DE3931969A1

DE3931969A1 - Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben

Info

Publication number: DE3931969A1
Application number: DE3931969A
Authority: DE
Inventors: Juergen Dipl Biol Logemann; Jeff Prof Schell; Barbara Dr Siebertz
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1989-09-25
Filing date: 1989-09-25
Publication date: 1991-04-04
Also published as: JPH03228684A; HUT57828A; AU6314090A; KR910006488A; EP0420819A1; IL95751A0; MA21956A1; IE903427A1; AP9000207A0; AP181A; HU905930D0; DE3931969C2; ZA907656B; CA2026049A1

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, ein wun1-Gen mit gestutztem Promotor sowie die Verwendung derselben.

Die Erzeugung von männlich sterilen Kulturpflanzen ist seit langem von wirtschaftlichem Interesse, da dadurch die bei vielen Pflanzenspezies verbreitete Selbstbestäubung verhindert werden könnte, die vor allem Züchter bei der Herstellung neuer Sorten behindert.

Ein wichtiger Punkt ist ferner die Herstellung von Hybridsamen. Viele Kulturpflanzen, wie z. B. Getreide oder Tomaten, werden als Hybridsamen verkauft. Die Herstellung dieser Hybridsamen wird durch die männliche Sterilität eines der beiden Kreuzungspartner wesentlich vereinfacht. Es sind bereits Kulturpflanzen mit einer durch Züchtung erzeugten männlichen Sterilität bekannt. Der Erhalt dieser Pflanzen ist jedoch kompliziert.

Aus den Literaturstellen The Plant Cell, Bd. 1, 1989, S. 151-158; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 1136-1140, Fbr. 1988, sowie der DE-OS 38 37 752 ist ein aus Solanum tuberosum isoliertes, als "wun1-Gen" bezeichnetes Gen mit einer DNA-Sequenz bekannt, dessen Verwendung in höheren Pflanzen bei Verwundung oder pathogenem Befall zur Expression von Genprodukten führt. Es konnte gezeigt werden, daß im Falle des "wun1-Gens" ein 1022 bp langer Promotorbereich (+179 bp wun1 5′ untranslatierter Bereich) seine verwundungsinduzierbare Aktivität auch dann beibehält, wenn der eigentliche Strukturgen-Bereich durch ein anderes Strukturgen (wie z. B. CAT, GUS) ersetzt wird. Auf diese Weise konnte eine verwundungsinduzierbare wun1-Promotoraktivität in Blatt, Stengel und Wurzel von transgenen Tabakpflanzen nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zur DE-OS 38 37 752, die sich mit einer verwundungsstimulierten DNA-Sequenz und ihrer Verwendung befaßt, betrifft die vorliegende Erfindung eine antherenspezifisch exprimierte DNA-Sequenz und ihre Verwendung. Es wurde eine DNA-Sequenz aufgefunden, die es ermöglicht, mit ihr fusionierte Strukturgene spezifisch in Antheren zu exprimieren.

Es wurde gefunden, daß man das aus den im Vorstehen angegebenen Literaturstellen bekannte wun1-Gen nicht nur als verletzungs- und/oder infektionsinduzierte DNA-Sequenz verwenden kann, sondern daß man, wenn man den Promotor des wun1-Gens stutzt, zu einer antherenspezifisch exprimierten DNA-Sequenz gelangt. Der für diese Merkmalsausprägung notwendige Bereich erstreckt sich über 1201 Basenpaare (bp) (1022 (bp) des wun1-Promotors +179 bp des 5′ untranslatierten Bereichs). Verkürzt man den 1201 Basenpaar langen Bereich, indem man 451 bp des wun1-Promotors am 5′Ende entfernt, so ist dieser gestutzte Promotor nur noch in den Antheren von Blüten aktiv. Dies läßt sich mit einem farblichen Nachweisgen beweisen, was man an den gestutzten Promotor hängt. Man findet die Nachweisfärbung in keinem Teil der Pflanze mit Ausnahme in den Pollen und Stomium von Antheren.

Entfernt man somit am 5′-Ende des wun1-Promotors beispielsweise 451 bp (-571wun1-GUS) und testet diesen gekappten Promotor z. B. in transgenen Tabakpflanzen, so findet man keine Aktivität mehr in verwundeten oder unverwundeten Blättern, Stengeln und in Wurzeln. Die Aktivität in den Antheren bleibt jedoch fast gleich stark erhalten.

Das gleiche Expressionsverhalten findet man auch bei noch kleineren wun1-Promotor-Fragmenten (-86wun1-GUS), allerdings ist hier die GUS-Aktivität etwa 2fach schwächer als bei -571wun1-GUS Antheren.

