HU220185B - Transzgénikus növények, eljárás ezek előállítására és a közreható genetikai eszközök - Google Patents
Transzgénikus növények, eljárás ezek előállítására és a közreható genetikai eszközök Download PDFInfo
- Publication number
- HU220185B HU220185B HU9301921A HU9301921A HU220185B HU 220185 B HU220185 B HU 220185B HU 9301921 A HU9301921 A HU 9301921A HU 9301921 A HU9301921 A HU 9301921A HU 220185 B HU220185 B HU 220185B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna sequence
- sequence
- leu
- specific
- ser
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány növényi génsebészettel foglalkozik. Elsősorban új DNS-szekvenciákra vonatkozik, melyek promoterként funkcionálnak az asszociált, expresszálható és lehetőleg kódoló DNS-szekvenciák portokspecifikus transzkripciója során a rekombináns vagy kiméra DNSszekvenciákban. A találmány továbbá olyan rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciákra vonatkozik, melyek specifikusan a növény portokjában expresszálódnak. Ezen rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciák felhasználhatók transzgén növények, elsősorban transzgén hímsteril növények előállításához. A találmány portokspecifikus cDNS-szekvenciákra és genom DNSszekvenciákra is vonatkozik, melyek alkalmasak a találmány szerinti portokspecifikus promoterszekvenciák izolálásához.
A hímsteril növények előállítása gazdasági jelentőségű a hibrid magvak termelése terén. A hímsterilitás megszünteti az önbeporzást, amely egyébként gyakran előfordul a különböző növényfajoknál, s gátolja a nemesítést és a hibrid magvak előállítását.
A legtöbb növényi génben a transzkripció térben és időben szabályozott. A génaktivitás szabályozása a transz-működésű faktorok és a cisz-szabályozóelemek interakciójának közvetítésével történik a gén promoterrégiójában.
Különösen érdekesek azok a gének, melyek elsősorban vagy kizárólag az ivari szövetekben, mint a portokvagy pollenszövet, expresszálódnak. Az ilyen gének felhasználhatók arra, hogy olyan polipeptideket expresszáljanak, melyek eredendően nem termelődnek a portokban, illetve a pollenben. Például egy portokspecifikus génből származó promoterrégió felhasználható arra, hogy a portok sejtjeiben olyan polipeptidet expresszáljon, amely a portok sejtjeiben történő expresszálódásakor megakadályozza az életképes pollen kialakulását, miáltal hímsteril növény jön létre.
A 0 420 819 Al számú európai szabadalmi leírás ismerteti a wunl gén hímsteril növények előállításához történő felhasználását.
Az 5,086,169 számú USA szabadalmi leírás ismerteti a promoterrégió izolálását egy pollenspecifikus kukoricagén Zml3 kiónjából és annak felhasználását a pollenben történő gén expresszálódását illetően.
PCT WO 89/10396 ismerteti a TA13, TA26 és TA29 hímsterilitás DNS-ek és portokspecifikus DNSek felhasználását. A TA13 és TA29 fejlődésspecifikus expresszálódási profilja megegyezik két cDNS-klónnal (ANT5 és ANT45), melyeket mi izoláltunk.
PCT WO 90/08825 ismertet három génszekvenciát (pMSIO, pMS14, pMS18) és azok GUS jelzőgénnel történő felhasználását rekombináns DNS-szekvenciákban. Az expresszióra nem ad bizonyítékot.
PCT WO 90/08831 szétkapcsoló gént ismertet, mely emlős szétkapcsoló protein (UCP=uncoupling protein) génként ismeretes. Ez a gén a sejtek respirációját gátolja.
A PCT WO 90/08828 hibrid vetőmag előállításának molekuláris módszereit ismerteti, melyekben a fertilis pollentermelés szabályozásához pollenspecifikus promoterekként rekombináns DNS-molekulákat használnak.
Tehát a találmány elsődleges tárgyát olyan DNSszekvenciák és a megfelelő nukleotidszekvenciák képezik, melyek alkalmasak a növényi gének portokspecifikus expresszálódásának szabályozásához.
További tárgyai a találmánynak a rekombináns, illetve kiméra DNS-szekvenciák, melyek specifikusan a növény portokjában expresszálódnak, illetve az említett rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciákat magukban foglaló vektorok. Az említett DNS-szekvenciák és vektorok felhasználhatók transzgén növények, elsősorban transzgén hímsteril növények előállításához.
A találmány ezen tárgya kifejezetten jól megvalósítható a találmány területén belül, mégpedig oly módon, hogy portokspecifikus cDNS- és genom DNSszekvenciákat izolálunk, melyek megfelelően alkalmazhatók portokspecifikus promoter DNS-szekvenciák előállításához, majd ezen promoterszekvenciákat alkalmas eljárással olyan expresszálható DNS-szekvenciákhoz kapcsoljuk, melyek a kívánt terméket kódolják.
Fentiek értelmében a találmány specifikusan a növényi portokban expresszálódó, új DNS-szekvenciákra vonatkozik. Jó néhány cDNS-szekvenciát ismertetünk, melyek portokspecifikus genom DNS-szekvenciák izolálásának vizsgálatához használhatók fel. A találmány egy sajátos megvalósítási lehetőségeként két genom DNSszekvenciát írunk le, melyek specifikusan a növényi portokban expresszálódnak. A portokspecifikus promoter DNS-szekvenciákat izoláljuk a genom Hónokból, majd ezeket - (a kívánt proteint kódoló) - expresszálható DNS-szekvenciákhoz kapcsoljuk, miáltal specifikusan a növényi portokban expresszálódó kiméra vektorokhoz jutunk.
A találmány továbbá portokspecifikus cDNS- és genom DNS-szekvenciákra is vonatkozik.
A találmány magában foglal egy izolált nuHeotidszekvenciát, mely esszenciálisán portokspecifikus cDNS-szekvenciából áll. A cDNS-szekvencia cDNSkönyvtárak differenciálscreenelésével nyerhető. Azokat a cDNS-Hónokat kell kiválasztani, melyekről megállapítható, hogy specifikus módon a portok szövetében expresszálódnak. A találmány cDNS-klónjai a következő DNS-szekvenciák: 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 14. és 20. szekvencia.
Másrészről a találmány részét képezi egy izolált DNS-szekvencia, mely esszenciálisán olyan DNSszekvenciából áll, mely megfelel egy portokspecifikus cDNS-klónnak, s így alkalmas ezen portokspecifikus cDNS-sel történő hibridizációra. A találmány genom DNS-szekvenciája legelőnyösebben genomkönyvtárból hibridizációval nyerhető, próbaként portokspecifikus cDNS-szekvencia felhasználásával.
A találmány genom DNS-szekvenciái a következő DNS-szekvenciák lehetnek: 16. és 18. szekvencia, vagy előállíthatok az 1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 14. és 20. szekvenciákkal rendelkező cDNS-ekkel extrém körülmények között végzett hibridizációval.
Ezen genom DNS-ek kiindulópontként szolgálnak olyan DNS-szekvenciák izolálásához, melyek promoterként szolgálnak az expresszálható és kódoló, asszo2
HU 220 185 Β ciált DNS-szekvenciák rekombináns vagy kiméra DNSekben történő portokspecifikus transzkripciójában.
Magától értetődő, hogy amint a találmány szerinti DNS-szekvenciák azonosítása egyszer már megtörtént, nincs szükség minden egyes alkalommal a megfelelő fonásból történő izolálásra, de természetesen bármikor könnyen szintetizálhatok az ismert kémiai eljárások segítségével. Rövid DNS-oligonukleotidok szintéziséhez alkalmasak például a foszfotriészter- vagy a foszfitmódszerek, melyek a szakember számára ismertek. Manapság az oligonukleotid-szintézisek döntő többsége gépesített és automatizált, így ezek rövid idő alatt állíthatók elő.
A találmány fent említett DNS-szekvenciáinak egy vagy több bázispáiját érintő delécióval, inszercióval vagy szubsztitúcióval könnyen előállíthatok a kérdéses szekvenciák variánsai, illetve mutánsai, s ellenőrizhetők a tekintetben, hogy portokspecifikus promoterszekvenciaként mennyire alkalmasak.
Specifikus mutánsok előállításának egy különlegesen hatékony módszere az úgynevezett oligonukleotidközvetített mutagenezis. Ezzel a módszerrel rövid oligonukleotid-fragmentumok szintetizálhatok, melyek alapján homológok a vad típus szekvenciájával, mégis egyes nukleotidokban különböznek azoktól. Ezek a különbségek származhatnak egy vagy több nukleotidot érintő inszercióból, delécióból, inverzióból, szubsztitúcióból vagy ezek kombinációjából. A mutáns fragmentumokkal általánosan ismert módszerekkel helyettesíthető a vad típusú gén homológ másolata. A befejező lépés egy megfelelő növényi vektorba történő klónozás, illetve transzformáció a növényben.
Bizonyos DNS-fiagmentumok mutációja sikeresen hajtható végre a polimeráz-láncreakcióval (PCR). Ebben az in vitro eljárásban olyan kémiai úton szintetizált oligonukleotidok használatosak, melyek általában a mutálandó DNS-fiagmentum perifériás régiójából származnak, s szálspecifikusak. Alkalmas körülmények mellett az oligonukleotidokat hibridizálják a denaturálással előállított egyszálú DNS komplementer régióival. Az ilyen módon nyert kétszálú régiók a következő polimerázreakcióhoz kiindulási pontként használatosak. Ebben az eljárásban az E. coli DNS-polimerázokon kívül használhatók termofil baktériumból (például Thermus aquaticus) származó, speciálisan hőtűrő polimerázok is.
A találmány nem korlátozódik azokra a promoterszekvenciákra, melyek a találmány szerinti genom DNS-szekvenciákból származtathatók, hanem magában foglalja mindazokat a mutánsokat és/vagy variánsokat, amelyek a DNS-szekvenciákból egy vagy több bázis deléciójával, inszerciójával, illetve szubsztitúciójával származtathatók, s megőrzik a találmány szerinti kiindulási szekvenciák specifikus tulajdonságait.
A találmány továbbá magában foglal izolált rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciákat. Ezekben a promoterrégió, mely portokspecifikus genom DNS-szekvenciából nyerhető, mesterségesen kapcsolt a portok sejtjeiben expresszálni kívánt proteint kódoló, expresszálható DNS-szekvenciához. Például a találmány izolált rekombináns DNS-szekvenciája tartalmazhat
5’-3’ irányban promoterrégiót, mely portokspecifikus genom DNS-szekvenciából nyerhető, s mesterségesen kapcsolt ahhoz a DNS-szekvenciához, mely egy olyan polipeptidet kódol, amely a portok sejtjeiben történő expresszálódásakor meggátolja az életképes pollen kialakulását. Az ily módon kapott növény nem tud életképes pollensejteket termelni, így hímsteril lesz. Ilyen rekombináns DNS-szekvenciák a kiméra vektorok, melyekben egy portokspecifikus promoter mesterségesen kapcsolt a polipeptidet kódoló DNS-szekvenciához, mint például a DTA, TURF-13, pektátliáz, ginrekombináz, iaaL vagy cytA toxingének kódolószekvenciáihoz.
A találmány továbbá expresszálható DNS-szekvenciához mesterségesen kapcsolt portokspecifikus promoterrégiót 5’-3’ irányban tartalmazó rekombináns DNSmolekula előállítási módszerére vonatkozik, mely eljárás a következőkből áll:
(i) alkalmas forrásból promoterrégió izolálása vagy az ismert módszerekkel történő szintetizálása; ez a promoterrégió felelős az asszociált, expresszálható DNSszekvenciák portokspecifikus expressziójáért;
(ii) az említett portokspecifikus DNS-szekvenciák expresszálható DNS-szekvenciákhoz 5’-3’ irányban történő működőképes kapcsolása.
Hogy a rekombináns DNS-szekvencia által kódolt peptid növényi sejten belüli helyzetét specifikusan irányíthassuk, a találmány rekombináns DNS-szekvenciájának 5’-3’ irányban tartalmaznia kell egy portokspecifikus promoterrégiót, mely a kódoló DNS-szekvenciához működőképesen kapcsolt jelzőszekvenciához kapcsolódik.
A találmány egy következő kiviteli alakként magában foglalja a találmány portokspecifikus szekvenciáit tartalmazó plazmidokat, főként azokat a rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciákat, melyekben a portokspecifikus genom DNS-szekvenciából nyerhető promoterrégió olyan expresszálható DNS-szekvenciához van mesterségesen kapcsolva, mely lehetőleg a portok sejtjeiben expresszálni kívánt fehéijéket kódolja. Ezek a plazmidok többek között a következők: pCIB3132, pCIB3132B, pCIB3178, pCIB3179, pLC251. A találmány magában foglal továbbá olyan, a találmány plazmidjaiból származtatható promoterfragmentumokat is, melyek rendelkeznek a találmány megvalósítását illetően esszenciális tulajdonságokkal, azaz képesek portokspecifikusan irányítani egy asszociált DNS-szekvencia expresszálódását.
A találmány egy nukleotidszekvenciának vagy -fragmentumnak egy plazmidból történő fizikai izolálására is vonatkozik. Ez lehet - a plazmidok egyikével homológ próba felhasználásával - egy nukleotidszekvencia, illetve -fragmentum fizikai izolálása, vagy a plazmidok nukleotidszekvenciáinak felhasználásával előállított szintetikus nukleotid fizikai izolálása.
A találmány egy másik kiviteli alakját transzgén növények ivaros és/vagy ivartalan úton létrejött utódai képezik. A növények transzformálása olyan rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciával történik, mely a találmány szerinti portokspecifikus promoterszekvenciát, il3
HU 220 185 Β letve optimálisan 5’-3’ irányban egy expresszálható, kódoló DNS-szekvenciához mesterségesen kapcsolt jelzőszekvenciát tartalmaz. Ezen transzgén növények a kiméra DNS-szekvencia által kódolt polipeptidet kizárólag a növényi portokban fogják expresszálni. Ha a kódolt polipeptid olyan, hogy a portok sejtjeiben történő expressziója során megakadályozza az életképes pollen kialakulását, a transzgén növény nem lesz képes élő pollensejteket termelni, s így a növény hímsteril lesz. Az ilyen transzgén növények kódolhatják például a következőket: DTA, TURF-13, pektátliáz, ginrekombináz, iaaL, cytA toxin.
A rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciák egyikével transzformált hímsteril növények ugyancsak a találmány tárgyát képezik.
A találmány továbbá rekombináns DNS-molekulát tartalmazó transzformált növényi anyag (ideértve a növényt) előállítási eljárását foglalja magában. A rekombináns DNS-molekula 5’-3’ irányban egy expresszálható DNS-szekvenciához mesterségesen kapcsolt portokspecifikus promoterrégiót tartalmaz. Az eljárás a következő lépésekből áll:
(i) az asszociált, expresszálható DNS-szekvencia portokspecifikus expresszálódásáért felelős promoterrégió megfelelő forrásból történő izolálása vagy az ismert módszerekkel történő szintetizálása;
(ii) a portokspecifikus DNS-szekvenciának az expresszálható DNS-szekvenciához 5’-3’ irányban történő mesterséges kapcsolása;
(iii) a kapott DNS-konstrukció expressziós vektorba történő klónozása növényekben aktív expressziójelzők kontrollja mellett;
(iv) az expressziós vektor ismert eljárásokkal növényi anyagba való transzformálása, s az abban történő expresszálása; adott esetben (v) az (iv) pont szerinti transzformált növényi anyag teljes, lehetőleg normál fenotípusú növénnyé történő regenerálása.
A portokspecifikus jelző a portok szövetéhez kapcsolt cDNS-ek, genom DNS-ek, messenger RNS-ek, promoter DNS-szekvenciák és gének megjelölésére szolgál. cDNS-ek, genom DNS-ek és messenger RNSek esetében a portokspecifikus kifejezés azt jelenti, hogy a Northemblot-hibridizációval végzett meghatározáskor a cDNS-, genom DNS- vagy mRNS-szekvenciának megfelelő mRNS a portok szöveteiben - más szövetekhez képest - százszoros koncentrációban van jelen. A promoter DNS-szekvenciák esetében a portokspecifikus kifejezés olyan regulátorszekvenciát jelöl, mely az asszociált kódolószekvenciák transzkripcióját úgy irányítja, hogy a megfelelő mRNS a portok szövetében - más szövetekhez képest - legalább százszoros koncentrációban jelenik meg. Gének esetében a portokspecifikus kifejezés olyan gént jelöl, melynek expresszálódása olyan génterméket eredményez, amely a portok szövetében - más szövetekben tapasztalhatóhoz képest - százszoros koncentrációban jelenik meg. Mivel mind a portok-, mind a pollenszövet a növény hímivari funkciójával kapcsolatos, a találmány értelmében egy DNS-szekvencia vagy gén akkor tekinthető portokspecifikusnak, ha specifikusan a portok vagy a pollen szövetében expresszálódik.
A rekombináns és kiméra kifejezések azt jelentik, hogy több, különböző eredetű DNS-szekvencia fúziójával vagy ligálásával keletkezett DNS-szekvencia, vektor vagy gén a természetben nem fordul elő. Például egy portokspecifikus génből származó promoterrégiónak egy más, heterológ eredetű gén kódolószekvenciájával történő összekapcsolásának eredményét rekombinánsnak vagy kimérának nevezik.
A következő leírásban számos olyan kifejezés szerepel, amely a DNS-technológiában és a növényi genetikában általánosan használatos. Annak érdekében, hogy a leírás és az igénypontok egyértelműségét biztosítsuk, a következő definíciókat soroljuk fel.
Növényi anyag: olyan növényi részek, melyek kultúrában vagy önmagukban életképesek, például protoplasztok, kalluszok, szövetek, embriók, növényi szervek, rügyek, magvak stb., illetve teljes növények.
Növényi sejt: a növény strukturális és fiziológiai egysége, mely protoplasztból és sejtfalból áll. A növényi sejt lehet izolált egyedi sejt, de lehet magasabb szerveződésű egység - mint a növényi szövet, szerv, teljes növény - része is.
Protoplaszt: növényi sejtekből vagy szövetekből izolált sejtfal nélküli csupasz sejt, melynek megvan az a képessége, hogy sejtklónná vagy teljes növénnyé regenerálódjon.
Növényi szövet: strukturális és funkcionális egységgé szerveződött növényi sejtek csoportja.
Növényi szövet: több szövetből álló strukturális és funkcionális egység, például gyökér, szár, levél, embrió.
Heterológ gén(ek) vagy DNS: olyan, specifikus terméket vagy termékeket kódoló vagy biológiai funkciót betöltő DNS-szekvencia, amely más fajból származik, mint amelybe az említett gént inszertáljuk: ezen DNSszekvenciát szokásos idegen génnek vagy DNS-nek is nevezni.
Homológ gén(ek) vagy DNS: olyan, specifikus terméket vagy termékeket kódoló vagy biológiai funkciót betöltő DNS-szekvencia, amely ugyanabból a fajból származik, mint amelybe az említett gént inszertáljuk.
Szintetikus gén(ek) vagy DNS: olyan, specifikus terméket vagy termékeket kódoló vagy biológiai funkciót betöltő DNS-szekvencia, mely szintetikus eljárással készült.
A találmány portokspecifikus nukleotidszekvenciákra, elsősorban rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciákra vonatkozik, melyek a növényi portokban sokkal nagyobb mértékben expresszálódnak, mint más szövetekben. Az említett rekombináns vagy kiméra DNSszekvenciák olyan, portokspecifikus genom DNS-szekvenciából származtatható promoterszekvenciát tartalmaznak, mely a portok sejtjeiben expresszálni kívánt fehérjét kódoló, expresszálható DNS-szekvenciához mesterségesen van kapcsolva.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint a kódoló DNS-szekvencia olyan polipeptidet kódol, amely a portok sejtjeiben történő expressziója esetén megakadályozza az életképes pollen kialakulását.
HU 220 185 Β
Kódoló DNS-szekvenciaként azon szekvenciák előnyösek, melyek a következő polipeptidek valamelyikét kódolják: DTA, TURF-13, pektátliáz, ginrekombináz, iaaL, cytA toxin.
A találmány szerinti rekombináns vagy kiméra DNS-szekvenciák előállításához használt portokspecifikus promoter DNS-szekvenciákat genom kiónokból izoláltuk, majd 5’-3’ orientációban olyan expresszálható DNS-szekvenciákhoz kapcsoltuk, melyek kódolják a kívánt fehéqeterméket. így specifikusan a növényi portokban expresszálódó kiméra vektorokat állítottunk elő.
A találmány egy speciális megvalósításában olyan izolált portokspecifikus genom DNS-klónokat foglal magában, melyek megfelelnek a már korábban említett
1., 3., 5., 7., 9., 11., 13., 14., 20. szekvenciával rendelkező portokspecifikus cDNS-klónoknak.
A portokspecifikus genom kiónok úgy nyerhetők, hogy portokspecifikus cDNS-klónokat használva próbaként kiválasztjuk a nekik megfelelő genom DNS-klónokat. Megfelelő genom DNS-klónok azok, melyek transzkripciója során olyan messenger RNS keletkezik, mely komplementer egy adott cDNS-sel, illetve azzá íródik át. A találmány magában foglalja az ant32 és ant34D izolált portokspecifikus genom DNS-klónokat, mely nukleotidszekvenciák a 16. és a 18. szekvenciájú cDNS-klónoknak felelnek meg.
Számos cDNS-szekvenciát írunk le, melyek tesztként használhatók a portokspecifikus genom DNS-szekvenciák izolálásához.
A találmány egy megvalósítási módjaként magában foglalja az ant32, ant43D, ant9, ant52, ant59, ant66, ant67, ant68 és ant43C izolált portokspecifikus cDNSklónokat, melyek megfelelnek az 1., 3., 5., 7., 9., 11.,
13., 14. és 20. nukleotidszekvenciáknak.
