataaggagc aacgacaaag 660 aattcatgaa agttgaggag catgaaatcg ccgttgcacg ccaccatccg ctccaaagcc 720 aatgaagctt aagtaaagca aaaaggtgac gaggcatgat agtatgacat gatagtatga 780 catgatagta tgacatgata gtaagaattg taagcaaaag gctttgctta ttaaacttgt 840 aattgaaaac 850 <210> 10 <211> 227 <212> PRT <213> Discosoma striata <400> 10 Met Ser Trp Ser Lys Ser Val Ile Lys Glu Glu Met Leu Ile Asp Leu 1 5 10 15 His Leu Glu Gly Thr Phe Asn Gly His Tyr Phe Glu Ile Lys Gly Lys 20 25 30 Gly Lys Gly Lys Pro Asn Glu Gly Thr Asn Thr Val Thr Leu Glu Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Gly Trp His Ile Leu Cys Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Asn Lys Ala Phe Val His His Pro Asp Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Thr Trp Glu Arg Ser 85 90 95 Met His Phe Glu Asp Gly Gly Leu Cys Cys Ile Thr Asn Asp Ile Ser 100 105 110 Leu Thr Gly Asn Cys Phe Asn Tyr Asp Ile Lys Phe Thr Gly Leu Asn 115 120 125 Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Val Gln Lys Lys Thr Thr Gly Trp Glu 130 135 140 Pro Ser Thr Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Ile Gly Asp 145 150 155 160 Ile His His Ala Leu Thr Val Glu Gly Gly Gly His Tyr Val Cys Asp 165 170 175 Ile Lys Thr Val Tyr Arg Ala Lys Lys Pro Val Lys Met Pro Gly Tyr 180 185 190 His Tyr Val Asp Thr Lys Leu Val Ile Arg Ser Asn Asp Lys Glu Phe 195 200 205 Met Lys Val Glu Glu His Glu Ile Ala Val Ala Arg His His Pro Leu 210 215 220 Gln Ser Gln 225 <210> 11 <211> 898 <212> DNA <213> Discosoma sp. <400> 11 gtcctcccaa gcagtggtat caacgcagag tacgggggag tttcagccag tgacggtcag 60 tgacagggtg agccacttgg tataccaaca aaatgaggtc ttccaagaat gttatcaagg 120 agttcatgag gtttaaggtt cgcatggaag gaacggtcaa tgggcacgag tttgaaatag 180 aaggcgaagg agaggggagg ccatacgaag gccacaatac cgtaaagctt aaggtaacca 240 aggggggacc tttgccattt gcttgggata ttttgtcacc acaatttcag tatggaagca 300 aggtatatgt caagcaccct gccgacatac cagactataa aaagctgtca tttcctgaag 360 gatttaaatg ggaaagggtc atgaactttg aagacggtgg cgtcgttact gtaacccagg 420 attccagttt gcaggatggc tgtttcatct acaagtcaag ttcattggcg ttgaactttc 480 cttccgatgg acctgttatg caaaagaaga caatgggctg ggaagccagc actgagcgtt 540 tgtatcctcg tgatggcgtg ttgaaaggag agattcataa ggctctgaag ctgaaagacg 600 gtggtcatta cctagttgaa ttcaaaagta tttacatggc aaagaagcct gtgcagctac 660 cagggtacta ctatgttgac tccaaactgg atataacaag ccacaacgaa gactatacaa 720 tcgttgagca gtatgaaaga accgagggac gccaccatct gttcctttaa ggctgaactt 780 ggctcagacg tgggtgagcg gtaatgacca caaaaggcag cgaagaaaaa ccatgatcgt 840 tttttttagg ttggcagcct gaaatcgtag gaaatacatc agaaatgtta caaacagg 898 <210> 12 <211> 205 <212> PRT <213> Discosoma sp. <400> 12 Met Arg Ser Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Asn Thr Val Lys Leu Lys Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Gln Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Lys Ser Ser Ser Leu Ala Leu Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu 130 135 140 Ala Ser Thr Glu Arg Leu Gly His Tyr Leu Val Glu Phe Lys Ser Ile 145 150 155 160 Tyr Met Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Tyr Tyr Tyr Val Asp 165 170 175 Ser Lys Leu Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu 180 185 190 Gln Tyr Glu Arg Thr Glu Gly Arg His His Leu Phe Leu 195 200 205 <210> 13 <211> 696 <212> DNA <213> Anemonia sulcata <220> <221> CDS <222> (1)...