Eine gentechnologisch erzeugte Sterilität hat den Vorteil, daß durch den Einbau eines definierten Gens in das Erbgut einer Pflanze die übrigen Eigenschaften der Pflanze nicht verändert würden. Dies gilt insbesondere für Tomaten, die genetisch relativ gut handhabbar (gewebekulturtauglich und transformierbar) sind, jedoch auch für andere Kulturpflanzen.

Durch die Verwendung von antherenspezifisch aktiven Promotoren gelingt es somit, über einen gentechnologischen Ansatz männliche Sterilität zu erhalten. Diese Promotoren ermöglichen es, Genprodukte (Proteine) nur in den Antheren (männliches Fortpflanzungsorgan der Pflanze) zu produzieren, während diese Genprodukte in allen anderen Geweben nicht, oder nur in sehr geringem Maße aufzufinden sind. Handelt es sich bei dem Genprodukt um ein Protein, das z. B. die Pflanzenzellphysiologie inaktiviert, so hat dies die spezifische Inaktivierung der Antheren zur Folge.

Im Folgenden soll gezeigt werden, daß Deletionen des wun1-Promotors, der aus den aufgeführten Literaturstellen bekannt ist, zu antherenspezifischen Expressionen führen. Die verwendeten Materialien und angewandten Methoden entsprechen weitestgehend den Materialien und Methoden, die in der DE-OS 38 37 752 angegeben sind.

In den Figuren sind dargestellt in:

Fig. 1: Anordnung von wun1 in dem genomischen Klon wun1-85. Auf dem 4 Kb großen EcoRI Fragment des genomischen Klons wun1-85 sind 1,0 Kb des wun1-Promotors, 0,8 Kb des wun1-Gens sowie 2,0 Kb des 3′ Endes vorhanden. Dieses 4 Kb Fragment wurde in die EcoRI Schnittstelle von pUC8 kloniert (pLSOOO).

Fig. 2: Deletionsanalyse des wun1-genomischen Klons wun1-85. Aufgrund der asymmetrischen XhoI Schnittstelle im genomischen Klon wun1-85 konnte das 4 Kb Fragment in beiden Orientierungen in M13mp18 nachgewiesen werden (85MP18; 85*MP18). Durch sukzessiven Verdau mit ExonukleaseIII wurden verschieden große DNA-Fragmente erhalten.

Fig. 3: Bestimmung der Größe des S1 geschützten Fragments. Die Hybridisierung des 5′ von der XhoI Schnittstelle gelegenen Bereichs aus plSOOO mit wun1-mRNA führt zu einem 162-179 bp langen DNA-RNA Hybrid (TU), das vor der einzelstrangspezifischen S1 Nuklease geschützt ist. Der tatsächliche Transkriptionsstart liegt also 162-197 Bp 5′ von der XhoI Schnittstelle entfernt (A; C; G; T = Sequenzauftragung zur Größenbestimmung des DNA-Fragments).

Fig. 4: Nukleotidsequenz des wun1-Gens aus wun1-85 CAAT-Box, TATA-Box und PolyA-Signal sind schwarz unterlegt. Der Transkriptionsstart bwz. -stop ist durch einen Pfeil markiert.

Fig. 5: Anordnung und Position wichtiger Bereiche im wun1-Gen. Der wun1-Promotor ist schwarz markiert, das wun1-Gen schraffiert. Wichtige Erkennungssequenzen sind eingerahmt; die mRNA ist durch eine geschlängelte Linie, der proteinkodierende Bereich durch Kreuze wiedergegeben. Die Größe der einzelnen Bereiche ist in (bp) angegeben.

Fig. 6: Konstruktion von wun1-GUS 5′ Deletionen für Expressionsuntersuchungen in stabilen Tabaktransformanten. Zwischen der linken und der rechten T-DNA Grenzsequenz des Vektors pPR69 liegt ein NPT II-Gen unter der Kontrolle des Nopalin-Synthase Promotors (nos). Er ist notwendig für die Selektion auf Kanamycin. Das GUS-Gen trägt eine nos-Terminatorsequenz und wird durch die verschiedenen 5′Deletionsfragmente des wun1-Promotors reguliert. Die Endpositionen der jeweiligen 5′Deletionsfragmente sind neben der jeweiligen Konstruktion angegeben. R = Klonierung des Promotors in umgekehrter Orientierung.

Fig. 7: Tabakblätter transgenischer Pflanzen aus dem Gewächshaus wurden auf ihre GUS-Aktivität, in Abhängigkeit der verschiedenen 5′Promotorelemente analysiert. Die Einheit pmol MU/mg Protein/min auf der Abszisse gibt die Enzymaktivität an. Die Ordinate zeigt jeweils 3 von 6-12 verschiedenen getesteten Pflanzen. Diese Pflanzen reflektieren die höchste, die mittlere und die niedrigste Aktivität der jeweils getesteten Pflanzen, nach einer Verwundung.