A találmány egy előnyös megvalósításában a találmány szerinti portokspecifikus cDNS-szekvenciát portok-, illetve levélszövetből történő cDNS-könyvtár készítésével nyertük. A levélből származó egyszálú DNS-t fotobiotinizáltuk és hibridizáltuk a portok-DNS-sel, majd a fotobiotinizált DNS-t eltávolítva a könyvtár portokspecifikus cDNS-szekvenciákkal gyarapodott (3. példa). A portokspecifikus cDNS-eket differenciálscreeneléssel azonosítottuk (4. példa). A portokspecifikus cDNS-eket kereszthibridizálva azonosítottuk az egyedülálló cDNS-eket (4. példa). A portokspecifikus expressziót különböző növényi szövetekkel történő RNS-blot-hibridizációval és in situ hibridizációval ellenőriztük (5. és 8. példa). A portokspecifikus cDNS-klónok fejlődésspecifikus expresszióját, szekvencia- és génkópiaszámát szintén meghatároztuk (6., 7. és 9. példa).
A találmány szerinti cDNS-szekvenciák felhasználhatók genom DNS-szekvenciák izolálásához. Abban az esetben, ha cDNS-részlet áll rendelkezésre, azt a portokspecifikus cDNS-könyvtár vizsgálatához tesztként használva teljes hosszúságú cDNS-klónt tudunk izolálni. A hibridizálóklónokat tisztítottuk, restrikciós módszerrel térképeztük és szekvenáltuk. A teljes hosszúságú klón pontos méretű üzenetet hordozó résszel és komplett leolvasókerettel rendelkezik. A genom kiónok izolálásának érdekében a genom könyvtárak vizsgálatához, próbaként, teljes hosszúságú portok-cDNS-t használtunk. Restrikciós térképezéssel és a portokcDNS-sel történő hibridizációval azonosítottuk a genom klón kódolórégióját. A klón kódolórégiójától ellenkező irányba eső terület a portok-promoterrégió.
A portokspecifikus promoterrégió deléciós analízissel még pontosabban térképezhető. A portokpromoter 5’-delécióit restrikciós helyek bevitelével végeztük, oligonukleotid primerek felhasználásával történt PCR-rel. A restrikciós helyek az 5’-végen, a portok-promoterszekvenciák a 3’-végen helyezkednek el. A PCR-termékeket emésztettük, tisztítottuk és a pBHOl plazmidba l(Clontech) klónoztuk. A deléciós mutánsok az 5’ nem transzlatált leaderszekvenciát a GUS gén transzlációs starthelyéhez kötődve tartalmazzák. A portokpromoterek 3’- és közbenső delécióit PCR-rel, hasonló módon végeztük. A PCR-fragmentumokat a CAMV 35S minimálpromotert [(-46)-(+1); Benfey és munkatársai, 1990] tartalmazó GUS vektorhoz fuzionáltuk. A transzgén növények tesztelését a GUS fluorometrikus és hisztokémiai eljárással végeztük.
A portokspecifikus promoterrégió a találmány keretein belül felhasználható olyan rekombináns vagy kiméra DNS-ek előállításához, melyek expresszálható DNS-szekvenciát, elsősorban specifikusan a növényi portokban expresszálódó, kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak.
A találmány szerinti rekombináns DNS-szekvenciák a portokspecifikus genom DNS-szekvenciából nyerhető, a kódoló DNS-szekvenciához mesterségesen kapcsolt promoterrégiót 5’-3’ irányban tartalmazzák. A rekombináns DNS-szekvenciák az asszociált, expresszálható DNS portokspecifikus expresszióját eredményezik. Az expresszálható DNS előnyösen olyan kódolószekvencia, mely struktúrgénként működik.
A kódoló DNS-szekvencia bármely, a kívánt polipeptidet kódolószekvencia lehet. A találmány területén előnyösek például mindazon struktúrgének, melyek védőhatást eredményeznek a transzformált növényi sejtekben és a belőlük fejlődő szövetekben, még inkább magukban a növényekben, például fokozott rezisztenciát patogénekkel (például növénykártevő gombák, baktériumok, vírusok stb.), kemikáliákkal [például herbicidek (mint a triazinok, tiokarbamidok, imidazolinonok, triazol-pirimidinek, bialafosz, glifozátok stb.), inszekticidek vagy más biocidek] szemben, illetve zavaró környezeti hatásokkal szemben (például meleg, hideg, szél, káros talajjellemzők, nedvesség, szárazság).
A találmány területén belül felhasználható kódoló DNS-ek lehetnek továbbá azok, amelyek a növényi sejtben kívánatos és hasznos vegyületek termelődését eredményezik.
A találmány keretein belül szintén felhasználhatók mindazon gének, melyek tartalék vagy raktározott anyagok fokozott termelődését eredményezik a levelekben, magvakban, gumókban, szárakban, gyökerekben vagy a magvak fehéijetesteiben. A transzgén növények által termelt anyagok lehetnek például proteinek, szénhidrátok, aminosavak, vitaminok, alkaloidák, flavinok, illatanyagok, festékek, zsírok stb.
HU 220 185 Β
A találmány szerinti DNS-szekvenciákkal asszociálhatnak olyan struktúrgének is, melyek gyógyászatilag alkalmazható aktív anyagokat kódolnak, például hormonokat, immunmodulátorokat és más, fiziológiailag aktív anyagokat.
A találmányban kifejezetten előnyösen alkalmazhatók azok a kódoló DNS-szekvenciák, amelyek olyan polipeptidek szintézisét kódolják, melyek a portok sejtjeiben expresszálódva képtelenné teszik a növényt arra, hogy életképes pollent termeljen. Ilyen DNS-szekvenciák például azok a gének, melyek leírása a következő hivatkozásokban található.
a) Diphteria toxin A-lánc gén (DTA), mely a fehérjeszintézist gátolja; Greenfield és munkatársai, 1983; Palmiter és munkatársai, 1987.
b) Erwinia chrysanthemi EC 16-ból származó pektátliáz gén (pelE), mely lebontja a pektint, miáltal sejtlizist okoz. Keen és munkatársai, 1986.
c) cms-T kukoricamitokondrium genomból származó T-urfl3 (TURF-13) gén, mely a mitokondrium- és a plazmamembránt roncsoló URF13 polipeptidet kódolja. Braun és munkatársai, 1990; Dewey és munkatársai, 1987; Dewey és munkatársai, 1986.
d) Fág Mugénből származó ginrekombináz gén. Ez helyspecifikus DNS-rekombinázt kódol, mely növényi sejtben történő expresszió esetén genomátrendeződést okoz, s csökkenti a sejt életképességét. Maeser és munkatársai, 1991.
e) Pseudomonas syringaebőA származó indolecetsav-lizin-szintetázgén (iaaL), mely olyan enzimet kódol, amely a lizint indolecetsavhoz (IAA) kapcsolja. A gén a növényi sejtekben történő expresszió esetén megváltozott fejlődést eredményez azáltal, hogy az ΙΑΑ-t a sejtből konjugáció útján eltávolítja. Romano és munkatársai, 1991; Spena és munkatársai, 1991; Roberto és munkatársai, 1990.
f) Bacillus thuringiensis Israelensisbol származó CytA toxingén, mely szúnyogirtó, illetve haemolitikus hatású fehéijét kódol. Ezen gén növényi sejtben történő expresszió esetén a sejtmembrán roncsolásával a sejt pusztulását okozza. McLean és munkatársai, 1987; Ellar és munkatársai, US Patent No. 4,918,006 (1990).
A találmány rekombináns DNS-szekvenciái 5’-3’ irányban tartalmazhatnak portokspecifikus genom DNS-szekvenciából nyerhető, egy kódoló DNS-szekvenciához mesterségesen kapcsolt jelzőszekvenciához mesterségesen kapcsolódó promoterrégiót is. A jelzőszekvencia felelős az asszociált peptid növényi sejten belüli specializált transzportjáért.
A találmány jelzőszekvenciája bármely olyan DNSszekvencia lehet, amely képes egy asszociált pepiidnek a sejt egy vagy több területére történő transzportját irányítani. A jelzőszekvencia elsősorban olyan szekvencia, mely jelzőpeptiddé transzlatálódik. A jelzőpeptid a peptid transzportjának befejeződése után elkülönül a peptidtől. A jelzőszekvenciák alkalmasak a kódoló DNS-szekvenciák polipeptidtermékeinek sejten belüli megfelelő irányítására (például mitokondriumba vagy az endoplazmatikus retikulumba), illetve azok extracelluláris transzportjának irányítására. Ilyen, a találmányban alkalmazható jelzőszekvencia például a dohány pathogenesis-related génje (PR-1) (Comellisen és munkatársai, 1986); az élesztő mitokondriális preszekvenciája (Schmitz és munkatársai, 1989); a növényi mitokondriális Rieske vas-kén protein jelzőszekvenciája (Huang és munkatársai, 1991); a mitokondriális és kloroplaszt célpeptidek (von Heine és munkatársai, 1989). A tudományban ismeretes más leaderszekvenciák azonosítása, lásd Della-Cioppa és munkatársai, 1987; Schekman, 1985.
Komplett kódoló DNS-szekvenciák kialakítása érdekében általánosan ismert eljárásokkal a legkülönfélébb szekvenciaszakaszok kapcsolhatók egymáshoz. Alkalmazható módszerek például a homológ szakaszokkal rendelkező DNS-szekvenciák in vivő rekombinációja, illetve a restrikciós fragmentumok in vitro összekapcsolása.
Ami a klónozóvektorokat illeti, rendelkezésre állnak olyan általánosan használt plazmid- vagy vírus(bakteriofág) vektorok, melyek a gazdasejttel kompatibilis fajból származó replikációs és kontrollszekvenciákkal bírnak.
A klónozóvektor rendszerint replikációs kezdőpontot hordoz, speciálisan E. co/iban, Agrobacteriumbsn vagy mindkettőben működőképes kezdőpontot, illetve specifikus géneket, melyek a transzformált gazdasejtben fenotípusos szelekciós jellemzőket alakítanak ki, elsősorban antibiotikum- és specifikus herbicid rezisztenciát. Ezen fenotípusos markerek alapján a transzformáció után kiszelektálhatok a gazdasejtben levő transzformáit vektorok. A találmányban felhasználható szelektálható fenotípusos markerek például: rezisztencia ampicillinre, tetraciklinre, higromicinre, kanamicinre, metotrexátra, G418-ra és neomicinre, de ez a felsorolás nem jelenti a találmány tárgyának korlátozását.
A találmányban alkalmazható gazdasejtek prokarióta baktériumok, például A. tumefaciens, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens, illetve cianobaktériumok. Eukarióta gazdák, mint például élesztők, micéliumképző gombák, növényi sejtek szintén felhasználhatók.
A találmány szerinti hibrid gén alkalmas klónozóvektorba történő illesztése standard módszerekkel (splicing) vihető végbe, lásd például Maniatis és munkatársai, 1982; Sambrook és munkatársai, 1989.
A klónozóvektorokat és a velük klónozott gazdasejtet rendszerint felhasználjuk a sejtben klónozott konstrukciók kópiaszámának növelésére. A megnövekedett kópiaszám következtében lehetővé válik a hibrid génkonstrukciót hordozó vektor izolálása, illetve előkészítése például kiméra génszekvencia növényi sejtbe történő inszerciójához.
Következő lépésként ezen plazmidok a kívánt génterméket kódoló struktúrgének vagy a regulátor funkciót betöltő, nem kódoló DNS-szekvenciák növényi sejtbe történő inszericójához, illetve növényi genomba történő integrálásához használatosak.
A találmány szerinti növényi anyagok lehetnek protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, embriók, petesejtek, zigóták stb., s nem utolsósorban megfelelő hímsterilitású teljes növények, melyek transzformá6
HU 220 185 Β lása az ismert eljárások alkalmazásával történt, s melyek expresszálható formában tartalmazzák a találmány szerinti rekombináns DNS-t. A találmány továbbá magában foglalja az említett transzgén növényi anyagok előállítási módszerét is.
A portokspecifíkus módon expresszálódó expressziós terméket tartalmazó transzformált növényi anyag, illetve teljes növény előállítási módszere a következő lépésekből áll :
(i) elsőként az asszociált, expresszálható DNS-szekvencia portokspecifíkus expressziójáért felelős DNSszekvencia alkalmas forrásból történő izolálása vagy ismert módszerekkel történő - szintetizálása;
(ii) az említett portokspecifíkus DNS-szekvencia expresszálható DNS-szekvenciához 5’-3’ irányban történő működőképes kapcsolása;
(iii) a kapott konstrukció növényi expressziós vektorba történő klónozása növényekben aktív expressziójelzők kontrollálása mellett;
(iv) az említett expressziós vektor ismert eljárásokkal történő transzformálása a növényi anyagba, illetve expresszálása a növényi anyagban; és adott esetben (v) az (iv) lépés szerint transzformált növényi anyag lehetőleg fenotipikusan normális, teljes növénnyé történő regenerálása.
A találmány továbbá olyan transzgén növényeket és azok ivaros és/vagy ivartalan úton létrejött utódait foglalja magában, melyek portokspecifíkus genom DNS-szekvenciából származó promoterrégiót tartalmazó rekombináns DNS-szekvenciával voltak transzformálva.
A „transzgén növények ivaros és ivartalan úton létrejött utódai” kifejezésen a találmány értelmében olyan mutánsokat és variánsokat is értünk, melyek az ismert eljárások alkalmazásával nyerhetők (például sejtfúzióval vagy mutánsszelekcióval), s mely mutánsok és variánsok a transzformált növényi anyag keresztezési és fúziós termékeivel együtt rendelkeznek még az eredeti transzformált növény jellegzetes tulajdonságaival.
A találmány transzgén növények proliferációs (szaporító-) anyagaira is vonatkozik. A transzgén növények proliferációs anyaga a találmányt illetően úgy határozható meg, mint bármely olyan növényi anyag, mely ivarosán vagy ivartalanul in vivő vagy in vitro szaporítható. A találmány keretein belül különösen előnyben részesített anyagok - más, a transzgén növényekből származó szaporítóanyagokkal együtt - a protoplasztok, sejtek, kalluszok, szövetek, szervek, magvak, embriók, petesejtek, zigóták.
A szekvenciák leírása
Az 1. szekvencia az ant32 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 2. szekvencia az ant32 nukleotidszekvencia (1. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 3. szekvencia az ant43D portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 4. szekvencia az ant43D nukleotidszekvencia (3. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
Az 5. szekvencia az ant9 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 6. szekvencia az ant9 nukleotidszekvencia (5. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 7. szekvencia az ant52 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 8. szekvencia az ant52 nukleotidszekvencia (7. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 9. szekvencia az ant59 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 10. szekvencia az ant59 nukleotidszekvencia (9. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
All. szekvencia az ant66 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 12. szekvencia az ant66 nukleotidszekvencia (11. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 13. szekvencia az ant67 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 14. szekvencia az ant68 portokspecifíkus cDNSklón nukleotidszekvenciája.
A 15. szekvencia az ant68 nukleotidszekvencia (14. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 16. szekvencia az Ant32 genom klón nukleotidszekvenciája. Ez a szekvencia az ant32 gén nukleotidszekvenciáját mutatja, az 5’-határszekvencia 2,0 kbát tartalmazva. A TATA box az 1971-1975 bázisoknál található. Az igazinak vélt transzkripciós starthely a 2009-es bázisnál található. A 2009-2075-ös bázisok tartalmazzák a transzlálatlan leaderszekvenciát. Az ATG transzlációs kezdőkodon a 2076-2078-as bázisoknál helyezkedik el. Intronok nincsenek. A TGA stopkodon a 3420-3422-es bázisoknál van.
A 17. szekvencia az Ant32 nukleotidszekvencia (16. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 18. szekvencia az Ant43D genom klón nukleotidszekvenciája. Ez a szekvencia az ant43D gén nukleotidszekvenciáját mutatja, az 5’-határszekvencia mintegy 1,2 kb-át tartalmazva. A valódinak vélt transzkripciós starthely az 1167-es bázisnál található. Szokatlanul hosszú TATA box található az 1089-1147-es bázispárok között. A „TA” szekvencia 29-szer ismétlődik. A transzlálatlan leaderszekvencia az 1167- 1229-es bázisok között helyezkedik el. A transzlációs kezdőkodon az 1230-1232-es bázisok között található. A lefordított szekvenciákat nagybetűvel jelöltük. Az 1571-1668-as bázisok között egy intron helyezkedik el.
A 19. szekvencia az Ant43D nukleotidszekvencia (18. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
A 20. szekvencia az ant43C portokspecifíkus cDNS-klón nukleotidszekvenciája.
A 21. szekvencia az ant43C nukleotidszekvencia (20. szekvencia) által kódolt polipeptid aminosavszekvenciája.
HU 220 185 Β
Az ábrák leírása
1. ábra: az Ant32 genom klón pCIB950 restrikciós térképe. A nyíl jelöli az ant32 génnek a pCIB950 genom szubklónon belüli helyzetét és 5’-3’ orientációját. A promoterrégió a leolvasási iránnyal ellentétes irányba eső PstI helytől a kódolórégióig terjed.
2. ábra: az Ant43D genom klón pCIB952 restrikciós térképe. A nyíl jelöli az ant43D génnek a pCIB952 genom szubklónon belüli helyzetét és 5’-3’ orientációját. A promoterrégió a leolvasási iránnyal ellentétes irányba eső EcoRI helytől a kódolórégióig terjed.
3. ábra: helyspecifikus mutagenezis útján megvalósított PCR, mely az Ant32 (3A. ábra) és az Ant43D (3B. ábra) transzlációs kezdőpontja elé történő Xbal hely inszerciójának eredménye.
A 3A. ábrán a bal felső rajz a promotert tartalmazó Pstl-SacI ant32 genom szubklón 3’-végét ábrázolja. Alatta az ATG-nél lévő szekvencia látható, amely elé a 16. példában leírt módon Xbal helyet inszertáltunk.
A 3B. ábrán a bal felső rajz a promotert tartalmazó EcoRI ant43D genom szubklón 3’-végét ábrázolja. Alatta az ATG-nél lévő szekvencia látható, amely elé a 18. példában leirt módon Xbal helyet inszertáltunk.
4. ábra: az Ant32-GUS fúziók plazmidtérképei, pCIB3132 (2,0 kb promoter - 4A. ábra) és pCIB3132B (600 bp promoter - 4B. ábra). A pCÍB3132 plazmidot a USD A Agricultural Research Service Culture Collectionben helyeztük letétbe [Northern Régiónál Research Center (NRRL), 1815 Northern University Street, Peoria, 111. 61604] 1992. június 16-án az NRRL B-18977 letéti számon.
5. ábra: az Ant32-DTA fúzió plazmidtérképe, pLC251.
6. ábra: az Ant43D-GUS fúzió plazmidtérképe, pCIB3178. A pCIB3178 plazmidot 1992. június 16-án helyeztük letétbe (USDA NRRL) és NRRL B-18978 letéti számon.
7. ábra: az Ant43D-DTA fúzió plazmidtérképe, pCIB3179.
A következő példák a találmány megvalósításában felhasznált anyagok és módszerek további leírását teszik lehetővé. Ezen példákat szemléltetésként adjuk közre, s nem jelentik az oltalmazni kívánt találmány korlátozását.
Általános rekombináns DNS-technikák
Mivel a szakember számára a találmányban alkalmazott rekombináns DNS-technikák végrehajtása rutinmunka, jobbnak tartottuk az általánosan használt technikák rövid leírását, mintsem hogy minden egyes előfordulás alkalmával jellemezzük azokat. Ahol nem tettünk külön megjegyzést, az alkalmazott eljárások a referenciaként hozott Maniatis és munkatársai (1982) könyvében találhatók.
A) Hasítás restrikciós endonukleázokkal
A reakcióelegy általában 50-500 pg/ml koncentrációban tartalmaz DNS-t a gyártó (New England Biolabs, Beverly, MA.) által ajánlott pufferoldatban. A DNS minden pg-jához 2-5 egységnyi restrikciós endonukleázt adva a reakcióelegyet a gyártó által javasolt hőmérsékleten 1-3 órán keresztül inkubáltuk.
A reakciót 65 °C-on történő 10 perces inkubációval vagy fenolos extrakciót követő etanolos DNS-kicsapással fejeztük be. Ezen technika leírása a Maniatis és munkatársai (1982) referenciában a 10-106. oldalakon található.
B) A DNS polimerázzal történő kezelése, mely tompa végek kialakulását eredményezi
A gyártó (New England Biolabs) által javasolt pufferben 50-500 pg DNS-ffagmentumot adtunk a reakcióelegyhez. A reakcióelegy mind a négy dezoxinukleotid-trifoszfátot 0,2 mM koncentrációban tartalmazta. A reakciót 30 °C-on 15 percig végeztük, majd 10 perces, 65 °C-os hőkezeléssel fejeztük be. Az 5’ szabad végeket biztosító restrikciós endonukleázokkal (például EcoRI, BamHI) történő hasítással nyert fragmentumokhoz a DNS-polimeráz hosszú fragmentumát vagy KJenow-fragmentumát használtunk. A 3’ szabad végeket kialakító endonukleázok (például PstI, SacI) alkalmazásával nyert fragmentumokhoz a T4 DNS-polimerázt használtuk. Ezen két enzim alkalmazása Maniatis és munkatásai (1982) könyvében a 113—121. oldalakon található.
C) Agaróz-gélelektroforézis és a DNS-fragmentumok géltől való tisztítása
Az agaróz-gélelektroforézist vízszintes apparátusban hajtottuk végre (Maniatis és munkatársai, pp. 150-163). A referenciában leírt triborátpuffert használtuk. A DNS-fragmentumokat 0,5 mg/ml koncentrációjú etidium-bromiddal festettük. A festék elektroforézis közben a gélben vagy a pufferben volt, de elvégezhető a festés az elektroforézis után is. A DNS-t hosszúhullámú ultraibolya fénnyel történő megvilágítással tettük láthatóvá. A fragmentumok géltől való elválasztásának érdekében alacsony hőmérsékleten gélesedő agarózgélt használtunk, mely a Sigma Chemicalból (St. Louis, Missouri) származik. Az elektroforézis után a kívánt fragmentumokat kivágtuk, műanyag kémcsőbe helyezve 65 °C-on 10 percig inkubáltuk, háromszor fenollal extraháltuk, s kétszer etanollal kicsaptuk. Ez az eljárás némileg különbözik a Maniatis és munkatársai (1982) referencia 170. oldalán leírtaktól.
A DNS elválasztható az agaróztól Geneclean kit (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) segítségével is.