(696) <400> 13 atg gct tcc ttt tta aag aag act atg ccc ttt aag acg acc att gaa 48 Met Ala Ser Phe Leu Lys Lys Thr Met Pro Phe Lys Thr Thr Ile Glu 1 5 10 15 ggg acg gtt aat ggc cac tac ttc aag tgt aca gga aaa gga gag ggc 96 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 20 25 30 aac cca ttt gag ggt acg cag gaa atg aag ata gag gtc atc gaa gga 144 Asn Pro Phe Glu Gly Thr Gln Glu Met Lys Ile Glu Val Ile Glu Gly 35 40 45 ggt cca ttg cca ttt gcc ttc cac att ttg tca acg agt tgt atg tac 192 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe His Ile Leu Ser Thr Ser Cys Met Tyr 50 55 60 ggt agt aag gcc ttc atc aag tat gtg tca gga att cct gac tac ttc 240 Gly Ser Lys Ala Phe Ile Lys Tyr Val Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Phe 65 70 75 80 aag cag tct ttc cct gaa ggt ttt act tgg gaa aga acc aca acc tac 288 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 gag gat gga ggc ttt ctt aca gct cat cag gac aca agc cta gat gga 336 Glu Asp Gly Gly Phe Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Asp Gly 100 105 110 gat tgc ctc gtt tac aag gtc aag att ctt ggt aat aat ttt cct gct 384 Asp Cys Leu Val Tyr Lys Val Lys Ile Leu Gly Asn Asn Phe Pro Ala 115 120 125 gat ggc ccc gtg atg cag aac aaa gca gga aga tgg gag cca tcc acc 432 Asp Gly Pro Val Met Gln Asn Lys Ala Gly Arg Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 gag ata gtt tat gaa gtt gac ggt gtc ctg cgt gga cag tct ttg atg 480 Glu Ile Val Tyr Glu Val Asp Gly Val Leu Arg Gly Gln Ser Leu Met 145 150 155 160 gcc ctt aag tgc cct ggt ggt cgt cat ctg act tgc cat ctc cat act 528 Ala Leu Lys Cys Pro Gly Gly Arg His Leu Thr Cys His Leu His Thr 165 170 175 act tac agg tcc aaa aaa cca gct gct gcc ttg aag atg cca gga ttt 576 Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Ala Ala Leu Lys Met Pro Gly Phe 180 185 190 cat ttt gaa gat cat cgc atc gag ata atg gag gaa gtt gag aaa ggc 624 His Phe Glu Asp His Arg Ile Glu Ile Met Glu Glu Val Glu Lys Gly 195 200 205 aag tgc tat aaa cag tac gaa gca gca gtg ggc agg tac tgt gat gct 672 Lys Cys Tyr Lys Gln Tyr Glu Ala Ala Val Gly Arg Tyr Cys Asp Ala 210 215 220 gct cca tcc aag ctt gga cat aac 696 Ala Pro Ser Lys Leu Gly His Asn 225 230 <210> 14 <211> 232 <212> PRT <213> Anemonia sulcata <400> 14 Met Ala Ser Phe Leu Lys Lys Thr Met Pro Phe Lys Thr Thr Ile Glu 1 5 10 15 Gly Thr Val Asn Gly His Tyr Phe Lys Cys Thr Gly Lys Gly Glu Gly 20 25 30 Asn Pro Phe Glu Gly Thr Gln Glu Met Lys Ile Glu Val Ile Glu Gly 35 40 45 Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe His Ile Leu Ser Thr Ser Cys Met Tyr 50 55 60 Gly Ser Lys Ala Phe Ile Lys Tyr Val Ser Gly Ile Pro Asp Tyr Phe 65 70 75 80 Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Thr Thr Thr Tyr 85 90 95 Glu Asp Gly Gly Phe Leu Thr Ala His Gln Asp Thr Ser Leu Asp Gly 100 105 110 Asp Cys Leu Val Tyr Lys Val Lys Ile Leu Gly Asn Asn Phe Pro Ala 115 120 125 Asp Gly Pro Val Met Gln Asn Lys Ala Gly Arg Trp Glu Pro Ser Thr 130 135 140 Glu Ile Val Tyr Glu Val Asp Gly Val Leu Arg Gly Gln Ser Leu Met 145 150 155 160 Ala Leu Lys Cys Pro Gly Gly Arg His Leu Thr Cys His Leu His Thr 165 170 175 Thr Tyr Arg Ser Lys Lys Pro Ala Ala Ala Leu Lys Met Pro Gly Phe 