DE3931969A1 - Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselben - Google Patents
Dna-sequenz, wunl-gen mit gestutztem promotor sowie verwendung derselbenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft eine DNA-Sequenz, ein wun1-Gen mit gestutztem
Promotor sowie die Verwendung derselben.
Die Erzeugung von männlich sterilen Kulturpflanzen ist seit
langem von wirtschaftlichem Interesse, da dadurch die bei vielen
Pflanzenspezies verbreitete Selbstbestäubung verhindert werden
könnte, die vor allem Züchter bei der Herstellung neuer Sorten
behindert.
Ein wichtiger Punkt ist ferner die Herstellung von Hybridsamen.
Viele Kulturpflanzen, wie z. B. Getreide oder Tomaten, werden
als Hybridsamen verkauft. Die Herstellung dieser Hybridsamen
wird durch die männliche Sterilität eines der beiden Kreuzungspartner
wesentlich vereinfacht. Es sind bereits Kulturpflanzen
mit einer durch Züchtung erzeugten männlichen Sterilität bekannt.
Der Erhalt dieser Pflanzen ist jedoch kompliziert.
Aus den Literaturstellen The Plant Cell, Bd. 1, 1989, S. 151-158;
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85, S. 1136-1140, Fbr. 1988, sowie
der DE-OS 38 37 752 ist ein aus Solanum tuberosum isoliertes,
als "wun1-Gen" bezeichnetes Gen mit einer DNA-Sequenz bekannt,
dessen Verwendung in höheren Pflanzen bei Verwundung oder
pathogenem Befall zur Expression von Genprodukten führt. Es
konnte gezeigt werden, daß im Falle des "wun1-Gens" ein 1022 bp
langer Promotorbereich (+179 bp wun1 5′ untranslatierter Bereich)
seine verwundungsinduzierbare Aktivität auch dann beibehält,
wenn der eigentliche Strukturgen-Bereich durch ein anderes
Strukturgen (wie z. B. CAT, GUS) ersetzt wird. Auf diese Weise
konnte eine verwundungsinduzierbare wun1-Promotoraktivität in
Blatt, Stengel und Wurzel von transgenen Tabakpflanzen nachgewiesen
werden.
Im Gegensatz zur DE-OS 38 37 752, die sich mit einer verwundungsstimulierten
DNA-Sequenz und ihrer Verwendung befaßt, betrifft
die vorliegende Erfindung eine antherenspezifisch exprimierte
DNA-Sequenz und ihre Verwendung. Es wurde eine DNA-Sequenz aufgefunden,
die es ermöglicht, mit ihr fusionierte Strukturgene
spezifisch in Antheren zu exprimieren.
Es wurde gefunden, daß man das aus den im Vorstehen angegebenen
Literaturstellen bekannte wun1-Gen nicht nur als
verletzungs- und/oder infektionsinduzierte DNA-Sequenz verwenden
kann, sondern daß man, wenn man den Promotor des wun1-Gens
stutzt, zu einer antherenspezifisch exprimierten DNA-Sequenz
gelangt. Der für diese Merkmalsausprägung notwendige
Bereich erstreckt sich über 1201 Basenpaare (bp) (1022 (bp)
des wun1-Promotors +179 bp des 5′ untranslatierten Bereichs).
Verkürzt man den 1201 Basenpaar langen Bereich, indem man
451 bp des wun1-Promotors am 5′Ende entfernt, so ist dieser
gestutzte Promotor nur noch in den Antheren von Blüten aktiv.
Dies läßt sich mit einem farblichen Nachweisgen beweisen, was
man an den gestutzten Promotor hängt. Man findet die Nachweisfärbung
in keinem Teil der Pflanze mit Ausnahme in den Pollen
und Stomium von Antheren.
Entfernt man somit am 5′-Ende des wun1-Promotors beispielsweise
451 bp (-571wun1-GUS) und testet diesen gekappten Promotor z. B.
in transgenen Tabakpflanzen, so findet man keine Aktivität mehr
in verwundeten oder unverwundeten Blättern, Stengeln und in
Wurzeln. Die Aktivität in den Antheren bleibt jedoch fast gleich
stark erhalten.
Das gleiche Expressionsverhalten findet man auch bei noch
kleineren wun1-Promotor-Fragmenten (-86wun1-GUS), allerdings
ist hier die GUS-Aktivität etwa 2fach schwächer als bei
-571wun1-GUS Antheren.