D) Szintetikus kapcsoló- (linker), fragmentumok hozzáadása a DNS-hez
Ha a DNS-molekula végéhez új endonukleáz hasítóhely hozzáadása szükséges, a molekulát - a tompa végek kialakítása érdekében - először DNS-polimerázzal kell kezelni, amint azt fentebb leírtuk. A fragmentum 0,1-1,0 pg-ját a New England Biolabsből származó foszforilált kapcsoló-DNS 10 ng-jához adtuk 20-30 pl térfogatban, 2 pl T4 DNS-ligázzal (New England Biolabs) és a gyártó által javasolt pufferben lévő 1 mM ATP-vel együtt. Egy éjszakán át tartó 15 °C-os inkubáció után a reakciót 65 °C-on 10 perces hőkezeléssel fejeztük be. A reakcióelegyet a szintetikus kapcsolószekvenciákat hasító restrikciós endonukleázoknak megfelelő pufferben körülbelül 100 pl-re hígítottuk. Az endonukleáz 50-200 egységét adtuk az elegyhez, melyet 2-6 órán keresztül megfelelő hőmér8
HU 220 185 Β sékleten inkubáltunk, majd a fragmentumot agaróz-gélelektroforézisnek vetettük alá, s a fentebb leírt módon tisztítottuk. A kapott fragmentum ezek után a restrikciós endonukleázokkal végzett hasítással kialakított végekkel rendelkezik. Ezek a végek rendszerint ragadósak, ezért ezen fragmentumok könnyen kapcsolhatók más, hasonló ragadós végekkel rendelkező fragmentumokhoz.
E) Az 5’-terminális foszfátok eltávolítása a DNSfragmentumokról
A plazmidklónozási lépések közben a vektorplazmidot foszfatázzal kezelve visszaszorul a vektor recirkularizációja (lásd Maniatis és munkatársai, 1982, p. 13). A DNS megfelelő restrikciós endonukleázzal történő hasítása után egyegységnyi borjúbélből származó lúgos foszfatázt (Boehringer-Mannheim, Mannheim) adagoltunk. Ezután a DNS-t egy órán keresztül 37 °Con inkubáltuk, kétszer extraháltuk fenollal és kicsaptuk etanollal.
F) A DNS-fragmentumok összekapcsolása
Ha az egymáshoz kapcsolni kívánt fragmentumok komplementer ragadós végekkel rendelkeznek, a reakcióelegy 2-40 μΐ-ében - mely a gyártó által javasolt pufferben 0,2 egység T4 DNS-ligázt (New England Biolabs) tartalmaz - minden fragmentum körülbelül 100 pg-ját inkubáltuk. Az inkubációt 15 °C-on
1- 20 óráig végeztük. Ha az egymáshoz kapcsolni kívánt DNS-fragmentumok tompa végekkel rendelkeznek, az inkubálást a fenti módon végeztük, azzal a különbséggel, hogy a T4 DNS-ligáz mennyiségét
2- 4 egységre növeltük.
G) DNS transzformációja E. coliba
A legtöbb kísérlethez E. coli HB101 törzs használatos. A DNS E. coliba történő bevitele a kalciumklorid-módszerrel történik (Maniatis és munkatársai, 1982, pp. 250-251).
Η) E. coli screenelése plazmidok jelenlétére
A transzformáció után kapott E. coli kolóniákat rapid plazmidizolációs eljárással teszteltük a kívánt plazmidok jelenlétére. Két szokásos eljárás leírása a Maniatis és munkatársai (1982) referenciában a 366-369. oldalakon található.
I) Nagyléptékű plazmid-DNS-izolálás
Az E. coliból származó plazmidok nagyléptékű izolásának módszereit illetően lásd Maniatis és munkatársai (1982), pp. 88-94.
J) Klónozás Ml3 fágvektorokba
A következő leírásból érthetővé válik, hogy az M13 fágszármazékok kétszálú, replikatív formái rutineljárásokhoz használatosak, mint például hasítás restrikciós endonukleázokkal, összekapcsolás stb.
Ahol nem jeleztük az ellenkezőjét, az enzimek forrása Boehringer, Biolabs (BRL). Ha másképp nem jeleztük, az enzimeket a gyártó útmutatásainak megfelelően alkalmaztuk.
K) Southem-blot-analízis
Az extrahált DNS-t először restrikciós enzimekkel kezeltük, majd 0,8-1%-os agarózgélben elektroforetizáltuk, nitro-cellulóz-membránra vittük [Southern, EM (1985)], s az előzőleg nick-transzlációba vitt, detektálni kívánt DNS-sel hibridizáltuk. (A DNS-specifikus aktivitás 5 χ 108-10χ 108 cpm/pg). A filtereket minden alkalommal háromszor egy óráig mostuk 0,03 M-os nátrium-citrát és 0,3 M-os nátrium-klorid vizes oldattal, 65 °C-on. A hibridizált DNS-t röntgenfilm 24-48 óráig tartó előhívásával tettük láthatóvá.
Példák
1. példa: Növényi anyag és növekedési körülmények
Magról vett dohánynövényeket (Nicotiana tabacum cv. Xanthi) növényházban neveltünk 16 óra fény/8 óra sötét periódusban.
2. példa: Portok- és levél-mRNSizolálása
0-10 mm termőhosszúságú virágrügyből származó portokokból és 5 hetes csíranövényekből teljes RNS-t izoláltunk az Ausubel és munkatársai (1987) által leírt Phenal/SDS módszerrel. A teljes RNS-ből poliA+RNS-t tisztítottunk (lásd Maniatis és munkatársai, 1982).
3. példa: cDNS-alkönyvtárakkészítése
A portok- és csíranövény-cDNS-könyvtárakat INVITROGEN’s Libraviam II kit felhasználásával készítettük (INVITROGEN CORP., 3985B Sorrento Valley Blvd, San Diego, CA; Cat No L1958-15). Kétszálú cDNS-t szintetizáltunk a portok-, illetve levél-poliA+RNS-ből, majd BstXI nonpalindrom linkereket kapcsoltunk hozzá, s a cDNS-t az INVITROGEN CORP.-tól (3958B Sorrento Valley Blvd, San Diego, CA) beszerezhető, BstXI-gyel hasított pTZ18R-B vektorba klónoztuk. A transzformációt E. coli DHlaF’ sejtekbe végeztük, melyek szintén az INVITROGEN CORP.-tól szerezhetők be. A kivont cDNS-könyvtárat az INVITROGEN’s Subtractor kit (INVITROGEN CORP. 3984B Sorrento Valley Blvd, San Diego, CA; Cat No K4320-01) felhasználásával készítettük. Egyszálú cDNS-eket izoláltunk a portok- és levél-cDNSkönyvtárakból. A levél egyszálú cDNS-ét fotobiotinizáltuk és a portok egyszálú cDNS-éhez hibridizáltuk. Mindkét, hibridizált, illetve hibridizálatlan, fotobiotinizált szekvenciát sztreptavidinnel és fenollal extraháltuk. A fennmaradó DNS-t Klenow-val kétszálúvá konzerváltuk és E. coli DHlaF’ sejtekbe transzformáltuk.
4. példa: Portokspecifikus cDNS-klónok izolálása
A portokspecifikus kiónokat portokból kivont cDNS-könyvtár differenciálvizsgálatával (screening) azonosítottuk. Replikamódszerrel 20 000 kiónt vittünk nitro-cellulóz-szűrőre, hogy differenciálvizsgálattal azonosítsuk a radioaktívan jelölt, portok-poliA+RNS-ből származó egyszálú cDNS-hez, s nem a csíranövény-poliA+RNS-ből származó egyszálú cDNS-hez hibridizáló kolóniákat. A klónozóvektorba inszertált cDNS-eket restrikciós enzimmel kivágtuk, s a mindösszesen 70 cDNS darabjait ismételten Southem-blottal screeneltük. Portok, termő és levél teljes RNS-Northem-blotjait cDNS-ekkel teszteltük, hogy igazoljuk a szövetspecifitást. Valamennyi portokspecifikus cDNS-t
HU 220 185 Β kereszthibridizáltuk annak érdekében, hogy az egyedülálló cDNS-eket azonosítsuk. Az egyedülálló cDNS-klónokat megtisztítottuk és bluescript vektorba klónoztuk. Az ant32 egy teljes hosszúságú cDNS-klónját izoláltuk a portok-cDNS-könyvtár - 0,9 kb hosszúságú cDNSrészlettel történő - screenelésével. A két cDNS szekvenciája 95%-ban homológ, ezért közeli rokon tagjai ugyanannak a géncsaládnak.
5. példa: Expressziós minta ellenőrzése
RNS-blo-hibridizációval
A Northem-blotokat nitro-cellulóz-szűrő felhasználásával készítettük Maniatis (1982) szerint. Vonalanként 20 pg portok, termő és levél teljes RNS-t adagoltunk. A prehibridizációkat 65 °C-on, 4 órán keresztül végeztük 3xSSC, 5 χ Denhardt’s, 20 mM Tris pH 7, 0,1% SDS, 2 mM EDTA, 1005 g/ml denaturált lazacspermium-DNS felhasználásával. A hibridizálásokat 42 °C-on, egy éjszakán keresztül végeztük 6 χ SSC, 5 χ Denhardt’s, 0,1% SDS, 500 pg/ml lazacspermium-DNS, 8%-os dextron-szulfát és 50%-os formamid (melyhez 5,5 χ 106 cpm/ml-es próbát adtunk) felhasználásával. A próbákat PHARMACIA’s oligolabelling kit (PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ; Cat No 27-9250-01) felhasználásával szintetizáltuk, a gyártó előírásainak megfelelően. A cDNS-ek expressziója csak a portok-RNS-nél volt megfigyelhető. Az ant66 cDNS esetében a pollenben is észleltünk expressziót.
PoliA+RNS-t portok-, termő-, levél-, szirom-, szárés gyökérszövetből izoláltunk. Mindegyik 15 g-ját, 205 g mag és csészelevél teljes RNS-sel együtt, Northem-elj árassal futtattuk, próbaként ant32 és ant43D cDNS felhasználásával. Mindkét cDNS expresszióját csak a portok-RNS-ben tapasztaltuk, bizonyítva ezzel, hogy az ant32 és ant43D cDNS szigorúan szabályozott és csak a portok szövetében expresszálódik.
6. példa: A portokspecifikus cDNS-klónok fejlődésspecifikus expressziója
Hat, különböző fejlődési stádiumú virágrügy portokjaiból teljes RNS-t izoláltunk. A fejlődésspecifikus expresszió meghatározásához a slot-blotokat portokspecifikus cDNS-ekkel teszteltük. A slot-hibridizációt 105 g RNS felhasználásával, Maniatis (1982) szerint végeztük. Az első táblázat a cDNS-ek fejlődésspecifikus expresszió profilját tartalmazza. Az ant9, -32, -43C, -59 és -68 kizárólag a portok korai fejlődési stádiumában expresszálódik, míg az ant43D, -52, -67 az egész fejlődés alatt. Az ant66 csak a fejlődés kései stádiumában expresszálódik.
7. példa: Portokspecifikus cDNS-klónok izolálása
A DNS szekvenálását - templátként kétszálú plazmid-DNS felhasználásával - a didezoxiláncterminációs módszerrel (Sanger és munkatársai, 1977) végeztük. Valamennyi DNS-szekvencia analízisét Digital Vax 8530 számítógépen, a University of Wisconsin Computer Genetics Group software-ével [beszerezhető: GENETICS COMPUTER GROUP, INC (University
Research Park, 575 Schience Drive, Madison, ál)] készítettük. Az oligonukleotid primereket Applied Biosystem
Model 380A Syntheszieren szintetizáltuk.
Az 1. táblázat az mRNS és a portokspecifikus cDNS-inszertek méretének összehasonlítását tartalmazza. Az ant32 és ant43D cDNS-ek mérete közel áll az mRNS-ek teljes hosszúságú másolataitól várt méretekhez. A többi cDNS inkomplett klón. Az ant32, -43C, -52, -43D, -59, -66 és -68 egyetlen nyitott leolvasókeretet kódol. Az ant32 cDNS 1542 bázisával közel teljes hosszúságú klón (1. szekvencia). Ez a szekvencia nagy nyitott leolvasókeretet tartalmaz, mely a 66. nukleotidtól az 1412-ig tart, 448 aminosavból álló polipeptidet kódolva. A nyitott olvasókeretet 65, illetve 130 bázis hosszúságú nem kódoló régió határolja a 3’-, illetve az 5’-végen. A poliadenilációs jel (AATAAA) az 1502-es helyen található.
Az ant43D cDNS 552 bázisával közel teljes hosszúságú klón (3. szekvencia). A szekvencia 118 aminosavnyi komplett, nyitott leolvasókerettel rendelkezik a 41-397. bázisok között. A nyitott leolvasókeretet az 5’-végen 40, míg a 3’-végen 155 bázis határolja. A poliadenilációs jel a 467-es helyen kezdődik.
Az ant43C 437 bázisból álló, inkomplett cDNS (20. szekvencia), mely 31 aminosavnyi nyitott leolvasókeretet tartalmaz. A 167-437. nukleotidok 90 aminosav hosszúságú polipeptidrészt kódolnak. Az ant43C és -43D cDNS-ek szekvenciaszinten 90%-ban homológok.
Az ant52 egy 96 bázisból álló inkomplett cDNSklón (7. szekvencia), mely 31 aminosavnyi nyitott leolvasókeretet tartalmaz.
Az ant59 egy 1201 bázisból álló inkomplett cDNSklón (9. szekvencia). Az 1-1119. nukleotidok közötti nyitott leolvasókeret egy 372 aminosavból álló polipeptidrészletet kódol. A nyitott leolvasókeretet a 3’végen 82 bázisból álló nem kódoló régió határolja.
Az ant66 egy 952 bázisból álló inkomplett cDNS-klón (11. szekvencia). Az 1-711. nukleotidok egy 236 aminosavból álló polipeptidet kódolnak. A nyitott leolvasókeretet 236 bázisból álló 3’-régió határolja. A szekvencia 15 bázis hosszúságú poliAfarkat tartalmaz.
Az ant68 egy 445 bázisból álló inkomplett cDNSklón (20. szekvencia), mely 148 aminosavat kódoló nyitott leolvasókerettel rendelkezik.
Az ant67 egy 305 bázisból álló inkomplett cDNSklón (13. szekvencia). Nem ismeretes, melyik az értelmes szál, mivel egyszálú, nagy, nyitott leolvasókeretet nem találtunk. Ez a klón mindkét szál transzlációjában egy nyitott leolvasókeret 3’-végét és egy 3’-határrégiót tartalmaz.
Az ant9 egy 612 bázisból álló, inkomplett kiméra cDNS (5. szekvencia). Portok-, termő- és levélszövet-Northem-blotjait a kiméra cDNS 5’- és 3’-régióival teszteltük, hogy meghatározzuk a cDNS-klón portokspecifikus régióját. Az 1-325. bázisokkal tesztelt Northemek a portok-, termő- és levélszövettel egyaránt hibridizáltak, míg a 326-612. bázisokkal teszteltek kizárólag a portok szövetével hibridizáltak. Ez utóbbi régiót a kiméra cDNS portokspecifikus régiójaként azono10
HU 220 185 Β sítottuk. A 344-442. nukleotidok 32 aminosavból álló polipeptidrészletet kódolnak. A poliadenilációs jel a 461. helyen kezdődik.
Valamennyi leszármaztatott aminosavszekvenciát összehasonlítottuk a GenBank Genetic Sequence Data Bank számítógépes DNS-szekvencia-adatbázisának szekvenciáival. Az ant66 cDNS 74%-os aminosavazonosságot mutatott az Arabadopsis thalianaból származó plazmamembránproton ATP-ázzal (H+-ATP-áz) (Harper és munkatársai, 1989). Az ant68 cDNS glicingazdag proteint kódol.
8. példa: Az ant32 expressziós minta ellenőrzése in situ hibridizációval
A 12 mm hosszú virágrügyből származó, paraffinba ágyazott portokmetszetekkel végzett in situ hibridizációs vizsgálatokat Perez-Grau és munkatársai (1989) szerint végeztük. Az in situ hibridizációhoz használt 35S-RNSpróbákat STATAGEN’s RNA Transcription Kit alkalmazásával végeztük (STRATAGENE CLONING SYSTEMS, 11099 North Torrey Pines Rd, La Jolla, CA; Cat No 200340). Keresztirányú és hosszanti portokmetszeteket teszteltünk ant32 antiszensz- és szensz-RNS-próbákkal. Az antiszensz próbával az expressziót a portok tapetális sejtrétegében lokalizáltuk.
9. példa: Génkópiaszám
Annak érdekében, hogy meghatározzuk a portokspecifikus génekkel hibridizáló dohány genom gének számát, Xanthi genom DNS-t Xbal, HindlII, EcoRI, BamHI enzimekkel emésztettük. A Southem-blotokat cDNS-klónokkal teszteltük. Az ant32, -43, -52, -59 és -67 próbákkal tesztelt biotok két sávja mindegyik emésztés alkalmával hibridizált, jelezve, hogy ezen cDNS-ek kisebb géncsaládok egykópiájú génjei, illetve tagjai. Az ant9, -66, -68 próbákkal tesztelt biotokban több sáv hibridizált, jelezve, hogy ezen cDNS-ek nagyobb géncsaládok tagjai.
10. példa: Southern-blotok
A Southem-blotokat nitro-cellulózzal készítettük Maniatis (1982) szerint. A prehibridizációkat 6xSSC, lOxDenhardt’s, 0,2% SDS és 75 pg/ml lazacspermium-DNS felhasználásával 68 °C-on 4-6 órán keresztül végeztük. A hibridizálásokat 68 °C-on 6xSSC, 5xDenhardt’s, 0,5% SDS és 125 pg/ml lazacspermium-DNS (melyhez 1 χ 106 cpm/ml DNS-próbát adtunk) felhasználásával végeztük. A mosás Maniatis (1982) szerint történt. A genom Southem-blotokat Duralon-UV membránokkal (Stratagene) készítettük, a hibridizáció körülményei a gyártó előírásainak megfelelőek voltak. 11 * * * * * * *
11. példa: Dohány genom DNS-könyvtárak készítése
A dohány-DNS-t Shure és munkatárai (1983) módszerével levelekből izoláltuk. A Sau3AI-gyel részlegesen emésztett Xanthi genom DNS-szakaszokat Stratagene’s Lambda DashII vektor BamHI felismerő helyére klónoztuk, és a könyvtárat kiegészítettük. Egy másik genomkönyvtárat a PROMEGA’s LambdaGEM-11
Xhol Half-Site Arms Cloning System (PROMEGA, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI; Cat No B1960) felhasználásával készítettünk. Sau3AI-gyel emésztett, részlegesen betöltött genom DNS-t részlegesen betöltött Xhol LambdaGEM-11 karokba klónoztunk.
12. példa: Az Ant32 genom klón izolálása és szekvenálása
A kiegészített Stratagene genomkönyvtárat ant32 próbával screeneltük, mely próba négy hibridizált plakkot eredményezett. Valamennyi kiónt tisztítottuk és restrikciós módszerrel térképeztük. Az ant3 2-vel történő próba alkalmával minden klónból egy EcoRI fragmentum hibridizált. Az EcoRI fragmentumokat pBS SK+ plazmidokba (beszerezhető: STRATAGENE CLONING SYSTEMS, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA) szubklónoztuk. A négy klónból származó EcoRI fragmentumok szubklónozása és térképezése azt mutatta, hogy a négy klón közül kettő egyforma. Az 1. ábra a pCIB950 EcoRI szubklón térképét ábrázolja. A pCIB950-ből származó fragmentumokat később szekvenálás végett - szubklónoztuk. 2 kb promotert, az egész kódolórégiót és 0,28 kb hosszú 3’ transzlálatlan régiót szekvenáltunk. Az ant32-ből származó 2,0 kb promoterfragmentum funkcionális. Amint azt a 16. példában leltjük, az ant32 0,6 kb-nyi fragmentuma elegendő a portokspecifikus aktivitás biztosításához.
13. példa: Az Ant43Dgenom klón izolálása és szekvenálása
A LambdaGEM-11 primer könyvtárat ant43D próbával screeneltük. A hibridizáló PCR-rel újrascreeneltük, hogy különbséget tudjunk tenni a két közeli rokon cDNS, az ant43D és az ant43C között. A plakkokból származó PCR-fragmentumokat emésztettük abból a célból, hogy a két cDNS-sel összefüggésben lévő genomokat megkülönböztethessük. Két genom klón az ant43Dnek megfelelő volt, ezeket tisztítottuk és térképeztük. Mindkettőből 6,6 kb hosszúságú SacI fragmentum hibridizált az ant43D próbával. A két SacI fragmentum szubklónozása és térképezése azt mutatta, hogy egyformák. A 2. ábra a pCIB952 SacI szubklón térképét tartalmazza. A pCIB952 fragmentumait szubklónoztuk és szekvenáltuk. 1,2 kb promotert, a teljes kódolórégiót (egy intronnal) és 0,22 kb-nyi 3’ transzlálatlan régiót szekvenáltunk. Az 1,2 kb hosszúságú promoterfragmentum a teljes ant43D promotert tartalmazza.