180 185 190 His Phe Glu Asp His Arg Ile Glu Ile Met Glu Glu Val Glu Lys Gly 195 200 205 Lys Cys Tyr Lys Gln Tyr Glu Ala Ala Val Gly Arg Tyr Cys Asp Ala 210 215 220 Ala Pro Ser Lys Leu Gly His Asn 225 230 <210> 15 <211> 919 <212> DNA <213> Discosoma sp <400> 15 attcacctcg gtgatttgta agagaaagga tcaccatcaa gagaagagct gtaaaagtta 60 atattttact gtacttctac cagcatgagt gcacttaaag aagaaatgaa aatcaacctt 120 acaatggaag gtgttgttaa cgggcttcca tttaagatcc gtggggatgg aaaaggcaaa 180 ccataccagg gatcacagga gttaaccttg acggtggtta aaggcgggcc tctgcctttc 240 tcttatgata ttctgacaac gatgtttcag tacggcaaca gggcattcgt aaactaccca 300 gaggacatac cagatatttt caagcagacc tgttctggtc ctaatggtgg atattcctgg 360 caaaggacca tgacttatga agacggaggc gtttgcactg ctacaagcaa catcagcgtg 420 gttggcgaca ctttcaatta tgacattcac tttatgggag cgaattttcc tcttgatggt 480 ccagtgatgc agaaaagaac aatgaaatgg gaaccatcca ctgagataat gtttgaacgt 540 gatggaatgc tgaggggtga cattgccatg tctctgttgc tgaagggagg gggccattac 600 cgatgtgatt ttgaaactat ttataaaccc aataaggttg tcaagatgcc agattaccat 660 tttgtggacc actgcattga gataacgagt caacaggatt attacaacgt ggttgagctg 720 accgaggttg ctgaagcccg ctactcttcg ctggagaaaa tcggcaaatc aaaggcgtaa 780 atccaagcaa tctaagaaaa caacaaggca ttaaaccgaa tcaccgtttt gaatttttcg 840 ttcggaattt cttggtaaaa ctaggtttag aacgtttcat ttcgctggac ttctttgact 900 cagctgtaga caagaaaga 919 <210> 16 <211> 231 <212> PRT <213> Discosoma sp. <400> 16 Met Ser Ala Leu Lys Glu Glu Met Lys Ile Asn Leu Thr Met Glu Gly 1 5 10 15 Val Val Asn Gly Leu Pro Phe Lys Ile Arg Gly Asp Gly Lys Gly Lys 20 25 30 Pro Tyr Gln Gly Ser Gln Glu Leu Thr Leu Thr Val Val Lys Gly Gly 35 40 45 Pro Leu Pro Phe Ser Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Met Phe Gln Tyr Gly 50 55 60 Asn Arg Ala Phe Val Asn Tyr Pro Glu Asp Ile Pro Asp Ile Phe Lys 65 70 75 80 Gln Thr Cys Ser Gly Pro Asn Gly Gly Tyr Ser Trp Gln Arg Thr Met 85 90 95 Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Val Cys Thr Ala Thr Ser Asn Ile Ser Val 100 105 110 Val Gly Asp Thr Phe Asn Tyr Asp Ile His Phe Met Gly Ala Asn Phe 115 120 125 Pro Leu Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr Met Lys Trp Glu Pro 130 135 140 Ser Thr Glu Ile Met Phe Glu Arg Asp Gly Met Leu Arg Gly Asp Ile 145 150 155 160 Ala Met Ser Leu Leu Leu Lys Gly Gly Gly His Tyr Arg Cys Asp Phe 165 170 175 Glu Thr Ile Tyr Lys Pro Asn Lys Val Val Lys Met Pro Asp Tyr His 180 185 190 Phe Val Asp His Cys Ile Glu Ile Thr Ser Gln Gln Asp Tyr Tyr Asn 195 200 205 Val Val Glu Leu Thr Glu Val Ala Glu Ala Arg Tyr Ser Ser Leu Glu 210 215 220 Lys Ile Gly Lys Ser Lys Ala 225 230 <210> 17 <211> 876 <212> DNA <213> Discosoma sp. <400> 17 agtttcagcc agtgacaggg tgagctgcca ggtattctaa caagatgagt tgttccaaga 60 atgtgatcaa ggagttcatg aggttcaagg ttcgtatgga aggaacggtc aatgggcacg 120 agtttgaaat aaaaggcgaa ggtgaaggga ggccttacga aggtcactgt tccgtaaagc 180 ttatggtaac caagggtgga cctttgccat ttgcttttga tattttgtca ccacaatttc 240 agtatggaag caaggtatat gtcaaacacc ctgccgacat accagactat aaaaagctgt 300 catttcctga gggatttaaa tgggaaaggg tcatgaactt tgaagacggt ggcgtggtta 360 ctgtatccca agattccagt ttgaaagacg gctgtttcat ctacgaggtc aagttcattg 420 gggtgaactt tccttctgat ggacctgtta tgcagaggag gacacggggc tgggaagcca 480 gctctgagcg tttgtatcct cgtgatgggg tgctgaaagg