Eine gentechnologisch erzeugte Sterilität hat den Vorteil, daß
durch den Einbau eines definierten Gens in das Erbgut einer
Pflanze die übrigen Eigenschaften der Pflanze nicht verändert
würden. Dies gilt insbesondere für Tomaten, die genetisch
relativ gut handhabbar (gewebekulturtauglich und transformierbar)
sind, jedoch auch für andere Kulturpflanzen.
Durch die Verwendung von antherenspezifisch aktiven Promotoren
gelingt es somit, über einen gentechnologischen Ansatz männliche
Sterilität zu erhalten. Diese Promotoren ermöglichen es, Genprodukte
(Proteine) nur in den Antheren (männliches Fortpflanzungsorgan der Pflanze) zu produzieren, während diese Genprodukte
in allen anderen Geweben nicht, oder nur in sehr geringem Maße
aufzufinden sind. Handelt es sich bei dem Genprodukt um ein
Protein, das z. B. die Pflanzenzellphysiologie inaktiviert, so
hat dies die spezifische Inaktivierung der Antheren zur Folge.
Im Folgenden soll gezeigt werden, daß Deletionen des wun1-Promotors,
der aus den aufgeführten Literaturstellen bekannt
ist, zu antherenspezifischen Expressionen führen. Die verwendeten
Materialien und angewandten Methoden entsprechen
weitestgehend den Materialien und Methoden, die in der DE-OS
38 37 752 angegeben sind.
In den Figuren sind dargestellt in:
Fig. 1: Anordnung von wun1 in dem genomischen Klon wun1-85.
Auf dem 4 Kb großen EcoRI Fragment des genomischen
Klons wun1-85 sind 1,0 Kb des wun1-Promotors,
0,8 Kb des wun1-Gens sowie 2,0 Kb des 3′ Endes
vorhanden. Dieses 4 Kb Fragment wurde in die
EcoRI Schnittstelle von pUC8 kloniert (pLSOOO).
Fig. 2: Deletionsanalyse des wun1-genomischen Klons
wun1-85.
Aufgrund der asymmetrischen XhoI Schnittstelle
im genomischen Klon wun1-85 konnte das 4 Kb
Fragment in beiden Orientierungen in M13mp18
nachgewiesen werden (85MP18; 85*MP18). Durch
sukzessiven Verdau mit ExonukleaseIII wurden
verschieden große DNA-Fragmente erhalten.
Fig. 3: Bestimmung der Größe des S1 geschützten Fragments.
Die Hybridisierung des 5′ von der XhoI Schnittstelle
gelegenen Bereichs aus plSOOO mit wun1-mRNA
führt zu einem 162-179 bp langen DNA-RNA
Hybrid (TU), das vor der einzelstrangspezifischen
S1 Nuklease geschützt ist. Der tatsächliche Transkriptionsstart
liegt also 162-197 Bp 5′ von der
XhoI Schnittstelle entfernt (A; C; G; T = Sequenzauftragung
zur Größenbestimmung des DNA-Fragments).
Fig. 4: Nukleotidsequenz des wun1-Gens aus wun1-85
CAAT-Box, TATA-Box und PolyA-Signal sind schwarz
unterlegt. Der Transkriptionsstart bwz. -stop
ist durch einen Pfeil markiert.
Fig. 5: Anordnung und Position wichtiger Bereiche im
wun1-Gen.
Der wun1-Promotor ist schwarz markiert, das
wun1-Gen schraffiert. Wichtige Erkennungssequenzen
sind eingerahmt; die mRNA ist durch eine geschlängelte
Linie, der proteinkodierende Bereich
durch Kreuze wiedergegeben. Die Größe der einzelnen
Bereiche ist in (bp) angegeben.
Fig. 6: Konstruktion von wun1-GUS 5′ Deletionen für
Expressionsuntersuchungen in stabilen Tabaktransformanten.
Zwischen der linken und der rechten
T-DNA Grenzsequenz des Vektors pPR69 liegt ein
NPT II-Gen unter der Kontrolle des Nopalin-Synthase
Promotors (nos). Er ist notwendig für die Selektion
auf Kanamycin. Das GUS-Gen trägt eine nos-Terminatorsequenz
und wird durch die verschiedenen 5′Deletionsfragmente
des wun1-Promotors reguliert. Die Endpositionen
der jeweiligen 5′Deletionsfragmente sind
neben der jeweiligen Konstruktion angegeben.
R = Klonierung des Promotors in umgekehrter
Orientierung.