14. példa: Primer extenzió
A prímért [λ-32Ρ] ATP-vel (6000 curie/mmol, Amersham) és T4 polinukleotidkinázzal végjelöltük. 20 pg portokból származó teljes RNS-t összekevertünk 0,01 pmol primerrel, 20 pl reverz transzkriptáz pufferben (50 mM Tris pH 7,3, 75 mM KC1, 3 mM MgCl2). A keveréket 80 °C-on 10 percig melegítettük, lassú, 40 °C-ra történő hűtéssel temperáltuk, majd egy éjszakán keresztül 40 °C-on hibridizáltuk. Minden 20 pl reakcióelegyhez 30 pl 5 mM DTT-t, 0,1 mg/ml BSA-t, 1 mM dATP-t, 1 mM dCTP-t, 1 mM dGTP-t, 1 mM
HU 220 185 Β dTTP-t [200 egység RNSsin-t (Promega) és 400 egység MMLV reverz transzkriptázt (BRL) tartalmazó pufferben] adtunk. A primer extenziót 40 °C-on 60 másodpercig végeztük. A DNS/RNS hibridet fenol:kloroform eleggyel extraháltuk és kicsaptuk etanollal, carrier DNS jelenlétében. A kapott anyagot telítő szekvenálófestékben feloldottuk és 6%-os akrilamid-karbamid szekvenálógélben analizáltuk. A primer extenziókísérletekhez használt primerek a következők:
Ant32-höz: - AT 101MO3 - 5’-GGC TTC ACT ACC CAG TGG TG-3’
Ant43D-hez: - AT 125MO3 - 5’-CAA CGC GCC CTT CTT TG A AA-3’
15. példa: Transzkripciós starthely térképezése primer extenzióval
Az ant32 és ant43D cDNS-ek transzkripciós starthelyét primer extenzió alkalmazásával térképeztük. A legnagyobb primer extenziós termék az ant32 cDNS végén levő néhány bázispárhoz tartozik. A legnagyobb primer extenziós tennék az ant43D cDNS végétől ellentétes irányba eső 23 bázispárhoz tartozik.
16. példa : Az ant32 promoterszekvencia GUS génhez történő fúziói
Az ant32 promotert tartalmazó pCIB950 2,0 kb hosszúságú 5’-határolórégióját a glükuronidáz (GUS) bakteriális riportergénjéhez fuzionáltuk, hogy jellemezzük a transzgén növényi portokspecifíkus gén promoterét. Az ATG triplet elé PCR-rel Xbal helyet inszertáltunk a következők szerint:
350 bp hosszúságú Xhol-Xbal fragmentumot (3A. ábra, jobbra fent) szintetizáltunk polimeráz-láncreakcióval (PCR; lásd Mullis és munkatársai, 1987; Erlich, 1989), hogy az ant32 promoterszekvenciát az Xhol hely előtti 55 bp-tól az ATG előtti 2 bp-ig teijedő szakaszra másoljuk. A PCR primerek egyike Xbal helyet inszertál az ATG előtti 2. bp-hoz. Az eredeti kiónból származó Pstl-Xhol fragmentumot tartalmazó, teljes hosszúságú ant32 promotert és az Xhol-Xbal PCRkazettát újra összeállítottuk a pBluescript SK vektor (Stratagene) Pstl-Xbal helyeibe történő háromirányú ligálással. Ez a promoterklón kódolószekvenciákhoz történő transzkripciós fúziókhoz használható fel.
A kapott promotert Sall-Xbal fragmentumként kivágtuk, és a GUS génhez fuzionáltuk a pBIlOl-ben (Clontech). 600 bp hosszúságú ant43 promoter-GUS fúziót az 1,4 kb hosszú HindlII fragmentumnak a bluescript promoterklónból történő deléciójával állítottuk elő. A deletált promotert Sall-Xbal fragmentumként a GUS génhez fuzionáltuk. A 2,0 kb hosszú promoter-GUS fúziót pCIB3132-vel, a 0,6 kb hosszú promoter-GUS fúziót pCIB3132B-vel jelöltük. A 0,6 kb hosszúságú ant32 promoterfragmentum elegendő a portokspecifíkus aktivitás biztosításához.
17. példa: Az ant32promoterszekvencia DTA génhez történő fúziója
5’ ant32 promoterszekvencia és a Diphteria toxin A-lánc (DTA) gén kódolószekvenciájának felhasználásával kiméra gént állítottunk elő (Palmiter és munkatársai, 1987). A GUS kódolószekvenciát Smal-gyel és Sacl-gyel kivágtuk a pCIB3132B-ból, a SacI helyet betöltöttük, és a plazmidot újra összekapcsoltuk (plC250). A DTA kódolószekvenciát p72 plazmidból kivágott BglII fragmentumként a plC250 BamHI helyére ligáltuk, miáltal plC251-hez jutottunk. A DTA kódolószekvenciát a plC252-ben ellentétes orientációban ligáltuk.
18. példa: ant43Dpromoterszekvencia GUS génhez történő fúziója
Az ant43D gén 1,2 kb hosszú 5’-határolórégióját a GUS génhez fuzionáltuk. Az ATG elé PCR-rel Xbal helyet fuzionáltunk a következők szerint:
PCR-rel 210 bp hosszú Earl-Xbal fragmentumot (3B. ábra, jobbra fent) szintetizáltunk abból a célból, hogy az ant43D promotert az EarI hely előtti 39. bp-tól az ATG előtti 22. bp-ig teqedő szakaszra másoljuk. A PCR primerek egyike 22 bp-ral az ATG elé egy Xbal helyet inszertál. Az eredeti klónból származó EcoRI-EarI fragmentumot tartalmazó, teljes hosszúságú ant43D promotert és az Earl-Xbal PCR-ffagmentumot újra összeállítottuk a bluescript vektor EcoRI-Xbal helyeibe történő háromirányú ligálással. Ez a promoter felhasználható a kódolószekvenciákhoz történő transzkripciós fúziókhoz.
A kapott promotert HindlII-Xbal fragmentumként kivágtuk és a PBI101-ben a GUS génhez fuzionáltuk (pCIB3178). A 3B. ábra azt mutatja, hogyan kaptuk az ant43D gén 1,2 kb-nyi oldalrégióját. Az 1,2 kb-nyi promoterfragmentum elégséges a portokspecifíkus aktivitás biztosításához.
19. példa: Az ant43D promoterszekvencia DTA génhez történő fúziója
A plC251-ből az 1,2 kb hosszú ant32 promotert HindlII-Xbal-gyel kivágtuk és HindlII-Xbal ant43D promoterfragmentummal helyettesítettük. A kapott plazmidot pCIB3179-cel jelöltük. A DTA kódolószekvenciát a pCIB3188-ban ellenkező orientációval fuzionáltuk. Az ant32 promotert a pLC251-ből HindlIImal és Xbal-gyel vágtuk ki és az ant43D promoterrel helyettesítettük.
20. példa: Transzgenikus növények előállítása
Dohánylevélkorongokat ant32-GUS (pCIB3132 2 kb promoter, pCIB3132B - 0,6 kb promoter), ant32-DTA [pLC251 és antiszensz kontroll (pLC252)], ant43D-GUS (pCIB3178) és ant43D-DTA [pCIB3179 és antiszensz kontroll (pCIB3188)] konstrukciókkal transzformáltunk, és a sikeresen transzformált növényeket Horsch és munkatársai (1985) szerint szelektáltuk. A transzformáló DNS jelenlétét PCR-rel igazoltuk.
21. példa: Az ant32 transzgénexpresszió
GUS-analízise
A transzformáns növényeket GUS hisztokémiai elemzéssel (Koltunow és munkatársai, 1990) és fluorometrikus módszerrel (Jefferson, 1987) teszteltük.
HU 220 185 Β
A hisztokémiai eljárással a GUS-expressziót a 10-20 mm hosszú virágrügy portokjának tapetális sejtrétegében tapasztaltuk. A portokban kisebb mértékű expressziót figyeltünk meg. Portok-, termő-, pollen-, levél- és szárszövetet fluorometrikusan elemeztünk, s a GUS-aktivitást kizárólag a portok- és pollenszövetben tapasztaltuk.
22. példa: Az ant32-DTA transzgenikus növények analízise db pLC251-et és 15 db pLC252-t tartalmazó transzgenikus növény virágmorfológiáját vizsgáltuk. A pLC251-tartalmú növények mindegyikének barna, fonnyadt portokjai voltak, s pollent nem szórtak. Ezzel ellentétben a pLC252 transzgenikus növényeknek normális portokjai voltak és szórták a pollent. Mindegyik növénnyel önbeporzást és visszakeresztezést végeztünk. A pLC251 növényekben önbeporzás nem volt, de a visszakeresztezésekből magvak termelődtek. A pLC252 növények esetében az önbeporzás és a visszakeresztezés normális volt.
A 14-16 mm-es és 25-30 mm-es virágrügyből származó portokokat paraffinba ágyazva fixáltuk, és a metszeteket toluidinkékkel festettük. A pLC251 növényekben a tapetum és a pollenzsák roncsolódott, míg a pLC352 növények normális morfológiát mutattak.
23. példa: Az ant43D transzgénexpresszió
GUS-analízise
A transzformáns növényeket a GUS hisztokémiai és fluorometrikus módszerekkel teszteltük. A hisztokémiai elemzés során a 14-16 mm hosszú rügyek portokjainak tapetális sejtrétegében, mikrospórákban és csökkent mértékben a portok konnektivumában és falszövetében tapasztaltunk GUS-expressziót. Portok-, pollen-, termő-, levél-, csészelevél-, szár- és gyökérszövetet fluorometrikusan elemeztünk. GUS-aktivitást kizárólag a portok- és pollenszövetben figyeltünk meg.
24. példa: Az ant43D-DTA transzgenikus növények analízise db pCIB3179 és 8 db kontroll pCIB3188 (DTA antiszensz orientációban) növény virágmorfológiáját vizsgáltuk. A pCIB3179 transzgenikus növények mindegyikének működésképtelen portokja volt, így pollent sem termeltek. A különböző növények portokmérete normálistól a zsugorodottig, portokszíne zöldtől barnáig terjedt, a portokok felnyílók, illetve nem felnyílók voltak. A kontroll pCIB3188 transzgenikus növények normális portokmorfológiával és pollenszórással rendelkeztek. Az önbeporzást és a visszakeresztezést valamennyi növény esetében elvégeztük. A pCIB3179 növények visszakeresztezése sikeres volt, az önbeporzás azonban nem. A pCIB3188 növények normális fertilitást mutattak.
8-10,10-12,14-16,25-30 mm-es virágrügyekből származó portokokat paraffinba ágyazva fixáltunk, s a metszeteket toluidinkékkel festettük. A pCIB3179 növények esetében a mikrospórák már a 8-10 mm-es virágrügyből hiányoznak.
LETÉT
A Budapesti Szerződés követelményeinek megfelelően a következő letéteket tettük a USDA Agricultural Research Service Culture Collectionben [Northern Régiónál Research Center (NRRL), 1815, North University Street, Peoria, 111. 61604],
| Plazmid | A letét dátuma | Életképességi bizonylat dátuma | Letéti szám |
| pCIB3178 | 1992. június 16. | 1992. június 22. | NRRLB-18978 |
| pCIB3132 | 1992. június 16. | 1992. június 22. | NRRL B-18977 |
1. táblázat
A portok-cDNS-ek fejlődésspecifikus expresszióprofilja
Rügyhossz (mm) genom Southern
| 10-15 | 15-20 | 20-25 | 25 30 | 30-40 | 40-50 | cDNS-méret | mRNS-méret | #HindIIl sáv | |
| ant5 | + | + | + | + | ,9kb | 1,8 kb | 6 | ||
| ant9 | + | + | ,6 | 1,0 | 9 | ||||
| ant32 | + | + | 1,5 | 1,9 | 2 | ||||
| ant43C | + | + | ,43 | 1,0 | 2 | ||||
| ant43D | + | + | + | + | + | + | ,55 | 1,0 | 2 |
| ant45 | + | + | + | 4- | ,8 | 1,8 | 6 | ||
| ant52 | + | + | + | 4- | + | + | ,1 | 1,0 | 4 |
| ant59 | + | + | + | 1,2 | 1,9 | 2 | |||
| ant66 | + | + | ,95 | 3,5 | 2 | ||||
| ant67 | + | + | + | 4- | + | + | ,3 | 1,4 | 2 |
| ant68 | + | + | ,45 | 1,3 | >8 |
HU 220 185 Β
IRODALOMJEGYZÉK
Benfey etal, EMBO, 9: 1677-1684,1990
Braun et al, Plánt Cell, 2: 153,1990
Comellisen et al, EMBO, 5: 37-40,1986
Della-Cioppa et al, Plánt Physiology, 84: 5 965-968,1987
Dewey et al, Cell, 44: 439,1986
Dewey et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84: 5374,1987
Erlich (Ed.), PCR Technology, Stockton Press (New York, 1989)
Goodall G. et al, Methods in Enzymology, 181: 148-161,1990
Greenfield et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 6853,1983
Grimsley N. H. et al, Natúré, 325: 177-179, 1987
Harper et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 1234-1238
Heijne etal, Eur. J. Biochem., 180: 535-545,1989
Horsch eí al, Science, 227: 1229-1231,1985 20
Huang et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:
716-10 720,1991
Jefferson, Plánt. Mól. Bioi. Rep., 5: 387-405,1987
Keen et al, J. Bacteriology, 168: 595,1986
Koltunow et al, Plánt. Cell, 2: 1201-1224,1990
Maeser et al, Mól. Gén. Génét., 230: 170-176,
1991
Maniatis et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1982)
McLean et al, J. Bacteriology, 169: 1017-1023,
1987
Mullis et al, Meth. Enzymology, 755: 335-350,
1987
Negrutiu I. et al, Plánt. Mól. Bioi., 8: 363-373, 1987
Neuhaus et al, Theor. Appl. Génét., 74: 30-36, 1987
Palmiter et al, Cell, 50: 435-443,1987
Perez-Grau et al, Plánt. Cell., 1: 1095-1109, 1989
Roberto et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87: 5795-5801,1990
Romano et al, Genes and Development, 5:
438-446,1991
Sambrook J. et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 74: 15 5463-5467,1977
Schekman, TIBS, 188,1985
Schmitz et al, Plánt. Cell., 1: 783-791,1989
Schocher R. J. et al, Bio/Technology, 4: 1093-1096,1986
Shillito és munkatársai, Bio/Technology, 3: 1099-1103,1985
Spena és munkatársai, Mól. Gén. Génét., 227: 205-212, 1991
Wang, Y-C. és munkatársai, Plánt. Mól. Bioi., 77: 25 433-439, 1988
Szabadalmi leírások és közzétett szabadalmi bejelentések jegyzéke
EP 420 819 Al
US 4,918,006 30 US 5,086,169
PCT WO 89/10396
PCT WO 90/08825
PCT WO 90/08831
PCT WO 90/08828
SZEKVENCIALISTA (1) ÁLTALÁNOS TUDNIVALÓK:
(i) BEJELENTŐ:
(A) NÉV: CIBA-GEIGY AG (B) UTCA: Klybeckstr. 141.
(C) VÁROS: Bázel (E) ORSZÁG: SVÁJC (F) POSTAI IRÁNYÍTÓSZÁM: 4002 (G) TELEFON: +416169 11 11 (H) TELEFAX: +41 61 696 79 76 (I) TELEX: 962 991 (ii) A TALÁLMÁNY CÍME: Portokspecifikus cDNS-szekvenciák, genom DNS-szekvenciák és rekombináns DN S-szekvenciák (iii) SZEKVENCIÁK SZÁMA: 21 (iv) SZÁMÍTÓGÉP-LEOLVASÁSI MÓD:
(A) INFORMÁCIÓHORDOZÓ: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM kompatibilis PC (C) MŰKÖDÉSI RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SZOFTVER: Patent In Release #1.0, Version #1.25 (EPO) (2) TUDNIVALÓK AZ 1. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1542 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris
HU 220 185 Β (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant32 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (KÓDOLÓSZEKVENCIA) (B) ELHELYEZKEDÉS: 66...1412 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 1. SZEKVENCIA:
TCTGTCAAGA TAACAATAAA AGAATAAAAA GATTAACCAA AAACGATATA CATATTTAGG 60 ACAGA ATG AAG GTT AGC TTG AAG CAC CAC TGG GTA GTG AAG CCA GCA 107
Met Lys Val Ser Leu Lys His His Trp Val Val Lys Pro Alá 1 5 10
| GAG | GCA | ACA TGG AAT GGC ACT | GTC TCC TTA TCG GAG TGT GAT CAA ACT | 155 | ||||||||||||
| Glu | Al a | Thr | Trp | Asn | Gly | Thr | Va 1 | Ser | Leu | Ser | Glu | Cys | As p | Gin | Thr | |
| 15 | 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| TTT | GCT | GTA | ACT | CAT | GTA | CCA | ACC | ATT | TAT | TAC | TAC | AGG | TTT | TGC | CAT | 203 |
| Phe | Al a | Val | Thr | Hi s | Val | Pro | Thr | Ile | Tyr | Tyr | Tyr | Arg | Phe | Cys | Hi s | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GAT | TGT | CTT | CCA | TCA | ACA | GAC | AAT | ATC | ATC | AAA | ACC | CTC | AGG | ACC | TCA | 251 |
| Asp | Cy s | Leu | Pro | Ser | Thr | Asp | Asn | Ile | Ile | Ly s | Thr | Leu | Arg | Thr | Ser | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| CTA | AGC | AAA | GCA | TTA | GTA | CAC | TTC | TAT | CCA | TTG | TCT | GGT | CGT | TTG | CGA | 299 |
| Leu | Ser | Lys | Al a | Le u | Val | Hi s | Phe | Tyr | Pro | Leu | Ser | Gly | Arg | Leu | Arg | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| TGG | ATC | GCT | GGG | TCC | CGC | CTC | GAG | CTC | GAC | TGT | AAT | GCC | TCG | GGA | ATC | 347 |
| Trp | Ile | Al a | Gly | Ser | Arg | Leu | Glu | Leu | Asp | Cy s | Asn | Al a | Ser | Gly | Ile | |
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| GTG | CTC | ATG | GAA | GCT | GAA | ACC | GAA | GCC | AAA | CTA | GAT | GAT | CTT | GGC | GAT | 395 |
| Val | Leu | Me t | Glu | Al a | Glu | Thr | Glu | Al a | Ly s | Leu | As p | Asp | Leu | Gly | Asp | |
| 95 | 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| TTC | TCG | CCA | TCC | CCT | GAC | TTG | AAC | AGC | TTG | TTT | CCC | CGT | GTA | GAC | TAC | 443 |
| Phe | Ser | Pro | Ser | Pro | Asp | Leu | Asn | Ser | Leu | Phe | Pro | Arg | Val | Asp | Tyr | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| ACA | ATC | CCA | ATT | GAT | GAA | CTC | CCT | TTG | TTG | TTT | GTT | CAG | CTT | ACT | AAG | 491 |
| Thr | 11 e | Pro | 11 e | Asp | Glu | Leu | Pro | Leu | Leu | Phe | Val | Gin | Leu | Thr | Ly s | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| TTT | CAG | TGT | GGT | GGT | ATT | GCT | CTG | AGT | TTT | GCA | ATA | TCA | CAT | GCT | GTA | 539 |
| Phe | Gin | Cys | Gly | Gly | Ile | Al a | Leu | Ser | Phe | Al a | Ile | Ser | Hi s | Al a | Val | |
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| GTT | GAT | GGC | CAA | AGT | GCT | CTT | TAC | TTC | CTC | ACC | GAA | TGG | GCT | AGC | CTT | 587 |
| Val | As p | Gly | Gin | Ser | Al a | Leu | Tyr | Phe | Leu | Thr | Glu | Trp | Al a | Ser | Leu | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| GCT | CGC | GGA | GAG | CCA | TTA | GGG | AAC | GAA | CCT | TTT | CAT | GAT | CGA | AAA | TTC | 635 |
| Al a | Arg | Gly | Glu | Pro | Leu | Gly | As n | Glu | Pro | Phe | Hi s | As p | Arg | Ly s | Phe | |
| 175 | 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| CTC | CGA | GCA | GGG | GAA | CCT | CCA | ATT | GCA | TAT | CCA | ACG | TTT | GAG | CAT | TTA | 683 |
| Leu | Arg | Al a | Gly | Glu | Pro | Pro | Ile | Al a | Tyr | Pro | Thr | Phe | Glu | Hi s | Leu | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| CAG | TTT | AAT | CCA | CCA | CCA | CTT | TTG | CTT | GGA | CAG | TCC | AGC | AGT | GAA | GAG | 731 |
| Gin | Phe | Asn | Pro | Pro | Pro | Leu | Leu | Leu | Gly | Gin | Ser | Ser | Ser | Glu | Glu | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| GAG | AAG | AAA | AAT | GAA | ACA | AAG | GGT | TCC | ATG | CTA | AAA | CTT | ACA | AAA | CAT | 779 |
| Glu | Lys | Ly s | Asn | Glu | Thr | Lys | Gly | Ser | Me t | Leu | Lys | Leu | Thr | Lys | Hi s | |
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| CAA | GTT | GAA | ATG | TTG | AGA | AAA | AAG | GCG | AAC | CAA | GGT | AAT | CAA | GGG | CGT | 827 |
| Gin | Val | Glu | Me t | Leu | Arg | Lys | Ly s | Al a | Asn | Gin | Gly | Asn | Gin | Gly | Arg | |
| 240 | 245 | 250 |
HU 220 185 Β
| AGT | TAC | ACA | CGT | TAT | GAA | GTT | GTG | ACT | GCA | CAT | ATA | TGG | AGA | TGT | GCA | 875 |
| Ser | Tyr | Thr | Arg | Tyr | Glu | Val | Val | Thr | Al a | Hi s | Ile | Trp | Arg | Cys | Al a | |