Fig. 8: Keimende Pollen der Konstruktion pLSO34-571. Die Blaufärbung im Pollen und im Pollenschlauch zeigt den Ort der Enzymtätigkeit an.

Material und Methoden

Dabei wird auf die folgenden Literaturstellen verwiesen:

(1) Ansorge, W., De Mayer, L. (1980). Thermally stabalized very thin (0.02-0.3 mm) polyacrylamide gels für electrophoresis. J. Chromatogr., 202:45-53.
(2) Ansorge, W., Barker, R. (1984). System for DNA sequencing with resolution of up to 600 base pairs. J. Biochem. Biophys. Meth., 9:33-47.
(3) Bedbrook, J. (1981). A plant nuclear DNA preparation procedure. PMB Newsletter II, 24.
(4) Benoist, C., O′Hare, K., Breathnach, R., Chambon, P. (1980). The ovalbumin gene sequence of putative control regions. Nucl. Acids. Res., 8:127-142.
(5) Benton, W. D. und Davis, R. W. (1977). Screening Lambda gt recombinant clones by hybridization to single plaques in situ. Science, 196:180.
(6) Berk, A. and Sharp, P. A. (1978). Spliced early mRNAs of SV40. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:1274-1278.
(7) Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucl. Acids. Res. 12:8711-8721.
(8) Ebert, P. R., HA, S. B., An, G. (1987). Identification of an essential upstream element in the nopalin synthase promoter by stable and transient assays. Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749.
(9) Fickett, F. W. (1982). Recognition of protein coding regions in DNA sequences. Nucl. Ac. Res., 10:5303-5318.
(10) Frischauf, A. M., Lehrach, H., Poustka, A. and Murray, N. (1983). Lambda replacment vectors carrying ploylinker sequences. J. Mol. Biol., 170:827-842.
(11) Henikoff, S. (1984). Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints for DNA sequencing. Gene, 28:351-359.
(12) Hoekema, A., Hirsch, P., Hoykaas, P., Schilperoort, R. (1983). A binary plant vector strategy based on separation o vir- and T-region of A. tumefaciens. Nature 303:179-180.
(13) Hohn, B. and Murray, K. (1977). Packaging recombinant DNA molecules into bacteriophage particles in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:3259-3263.
(14) Jefferson, R. A. (1987). Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405.
(15) Joshi, C. P. (1987). An inspection of the domain between putative TATA box and translation start side in 79 plant genes. Nucl. Acids. Res. 15:6643-6653.
(16) Lehrach, H., Diamond, D., Wozney, J. M. and Boedtker, H. (1977). RNA molecular weight determinations by gel electrophoresis under denaturing conditions, a critical reexamintion. Biochemistry, 16:4743.
(17) Lipphardt, S. (1988). Dissertation an der Universität zu Köln.
(18) Logemann, J., Schell, J. and Willmitzer, L. (1987). Improved method for the isolation of RNA from plant tissues. Anal. Biochem., 163:16-20.
(19) Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. (1982). Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, New York.
(20) Messing, J., Geraghty, D., Hu, N. T., Kridl, J. and Rubenstein, I. (1983). Plant Gene Structure. In: Kosuge, F., Meredith, C. P., Hollaender, A. (eds.). Genetic engineering of plants. Plenum Press, New York: 211-227.
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(22) Murray, M. G., Thompson, W. F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl. Acids. Res. 8:4321-4325.
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(24) Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, AR. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74-5463-5467.
(25) Southern, E. M. (1975). Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol., 98:503-517.
(26) Van Houte, E., Joos, H., Maes, M., Warren, G., Van Montagu, M., Schell, J. (1983). Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: a novel strategy for reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium tumefaciens. EMBO J., 2:411-418.
(27) Vieira, J., Messing, J. (1982). The puc plasmid, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19:259-268.
(28) Wassenegger, M. (1988). Dissertation an der Universität zu Köln.
(29) Willmitzer, L., Schmalenbach, W. and Schell, J. (1982). Transcription of T-DNA in octopine and nopaline crown gall tumours is inhibited by low concentration of alfa-amanitin Nucl. Acids Res., 9:19.
(30) Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequencing of the M13mp18 and puc19 vectors. Gene 33:103-109.
(31) Zambrisky, P., Joos, J., Genetello, C., Leemans, J., Van Montagu, M., Schell, J. (1983). Ti-Plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal capacity. EMBO J., 1:147-152.

Material Medien

Die zur Anzucht von Bakterien verwendeten Medien wurden den Angaben von Maniatis et al. (1982) entnommen.

Pflanzenmedien

Die benutzten Medien leiten sich von dem von Murashige und Skoog (1962) angegebenen Medien (MS) ab.