agacatccat atggctctga 540 ggctggaagg aggcggccat tacctcgttg aattcaaaag tatttacatg gtaaagaagc 600 cttcagtgca gttgccaggc tactattatg ttgactccaa actggatatg acgagccaca 660 acgaagatta cacagtcgtt gagcagtatg aaaaaaccca gggacgccac catccgttca 720 ttaagcctct gcagtgaact cggctcagtc atggattagc ggtaatggcc acaaaaggca 780 cgatgatcgt tttttaggaa tgcagccaaa aattgaaggt tatgacagta gaaatacaag 840 caacaggctt tgcttattaa acatgtaatt gaaaac 876 <210> 18 <211> 230 <212> PRT <213> Discosoma sp. <400> 18 Met Ser Cys Ser Lys Asn Val Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val 1 5 10 15 Arg Met Glu Gly Thr Val Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Lys Gly Glu 20 25 30 Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly His Cys Ser Val Lys Leu Met Val 35 40 45 Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Phe Asp Ile Leu Ser Pro Gln 50 55 60 Phe Gln Tyr Gly Ser Lys Val Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro 65 70 75 80 Asp Tyr Lys Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val 85 90 95 Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Ser Gln Asp Ser Ser 100 105 110 Leu Lys Asp Gly Cys Phe Ile Tyr Glu Val Lys Phe Ile Gly Val Asn 115 120 125 Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Arg Arg Thr Arg Gly Trp Glu 130 135 140 Ala Ser Ser Glu Arg Leu Tyr Pro Arg Asp Gly Val Leu Lys Gly Asp 145 150 155 160 Ile His Met Ala Leu Arg Leu Glu Gly Gly Gly His Tyr Leu Val Glu 165 170 175 Phe Lys Ser Ile Tyr Met Val Lys Lys Pro Ser Val Gln Leu Pro Gly 180 185 190 Tyr Tyr Tyr Val Asp Ser Lys Leu Asp Met Thr Ser His Asn Glu Asp 195 200 205 Tyr Thr Val Val Glu Gln Tyr Glu Lys Thr Gln Gly Arg His His Pro 210 215 220 Phe Ile Lys Pro Leu Gln 225 230
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (31)優先権主張番号 ０９／４１８，９２２ (32)優先日 平成11年10月15日(1999．10．15) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４４４，３４１ (32)優先日 平成11年11月19日(1999．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４４４，３３８ (32)優先日 平成11年11月19日(1999．11．19) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５８，４７７ (32)優先日 平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５７，５５６ (32)優先日 平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５８，１４４ (32)優先日 平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０９／４５７，８９８ (32)優先日 平成11年12月９日(1999．12．9) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ＰＣＴ／ＵＳ９９／２９４０５ (32)優先日 平成11年12月10日(1999．12．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，６２７ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，６８７ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，６０９ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，６２６ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，８８０ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，６０７ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，７６６ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１１，８８８ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ６０／２１２，０７０ (32)優先日 平成12年６月14日(2000．6．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ラビス ユーリー アレクサンドロビッチ ロシア連邦 モスクワ 35−416 ウーリ ッツァ ゲネラーラ チュレネーバ (72)発明者 マッツ ミハイル ウラディミロビッチ ロシア連邦 モスクワ ７／２−28 ウー リッツァ テェプリ スタン (72)発明者 テルスキフ アレクセイ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サン タ クララ ハーフォード アベニュー ＃163 1760 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA05 AA11 BA80 CA02 DA02 EA04 GA11 4B064 AG01 AG27 BH20 CA10 CA19 CC24 DA01 DA10 DA13 4B065 AA90X AA93X AB01 AC14 BA02 CA24 CA41 CA44 CA46 CA50 4H045 AA10 AA20 BA10 CA50 DA75 DA76 EA01 EA15 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 天然の環境以外で存在する花虫類の色素タンパク質または蛍