| 255 | 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| TGC | AAG | GCA | AGA | GGT | CAT | AAA | TTT | GAG | CAG | CCT | ACT | AAT | TTA | TGC | ATT | 923 |
| Cy s | Ly s | Al a | Arg | Gly | Hi s | Ly s | Phe | Gl u | Gin | Pro | Thr | Asn | Leu | Cys | Ile | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| TGT | GTT | AAC | ATA | CGC | AAT | ATA | ATG | CAA | CCA | CCT | TTG | CCT | AAA | TCC | TAT | 971 |
| Cys | Va 1 | Asn | Ile | Arg | Asn | Ile | Me t | Gin | Pro | Pro | Leu | Pro | Ly s | Ser | Tyr | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| TTT | GGC | AAT | GCC | ATA | GTT | GAT | GTT | ATT | GCC | AAT | GGC | GTC | TCG | GGT | GAC | 1019 |
| Phe | Gly | Asn | Alá | Ile | Val | As p | Va 1 | Ile | Al a | Asn | Gly | Va 1 | Ser | Gly | Asp | |
| 305 | 310 | 315 | ||||||||||||||
| ATT | ACC | TCG | AGG | CCA | TTG | GAG | TAT | GTT | GCT | CGA | AGG | GTG | CGA | GCA | GCC | 1067 |
| He | Thr | Ser | Arg | Pro | Leu | Glu | Tyr | Va 1 | Al a | Arg | Arg | Va 1 | Arg | Al a | Al a | |
| 320 | 325 | 330 | ||||||||||||||
| ATT | AAA | ATG | GTG | ACG | AGT | GAT | TAC | GCA | AAC | TCG | ACG | ATT | GAT | TTC | TTA | 1115 |
| Ile | Lys | Me t | Val | Thr | Ser | Asp | Tyr | Alá | Asn | Ser | Thr | Ile | As p | Phe | Leu | |
| 335 | 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| AAA | AAC | CAG | GAG | GAT | TTG | TCA | AAA | TAT | CAA | GAT | ATT | CAT | GCA | TTT | AGA | 1163 |
| Ly s | Asn | Gin | Glu | As p | Leu | Ser | Ly s | Tyr | Gin | As p | Ile | Hi s | Al a | Phe | Arg | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| AGC | AAG | GAA | GGT | CCT | TTT | TAT | GGA | AAC | CCT | AAT | CTT | GGG | GTT | ATA | AGT | 1211 |
| Ser | Lys | Glu | Gly | Pro | Phe | Tyr | Gly | As n | Pro | Asn | Leu | Gl y | Val | I le | Ser | |
| 370 | 375 | 380 | ||||||||||||||
| TGG | ATA | AGT | TTG | CCA | TTA | TTA | GGA | TTG | GAT | TTT | GGG | TGG | GGA | AAA | GAG | 1259 |
| Trp | Ile | Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Gly | Leu | Asp | Phe | Gl y | Trp | Gly | Ly s | Glu | |
| 385 | 390 | 395 | ||||||||||||||
| ATA | CAT | ATG | AGC | CCT | GGA | ACT | CAT | GAA | TAT | GAT | GGT | GAT | TGT | GTG | ATA | 1307 |
| Ile | Hi s | Me t | Ser | Pro | Gly | Thr | Hi s | Gl u | Tyr | Asp | Gly | Asp | Cy s | Val | Ile | |
| 400 | 405 | 410 | ||||||||||||||
| CTT | CCA | GGA | AAA | GAA | GGG | GAT | GGA | TCT | TTG | ACT | GTT | GCA | ATC | ATT | CTT | 1355 |
| Leu | Pro | Gly | Lys | Glu | Gly | Asp | Gly | Ser | Leu | Thr | Val | Al a | Ile | Ile | Leu | |
| 415 | 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| CAA | GCT | GTT | CAT | GTG | GAT | GCT | TTC | AAG | AAC | TTC | TTC | TAT | GAA | GAA | ATT | 1403 |
| Gin | Al a | Val | Hi s | Val | Asp | Al a | Phe | Lys | Asn | Phe | Phe | Tyr | Glu | Glu | Ile | |
| 435 | 440 | 445 |
GAA TGT TGAAAAACAT AAGTGTTTTA TGAGAAGAAA GGAAACAAAT TAAGAACATG 14 59 Glu Cys
TAGCTTTTCC TAAATTGACA TTGTTAGTCA TGGTCTAAGC AAAATAAACT CTTTATCTAC 1519 ACATTATTTC AATATATTTT CCT 1542 (2) TUDNIVALÓK A 2. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 448 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 2. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Lys | Val | Ser | Le u 5 | Lys | Hi s | Hi s | Trp | Val 10 | Val | Lys | Pro | Al a | Glu 15 | Al a |
| Thr | Trp | Asn | Gly | Thr | Val | Ser | Leu | Ser | Glu | Cys | As p | Gin | Thr | Phe | Al a |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Thr | Hi s | Val | Pro | Thr | Ile | Tyr | Tyr | Tyr | Arg | Phe | Cys | Hi s | As p | Cy s |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Ser | Thr | As p | Asn | Ile | Ile | Ly s | Thr | Leu | Arg | Thr | Ser | Leu | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ly s | Al a | Leu | Val | Hi s | Phe | Tyr | Pro | Leu | Ser | Gly | Arg | Leu | Arg | Trp | Ile |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Al a | Gly | Ser | Arg | Leu | Glu | Leu | As p | Cy s | Asn | Al a | Ser | Gly | Ile | Va 1 | Leu |
| 85 | 90 | 95 |
HU 220 185 Β
| Me t | Glu | Alá | Glu 100 | Thr | Glu | Al a | Ly s | Leu 105 | As p | As p | Leu | Gly | As p 110 | Phe | Ser |
| Pro | Ser | Pro | Asp | Leu | Asn | Ser | Leu | Phe | Pro | Arg | Va 1 | As p | Tyr | Thr | Ile |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Pro | Ile | Asp | Glu | Leu | Pro | Leu | Leu | Phe | Va 1 | Gin | Leu | Thr | Ly s | Phe | Gin |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Cys | Gly | Gly | I le | Al a | Leu | Ser | Phe | Alá | He | Ser | Hi s | Alá | Va 1 | Val | Asp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Gin | Ser | Al a | Leu | Tyr | Phe | Leu | Thr | Glu | Trp | Al a | Ser | Leu | Alá | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| G1 y | Glu | Pro | Leu | Gly | Asn | Glu | Pro | Phe | Hi s | As p | Arg | Ly s | Phe | Leu | Arg |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Al a | Gly | Glu | Pro | Pro | I le | Alá | Tyr | Pro | Thr | Phe | Glu | Hi s | Leu | Gin | Phe |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Pro | Pro | Leu | Leu | Leu | Gly | Gin | Ser | Ser | Ser | Glu | Glu | Glu | Lys |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Asn | Glu | Thr | Ly s | Gly | Ser | Me t | Leu | Lys | Leu | Thr | Lys | Hi s | Gin | Val |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Glu | Me t | Leu | Arg | Lys | Lys | Al a | Asn | Gin | Gly | Asn | Gin | Gly | Arg | Ser | Tyr |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Thr | Arg | Tyr | Glu | Val | Va 1 | Thr | Al a | Hi s | Ile | Trp | Arg | Cys | Al a | Cys | Lys |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Al a | Arg | Gly | His | Lys | Phe | Glu | Gin | Pro | Thr | Asn | Leu | Cy s | Ile | Cy s | Val |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Arg | Asn | Ile | Me t | Gin | Pro | Pro | Leu | Pro | Lys | Ser | Tyr | Phe | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Asn | Al a | Ile | Val | As p | Va 1 | Ile | Al a | Asn | G1 y | Val | Ser | Gly | As p | Ile | Thr |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ser | Arg | Pro | Leu | G1 u | Tyr | Val | Al a | Arg | Arg | Val | Arg | Alá | Al a | Ile | Lys |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Me t | Va 1 | Thr | Ser | Asp | Tyr | Alá | As n | Ser | Thr | Ile | Asp | Phe | Leu | Ly s | Asn |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Gin | Glu | Asp | Leu | Ser | Ly s | Tyr | Gin | As p | Ile | Hi s | Al a | Phe | Arg | Ser | Ly s |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Glu | Gly | Pro | Phe | Tyr | Gly | Asn | Pro | Asn | Leu | Gly | Val | Ile | Ser | Trp | Ile |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Ser | Leu | Pro | Leu | Leu | Gly | Leu | As p | Phe | Gly | Trp | Gly | Lys | G1 u | Ile | Hi s |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Me t | Se r | Pro | Gly | Thr | Hi s | Glu | Tyr | As p | Gly | As p | Cy s | Val | Ile | Leu | Pro |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Gly | Ly s | Glu | Gly | Asp | Gly | Ser | Leu | Thr | Val | Al a | Ile | Ile | Leu | Gin | Al a |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Val | Hi s | Val | As p | Al a | Phe | Ly s | Asn | Phe | Phe | Tyr | Glu | Glu | I 1 e | Glu | Cy s |
| 435 | 440 | 445 |
(2) TUDNIVALÓK A 3. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 552 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant43D (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 41...397
HU 220 185 Β (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 3. SZEKVENCIA:
CTTACATTTC TTCAATAGTT TAGTCCATAA AGCAATAGAT ATG GCT CGG TTT CTT 5 5 Met Alá Arg Phe Leu
5
GTG TTC CTT GCT TTA GCC CTT GTA ATA ATT TCA AAG AAG GGC GCG TTG 103
Val Phe Leu Alá Leu Alá Leu Val Ile Ile Ser Lys Lys Gly Alá Leu
15 20
GGT GCT CCT CCT TCC TGT CCA ACA GTT ACA ACG CAG CTG GCT CCT TGT 151
Gly Alá Pro Pro Ser Cys Pro Thr Val Thr Thr Gin Leu Alá Pro Cys
30 35
CTA TCG TAC ATT CAA GGT GGA GGT GAT CCA TCT GTA CCT TGC TGC ACT 199
Leu Ser Tyr Ile Gin Gly Gly Gly Asp Pro Ser Val Pro Cys Cys Thr
45 50
GGT ATA AAT AAC ATA TAT GAA CTT GCT AAA ACC AAA GAA GAC CGA GTC 24 7
Gly Ile Asn Asn Ile Tyr Glu Leu Alá Lys Thr Lys Glu Asp Arg Val
60 65
GCT ATC TGC AAC TGC TTA AAA ACC GCA TTT ACT CAT GCT GGA AAT GTC 29 5
Alá Ile Cys Asn Cys Leu Lys Thr Alá Phe Thr His Alá Gly Asn Val
75 80 85
AAT CCC ACT CTC GTA GCT CAA CTC CCC AAG AAA TGT GGC ATT TCT TTT 343
Asn Pro Thr Leu Val Alá Gin Leu Pro Lys Lys Cys Gly Ile Ser Phe
95 100
AAT ATG CCT CCT ATT GAT AAA AAC TAC GAC TGT AAC ACG ATT TCT ATG 391
Asn Met Pro Pro Ile Asp Lys Asn Tyr Asp Cys Asn Thr Ile Ser Met
105 110 115
TAC TGATGAATGG GTAGTGAATC TCGGAAGCTG CTCAAATTTA TGAATAAAAC 444
Tyr
ATATATAGAT GTTCATCTCA TGTCTGAAAT CTGAAAGCAA TTTGATCCAC TGTAAACTTC 504 AAATGTATGC AGACGGTTAA ATGTTGAATT ATGATATATA TAAATTTG 552 (2) TUDNIVALÓK A 4. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 118 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 4. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Al a | Arg | Phe | Leu 5 | Val | Phe | Leu | Al a | Leu 10 | Al a | Leu | Val | Ile | Ile 15 | Ser |
| Lys | Ly s | Gly | Al a | Leu | Gly | Al a | Pro | Pro | Ser | Cy s | Pro | Thr | Va 1 | Thr | Thr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gin | Leu | Al a | Pro | Cys | Leu | Ser | Tyr | Ile | Gin | Gly | Gly | Gly | As p | Pro | Ser |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | Pro | Cys | Cys | Thr | Gly | Ile | Asn | Asn | Ile | Tyr | Glu | Leu | Al a | Ly s | Thr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ly s | Glu | Asp | Arg | Val | Al a | Ile | Cy s | Asn | Cy s | Leu | Ly s | Thr | Alá | Phe | Thr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Hi s | Al a | Gly | Asn | Va 1 | Asn | Pro | Thr | Leu | Val | Al a | Gin | Leu | Pro | Ly s | Ly s |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Cys | G1 y | Ile | Ser | Phe | Asn | Me t | Pro | Pro | Ile | Asp | Ly s | Asn | Tyr | As p | Cys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Asn | Thr | Ile | Se r | Me t | Tyr | ||||||||||
| 115 |
(2) TUDNIVALÓK AZ 5. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 612 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM
HU 220 185 Β (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant9 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 344.. .442 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 5. SZEKVENCIA:
TGTCAGAGAG GGTGATGTTT TAACATTGTT AGAGTCTGAC AGGTCCCTTG ACATTTCTCA 60 TGATAAACCT GTTCTGGTCA TCATGAGAAA TGTCTAGCCT CTCTCTCAGA CTCTAACAAT 120 GTTAAAACAT CACCCTCTCT GACAGGTCCC TTGACATTTC TCATGATAAA CCTGTTCTGG 180 TCATCAAGAA ACTTGACTCT CACCTGAGTT ACCTGTCCTC TGGACCCAGT ACGGCCCATG 240 ACTTTCACCA CAATAGCATG CTTGGTCGCA GATTCCATCC TTGAGAGGAG CAGACGAGCG 300 AGCACAAAGC GCAAATTGCT ATGACGGCCG AATAGGAGAA AAA ATG CCT TCC CTC 35 5
Met Pro Ser Leu 1
| TCA | GTG | CAA | TCT | TCC | TCC | CCT | CTC | TTG | TGC | GGC | AAA | CTG | AGT | TTG | ATG | 403 |
| Ser | Val | Gin | Ser | Ser | Ser | Pro | Leu | Leu | Cy s | Gly | Lys | Leu | Ser | Leu | Me t | |
| 5 | 10 | 15 | 20 | |||||||||||||
| GGG | TCC | GTG | CCT | ACC | AGT | TCC | CAG | TCA | CTG | GGC | GAA | TAATATCATA | 449 | |||
| Gly | Ser | Val | Pro | Thr | Ser | Ser | G1 n | Ser | Leu | Gly | Glu | |||||
| 25 | 30 |
GTTCTAAAAT CAATAAATTT ACTTTGTCCC TTCTATCTTT TTTTTCTTCT TTTTCATTGG 509 TGCTCTTTAT GCTAATGTCC TCACTCCTCT GTTCTATCAC AGAGCAAGGT CAGGAAAGAG 569 TTTGTATTGT CATATGAAAT CAATAAAACA AACTGTTTAC CCG 612 (2) TUDNIVALÓK A 6. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 32 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii)MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 6. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Pro | Ser | Leu | Ser 5 | Val | Gin | Ser | Ser | Ser 10 | Pro | Leu | Leu | Cy s | Gly 15 | Lys |
| Leu | Ser | Leu | Me t 20 | Gly | Ser | Val | Pro | Thr 25 | Ser | Ser | Gin | Ser | Leu 30 | Gly | Glu |
(2) TUDNIVALÓK A 7. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 96 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant52 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :3...95 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 7. SZEKVENCIA:
CC CAT AAC TGC CTT AAT TGC AAT TCT AAA AGG CAA CAA GAT TCT TAC 47 His Asn Cys Leu Asn Cys Asn Ser Lys Arg Gin Gin Asp Ser Tyr
10 15
TTC TTC ACT GAT CCA ATG AAA GCA CAA TCA ATA GTA GGA ACT GTC ACC 95 Phe Phe Thr Asp Pro Met Lys Alá Gin Ser Ile Val Gly Thr Val Thr
25 30
C 96
HU 220 185 Β (2) TUDNIVALÓK A 8. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 31 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 8. SZEKVENCIA:
| Hi s 1 | Asn | Cy s | Leu Asn 5 | Cy s | Asn | Ser | Lys | Arg 10 | Gin | Gin | As p | Ser | Tyr 15 | |
| Phe | Thr | Asp | Pro | Me t | Ly s | Al a | Gin | Ser | Ile | Val | Gly | Thr | Va 1 | Thr |
| 20 | 25 | 30 |
(2) TUDNIVALÓK A 9. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1201 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS :
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant59 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...1119 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 9. SZEKVENCIA:
| ATC TTT | AGT | AGC | CAA ATA TGG ACT CAA CCT AAT TCT GAA ATG AAT AAT | 48 | ||||||||||||
| Ile | Phe | Ser | Ser | Gin | I le | Trp | Thr | Gin | Pro | Asn | Ser | Glu | Me t | Asn | Asn | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| GAT | CTT | GTG | ATC | CCC | GCC | ATT | TTC | AAC | CAT | GAG | AAG | CTT | AGG | ACC | ATT | 96 |
| As p | Leu | Val | Ile | Pro | Al a | Ile | Phe | Asn | Hi s | Glu | Lys | Leu | Arg | Thr | Ile | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| TCA | CGT | GAA | TGC | GAT | CCC | AAG | CGT | AAA | CTA | GCC | GAA | AGC | AAT | TCA | GGA | 144 |
| Ser | Arg | Glu | Cy s | Asp | Pro | Lys | Arg | Lys | Leu | Al a | Glu | Ser | Asn | Ser | Gly | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GAC | ATC | ATG | GGA | GAA | GTT | AAG | AAG | ACT | CAT | CAA | GCT | ATT | CAA | TCA | CTT | 192 |
| As p | Ile | Me t | Gly | Glu | Val | Lys | Ly s | Thr | Hi s | Gin | Al a | Ile | Gin | Ser | Leu | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GAT | AAA | AGT | ATG | TCA | ACA | TTG | GAG | AAT | GAA | TTG | GCA | ATA | GCT | CGG | ACA | 240 |
| Asp | Ly s | Ser | Me t | Ser | Thr | Leu | Glu | Asn | Glu | Le u | Al a | Ile | Al a | Arg | Thr | |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||||
| AGG | CAA | ACA | ATC | AGT | CAC | AAT | GCA | AAG | GAA | AAT | AGG | GCT | TCA | AAT | CAC | 288 |
| Arg | Gin | Thr | Ile | Ser | Hi s | Asn | Al a | Ly s | Glu | Asn | Arg | Al a | Ser | Asn | Hi s | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| ACC | ACA | CCG | AAT | AAA | GCA | TTC | ATC | GTG | GTG | GGA | ATT | AAT | ACC | GCA | TTC | 336 |
| Thr | Thr | Pro | Asn | Ly s | Al a | Phe | Ile | Val | Val | Gly | Ile | Asn | Thr | Al a | Phe | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| AGC | AGC | AGA | AAA | AGA | CGC | GAT | TCT | CTT | AGA | GAA | ACT | TGG | ATG | CCT | AAA | 384 |
| Ser | Ser | Arg | Lys | Arg | Arg | Asp | Ser | Leu | Arg | Glu | Thr | Trp | Me t | Pro | Lys | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| GGG | GAT | AAG | CTA | AGG | AAG | CTA | GAG | AAA | GAG | AAG | GGA | ATC | GTG | ATA | CGG | 432 |
| Gly | Asp | Lys | Leu | Arg | Lys | Leu | Glu | Lys | Glu | Lys | Gly | Ile | Va 1 | Ile | Arg | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| TTT | GTG | ATA | GGA | CAC | AGT | GCT | ACA | CGA | GGA | GGA | GTT | CTT | GAT | CGT | GCC | 480 |
| Phe | Va 1 | Ile | Gly | Hi s | Ser | Alá | Thr | Arg | Gly | Gly | Val | Leu | As p | Arg | Al a | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||||
| ATT | GAT | AGT | GAG | GAT | GCT | CAG | TAC | AAG | GAT | TTC | CTT | CGA | CTT | GAC | CAC | 528 |
| Ile | Asp | Ser | Glu | Asp | Al a | Gin | Tyr | Lys | Asp | Phe | Leu | Arg | Leu | Asp | Hi s | |
| 165 | 170 | 175 |
HU 220 185 Β
| GTT | GAG | GGT | TAT | CAT | GAG | CTG | TCC | ACC | AAG | ACA | AGA | TTG | TAT | TTC | TCT | 576 |
| Val | Glu | Gly | Tyr | Hi s | Glu | Leu | Ser | Thr | Ly s | Thr | Arg | Leu | Tyr | Phe | Ser | |
| AAA | GCT | GTC | 180 TCC | ATT | TGG | GAC | GCT | 185 GAC | TTC | TAC | GTT | AAA | 190 GTG | GAC | GAT | 624 |
| Lys | Al a | Val | Ser | Ile | Trp | Asp | Al a | As p | Phe | Tyr | Val | Ly s | Va 1 | Asp | Asp | |
| GAT | GTC | 195 CAT | CTC | AAC | TTA | GGT | 200 ATG | CTT | GCG | AAC | ACA | 205 TTA | GCA | AAA | TAC | 672 |
| Asp | Val | Hi s | Leu | Asn | Leu | Gly | Me t | Leu | Al a | Asn | Thr | Leu | Al a | Ly s | Thr | |
| AAA | 210 TCC | AAA | CCA | AGA | GTC | 215 TAC | ATT | GGA | TGC | ATG | 220 AAA | TCA | GGG | CCA | GTT | 720 |
| Ly s | Ser | Ly s | Pro | Arg | Val | Tyr | He | Gly | Cys | Me t | Lys | Ser | Gly | Pro | Val | |
| 225 CTT | TCC | CAA | AAA | GGA | 230 GTA | AGG | TAT | TAT | GAG | 235 CCC | GAG | TAT | TGG | AAA | 240 TTT | 768 |