3MS: MS + 3% Saccharose
3MSC: MS + 3% Saccharose, 500 µg/ml Claforan
MSC10: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 0,2 µg/ml NAA, 1 µg/ml BAP, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MSC15: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MS15: MS + 2% Saccharose, 100 µg/ml Kanamycinsulfat

Für festes Medium wurden zusätzlich 8 g/l Bacto-Agar zugegeben.

Stämme und Vektoren E. coli-Stämme

BMH 71-18: (lac-proAB), thi, supE; F′ (laci^q, ZdeltaM15, proA⁺B⁺) (Messing et al. 1977)
C 600: = CR34 (Maniatis et al., 1982)
Agrobakterien-Stämme: LBA 4404: (Hoekema et al., 1983)
Plasmide: pUC8 (Vieira und Messing, 1982)
pPR69 (ein Derivat des bin 19, Bevan 1984)
Phagen: EMBL4 (Frischauf et al., 1983)
M13mp18 (Yanisch-Perron et al., 1985)
M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985)
Pflanzen: Solanum tuberosum AM 80/5793 (haploid)
Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W83)

Methoden

Alle molekularbiologischen Standard-Methoden, wie z. B. Restriktionsanalyse, Plasmidisolierung, Minipräparation von Plasmid-DNA, Transformation von Bakterien usw. sind, sofern nicht anders angegeben, wie bei Masniatis et al., (1982) beschrieben, durchgeführt worden.

RNA-Isolierung

Die Isolierung von RNA aus verschiedenen Organen der Kartoffel und des Tabaks wurden wie bei Logemann et al., (1987) beschrieben, durchgeführt.

"Northern-Blot" Analyse

Die RNA wurde auf einem 1,5%igen Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (Lehrach et al., (1977)). Wie bei Willmitzer et al., (1982) beschrieben, wurde anschließend die RNA auf Nitrozellulose transferiert, fixiert und gegen ³²P radioaktiv markierte cDNA hybridiert, gewaschen und exponiert.

DNA-Isolierung

Nukleäre DNA wurde nach der Methode von Bedbrook (1981) aus Kartoffelblättern gewonnen und für die Klonierung in Lambda-Phagen EMBL4 verwandt. DNA aus transformierten Gewebe wurde nach dem kombinierten Aufbruch mit Triton X 100, SDS, und Proteinase K (Wassenegger, 1988) gereinigt.

"Southern-Blot" Analyse

DNA wurde auf 0,8 bis 1,2%igen Agarose-Gelen elektrophoretisch getrennt, auf Nitrocellulose transferiert und fixiert (Southern, 1975), sowie hybridiert und gewaschen wie bei Willmitzer et al., (1982) beschrieben.

Erstellen und Untersuchen einer genomischen Bank Isolierung der genomischen DNA

Als genomische Kartoffel-DNA diente nach der Methode von Bedbrook, 1981, isolierte Blatt-DNA der haploiden Linie AM 80/5793. Diese DNA wurde vollständig mit EcoRI verdaut.

Isolierung der Phagen-DNA

EMBL4 DNA wurde mit EcoRI in drei Fragmente zerschnitten, wobei über gelektrophoretische Auftrennung mit anschließender Fragmentisolierung die beiden Vektor-Arme von dem Mittelfragment getrennt werden konnten. Zusätzlich wurden auch kommerziell erhältliche und gereinigte EMBL4-Arme verwandt (Amersham).

Ligation und Verpackung

Nach erfolgter Ligation der EMBL4-Arme mit der EcoRI verdauen genomischen DNA wurde die ligierte, hochmolekulare DNA in vitro in Phagenköpfe verpackt (Hohn und Murray, 1977; Hohn, 1979). Das Verpackungsmaterial stammt aus einem "Lambda in vitro packaging kit" der Firma Amersham. Die genomische Bank wurde mit einer Konzentration von 25 000 plaques pro Platte (25 × 25 cm) ausplattiert.

Plaquehybridisierung

Das Auffinden cDNA homologer Lambda Klone erfolgte durch Plaquehybridisierung nach Benton und Davies (1977) mittels radioaktiv markierter cDNA. Positiv hybridisierende Plaques wurden vereinzelt und nochmalig getestet.

DNA-Präparation rekombinanter Phagen

20 ml einer C600 lysierten Bakterienkultur werden mit Chloroform versetzt, um nach anschließender Zentrifugation einen bakterienfreien Überstand zu erhalten. Das Sedimentieren der Phagen aus dem Überstand gelingt durch 4stündiges Zentrifugieren bei 10 000 rpm. Das Phagen-Sediment wird in 500 µl Phagen-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂) aufgenommen und mit DNase und RNase behandelt. Nach der Extraktion der DNA durch mehrmaliges Phenolisieren wird die Phagen-DNA EtOH-präzipitiert, mit 70%igen EtOH gewaschen und inTE aufgenommen.