    光タンパク質。
  2. 【請求項２】 タンパク質が、約300 nmから700 nmの範囲の吸収極大（abso
    rbance maximum）を有する、請求項1記載のタンパク質。
  3. 【請求項３】 タンパク質が、約350 nmから650 nmの範囲の吸収極大を有す
    る、請求項2記載のタンパク質。
  4. 【請求項４】 タンパク質が、約400 nmから600 nmの範囲の吸収極大を有す
    る、請求項3記載のタンパク質。
  5. 【請求項５】 タンパク質が、約300 nmから700 nmの範囲の励起（excitati
    on）スペクトルおよび約400 nmから800 nmの範囲の放射（emission）スペクトル
    を有する、請求項1から4のいずれか一項記載のタンパク質。
  6. 【請求項６】 タンパク質が、約350 nmから650 nmの範囲の励起スペクトル
    および約425 nmから775 nmの範囲の放射スペクトルを有する、請求項5記載のタ
    ンパク質。
  7. 【請求項７】 タンパク質が、約400 nmから600 nmの範囲の励起スペクトル
    および約450 nmから750 nmの範囲の放射スペクトルを有する、請求項6記載のタ
    ンパク質。
  8. 【請求項８】 タンパク質が、配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16
    、18の配列と実質的に同様または同一であるアミノ酸配列を有する、請求項1か
    ら7のいずれか一項記載のタンパク質。
  9. 【請求項９】 タンパク質が、配列番号：02、04、06、08、10、12、14、16
    、18からなる群より選択される配列と少なくとも約60％の配列同一性を有する、
    請求項8記載のタンパク質。
  10. 【請求項１０】 タンパク質が、配列番号：02、04、06、08、10、12、14、
    16、18からなる群より選択される配列と少なくとも約75％の配列同一性を有する
    、請求項9記載のタンパク質。
  11. 【請求項１１】 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質の断片。
  12. 【請求項１２】 請求項1から10のいずれか一項記載の花虫類の色素タンパ
    ク質もしくは蛍光タンパク質、または請求項11記載の断片をコードするヌクレオ
    チド配列を有する、天然の環境以外で存在する核酸。
  13. 【請求項１３】 配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17のヌクレ
    オチド配列と実質的に同様または同一である核酸配列を有する、請求項12記載の
    核酸。
  14. 【請求項１４】 配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17からなる
    群より選択される配列と少なくとも約60％の配列類似性を有する、請求項13記載
    の核酸。
  15. 【請求項１５】 配列番号：01、03、05、07、09、11、13、15、17からなる
    群より選択される配列と少なくとも約75％の配列類似性を有する、請求項14記載
    の核酸。
  16. 【請求項１６】 請求項12から15のいずれか一項記載の核酸の断片。
  17. 【請求項１７】 請求項12から16のいずれか一項記載の核酸またはその相補
    的配列とストリンジェントな条件下でハイブリッドを形成する、単離された核酸
    またはその模倣物（mimetic）。
  18. 【請求項１８】 請求項12から17のいずれか一項記載のベクターおよび核酸
    を含む構築物。
  19. 【請求項１９】 発現宿主において機能的な転写開始領域、転写開始領域の
    転写調節下にある請求項12から17のいずれか一項記載の核酸において見出される
    ヌクレオチド配列を有する核酸および該発現宿主において機能的な転写終結領域
    を含む、発現カセット。
  20. 【請求項２０】 発現カセットを宿主細胞へ導入した結果として、染色体外
    要素の一部としての、または宿主細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項19記載
    の発現カセットを含む、細胞またはその子孫。
  21. 【請求項２１】 以下の段階を含む、請求項1から10のいずれか一項記載の
    タンパク質を作製する方法： それによりタンパク質が発現され、請求項20記載の細胞を成長させる段階；およ
    び実質的に他のタンパク質を含まない、該タンパク質を単離する段階。
  22. 【請求項２２】 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質または請
    求項11記載の断片に、特異的に結合する抗体。
  23. 【請求項２３】 ポリクローナル抗体である、請求項22記載の抗体。
  24. 【請求項２４】 モノクローナル抗体である、請求項22記載の抗体。
  25. 【請求項２５】 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸からなる群より
    選択される導入遺伝子（transgene）を含む、トランスジェニック細胞またはそ
    の子孫。
  26. 【請求項２６】 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質を発現す
    る能力があるトランスジェニック生物。
  27. 【請求項２７】 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質を使用す
    る段階を含む、色素タンパク質または蛍光タンパク質を用いる応用における改善
    。
  28. 【請求項２８】 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸を使用する段階
    を含む、色素タンパク質または蛍光タンパク質をコードする核酸を用いる応用に
    おける改善。
  29. 【請求項２９】 請求項1から10のいずれか一項記載のタンパク質またはそ
    れを作製する手段を含むキット。
  30. 【請求項３０】 請求項12から17のいずれか一項記載の核酸を含むキット。
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