| Leu | Ser | Gin | Ly s | Gly | Val | Arg | Tyr | Tyr | Glu | Pro | Glu | Tyr | Trp | Ly s | Phe | |
| GGA | GAA | GAA | GGA | 245 AAC | AAG | TAT | TTC | AGG | 250 CAT | GCC | ACG | GGT | CAA | 255 ATA | TAT | 816 |
| Gly | Glu | Glu | Gly | Asn | Lys | Tyr | Phe | Arg | Hi s | Al a | Thr | Gly | Gin | Ile | Tyr | |
| GGC | ATC | TCT | 260 AGA | GAC | CTT | GCT | TCA | 265 TAT | ATC | TCC | ATC | AAC | 270 TCG | GGA | ATA | 864 |
| Gly | Ile | Ser | Arg | Asp | Leu | Al a | Ser | Tyr | Ile | Ser | Ile | Asn | Se r | Gly | Ile | |
| TTA | CAT | 275 AGA | TAT | GCA | AAT | GAA | 280 GAC | GTA | TCA | TTG | GGA | 285 TCA | TGG | TTA | ATT | 912 |
| Leu | Hi s | Arg | Tyr | Al a | Asn | Glu | As p | Val | Ser | Leu | Gly | Ser | Trp | Leu | Ile | |
| GGG | 290 TTG | GAA | GTA | GAG | CAT | 295 GTG | GAT | GAG | CGT | TCA | 300 ATG | TGC | TGT | GGA | ACA | 960 |
| Gly | Leu | Glu | Val | Glu | Hi s | Val | As p | Glu | Arg | Se r | Me t | Cy s | Cys | Gly | Thr | |
| 305 CCT | CCA | GAT | TGT | GAG | 310 TGG | AAA | GCC | AAA | GGA | 315 GGA | AAT | ATA | TGT | GTG | 320 GCA | 1008 |
| Pro | Pro | As p | Cys | Glu | Trp | Lys | Al a | Lys | Gly | Gly | Asn | Ile | Cys | Val | Al a | |
| TCA | TTT | GAT | TGG | 325 TCA | TGC | AGT | GGG | ATA | 330 TGC | AAG | TCG | GTA | GAG | 335 AGG | ATG | 1056 |
| Ser | Phe | Asp | Trp | Ser | Cys | Ser | Gly | Ile | Cys | Ly s | Ser | Val | Glu | Arg | Me t | |
| AAA | GAT | GTG | 340 CAC | CAC | TCA | TGC | GGC | 345 GAA | GGT | GAC | GCA | GCT | 350 CTT | TGG | AAT | 1104 |
| Lys | As p | Val | Hi s | Hi s | Ser | Cys | Gly | Glu | Gly | Asp | Al a | Al a | Leu | Trp | Asn |
355 360 365
GTT CCT CTC TCA TGAGATTTAT TGGAGAGAAC TTAATTAATT ATCCACATAG 1156
Val Pro Leu Ser
370
TATTTCCTTT CGATTAATTA ATAATTTACT TGCGCAATGC AATTC 1201 (2) TUDNIVALÓK A 10. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 372 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 10. SZEKVENCIA:
| Ile 1 | Phe | Ser | Ser | Gin 5 | Ile | Trp | Thr | Gin | Pro 10 | Asn | Ser | Glu | Me t | Asn 15 | Asn |
| Asp | Leu | Va 1 | Ile | Pro | Al a | Ile | Phe | Asn | Hi s | Glu | Lys | Le u | Arg | Thr | Ile |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ser | Arg | Gl u | Cys | Asp | Pro | Ly s | Arg | Lys | Leu | Al a | Glu | Ser | Asn | Ser | Gly |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asp | 11 e | Me t | Gly | Glu | Val | Lys | Lys | Thr | Hi s | Gin | Al a | Ile | Gin | Ser | Leu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| As p | Lys | Ser | Me t | Ser | Thr | Leu | Glu | Asn | Glu | Leu | Al a | Ile | Al a | Arg | Thr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Arg | Gin | Thr | He | Ser | Hi s | Asn | Al a | Ly s | Glu | Asn | Arg | Al a | Ser | Asn | Hi s |
| 85 | 90 | 95 |
HU 220 185 Β
| Thr | Thr | Pro | Asn 100 | Ly s | Al a | Phe | Ile | Val 105 | Val | Gl y | I le | Asn | Thr 110 | Al a | Phe |
| Ser | Ser | Arg | Lys | Arg | Arg | As p | Ser | Leu | Arg | Glu | Thr | Trp | Me t | Pro | Ly s |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Gly | As p | Ly s | Leu | Arg | Lys | Leu | Glu | Ly s | Glu | Ly s | Gly | Ile | Va 1 | Ile | Arg |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Phe | Va 1 | Ile | Gly | Hi s | Ser | Al a | Thr | Arg | Gly | Gly | Val | Leu | As p | Arg | Al a |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ile | As p | Ser | Glu | Asp | Al a | Gin | Tyr | Ly s | As p | Phe | Leu | Arg | Le u | As p | Hi s |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Val | Glu | Gly | Tyr | Hi s | Gl u | Leu | Ser | Thr | Lys | Thr | Arg | Leu | Tyr | Phe | Ser |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Ly s | Al a | Val | Ser | Ile | Trp | Asp | Al a | Asp | Phe | Tyr | Val | Lys | Val | Asp | Asp |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Asp | Va 1 | Hi s | Leu | Asn | Leu | Gly | Me t | Leu | Al a | Asn | Thr | Leu | Al a | Ly s | Tyr |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Ly s | Pro | Arg | Val | Tyr | Ile | Gly | Cys | Me t | Ly s | Ser | Gly | Pro | Val |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Leu | Ser | Gin | Lys | Gly | Val | Arg | Tyr | Tyr | Glu | Pro | Glu | Tyr | Trp | Ly s | Phe |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Glu | Gly | Asn | Lys | Tyr | Phe | Arg | Hi s | Al a | Thr | Gly | Gin | Ile | Tyr |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Gly | Ile | Ser | Arg | As p | Leu | Al a | Ser | Tyr | Ile | Ser | Ile | Asn | Ser | Gl y | Ile |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Leu | Hi s | Arg | Tyr | Al a | Asn | Gl u | Asp | Va 1 | Ser | Leu | Gly | Ser | Trp | Leu | Ile |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Gly | Leu | Glu | Va 1 | Glu | Hi s | Val | As p | Glu | Arg | Ser | Me t | Cys | Cys | Gly | Thr |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Pro | Pro | As p | Cys | Gl u | Trp | Lys | Al a | Lys | Gly | Gl y | Asn | Ile | Cys | Va 1 | Al a |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Ser | Phe | As p | Trp | Ser | Cy s | Ser | Gly | Ile | Cys | Ly s | Ser | Val | Glu | Arg | Me t |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Lys | As p | Val | Hi s | Hi s | Ser | Cys | Gly | Glu | Gly | Asp | Al a | Al a | Leu | Trp | Asn |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Val | Pro | Leu | Ser |
370 (2) TUDNIVALÓK A 11. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 952 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant66 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS :1...711 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 11. SZEKVENCIA:
| ATC | ATG | ACC | ATC | TCT | AAG | GAC | AGG | GTG | AAG | CCA | TCC | CCT | CTG | CCC | GAC | 48 |
| Ile | Me t | Thr | Ile | Ser | Lys | Asp | Arg | Val | Lys | Pro | Ser | Pro | Leu | Pro | Asp | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| TCG | TGG | AAG | CTC | AAC | GAA | ATC | TTT | GCC | ACT | GGA | ATC | GTC | CTC | GGA | ACC | 96 |
| Ser | Trp | Lys | Leu | Asn | Glu | Ile | Phe | Al a | Thr | Gly | Ile | Val | Leu | Gly | Thr | |
| 20 | 25 | 30 |
HU 220 185 Β
| TAT CAA | GCT ATT ATG ACT | GTG | GTG TTC TTC TAT CTT | GCA GCT | GAC ACT | 144 |
| Tyr Gin | Alá I1e Me t Thr 35 | Val | Val Phe Phe Tyr Leu 40 | Alá Alá 45 | Asp Thr | |
| GAC TTC | TTT ACA GAG AAA | TTC | AAC GTT AAA TCA ATC | AGG GAT | AAT CCC | 192 |
| Asp Phe | Phe Thr Glu Lys 50 | Phe 55 | Asn Val Lys Ser lle 60 | Arg Asp | Asn Pro | |
| TAC GAG | CTT ACA GCT GCT | GTA | TAC CTT CAA GTG AGC | ATC ATC | AGC CAA | 240 |
| Tyr Glu 65 | Leu Thr Alá Alá 70 | Val | Tyr Leu Gin Val Ser 75 | lle lle | Ser Gin 80 | |
| GCT CTT | ATC TTT GTG ACA | AGA | TCA AGA AGC TGG TCA | TTT TTG | GAA CGC | 288 |
| Alá Leu | lle Phe Val Thr 85 | Arg | Ser Arg Ser Trp Ser 90 | Phe Leu | Glu Arg 95 | |
| CCG GGT | TTC TTG CTT GTC | ACT | GCT TTC CTC TTA GCC | CAA TTT | GTG GCT | 336 |
| Pro Gly | Phe Leu Leu Val 100 | Thr | Alá Phe Leu Leu Alá 105 | Gin Phe 110 | Val Alá | |
| ACA TTA | ATC GCT GTC TAC | GCC | AAC TGG AAG TTT GCT | AGG ATC | CAT GGA | 384 |
| Thr Leu | lle Alá Val Tyr 115 | Al a | Asn Trp Lys Phe Alá 120 | Arg lle 125 | His Gly | |
| ATT GGT | TGG GGA TGG GCA | GGA | ATC ATC TGG ATC TAC | ACA ATT | ATC ACC | 432 |
| lle Gly 130 | Trp Gly Trp Alá | Gly 135 | lle lle Trp lle Tyr 140 | Thr lle | lle Thr | |
| TAT ATC | CCT CTT GAT ATT | CTC | AAA TTC ATC AGT CGT | TAC ACG | TTG AGT | 480 |
| Tyr lle 145 | Pro Leu Asp lle 150 | Leu | Lys Phe lle Ser Arg 155 | Tyr Thr | Leu Ser 160 | |
| GGT GAG | GCC TGG AAT TCA | ATG | ATC CAA AAT AAG ACT | GCT TTC | ACA ACC | 528 |
| Gly Glu | Alá Trp Asn Ser 165 | Me t | lle Gin Asn Lys Thr 170 | Alá Phe | Thr Thr 175 | |
| AAG AAG | GAT TAT GGA AAA | GGT | GAG AGG GAA GCA CAA | TGG GCT | GTG GCG | 576 |
| Lys Lys | Asp Tyr Gly Lys 180 | Gly | Glu Arg Glu Alá Gin 185 | Trp Alá 190 | Val Alá | |
| CAA CGA | ACA CTA CAC GGT | CTC | CAG ACT GCT GAA AGC | AAT GGC | CTA TTC | 624 |
| Gin Arg | Thr Leu His Gly 195 | Leu | Gin Thr Alá Glu Ser 200 | Asn Gly 205 | Leu Phe | |
| CAT GAC | AAG AAC TAC AGA | GAA | TTG AAT GAG ATT GCT | GAA CAG | GCT AAA | 672 |
| His Asp 210 | Lys Asn Tyr Arg | Glu 215 | Leu Asn Glu lle Alá 220 | Glu Gin | Alá Lys | |
| CGT CGC Arg Arg 225 | GCT GAA GTT GCA Alá Glu Val Alá 230 | AAA Lys | TAT ACA CAT GAG CCA Tyr Thr His Glu Pro 235 | TGAAAATAAC | 718 | |
| TTGATTATCT CAATAACCAT GTTGCAAGAT AGGGGAATAT TAGACTCTCA AGGGACATGT 778 | ||||||
| TAAATCTATG TAGTCTAAGT TAAAGGGCAT TTTTGCAGCT ATTTATCAAG AATGTATCTC 838 | ||||||
| AATGTTGGAT GAAATCCAAT ATTGGTGAAC TACAAAGGCT AGCTGCTAAT CAAAACTATT 898 | ||||||
| AAACTAGTAG TTATATACAT AAAGAAAATT TACTATAGCA AAAAAAAAAA AAAA | 952 |
(2) TUDNIVALÓK A 12. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 236 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 12. SZEKVENCIA:
| lle 1 | Me t | Thr | lle | Ser 5 | Lys | Asp | Arg | Val | Lys 10 | Pro | Ser | Pro | Leu | Pro 15 | Asp |
| Ser | Trp | Lys | Leu | Asn | Glu | lle | Phe | Al a | Thr | Gly | lle | Val | Leu | Gly | Thr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Tyr | Gin | Al a | lle | Me t | Thr | Val | Val | Phe | Phe | Tyr | Leu | Al a | Al a | Asp | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Asp | Phe | Phe | Thr | Glu | Lys | Phe | As n | Val | Ly s | Ser | lle | Arg | As p | Asn | Pro |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Tyr | Glu | Leu | Thr | Al a | Al a | Va 1 | Tyr | Leu | Gin | Val | Ser | lle | lle | Ser | Gin |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
HU 220 185 Β
| Al a | Leu | Ile | Phe | Va 1 85 | Thr | Arg | Ser | Arg | Ser 90 | Trp | Ser | Phe | Leu | Glu 95 | Arg |
| Pro | Gly | Phe | Leu | Leu | Val | Thr | Al a | Phe | Leu | Leu | Al a | Gin | Phe | Val | Al a |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Thr | Le u | Ile | Al a | Va 1 | Tyr | Al a | Asn | Trp | Lys | Phe | Al a | Arg | I le | Hi s | Gly |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Gly | Trp | Gly | Trp | Al a | Gly | Ile | Ile | Trp | Ile | Tyr | Thr | Ile | Ile | Thr |
| 1 30 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Tyr | Ile | Pro | Leu | As p | Ile | Leu | Ly s | Phe | Ile | Ser | Arg | Tyr | Thr | Leu | Ser |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Glu | Al a | Trp | Asn | Ser | Me t | Ile | Gin | Asn | Ly s | Thr | Al a | Phe | Thr | Thr |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ly s | Ly s | Asp | Tyr | Gly | Lys | Gly | Glu | Arg | Glu | Al a | Gin | Trp | Al a | Val | Al a |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Gin | Arg | Thr | Leu | Hi s | Gly | Leu | Gin | Thr | Al a | Glu | Ser | Asn | Gly | Leu | Phe |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Hi s | As p | Lys | Asn | Tyr | Arg | Glu | Leu | Asn | Glu | Ile | Al a | Glu | Gin | Al a | Lys |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Arg | Arg | Al a | Glu | Val | Al a | Lys | Tyr | Thr | Hi s | Glu | Pro | ||||
| 225 | 230 | 235 |
(2) TUDNIVALÓK A 13. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 305 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant67 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 13. SZEKVENCIA:
ATTAAACTCT TGTTGTGTTT CCCTAGATTC CCAAGTTCTT TTTAGCTCCA TGCTTCTTGT 60 CCTCATGGCA TCCTGCTCTC TGTAAAAATT GAATCTTTTT ATGTTTTACT TCCATTCTTG 120 AATTTCATCC CTTTTGTTTG CTTCAATTGT TGCTTCTACC TTAATCATTT ATGTATTCCA 180 TGTTGTGGGT TTTGCTTCTT CATTTTAAGT TTAACTCCTG TGCCCTAAGA TAATTTTTTT 240 TAATGTTTTT CTTCCATTCT TGATTTTCTT TTTCTGTGCA TTAGGCCTTT TTGTATATTT 300 CTTGT 305 (2) TUDNIVALÓK A 14. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 445 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant68 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 2...445 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 14. SZEKVENCIA:
A GTT GGT GGC GGT GGC AGT GGC GGA GGT GGA GCC TAT GGT AGC GGG 46 Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Alá Tyr Gly Ser Gly
10 15
TGT GGT GAA AAT GGC TGT AAT TAC CCG CCC GTT GTA CCT GGA CCT CCA 94 Cys Gly Glu Asn Gly Cys Asn Tyr Pro Pro Val Val Pro Gly Pro Pro
25 30
HU 220 185 Β
| CAA | ACA | GGC | GAA | AAC | CCT | TAT | TGC | ATG |
| Gin | Thr | Gly | Glu 35 | Asn | Pro | Tyr | Cy s | Me t 40 |
| GGT | GGG | GTA | GGC | GGC | AGT | AAT | GGC | GGA |
| Gly | Gly | Val 50 | Gly | Gly | Ser | Asn | Gly 55 | Gly |
| GGT | GGT | GGC | GGA | GGT | GGA | GGT | GGA | GGA |
| Gly | Gly 65 | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly 70 | Gly | Gly |
| AAT | GGA | AAT | TGT | AAT | TAC | CCA | CCC | GTT |
| Asn 80 | Gl y | Asn | Cys | As n | Tyr 85 | Pro | Pro | Val |
| ATT | GGA | CCT | ATA | TGC | AAT | TGT | CCA | ATA |
| Ile | Gly | Pro | He | Cy s 100 | Asn | Cys | Pro | Ile |
| CGT | TGT | CCA | TAT | GGA | TGT | CAG | CCA | CCA |
| Arg | Cy s | Pro | Tyr 115 | Gly | Cy s | Gin | Pro | Pro 120 |
| GGA | AAT | TCC | AGA | CTA | ACT | CAT | GAC | AAG |
| Gly AAG Lys | Asn ACT Thr | Ser 130 ACT Thr | Arg GCT Al a | Leu TCG Ser | Thr | Hi s | As p 135 | Lys |
145 (2) TUDNIVALÓK A 15. SZEKVENCIÁHOZ: (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 148 aminosav (B) TÍPUS: aminosav
| CCT | GGT | TGT | GGC | GTA | GGT | GGT | 142 |
| Pro | Gly | Cys | Gly | Val | Gl y | Gly | |
| AGT | GGC | GGT | GGA | 45 GGA | GGC | GGT | 190 |
| Ser | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | |
| TAT | GGT | AGT | 60 GGT | TAT | GGT | GAA | 238 |
| Tyr | Gly | Ser | Gly | Tyr | Gly | Glu | |
| ATA | CCT | 75 GGA | CCC | CCA | CAA | ACA | 286 |
| Ile | Pro | Gly | Pro | Pro | Gin | Thr | |
| ACT | 90 CAA | CCA | ACA | TTC | CCA | 95 TTT | 334 |
| Thr | Gin | Pro | Thr | Phe | Pro | Phe | |
| 105 CCT | AGT | TAT | GGC | TGC | 110 CCA | AAT | 382 |
| Pro | Ser | Tyr | Gly | Cys | Pro | Asn | |
| GAA | AAA | CAG | AAT | 125 CAT | CAG | CCC | 430 |
| Glu | Ly s | Gin | Asn | Hi s | Gin | Pro |
140
445 (D)ALAK: lineáris (ii)MOLEKULATÍPUS: protein
| (x | i) SZE | KVEN | CIALEÍRÁS | : 15. S | SZEKVENCIA: | |||
| Val | Gly | Gly | Gly | Gly | Ser | Gly | Gly | Gl y |
| 1 | 5 | |||||||
| Gly | Glu | Asn | Gly | Cys | Asn | Tyr | Pro | Pro |
| 20 | 25 | |||||||
| Thr | Gly | Glu | Asn | Pro | Tyr | Cys | Me t | Pro |
| 35 | 40 | |||||||
| Gly | Val | Gly | Gly | Ser | Asn | Gly | Gly | Ser |
| 50 | 55 | |||||||
| Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | Gly | Tyr |
| 65 | 70 | |||||||
| Gl y | As n | Cy s | Asn | Tyr | Pro | Pro | Va 1 | Ile |
| 85 | ||||||||
| Gly | Pro | Ile | Cy s | Asn | Cy s | Pro | Ile | Thr |
| 100 | 105 | |||||||
| Cy s | Pro | Tyr | Gly | Cys | Gin | Pro | Pro | Pro |
| 115 | 120 | |||||||
| Asn | Ser | Arg | Leu | Thr | Hi s | Asp | Ly s | Glu |
| 130 | 135 | |||||||
| Thr | Thr | Al a | Ser | |||||
| 145 |
| Gly | Al a | Tyr | Gly | Ser | Gly | Cys |
| 10 | 15 | |||||
| Val | Va 1 | Pro | Gl y | Pro 30 | Pro | Gin |
| Gly | Cys | Gly | Val 45 | Gly | Gly | Gly |
| Gly | Gly | Gly 60 | Gly | Gly | Gly | Gly |
| Gly | Ser 75 | Gly | Tyr | Gly | Glu | Asn 80 |
| Pro 90 | Gly | Pro | Pro | Gin | Thr 95 | Ile |
| Gin | Pro | Thr | Phe | Pro 110 | Phe | Arg |
| Ser | Tyr | Gl y | Cy s 125 | Pro | Asn | Gly |
| Ly s | Gin | Asn 140 | Hi s | Gin | Pro | Ly s |
(2) TUDNIVALÓK A 16. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 3706 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM
HU 220 185 Β (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant32 genom klón (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:
(B) KLÓN: pCIB950 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: TATAJel (B) ELHELYEZKEDÉS: 1971... 1975 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 2076...3422 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: miscjeature (B) ELHELYEZKEDÉS: 2009 (D) MÁS INFORMÁCIÓ:/megjegyzés=„feltételezett transzkripciós starthely” (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 16. SZEKVENCIA:
CTGCAGTAAG GGGGATATTC AGAGACTCAA CTTAATCAAT ATTTGGCCCA AATTTGGCCT 60
GCCGCGTCAC CCAAGGCATC GCATCAGTGT AATTCTCTTC GCAATCTGAT TTTTGCTCTG 120
CTACCCTTCA TGAAAAAAGT CATAACTTCT TGTAGGAAAT ATTGGAATGA TAAATGGTTT 180
GATGTTCTGG AAACTAGACT CACAGAAAAT TCATTTGATA TATAGCTAAT AGCTCAATTC 240
GTAATGCATT CGGAGATATG ATTGTTTGAA GTTACATCAT ATGCGAGTAT GCTCGCTTTC 300
TTCTCTTAAA CCTTTTCTAT TTGTTCCAAA CTACTTCTTC TCACTTATAG ATGTCCATAT 360
AACTTTACAA ACATGAGATT TAGGTATTAC ACACCTTCAA AACTTTTCGA ACACACGTGT 420
GTCTACTTAG GGCTTGAACC AGAACGTAAT ACTTAACGAT TTTCGGGGCA TTACATGCAT 480
ACACCACTGT TAACAGGAAA ATTGCTTTCA TTAAATTATA ACATTGGATT TGGTGTGCAC 540
TAAGTTCCTA TGCTTAATTG TTATGAACAT GAGTACTTTG CTTTCTCCCT TTGGTGGTGC 600
ATACTTGTTT GTGGATATAT ATCGAGAATA ATAATGTGAG TGAATAGATA TTGTCTATTA 660
TTTAACTTTA ATTTGCACCG CTACTTGTTC ACCACATTGG GATTCAATTG GGTGACTCGG 720
CATATTTATC AATTAATATT CATCTAATGA GAACTCTTGC AAATTCTGTT ATAGGTTCTT 780
AGTAGCATCA GCTGCATATC ATGTAAACTA AGAGTCAATA TGCTCACTTG TCAGTAAAAA 840