Erzeugung von Deletionsmutanten nach Exonuklease-III Behandlung (Henikoff et al., 1984)

Das zu untersuchende Fragment wurde in beiden Orientierungen in M13mp19 kloniert. Da die Exonuclease III 5′ überstehende Enden abverdaut, jedoch 3′ überstehende Enden verschont, wurden 20 µg der zu analysierenden DNA mit zwei Restriktionsenzymen verdaut, die auf einer Seite des klonierten Fragments ein 5′ und ein 3′ Ende erzeugten. Da das 5′Ende dem Fragment zugewandt war, konnte eine Exonuclease-Verdauung in das Fragment hinein erfolgen. Durch sukzessives Stoppen dieser Reaktion konnten jeweils 200 bp kleinere Fragmente isoliert werden, deren überstehenden Enden durch eine nachfolgende S1-Behandlung in ligierbare glatte Enden umgewandelt wurden. Zuletzt folgte die Transformation dieser DNA in BMH 7118 Zellen mit anschließender Einzelstrang DNA Isolierung.

Sequenzierung

Die Sequenzierung von Einzelstrang DNA wurde nach der Kettenabbruch-Methode von Sanger et al., (1977) durchgeführt. Die Auftrennung der Reaktionsansätze erfolgte auf 6- und 8%igen Sequenzgelen (Ansorge und de Mäyer, 1980; Ansorge und Barker, 1984).

S1-Analyse

Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes wurde nach Berk und Sharp (1987) durchgeführt. Dazu wurde aus dem Plasmid pLS000 mit EcoRI und XhoI das 1,2 kb Fragment isoliert und durch Behandlung mit Phosphatase dephosphoryliert. Anschließend erfolgte eine radioaktive Markierung der 5′ OH Enden durch die Kombination von Polynukleotidkinase und y-³²P-ATP. Nach Denaturierung der DNA-Fragmente wurden diese mit 50 µg Gesamt-RNA hybridisiert (Hybridisierungspuffer: 80% Formamid, 0,4 M NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4 und 1 mM EDTA. Diese Bedingung begünstigt RNA-DNA-Hybride im Vergleich zu DNA-DNA-Hybriden (Casey und Davidson, 1977). Die Hybridisierungstemperatur beginnt bei 80°C und wird über Nacht auf 40°C gesenkt. Eine anschließende S1-Nuklease Verdauung (120 U/ml) entfernt ungepaarte Stränge. Es wurde erwartet, daß die im 5′ untranslatierten Bereich des wun1 Gens gelegene und radioaktiv markierte XhoI Schnittstelle durch ihre Homologie zur mRNA geschützt ist. Zuletzt wird der S1 geschützte DNA-Strang auf einem Sequenzgel elektrophoretisch aufgetrennt, wobei als Längenvergleich die Sequenz eines bekannten DNA-Fragment dient.

DNA Transfer in Agrobakterien Transformation

Die in E. coli klonierte DNA wurde nach der von Van Haute et al., (1983) beschriebene Methode durch Konjugation nach A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983) transferiert.

DNA-Analyse

Die Überprüfung des DNA Transfers in das Agrobacterium erfolgte durch die Isolierung von Agrobakterien DNA nach der von Ebert et al. (1987) geschilderten Methode. Restriktionsspaltung der DNA, der Transfer auf Nitrocellulose und die Hybridisierung gegen die entsprechende radioaktive Sonde gaben Aufschluß über einen erfolgreichen DNA Transfer ins Agrobacterium.

Transformation von Tabak Anzucht der Agrobakterien

Die zur Infektion benötigten Agrobakterien LBA4404_Km wurden in selektivem Antibiotika-Medium angezogen (Zambrisky et al., 1983), durch Zentrifugation sedimentiert und in YEB-Medium ohne Antibiotika gewaschen. Nach erneuter Sedimentation und Aufnahme in 3MS-Medium konnten die Bakterien zur Infektion verwandt werden.

Blattscheiben-Infektion

Für die Blattscheiben-Infektion wurden sterile Blätter der Tabaklinien SNN und W38 verwendet. Etwa 1 cm große Blattstücke, in die wie oben beschriebene Agrobakteriensuspension eingetaucht, mit anschließender Überführung auf 3MS-Medium. Nach 2tägiger Inkubation bei 16 Stunden Licht und 25°C bis 27°C wurden die Blattstücke mehrmals in flüssigem 3MS-Medium gewaschen und auf 3MSC-Medium überführt. Nach 4-6 Wochen erscheinende Sprosse wurde abgeschnitten und auf 2MSC-Medium inkubiert.

Analyse der transformierten Pflanzen Isolierung genomischer DNA

Aus den Pflanzen wird die DNA nach einer abgewandelten Methode von Murray und Thompson (1980) isoliert, mit Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem Gel aufgetrennt. Nach dem Transfer dieser DNA auf Nitrocellulose wird sie mit einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die Anwesenheit dieser spezifischen DNA im Genom der untersuchten Pflanze anzeigt.