AGAGTCATTA TCCTCACTTA TGTCATTTAC TCTATAGCTA TATTGGAGGC ATTATGTTAA 900
TGGATTCCTA ATAATACCAA ATTACACCTT ATATGAGTCA TTGTTGGACA GAGTTTATCA 960
ATACCTATAT ATTAGTGTAC TCTTATTCTT GCTCTTTGTG AGTATTAATA TGATGACTAT 1020
ATTGACAGCA TTTGCATGAT GATGAGTGGG GCAGGAGACG CACAAAGTTT GTACCATAGA 1080
GGAAGTTCGA GTTCTGTGAT AATCTTGGAA GAAAGTATAG TTATATTCTT TCTCCCCACC 1140
TTGTTGATTT CCGACTTGTT TGAAGTTTGC TCCTTGTTGC TGTCACAATT GTATTCATGT 1200
TAAGTTCTTT ATGAAGTTGG GTTGACGTTC AAATCTCATA CGCATGTTTG TTGCCTCTTT 1260
TTATTTGTCT ATGGGGGTTG CATCAGTTGT CTCAGATCAA GATGGGAGCA TATTACTGCT 1320
CCAAAGGTTT GGTTGTCCTT GGTAGTAACT AGTTCATGTG CAGGTTGGCT GCTCTGTTTG 1380
ATTCTGCTTT GAGAACTTAA AGCTTTCATT TACTCAATTA TCAAATATCT GGGGTTTAAT 1440
GGGCTCAAAT CACCCTTATA CAAACACCTT TTGTTTCCCT TATCAATGAA TGAACGAATT 1500
TCCTTTGAGT TGTGAATGTA ATAAGGGTGT GAAAGAGGAG TTTTCGTTGT TAAATTGGCG 1560
TTTGAAAGGT TCTCCCTTTT GTTCTTTTTT CGGCTTTTAC TTTTATATAC TGATAGTCTA 1620
AGAAACTTTT TACACTATCA AGTTGCCTAA AAGATAGCTA CATGAGTAAC TTGTTACAAC 1680
CGGTTAAATT ACACTAATAT TACAAATAAA AGTAAATCAG TAATATAAAA GTTATTTACA 1740
TAGTCAATAT ATATAATTTA AATCCTTTTC TATTTTTTCT CGAGGGGTTT GGATTTTTAT 1800
TTTAGTTGGC TCTTAAGACT TGTGCATGTA CATTCTTGAG AAAATAACTC TGTTCATGAG 1860
AAAGCTACCT TAACTAACTA ACGTACTTCA CGGCCGAAAC AAAATCATAC AAATAACACA 1920
TTTCTTTGTG GTTACCTTAA AATTTGGCCA TGAAACTTGG TCTGTTCGAT TATATCTTTA 1980
AATACTACTA CCATCTACCA CACACTCTCC TCTGTCAAGA TAACAATAAA AGAATAAAAA 2040
GATTAACCAA AAACGATATA CATATTTAGG ACAGA ATG AAG GTT AGC TTG AAG 2093
Met Lys Val Ser Leu Lys
5
| CAC | CAC | TGG | GTA | GTG | AAG | CCA | GCA | GAG | GCA | ACA | TGG | AAT | GGC | ACT | GTC | 2141 |
| Hi s | Hi s | Trp | Val | Val | Lys | Pro | Al a | Glu | Al a | Thr | Trp | Asn | Gly | Thr | Val | |
| 10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
| TCC | TTA | TCG | GAG | TGT | GAT | CAA | ACT | TTT | GCT | GTA | ACT | CAT | GTA | CCA | ACC | 2189 |
| Ser | Leu | Ser | Glu | Cy s | Asp | Gin | Thr | Phe | Al a | Va 1 | Thr | Hi s | Val | Pro | Thr | |
| 25 | 30 | 35 |
HU 220 185 Β
| ATT | TAT | TAC | TAC | AGG | TTT | TGC | CAT | GAT | TGT | CTT | CCA | TCA | ACA | GAC | AAT | 2237 |
| Ile | Tyr | Tyr | Tyr | Arg | Phe | Cys | Hi s | Asp | Cys | Leu | Pro | Ser | Thr | As p | Asn | |
| ATC | 40 ATC | AAA | ACC | CTC | AGG | 45 ACC | TCA | CTA | AGC | AAA | 50 GCA | TTA | GTA | CAC | TTC | 2285 |
| Ile | Ile | Lys | Thr | Leu | Arg | Thr | Ser | Leu | Ser | Ly s | Alá | Leu | Val | Hi s | Phe | |
| 55 TAT | CCA | TTG | TCT | GGT | 60 CGT | TTG | CGA | TGG | ATC | 65 GCT | GGG | TCC | CGC | CTC | 70 GAG | 2333 |
| Tyr | Pro | Leu | Se r | Gly | Arg | Leu | Arg | Trp | Ile | Al a | Gly | Ser | Arg | Leu | Glu | |
| CTC | GAC | TGT | AAT | 75 GCC | TCG | GGA | ATC | GTG | 80 CTC | ATG | GAA | GCT | GAA | 85 ACC | GAA | 2381 |
| Leu | Asp | Cy s | Asn | Al a | Ser | Gly | Ile | Val | Leu | Me t | Glu | Al a | Glu | Thr | Glu | |
| GCC | AAA | CTA | 90 GAT | GAT | CTT | GGC | GAT | 95 TTC | TCG | CCA | TCC | CCT | 100 GAC | TTG | AAC | 2429 |
| Al a | Ly s | Leu | As p | As p | Leu | Gly | As p | Phe | Ser | Pro | Ser | Pro | As p | Leu | Asn | |
| AGC | TTG | 105 TTT | CCC | CGT | GTA | GAC | 110 TAC | ACA | ATC | CCA | ATT | 115 GAT | GAA | CTC | CCT | 2477 |
| Ser | Leu | Phe | Pro | Arg | Val | Asp | Tyr | Thr | Ile | Pro | Ile | Asp | Glu | Leu | Pro | |
| TTG | 120 TTG | TTT | GTT | CAG | CTT | 125 ACT | AAG | TTT | CAG | TGT | 130 GGT | GGT | ATT | GCT | CTG | 2525 |
| Leu | Leu | Phe | Val | G1 n | Leu | Thr | Ly s | Phe | Gin | Cy s | G1 y | Gly | Ile | Al a | Leu | |
| 135 AGT | TTT | GCA | ATA | TCA | 140 CAT | GCT | GTA | GTT | GAT | 145 GGC | CAA | AGT | GCT | CTT | 150 TAC | 2573 |
| Ser | Phe | Al a | Ile | Ser | Hi s | Al a | Va 1 | Val | Asp | Gly | Gin | Ser | Al a | Leu | Tyr | |
| TTC | CTC | ACC | GAA | 155 TGG | GCT | AGC | CTT | GCT | 160 CGC | GGA | GAG | CCA | TTA | 165 GGG | AAC | 2621 |
| Phe | Leu | Thr | Glu | Trp | Al a | Ser | Leu | Al a | Arg | Gly | Glu | Pro | Leu | G1 y | Asn | |
| GAA | CCT | TTT | 170 CAT | GAT | CGA | AAA | TTC | 175 CTC | CGA | GCA | GGG | GAA | 180 CCT | CCA | ATT | 2669 |
| Glu | Pro | Phe | Hi s | As p | Arg | Lys | Phe | Leu | Arg | Al a | Gly | Glu | Pro | Pro | Ile | |
| GCA | TAT | 185 CCA | ACG | TTT | GAG | CAT | 190 TTA | CAG | TTT | AAT | CCA | 195 CCA | CCA | CTT | TTG | 2717 |
| Al a | Tyr | Pro | Thr | Phe | Glu | Hi s | Leu | Gin | Phe | Asn | Pro | Pro | Pro | Leu | Leu | |
| CTT | 200 GGA | CAG | TCC | AGC | AGT | 205 GAA | GAG | GAG | AAG | AAA | 210 AAT | GAA | ACA | AAG | GGT | 2765 |
| Leu | Gly | Gin | Ser | Ser | Ser | Glu | Glu | Glu | Lys | Lys | Asn | Glu | Thr | Lys | Gly | |
| 215 TCC | ATG | CTA | AAA | CTT | 220 ACA | AAA | CAT | CAA | GTT | 225 GAA | ATG | TTG | AGA | AAA | 230 AAG | 2813 |
| Ser | Me t | Leu | Lys | Leu | Thr | Lys | Hi s | Gin | Val | Glu | Me t | Leu | Arg | Ly s | Lys | |
| GCG | AAC | CAA | GGT | 235 AAT | CAA | GGG | CGT | AGT | 240 TAC | ACA | CGT | TAT | GAA | 245 GTT | GTG | 2861 |
| Al a | Asn | Gin | Gly | Asn | Gin | Gly | Arg | Ser | Tyr | Thr | Arg | Tyr | Glu | Val | Val | |
| ACT | GCA | CAT | 250 ATA | TGG | AGA | TGT | GCA | 255 TGC | AAG | GCA | AGA | GGT | 260 CAT | AAA | TTT | 2909 |
| Thr | Al a | Hi s | Ile | Trp | Arg | Cys | Al a | Cys | Ly s | Al a | Arg | Gly | Hi s | Ly s | Phe | |
| GAG | CAG | 265 CCT | ACT | AAT | TTA | TGC | 270 ATT | TGT | GTT | AAC | ATA | 275 CGC | AAT | ATA | ATG | 2957 |
| Glu | Gin | Pro | Thr | As n | Leu | Cy s | Ile | Cys | Val | Asn | Ile | Arg | Asn | Ile | Me t | |
| CAA | 280 CCA | CCT | TTG | CCT | AAA | 285 TCC | TAT | TTT | GGC | AAT | 290 GCC | ATA | GTT | GAT | GTT | 3005 |
| Gin | Pro | Pro | Leu | Pro | Ly s | Ser | Tyr | Phe | Gly | Asn | Alá | Ile | Val | Asp | Val | |
| 295 ATT | GCC | AAT | GGC | GTC | 300 TCG | GGT | GAC | ATT | ACC | 305 TCG | AGG | CCA | TTG | GAG | 310 TAT | 3053 |
| Ile | Al a | Asn | Gly | Val | Ser | Gly | As p | Ile | Thr | Ser | Arg | Pro | Leu | Glu | Tyr | |
| GTT | GCT | CGA | AGG | 315 GTG | CGA | GCA | GCC | ATT | 320 AAA | ATG | GTG | ACG | AGT | 325 GAT | TAC | 3101 |
| Val | Al a | Arg | Arg | Va 1 | Arg | Al a | Al a | I 1 e | Ly s | Me t | Val | Thr | Ser | Asp | Tyr | |
| GCA | AAC | TCG | 330 ACG | ATT | GAT | TTC | TTA | 335 AAA | AAC | CAG | GAG | GAT | 340 TTG | TCA | AAA | 3149 |
| Al a | Asn | Ser | Thr | Ile | As p | Phe | Leu | Lys | Asn | Gin | Glu | Asp | Leu | Ser | Ly s |
345 350 355
HU 220 185 Β
| TAT CAA | GAT ATT CAT | GCA TTT AGA AGC AAG | GAA GGT CCT | TTT | TAT | GGA | 3197 |
| Tyr Gin | Asp Ile His | Alá Phe Arg Ser Lys | Glu Gly Pro | Phe | Tyr | Gly | |
| 360 | 365 | 370 | |||||
| AAC CCT | AAT CTT GGG | GTT ATA AGT TGG ATA | AGT TTG CCA | TTA | TTA | GGA | 3245 |
| Asn Pro | Asn Leu Gly | Val Ile Ser Trp Ile | Ser Leu Pro | Leu | Leu | Gly | |
| 375 | 380 | 385 | 390 | ||||
| TTG GAT | TTT GGG TGG | GGA AAA GAG ATA CAT | ATG AGC CCT | GGA | ACT | CAT | 3293 |
| Leu Asp | Phe Gly Trp | Gly Lys Glu Ile His | Met Ser Pro | Gly | Thr | Hi s | |
| 395 | 400 | 405 | |||||
| GAA TAT | GAT GGT GAT | TGT GTG ATA CTT CCA | GGA AAA GAA | GGG | GAT | GGA | 3341 |
| Glu Tyr | Asp Gly Asp | Cys Val Ile Leu Pro | Gly Lys Glu | Gly | Asp | Gly | |
| 410 | 415 | 420 | |||||
| TCT TTG | ACT GTT GCA | ATC ATT CTT CAA GCT | GTT CAT GTG | GAT | GCT | TTC | 3389 |
| Ser Leu | Thr Val Alá | Ile Ile Leu Gin Alá | Val His Val | As p | Al a | Phe | |
| 425 | 430 | 435 | |||||
| AAG AAC | TTC TTC TAT | GAA GAA ATT GAA TGT | TGAAAAACAT AAGTGTTTTA | 3439 | |||
| Lys Asn | Phe Phe Tyr | Glu Glu Ile Glu Cys | |||||
| 440 | 445 | ||||||
| TGAGAAGAAA GGAAACAAAT TAAGAACATG TAGCTTTTCC TAAATTGACA TTGTTAGTCA 3499 | |||||||
| TGGTCTAAGC AAAATAAACT CTTTATCTAC ACATTATTTC AATATATTTT CCTTATTTTC 3559 | |||||||
| TATCAGATTT CTCATATGTT TATTTGATGT TCTTAATTTT ACGAACAATA ATCGGTCATA 3619 | |||||||
| AATGGTTTGA AAATCAATAA CCAAAACTGG AACTATATTG ATTGTTTGGA AGCTAAGCAC 3679 | |||||||
| TTTTTTTCTT CTTTTTTCGC AAAGCAC | 3706 |
(2) TUDNIVALÓK A 17. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 448 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 17. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Ly s | Val | Ser | Leu 5 | Ly s | Hi s | Hi s | Trp | Val 10 | Val | Lys | Pro | Al a | Glu 15 | Al a |
| Thr | Trp | Asn | Gly | Thr | Val | Ser | Leu | Ser | Glu | Cys | Asp | Gin | Thr | Phe | Al a |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Val | Thr | Hi s | Val | Pro | Thr | Ile | Tyr | Tyr | Tyr | Arg | Phe | Cy s | Hi s | Asp | Cy s |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Leu | Pro | Ser | Thr | Asp | Asn | Ile | I 1 e | Ly s | Thr | Leu | Arg | Thr | Ser | Leu | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ly s | Al a | Leu | Val | Hi s | Phe | Tyr | Pro | Leu | Ser | Gly | Arg | Leu | Arg | Trp | Ile |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Al a | Gly | Ser | Arg | Leu | Glu | Leu | As p | Cys | Asn | Al a | Ser | Gly | Ile | Val | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Me t | Glu | Alá | Glu | Thr | Glu | Alá | Ly s | Leu | Asp | As p | Leu | Gly | As p | Phe | Ser |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Pro | Ser | Pro | Asp | Leu | Asn | Ser | Le u | Phe | Pro | Arg | Va 1 | As p | Tyr | Thr | Ile |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Pro | 11 e | As p | Glu | Leu | Pro | Leu | Leu | Phe | Va 1 | G1 n | Leu | Thr | Ly s | Phe | Gin |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Cys | Gly | Gly | Ile | Alá | Leu | Ser | Phe | Al a | Ile | Ser | Hi s | Al a | Val | Val | Asp |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Gly | Gin | Ser | Al a | Leu | Tyr | Phe | Leu | Thr | Glu | Trp | Al a | Ser | Leu | Al a | Arg |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gly | Glu | Pro | Leu | Gly | Asn | Glu | Pro | Phe | Hi s | As p | Arg | Lys | Phe | Leu | Arg |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Alá | Gly | Glu | Pr o | Pro | Ile | Al a | Tyr | Pro | Thr | Phe | Glu | Hi s | Le u | Gin | Phe |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Pro | Pro | Leu | Leu | Leu | Gly | Gin | Ser | Ser | Ser | Glu | Glu | Glu | Lys |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Lys | Asn | G1 u | Thr | Ly s | Gly | Ser | Me t | Leu | Lys | Leu | Thr | Lys | Hi s | Gin | Va 1 |
| 225 | 230 | 235 | 240 |
HU 220 185 Β
| Glu | Me t | Leu Arg | Ly s 245 | Lys | Al a | Asn Gin Gly Asn Gin Gly 250 | Arg | Ser 255 | Tyr | ||||||
| Thr | Arg | Tyr | Glu | Va 1 | Va 1 | Thr | Al a | Hi s | 11 e | Trp | Arg | Cy s | Al a | Cys | Lys |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Al a | Arg | Gly | Hi s | Ly s | Phe | Glu | Gin | Pro | Thr | As n | Leu | Cy s | Ile | Cys | Val |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Asn | Ile | Arg | Asn | Ile | Me t | Gin | Pro | Pro | Leu | Pro | Lys | Ser | Tyr | Phe | Gly |
| 290 | 295 | 300 | |||||||||||||
| Asn | Al a | Ile | Val | Asp | Va 1 | Ile | Al a | Asn | Gl y | Val | Ser | Gly | As p | Ile | Thr |
| 305 | 310 | 315 | 320 | ||||||||||||
| Ser | Arg | Pro | Leu | Glu | Tyr | Val | Al a | Arg | Arg | Va 1 | Arg | Al a | Al a | Ile | Ly s |
| 325 | 330 | 335 | |||||||||||||
| Me t | Val | Thr | Se r | Asp | Tyr | Al a | Asn | Ser | Thr | Ile | Asp | Phe | Leu | Lys | Asn |
| 340 | 345 | 350 | |||||||||||||
| Gin | Glu | As p | Leu | Ser | Lys | Tyr | Gin | Asp | Ile | Hi s | Al a | Phe | Arg | Ser | Lys |
| 355 | 360 | 365 | |||||||||||||
| Glu | Gly | Pro | Phe | Tyr | Gly | Asn | Pro | Asn | Leu | Gly | Val | Ile | Ser | Trp | Ile |
| 370 | 375 | 380 | |||||||||||||
| Ser | Leu | Pro | Leu | Le u | Gly | Leu | As p | Phe | Gly | Trp | Gly | Ly s | Glu | Ile | Hi s |
| 385 | 390 | 395 | 400 | ||||||||||||
| Me t | Ser | Pro | Gly | Thr | Hi s | Glu | Tyr | Asp | Gly | As p | Cys | Val | Ile | Leu | Pro |
| 405 | 410 | 415 | |||||||||||||
| Gly | Lys | Glu | Gly | Asp | Gly | Ser | Leu | Thr | Va 1 | Al a | Ile | Ile | Leu | Gin | Al a |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Val | Hi s | Val | Asp | Al a | Phe | Ly s | Asn | Phe | Phe | Tyr | Glu | Glu | Ile | Glu | Cy s |
| 435 | 440 | 445 |
(2) TUDNIVALÓK A 18. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 1906 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: DNS (genom) (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant43D (vii) KÖZVETLEN FORRÁS:
(B) KLÓN: pCIB952 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: osztott (1230...1570,1669...1684) (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: intron (B) ELHELYEZKEDÉS: 1571...1668 (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: miscjeature (B) ELHELYEZKEDÉS: 1167 (D) MÁS INFORMÁCIÓ:/megjegyzés=„feltételezett transzkripciós starthely” (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 18. SZEKVENCIA:
GAATTCCTCG ATTTAACCAG AAATCTGCAA AAAATCCCTC AATTCAGCTA ATTAGGACTC 60 TGATACCATG TTAACTTTCA CTGATTTATA CTGATTATGA AGTGTAATCC ACAACTGAAT 120 GAATTGAGAA GACGAAATTG AAAGCAGAAG AAAGGTAAAG AACAGAGAGA ACAATATGAT 180 TACTTCTCTG CTTAGCAATG TCGGTCATTA CTAACAAAAT GAATGTATAC ATATACTTAT 240 ACTAATATTT ATTGACTCCT AATAGATGAC CGTTGTAAAT AAGAAAAATG ACATAATTAC 300 TCCTGTAGCT AACTAATGAT CAGGGAATTA TAGTGCAATT AACTAACTCC TTTACAAAAC 360 CCGATTTACT TTGATGCGAT TGACTTTTTC ATATATCTTA ATTTAATGGA AAGAATCTGT 420 GATTATCACA CCTTATTTAG AGAAGATCTT TTAAAAGTAA GGAGGCATCG CCTAAAACAT 480 CTTAATAACT TCCTTTTCAC CGCATAAAAT AAGTGTGTAA ACCGTAGTAG TGTGTAAACC 540
HU 220 185 Β
AGCAAAAGAA CAACCATATA AAGAAAAATA TGTGAAATTA TATTTAAGCC GCTCCCAAAA 600 ATAATAGCCG ATAAAATGTA TATTTTTCAT ACATTATGTG TATGTATTAT ATACGAAAAA 660 GATACATATT TTATATACTT TTTGACAAAT GAATACAATT AGTTTCGGTC AACCTGCCAA 720 TTTTATATTT TGCCCTAAAA ATATACCCAA CAAAAAGAGA CTTTGTATGT AAAAAAAAAA 780 AAAAAATTAC TATGTGCAAA GTTAAGATCG GCAGGCTGCC TTAAAATCCC AAAAAAAAAA 840 AAAAAAAAAA AAATGGCTTG CTTTAATTAC ACATGAACAG CCAATGGTTT GCTTTAATTT 900 ATTCCTCTAA TACGTATATT GTCGTTGACA GAGAATTTGA ATCAAGCAAC TCACATCTCC 960 AAATAGAAGA GGAAATATCG TGTGAAATTC CAATTGAACA ACAAACTGCG CAGAGAATTG 1020 AAAACTCTAA TTCATGAGAA TCGCATGTTA CAAGTTACTA TAACAGAATA AAGGGGCTGA 1080 AAGATAGGTA TATATAT ΑΤΑ TATATATATA TATATATATA TATATATATA TATATATATA 1140 TATATATGTC ACTCATTTGC ACATAATTCT ACACACAGAG AGAATTTAAC TTACATTTCT 1200 TCAATAGTTT AGTCCATAAA GCAATAGAT ATG GCT CGG TTT CTT GTG TTC CTT 125 3
| Me t 1 | Al a | Arg | Phe | Leu | Val | Phe | Leu | |||||||||
| GCT | TTA | GCC | CTT | GTA | ATA | ATT | TCA | 1 AAG | AAG | GGC | GCG | 3 TTG | GGT | GCT | CCT | 1301 |
| Al a | Leu | Al a | Leu | Val | Ile | Ile | Ser | Ly s | Lys | Gl y | Al a | Leu | Gly | Al a | Pro | |
| 10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
| CCT | TCC | TGT | CCA | ACA | GTT | ACA | ACG | CAG | CTG | GCT | CCT | TGT | CTA | TCG | TAC | 1349 |
| Pro | Ser | Cys | Pro | Thr | Val | Thr | Thr | Gin | Leu | Al a | Pro | Cys | Le u | Ser | Tyr | |
| 25 | 30 | 35 | 40 | |||||||||||||
| ATT | CAA | GGT | GGA | GGT | GAT | CCA | TCT | GTA | CCT | TGC | TGC | ACT | GGT | ATA | AAT | 1397 |
| Ile | Gin | Gly | Gly | Gly | As p | Pro | Ser | Va 1 | Pro | Cy s | Cy s | Thr | Gly | Ile | Asn | |
| 45 | 50 | 55 | ||||||||||||||
| AAC | ATA | TAT | GAA | CTT | GCT | AAA | ACC | AAA | GAA | GAC | CGA | GTC | GCT | ATC | TGC | 1445 |
| Asn | Ile | Tyr | Glu | Leu | Al a | Ly s | Thr | Ly s | Glu | As p | Arg | Val | Al a | Ile | Cy s | |
| 60 | 65 | 70 | ||||||||||||||
| AAC | TGC | TTA | AAA | ACC | GCA | TTT | ACT | CAT | GCT | GGA | AAT | GTC | AAT | CCC | ACT | 1493 |
| Asn | Cy s | Leu | Ly s | Thr | Al a | Phe | Thr | Hi s | Al a | Gly | Asn | Val | Asn | Pro | Thr | |
| 75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
| CTC | GTA | GCT | CAA | CTC | CCC | AAG | AAA | TGT | GGC | ATT | TCT | TTT | AAT | ATG | CCT | 1541 |
| Leu | Va 1 | Al a | Gin | Leu | Pro | Lys | Lys | Cys | Gly | Ile | Ser | Phe | Asn | Me t | Pro | |
| 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
| CCT | ATT | GAT | AAA | AAC | TAC | GAC | TGT | AAC | AC GTAAGTTTAT ATTACCTCTC 1590 | |||||||
| Pro | Ile | Asp | Lys | Asn | Tyr | Asp | Cy s | Asn | Thr |
105 110
AATTTTTATT TCCACCCAAT TTGGTGCAGA TCGACTGCTT GTTTAATCTA ACTTATTATT 1650 TTTATTACAT GCATGCAG G ATT TCT ATG TAC TGATGAATGG GTAGTGAATC 1701
Ile Ser Met Tyr 115
TCGGAAGCTG CTCAAATTTA TGAATAAAAC ATATATAGAT GTTCATCTCA TGTCTGAAAT 1761 CTGAAAGCAA TTTGATCCAC TGTAAACTTC AAATGTATGC AGACGGTTAA ATGTTGAATT 1821 ATGATATATA TAAATTTGGT TAATGCCTTT GTTTTTGGTA GTCTTAGACC AAGTTCACCA 1881 AGAGAGACGG TTCATATGAG CTTTT 1906 (2) TUDNIVALÓK A 19. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 118 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 19. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Alá Arg | Phe | Leu 5 | Val | Phe | Leu | Al a | Leu 10 | Al a | Leu | Val | Ile | Ile 15 | Ser | |