Nachweis von GUS-Aktivität

Aus der Transformation regenerierte Pflanzen werden nach der Methode von Jefferson (1987) auf die Stärke der Aktivität des Enzyms β-Glucuronidase (GUS) untersucht. Ein zusätzlicher histochemischer Test (Jefferson, 1987) zeigt die Lokalisation im Gewebe an. Dazu werden Dünnschnitte der Pflanzen mit dem Substrat X-Gluc, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Glucuronid, inkubiert. Am Ort der Enzymaktivität bildet sich ein blaues Präzipitat.

Ergebnisse Erstellen einer genomischen Bank aus einer haploiden Kartoffel

Die geringe Anzahl an wun1-mRNA codierenden und exprimierenden Genen in Genom der haploiden Kartoffellinie AM80/5793 sowie die Tatsache, daß aufgrund der "Southern-Blot" Analyse (Fig. 4) mit der Präsenz des vollständigen Gens auf einem EcoRI Fragment zu rechnen ist, führten dazu, aus EcoRI totalverdauter genomischer DNA eine genomische Bank anzulegen.

10 µg EcoRI geschnittene DNA aus AM80/5793 wurden mit EcoRI geschnittenen EMBL4-Armen ligiert und auf einem C600 Bakterienrasen ausplattiert. Ca. 500 000 Plaques wurden erhalten, die statisch gesehen das Genom der Kartoffel repräsentieren sollten.

Identifizierung wun1 homologer EMBL4-Klone

Nach dem Transfer dieser Plaques auf Nitrozellulose konnte durch Plaquehybridisierungstechniken gegen radioaktiv markierte wun1-cDNA zwei genomische Klone (wun1-22 und wun1-85), identifiziert und gereinigt werden.

Die Isolierung von rekombinanter EMBL4 DNA aus wun1-22, wun1-85 sowie deren Restriktionskartierung und Hybridisierung gegen radioaktive wun1-cDNA ergab folgende Daten:

Das wun1-cDNA äquivalente Fragment in wun1-85 hat eine Größe von 4 Kb. Es entspricht damit exakt mit der mit wun1-cDNA hybridisierenden Fragmentgröße EcoRI verdauter DNA aus der haploiden Kartoffel. Aufgrund der asymmetrischen XhoI-Schnittstelle im 5′ Bereich des cDNA-Klons, und der Verwendung radioaktiver cDNA-Proben die nur den 5′ Bereich des cDNA-Klones abdecken, konnte die Orientierung des Gens in dem 4 Kb Fragment ermittelt werden. Demnach liegt vor dem wun1-Gen ein ca. 1 Kb großer Promotorenbereich, während sich 3′ vom Gen ein ca. 2 Kb nicht homologer Teil befindet (Fig. 5). Das zusätzlich in wun1-85 enthaltene 8 Kb große EcoRI Fragment konnte nicht zur näheren Analyse des wun1-Gens herangezogen werden. Aufgrund des Totalverdaus der Kartoffel-DNA mit EcoRI ist es wahrscheinlich, daß bei der anschließenden Ligation zwei nicht zusammengehörige Fragmente in den EMBL4-Vektor gebracht wurden, also auch nicht in funktionelle Beziehung zueinander gebracht werden können.

Sequenzanalyse des genomischen Klons wun1-85

Im folgenden wurde die genomische Analyse des wun1 kodierenden Gens durchgeführt. Da im Restriktionsverhalten keine Unterschiede zwischen wun1-85 und wun1-22 festgestellt wurden, wurde zur weiteren Analyse das 4 Kb Fragment von wun1-85 in EcoRI geschnittenen pUC8 ligiert (Fig. 5). Zur Sequenzierung des wun1-Promotors sowie des wun1-Gens erfolgte eine weitere Umklonierungen des 4 Kb Fragments in die EcoRI Schnittstelle von M13mp18. Die Bestimmung seiner Orientierung wurde mittels Kontrollverdauungen an der asymmetrisch gelegenen XhoI Schnittstelle durchgeführt. Die Klone 85*mp18 und 85mp18 repräsentieren beide Orientierungen des Fragments (Fig. 6). Das Schneiden dieser Plasmide mit SphI und XbaI ermöglichte es, mit Hilfe der ExonukleaseIII beim Klon 85mp18 das 3′ Ende des wun1-Gens und beim Klon 85*mp18 das 5′ Ende des wun1-Gens sukzessive abzudauen.

Daraus resultierende Deletionsklone mit unterschiedlichen Fragmentgrößen wurden für die Sequenzierung benutzt. Insgesamt gelangt es, das gesamte wun1-Gen bidirektional zu Sequenzieren, sowie zusätzlich ca. 400 bp des 3′ Endes unidirektional zu analysieren (Fig. 9).

Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes

Zur Identifikation des genauen Transkriptionsstarts des wun1-Gens wurde die Methode der S1 Nuklease Kartierung benutzt. Das Prinzip dieser Methode basiert darauf, daß durch eine Hybridisierung von Einzelstrang DNA aus dem 5′ Bereich des wun1-Gens mit wun1-mRNA nur die Bereiche vor einem Abbau der einzelstrangspezifischen Nuklease S1 geschützt sind, die aufgrund ihrer Homologie einen Doppelstrang ausbilden können. Die Größe des geschützten DNA Fragments kann auf einem Sequenzgel ermittelt werden und somit der Transkriptionsstart zurückverfolgt werden.

Mit Hilfe der Schnittstelle XhoI und EcoRI wurde aus pLS000 ein 1,1 Kb Fragment isoliert, das den Promotor und Teile des 5′ untranslatierten Bereich des wun1-Gens beinhaltet. Dieses Fragment wurde mit Polynukleotidkinase an dem 5′ Ende der XhoI Stelle mit ³²P radioaktiv markiert und gegen 50 µg Gesamt-RNA aus verwundeten Kartoffelknollen hybridisiert. Nach S1-Behandlung des Hybrids wurde die Größe des geschützten Fragments auf einem Sequenzgel ermittelt; sie variiert zwischen 162-179 bp (Abb. 8). Geht man von dem längsten Fragment aus, so beginnt der Transkriptionsstart 179 bp stromaufwärts von der XhoI Stelle, d. h. mit der Sequenz ACCATAC. Diese Sequenz stimmt im zentralen Bereich (CAT) mit der von Joshi et al., 1987 ermittelten Konsensussequenz für Transkriptionsstart CTCATCA überein. Aus der Position des Transkritionsstarts ergeben sich weitere Informationen (Abb. 9, 10):

1. In Position -33, gesehen vom Transkriptionsstart, ist eine TATA-Box CTATATATT zu finden, die gut mit der von Joshi et al., 1987 ermittelten Konsensussequenz TCACTATATATAG übereinstimmt.
2. Die von Benoist et al., 1980, beschriebene CAAT-Box im Bereich zwischen -60 und -80 ist im wun1-Promotor an Position -58 (CAAACT) zu finden.
3. Der 5′ untranslatierte Bereich des wun1-Gens erstreckt sich über 217 bp und ist damit verhältnismäßig groß.
4. Das wun1-mRNA kodierende Gen umfaßt somit 794 bp, was sehr genau der Größenbestimmung von wun1-mRNA aufgrund der "Northern-Blot" Analysen entspricht.
5. Dem cDNA-Klon wun1-25A2 fehlen 97 bp des 5′ untranslatierten Bereichs im wun1-Gen.
6. Neben den bereits im cDNA-Klon ermittelten offenen Leserastern, können keine weiteren im 5′untranslatierten Bereich des genomischen Klons gefunden werden.
7. Das wun1-Gen verfügt über keine Introns.

Erstellung der Derivate des Vektors pPR69

Die durch Exonuclease III erzeugten Promoterdeletionsfragmente mit den Endpunkten -571 bp, -111 bp und -86 bp, sowie der Promoter bis zum Bereich -1022 bp im 5′ gelegenen Bereich wurden in den Vektor pPR69 umkloniert. Zur gerichteten Umklonierung wurden die Deletionsfragmente über die XhoI-Schnittstelle aus M13mp18 ausgeschnitten. Zur Herstellung der Kontrolle, die den Vektor in umgekehrter Orientierung trägt, wurden die 5′ überhängenden Enden der Schnittstellen durch das Klenowfragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und in den Vektor kloniert. Die Aufnahme der Deletionsfragmente im Vektor wurde über Hybridisierung gegen eine radioaktiv markierte wun1-Promoterprobe, sowie über Restriktionsanalyse getestet.

Stabile Transformation und Analyse von wun1-GUS in Tabak

Verschiedene wun1-Promotor-Deletionen wurden in transgenen Pflanzen bezüglich ihrer Organspezifität und ihrer Wundinduzierbarkeit getestet. Dazu wurden die Plasmide pLS034-1022, -571, -111, -89, -1022R in den Agrobakterienstamm LBA4404 transformiert. Diese Agrobakterien wurden nun über die Methode der Blattscheibeninfektion zur Transformation der Tabaksorte Wisconsin 38 (W38) benutzt. Unter Kanamycin-Selektion wurden entstehende Kalli zur Pflanze regeneriert und auf Southern-Ebene auf korrekte Integration der pLS034-DNA ins Pflanzengenom untersucht.

Die funktionelle Analyse der transgenen Tabakpflanzen erstreckte sich auf den Nachweis von GUS-Aktivität in Gewächshauspflanzen.