| Ly s | Ly s | Gly | Al a | Leu | Gly | Al a | Pro | Pro | Ser | Cys | Pro | Thr | Val | Thr | Thr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Gin | Leu | Alá | Pro | Cys | Leu | Ser | Tyr | Ile | Gin | Gly | Gl y | Gly | Asp | Pro | Ser |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Va 1 | Pro | Cys | Cy s | Thr | Gly | Ile | Asn | Asn | Ile | Tyr | Glu | Leu | Al a | Ly s | Thr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Lys | Glu | Asp | Arg | Val | Al a | Ile | Cy s | Asn | Cy s | Le u | Ly s | Thr | Al a | Phe | Thr |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
HU 220 185 Β
| Hi s | Al a | Gly | Asn | Va 1 85 | Asn | Pro | Thr | Leu | Val 90 | Al a | Gin | Leu | Pro | Ly s 95 | Ly s |
| Cys | Gly | lle | Ser | Phe | Asn | Me t | Pro | Pro | lle | As p | Lys | Asn | Tyr | Asp | Cys |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Asn | Thr | lle | Ser | Me t | Tyr |
115 (2) TUDNIVALÓK A 20. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 437 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: cDNS (iii) HIPOTETIKUS: NEM (iv) ANTISZENSZ: NEM (vi) EREDETI FORRÁS:
(A) SZERVEZET: Nicotiana tabacum (C) EGYEDI IZOLÁTUM: Ant43C (ix) SAJÁTOS JELLEMZŐ:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS: 167...436 (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 20. SZEKVENCIA:
CTGTGATTAA GGATACTGTC ACCCCTGTGA ATTTGGTTGG ATATGGGTTG GCTTTCTTGG 60 GTGACAGTAT CCTTAATCAC AGACCAAGAA AAGGCAATCA ACAACCAATC CTACACACAC 120 ACATTTAAAT TACATTTCTT CAATTGTAGT CCATAAACCA ATAGAT ATG GCT CGG 175
Met Alá Arg 1
| TTT | CTT GCT TTA GCC | CTA GTA GTT ATA | GCT | CTC | TCA | AAC | GAC | GCG | TTG | 223 | ||||||
| Phe | Leu | Al a | Leu | Al a | Leu | Val | Va 1 | lle | Al a | Leu | Ser | Asn | As p | Al a | Leu | |
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||||
| GGT | GCT | CCT | CCC | TCG | TGT | CAA | ACT | GTT | ACA | ACG | CAG | CTG | GCT | CCT | TGT | 271 |
| Gly | Al a | Pro | Pro | Ser | Cys | Gin | Thr | Val | Thr | Thr | Gin | Leu | Al a | Pro | Cy s | |
| 20 | 25 | 30 | 35 | |||||||||||||
| CTA | TCG | TAC | ATT | CAA | AAT | CGT | GTT | AAG | GGC | GGT | GGC | AAT | CCA | TCA | GTA | 319 |
| Leu | Ser | Tyr | lle | Gin | Asn | Arg | Va 1 | Ly s | Gly | Gly | Gly | Asn | Pro | Ser | Val | |
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| CCT | TGT | TGT | ACC | GGT | ATA | AAT | AAC | ATA | TAT | GAA | CTC | GCT | AAA | ACC | AAA | 367 |
| Pro | Cys | Cys | Thr | Gl y | lle | Asn | Asn | lle | Tyr | Glu | Leu | Al a | Lys | Thr | Lys | |
| 55 | 60 | 65 | ||||||||||||||
| GAA | GAT | CGA | GTC | GCT | ATC | TGC | AAC | TGC | TTA | AAA | AAC | GCA | TTT | ATT | CAT | 415 |
| Glu | As p | Arg | Val | Al a | lle | Cy s | Asn | Cys | Leu | Ly s | Asn | Al a | Phe | lle | Hi s | |
| 70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
| GCT | GGA | AAT | GTC | AAT | CCC | ACC | C | 437 | ||||||||
| Al a | Gly | Asn | Val | Asn | Pro | Thr | ||||||||||
| 85 | 90 |
(2) TUDNIVALÓK A 21. SZEKVENCIÁHOZ:
(i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:
(A) HOSSZÚSÁG: 90 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (D)ALAK: lineáris (ii) MOLEKULATÍPUS: protein (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS: 21. SZEKVENCIA:
| Me t 1 | Al a | Arg | Phe | Leu 5 | Al a | Leu | Al a | Leu | Val 10 | Va 1 | lle | Al a | Leu | Ser 15 | Asn |
| Asp | Al a | Leu | Gly | Al a | Pro | Pro | Ser | Cys | Gin | Thr | Val | Thr | Thr | Gin | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Al a | Pro | Cys | Leu | Ser | Tyr | lle | Gin | Asn | Arg | Va 1 | Lys | Gly | Gly | Gly | Asn |
| 35 | 40 | 45 |
HU 220 185 Β
| Pro | Ser 50 | Val | Pro | Cy s | Cys | Thr 55 | Gly | Ile | Asn | Asn | Ile 60 | Tyr | Glu | Leu | Al a |
| Lys | Thr | Lys | Glu | As p | Arg | Val | Al a | Ile | Cys | Asn | Cy s | Leu | Ly s | Asn | Al a |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Phe | Ile | Hi s | Al a | G1 y | Asn | Val | Asn | Pro | Thr | ||||||
| 85 | 90 |
Claims (27)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Izolált nukleotidszekvencia, mely a következő portokspecifikus cDNS-szekvenciák egyike: 1. szekvencia, 3. szekvencia, 5. szekvencia, 7. szekvencia, 9. szekvencia, 11. szekvencia, 13. szekvencia, 14. szekvencia, 20. szekvencia.
- 2. Izolált genom DNS-szekvencia, mely szigorú körülmények között hibridizál az 1. igénypont szerinti egy vagy több portokspecifikus cDNS-szekvenciával.
- 3. Izolált nukleotidszekvencia, mely a 16. vagy a 18. portokspecifikus genom DNS-szekvenciák egyike.
- 4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti nukleotidszekvenciák részeivel azonos szekvenciájú izolált DNS-szekvencia, amely képes promoterként irányítani rekombináns vagy kiméra DNS-konstrukciókban az asszociált, kifejezhető és előnyösen kódoló DNS-szekvenciák portokspecifikus transzkripcióját.
- 5. Rekombináns DNS-szekvencia, amely 5’->3’ irányban a 2. vagy 3. igénypont szerinti portokspecifikus genom DNS-szekvenciából származó promoterrégióból áll és működőképesen kapcsolódik egy kifejezhető DNS-szekvenciához.
- 6. Az 5. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, amelyben a promoterrégió működőképesen kapcsolódik egy szignálszekvenciához, és az utóbbi működőképesen kapcsolódik egy kifejezhető DNS-szekvenciához.
- 7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, amelyben a kifejezhető DNS-szekvencia egy kódolószekvencia.
- 8. A 7. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, melyben a kódoló DNS-szekvencia olyan polipeptidet kódol, amely a portoksejtekben történő kifejeződésekor megakadályozza életképes pollen kialakulását.
- 9. A 8. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, ahol a kódoló DNS-szekvencia a következő polipeptidek egyikét kódolja: DTA, TURF-13, pektátliáz, ginrekombináz, iaaL és cytA toxin.
- 10. Plazmid, mely az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz.
- 11. A 10. igénypont szerinti plazmid, melyet pCIB3132 NRRL B-18977 letéti számon helyeztünk letétbe.
- 12. A 10. igénypont szerinti plazmid, melyet pCIB3178 NRRL B-18978 letéti számon helyeztünk letétbe.
- 13. A 11. igénypont szerinti plazmidból nyerhető, 4. igénypont szerinti promoterfragmentum, amely portokspecifikus módon elősegíti egy társult DNS-szekvencia kifejeződését.
- 14. A 12. igénypont szerinti plazmidból nyerhető, 4. igénypont szerinti promoterfragmentum, amely portokspecifikus módon elősegíti egy társult DNS-szekvencia kifejeződését.
- 15. Rekomináns DNS-szekvencia, amely 5’->3’ irányban a 13. vagy 14. igénypont szerinti promoterfragmentumot tartalmazza működőképesen összekapcsolva egy kifejezhető DNS-szekvenciával.
- 16. Az 5. vagy 15. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, melyben a promoterrégió működőképesen kapcsolódik egy szignálszekvenciához, és ez utóbbi működőképesen kapcsolódik egy kifejezhető DNSszekvenciához.
- 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, ahol a kifejezhető DNS-szekvencia egy kódolószekvencia.
- 18. A 17. igénypont szerinti rekombináns DNSszekvencia, ahol a kódoló DNS-szekvencia olyan polipeptidet kódol, amely a portoksejtekben történő kifejeződésekor megakadályozza életképes pollen kialakulását.
- 19. A 18. igénypont szerinti rekombináns szekvencia, ahol a kódoló DNS-szekvencia a következő polipeptidek egyikét kódolja: DTA, TURF-13, pektátliáz, ginrekombináz, iaaL vagy cytA toxin.
- 20. Gazdaszervezet, amely az 5-9. vagy 15-19. igénypont bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz.
- 21. A 20. igénypont szerinti gazdaszervezet, amely egy baktérium.
- 22. A 20. igénypont szerinti gazdaszervezet, amely egy növényi sejt.
- 23. Transzgenikus növény és utódai, amelyek az 5-7. vagy 15-17. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazzák.
- 24. Transzgenikus hímsteril növény és utódai, amelyek a 8., 9. vagy 18-19. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazzák.
- 25. A 23. vagy 24. igénypont szerinti transzgenikus növény ivaros és/vagy ivartalan utódai, amelyek az 5-9. vagy a 15-19. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmazzák, és amelyek esetében a rekombináns DNS-szekvencia a növény portokában fejeződik ki.
- 26. Eljárás rekombináns DNS-molekula előállítására, amely 5’->3’ irányban a 4. igénypont szerinti portokspecifikus promoterrégiót tartalmaz működőképesen összekapcsolva egy kifejezhető DNS-szekvenciával, azzal jellemezve, hogyi) megfelelő forrásból elkülönítjük vagy ismert módon előállítjuk a 4. igénypont szerinti promoterrégiót,HU 220 185 Β amely felelős egy hozzákapcsolódó kifejezhető DNSszekvencia portokspecifikus kifejeződéséért, és ii) ezt a portokspecifikus DNS-szekvenciát 5’—>3’ irányban működőképesen hozzákapcsoljuk egy kifejezhető DNS-szekvenciához.
- 27. Eljárás transzformált növényi anyag előállítására, ideértve a teljes növényeket, amely egy 4. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz, amelyben 5’—>3’ irányban egy portokspecifikus promoterrégió van jelen működőképesen kapcsolódva 10 egy kifejezhető DNS-szekvenciához, azzal jellemezve, hogyi) megfelelő forrásból elkülönítjük vagy ismert módon előállítjuk a 4. igénypont szerinti promoterrégiót, amely felelős egy hozzákapcsolt kifejezhető DNS-szekvencia portokspecifikus kifejeződéséért, és ii) ezt a portokspecifikus DNS-szekvenciát működőképesen hozzákapcsoljuk 5’—>3’ irányban egy kifejez5 hető DNS-szekvenciához, iii) a végeredményben kapott szerkezetet növényekben aktív kifejeződési szignálok ellenőrzése alatt egy növényi kifejeződési vektorba klónozzuk, iv) ezt a kifejeződési vektort ismert módon növényi anyagba transzformáljuk és abban kifejezzük, és adott esetbenv) az iv) lépés szerint transzformált növényi anyagot teljes és előnyösen fenotípusosan normális növénnyé regeneráljuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US90824292A | 1992-07-02 | 1992-07-02 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9301921D0 HU9301921D0 (en) | 1993-10-28 |
| HUT68406A HUT68406A (en) | 1995-06-28 |
| HU220185B true HU220185B (hu) | 2001-11-28 |
Family
ID=25425427
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9301921A HU220185B (hu) | 1992-07-02 | 1993-07-01 | Transzgénikus növények, eljárás ezek előállítására és a közreható genetikai eszközök |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5477002A (hu) |
| EP (1) | EP0578611B1 (hu) |
| AT (1) | ATE255166T1 (hu) |
| BR (1) | BR9302735A (hu) |
| CA (1) | CA2099482C (hu) |
| DE (1) | DE69333310T2 (hu) |
| ES (1) | ES2211864T3 (hu) |
| HU (1) | HU220185B (hu) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5837850A (en) * | 1994-04-21 | 1998-11-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
| US5470359A (en) * | 1994-04-21 | 1995-11-28 | Pioneer Hi-Bred Internation, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
| GB9515161D0 (en) * | 1995-07-24 | 1995-09-20 | Zeneca Ltd | Production of male sterile plants |
| US5919919A (en) * | 1996-02-06 | 1999-07-06 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By Agriculture And Agri-Food Canada | Brassica sp. gene promoter highly expressed during tapetum development |
| US6037523A (en) * | 1997-06-23 | 2000-03-14 | Pioneer Hi-Bred International | Male tissue-preferred regulatory region and method of using same |
| US7154024B2 (en) * | 1997-06-23 | 2006-12-26 | Pioneer Hi-Bred, Inc. | Male tissue-preferred regulatory sequences of Ms45 gene and method of using same |
| WO1999005281A1 (en) * | 1997-07-25 | 1999-02-04 | The University Of Melbourne | Novel nucleic acid molecules and uses therefor |
| US7135608B1 (en) * | 1997-08-28 | 2006-11-14 | The Salk Institute For Biological Studies | Site-specific recombination in eukaryotes and constructs useful therefor |
| US7303917B2 (en) | 1998-03-20 | 2007-12-04 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food Eastern Cereal & Oilseed, Research Center | Modification of pollen coat protein composition |
| US6852911B1 (en) | 1999-08-31 | 2005-02-08 | Fertiseed Ltd. | Method of producing a male sterile plant by exogenic allelism |
| US6444877B1 (en) | 1999-11-04 | 2002-09-03 | Westvaco Corporation | Liquidambar styraciflua AGAMOUS (LSAG) gene |
| US7105718B2 (en) | 2000-03-31 | 2006-09-12 | The Regents Of The University Of Colorado | Compositions and methods for regulating metabolism in plants |
| ES2164599B1 (es) | 2000-03-31 | 2003-05-16 | Consejo Superior Investigacion | Promotor y secuencias reguladoras de end1, un gen de guisante que se expresa especificamente en anteras |
| US7230168B2 (en) * | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
| CA2475485C (en) | 2002-02-26 | 2012-08-28 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| ES2265232B1 (es) * | 2004-07-17 | 2008-06-16 | Newbiotechnic, S.A. | Tomates partenocarpicos y procedimiento para su produccion. |
| US7750208B2 (en) * | 2008-07-09 | 2010-07-06 | National Taiwan University | Anther-specific expression promoter in plant and application thereof |
| US20160237449A1 (en) | 2013-09-13 | 2016-08-18 | University Of Bremen | Transgenic plants for nitrogen fixation |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990008828A2 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Paladin Hybrids Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| GB8810120D0 (en) * | 1988-04-28 | 1988-06-02 | Plant Genetic Systems Nv | Transgenic nuclear male sterile plants |
| GB8901675D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Inhibitor of gene expression |
| GB8901697D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Male flower specific gene sequences |
| US5086169A (en) * | 1989-04-20 | 1992-02-04 | The Research Foundation Of State University Of New York | Isolated pollen-specific promoter of corn |
| DE3931969A1 (de) * | 1989-09-25 | 1991-04-04 | Max Planck Gesellschaft | Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben |
-
1993
- 1993-06-24 ES ES93810455T patent/ES2211864T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-24 EP EP93810455A patent/EP0578611B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-24 DE DE69333310T patent/DE69333310T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1993-06-24 AT AT93810455T patent/ATE255166T1/de not_active IP Right Cessation
- 1993-06-30 CA CA002099482A patent/CA2099482C/en not_active Expired - Lifetime
- 1993-07-01 BR BR9302735A patent/BR9302735A/pt not_active IP Right Cessation
- 1993-07-01 HU HU9301921A patent/HU220185B/hu unknown
-
1994
- 1994-03-07 US US08/207,904 patent/US5477002A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR9302735A (pt) | 1994-02-01 |
| EP0578611A1 (en) | 1994-01-12 |
| ES2211864T3 (es) | 2004-07-16 |
| HUT68406A (en) | 1995-06-28 |
| ATE255166T1 (de) | 2003-12-15 |
| DE69333310D1 (de) | 2004-01-08 |
| HU9301921D0 (en) | 1993-10-28 |
| US5477002A (en) | 1995-12-19 |
| EP0578611B1 (en) | 2003-11-26 |
| DE69333310T2 (de) | 2004-08-26 |
| CA2099482A1 (en) | 1994-01-03 |
| CA2099482C (en) | 2007-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100278819B1 (ko) | 형질전환식물에서웅성불임성을위한가역적핵유전시스템 | |
| ES2267105T3 (es) | Sistema genetico nuclear reversible para la esterilizacion masculina de plantas transgenicas. | |
| CA2106718C (en) | Methods for the production of hybrid seed | |
| JP3727492B2 (ja) | 改変雄蕊細胞を有する植物 | |
| CA2087703C (en) | Binary cryptocytotoxic method of hybrid seed production | |
| AU718262B2 (en) | Methods and constructs for producing male sterile plants | |
| HU220185B (hu) | Transzgénikus növények, eljárás ezek előállítására és a közreható genetikai eszközök | |
| JP2000507808A (ja) | 植物における鱗翅目制御のための修飾バチルス・サーリンジェンシス遺伝子 | |
| JP3595335B2 (ja) | アブラナ亜種のタペータムに特異的なプロモーター | |
| HU228694B1 (en) | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same | |
| JP2001512988A (ja) | 条件的雌性不稔性を用いるハイブリッド種子作成の方法 | |
| JP4134281B2 (ja) | 雌しべの各組織に特異的な活性を有するプロモーターおよびその利用 | |
| WO1999043818A1 (fr) | Nouveaux fragments d'adn regissant l'expression genique predominante dans les organes des fleurs | |
| JP3952246B2 (ja) | 花粉特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 | |
| JP2945953B2 (ja) | 傷ストレス誘導性ｍａｐキナーゼおよびその遺伝子 | |
| CA2373071C (en) | Tapetum-specific promoters | |
| AU779707B2 (en) | Novel nucleic acid molecules and uses therefor | |
| KR100455620B1 (ko) | 벽판-특이적 아연 핑거 전사 인자 유전자를 이용한 화분수정률의 감소 방법 | |
| CA2297364A1 (en) | Novel nucleic acid molecules and uses therefor | |
| CA2567357A1 (en) | Anther-specific cdna sequences, genomic dna sequences and recombinant dna sequences | |
| JP2001145429A (ja) | タペート層特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 | |
| JP2007202561A (ja) | 花粉特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 | |
| JP2003319780A (ja) | 花粉特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 | |
| JP2004000197A (ja) | タペート層特異的ジンクフィンガー転写因子の遺伝子を用いて花粉稔性を低下させる方法 | |
| AU8719098A (en) | Novel nucleic acid molecules and uses therefor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: NOVARTIS AG., CH |
|
| HPC4 | Succession in title of patentee |
Owner name: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG, CH |