Dazu wurden unabhängige Transformanten der verschiedenen Konstruktionen auf ihre GUS-Aktivität in unterschiedlichen Geweben analysiert. Nicht-transformierte Tabakpflanzen dienten als Kontrolle (K).

Ein Vergleich der Gusaktivität in Tabakblättern zeigte eine geringe Aktivität für Pflanzen der Konstruktion pLS034-86, -111 und pLS034-1022R, die im Bereich der Aktivität von Kontrollpflanzen lag. Die GUS-Aktivität von pLS034-571 ist im Vergleich zu diesen ca. 4fach höher. Während die Aktivität des ganzen Promoters 13 bis 370fach stärker ist als die der kürzesten Konstruktion (pLS034-86), s. Fig. 7.

Über die histochemische in-situ Analyse wurde die Aktivität des Enzyms in verschiedenen Geweben der Pflanze analysiert. Dazu wurden Dünnschnitte des Gewebes mit dem Substrat des Enzyms, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Glucuronid (X-Gluc) über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am Ort der Enzymaktivität bildet sich ein blaues Präzipitat. Die Analyse ergab, daß in Pflanzen der Konstruktionen pLS034-86, -111, -571 und -1022R keine Aktivität in Blättern, Stamm oder Wurzel nachweisbar ist.

Pflanzen, die den vollen wun1-Promotor in der Konstruktion tragen, zeigen Aktivität in allen genannten Geweben. Ein anderes Bild ergab sich bei der Analyse der Blüten. Hier zeigten alle Transformanten GUS-Aktivität, die sich nur in ihrer Intensität unterschied. In Blütenquerschnitten mit den verschiedenen Konstruktionen zeigte sich folgende Verteilung der Enzymaktivität: Pflanzen der Konstruktion pLS034-1022 zeigten GUS-Aktivität im Stomium der Antheren, sowie in den Pollenkörnern. 30% der Pollenkörner zeigten nach Inkubation mit X-Gluc Blaufärbung. Antheren von pLS034-571 und-86 zeigten das gleiche Muster der Aktivität jedoch mit geringerer Intensität. In Kontrollpflanzen, wie auch in Pflanzen der Konstruktion pLS034-111 und pLS034-1022R ließ sich keine Blaufärbung im Stomium nachweisen, die Färbung der Pollenkörner reduzierte sich auf 0.75% (Fig. 8).

Ein Vergleich der gemessenen GUS-Aktivitäten von Antheren der veschiedenen Konstruktionen zeigte eine 2-10fach stärkere Aktivität von pLS034-1022 gegenüber pLS034-571. Die mittlere Aktivität des vollen Promotors erreichte in Antheren eine Enzymaktivität von 1276 pmol MU/mg/min. Antheren der Konstruktion pLS034-571 zeigten eine 2fach höhere Aktivität als Antheren von pLS034-86. Die mittleren Enzymaktivitäten liegen bei 217 pmol MU/mg/min, beziehungsweise 97 pmol MU/mg/min.

Bekanntlich ist der 35S-Promotor aus Cauliflower Mosaik Virus in Antheren aktiv. Seine Aktivität liegt bei 500 pmol MU/mg/min. Da es sich bei dem 35S-Promotor des CaMV um einen starken, in Pflanzen aktiven Promotor handelt, lassen sich die Deletionsfragmente des wun1-Promotors durchaus in diesen Aktivitätsbereich einreihen.

Claims

1. DNA-Sequenz, die bei Pflanzen eine antherenspezifische Expression bewirkt.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 aus Solanum tuberosum.

3. DNA-Sequenz nach Ansprüchen 1 und 2, mit einem bp-Bereich von -571 bis +179 des wun1-Promotors bzw. wun1-Gens.

4. Wun1-Gen, dessen Promotorteil am 5′-Ende um so viele bp verkürzt worden ist, daß es von der ursprünglich vorhandenen verwundungsinduzierbaren Aktivität und Antherenaktivität nur noch die Antherenaktivität aufweist.

5. Wun1-Gen nach Anspruch 4, dessen Promotorteil um so viele bp verkürzt worden ist, daß dieses höchstens noch 571 bp aufweist.

6. Verwendung der DNA-Sequenz nach Ansprüchen 3, 4 und 5 zur Erzeugung männlicher Sterilität bei Kulturpflanzen, insbesondere bei Getreide, Tomaten, Kartoffeln und Tabak.

7. DNA-Übertragungsvektoren mit insertierter DNA-Sequenz nach Ansprüche 3 und 4.

8. DNA-Übertragungsvektoren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß er den Promotorteil oder seine aktiven Bereiche in Verbindung mit einem Strukturgenteil enthält, das von dem Strukturgenteil des wun1-Gens verschieden ist.

9. Pflanzen oder Pflanzenmaterial enthaltend eine DNA-Sequenz nach Ansprüchen 3 und 4.