Fig. 7: Tabakblätter transgenischer Pflanzen aus dem
Gewächshaus wurden auf ihre GUS-Aktivität, in
Abhängigkeit der verschiedenen 5′Promotorelemente
analysiert. Die Einheit pmol MU/mg
Protein/min auf der Abszisse gibt die Enzymaktivität
an. Die Ordinate zeigt jeweils 3 von
6-12 verschiedenen getesteten Pflanzen. Diese
Pflanzen reflektieren die höchste, die mittlere
und die niedrigste Aktivität der jeweils getesteten
Pflanzen, nach einer Verwundung.
Fig. 8: Keimende Pollen der Konstruktion pLSO34-571. Die
Blaufärbung im Pollen und im Pollenschlauch zeigt
den Ort der Enzymtätigkeit an.
Dabei wird auf die folgenden Literaturstellen verwiesen:
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Thermally stabalized very thin (0.02-0.3 mm) polyacrylamide
gels für electrophoresis. J. Chromatogr., 202:45-53.
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(28) Wassenegger, M. (1988). Dissertation an der Universität zu Köln.
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Die zur Anzucht von Bakterien verwendeten Medien wurden den
Angaben von Maniatis et al. (1982) entnommen.
Die benutzten Medien leiten sich von dem von Murashige und
Skoog (1962) angegebenen Medien (MS) ab.
3MS: MS + 3% Saccharose
3MSC: MS + 3% Saccharose, 500 µg/ml Claforan
MSC10: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 0,2 µg/ml NAA, 1 µg/ml BAP, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MSC15: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MS15: MS + 2% Saccharose, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
3MSC: MS + 3% Saccharose, 500 µg/ml Claforan
MSC10: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 0,2 µg/ml NAA, 1 µg/ml BAP, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MSC15: MS + 2% Saccharose, 500 µg/ml Claforan, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
MS15: MS + 2% Saccharose, 100 µg/ml Kanamycinsulfat
Für festes Medium wurden zusätzlich 8 g/l Bacto-Agar
zugegeben.
BMH 71-18: (lac-proAB), thi, supE;
F′ (laciq, ZdeltaM15, proA⁺B⁺)
(Messing et al. 1977)
C 600: = CR34 (Maniatis et al., 1982)
Agrobakterien-Stämme: LBA 4404: (Hoekema et al., 1983)
Plasmide: pUC8 (Vieira und Messing, 1982)
pPR69 (ein Derivat des bin 19, Bevan 1984)
Phagen: EMBL4 (Frischauf et al., 1983)
M13mp18 (Yanisch-Perron et al., 1985)
M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985)
Pflanzen: Solanum tuberosum AM 80/5793 (haploid)
Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W83)
C 600: = CR34 (Maniatis et al., 1982)
Agrobakterien-Stämme: LBA 4404: (Hoekema et al., 1983)
Plasmide: pUC8 (Vieira und Messing, 1982)
pPR69 (ein Derivat des bin 19, Bevan 1984)
Phagen: EMBL4 (Frischauf et al., 1983)
M13mp18 (Yanisch-Perron et al., 1985)
M13mp19 (Yanisch-Perron et al., 1985)
Pflanzen: Solanum tuberosum AM 80/5793 (haploid)
Nicotiana tabacum Wisconsin 38 (W83)
Alle molekularbiologischen Standard-Methoden, wie z. B.
Restriktionsanalyse, Plasmidisolierung, Minipräparation von
Plasmid-DNA, Transformation von Bakterien usw. sind, sofern
nicht anders angegeben, wie bei Masniatis et al., (1982)
beschrieben, durchgeführt worden.
Die Isolierung von RNA aus verschiedenen Organen der Kartoffel
und des Tabaks wurden wie bei Logemann et al., (1987) beschrieben,
durchgeführt.
Die RNA wurde auf einem 1,5%igen Formaldehyd-Agarose-Gel
elektrophoretisch aufgetrennt (Lehrach et al., (1977)). Wie
bei Willmitzer et al., (1982) beschrieben, wurde anschließend
die RNA auf Nitrozellulose transferiert, fixiert und gegen
³²P radioaktiv markierte cDNA hybridiert, gewaschen und
exponiert.
Nukleäre DNA wurde nach der Methode von Bedbrook (1981) aus
Kartoffelblättern gewonnen und für die Klonierung in Lambda-Phagen
EMBL4 verwandt. DNA aus transformierten Gewebe wurde
nach dem kombinierten Aufbruch mit Triton X 100, SDS, und
Proteinase K (Wassenegger, 1988) gereinigt.
DNA wurde auf 0,8 bis 1,2%igen Agarose-Gelen elektrophoretisch
getrennt, auf Nitrocellulose transferiert und fixiert
(Southern, 1975), sowie hybridiert und gewaschen wie bei
Willmitzer et al., (1982) beschrieben.
Als genomische Kartoffel-DNA diente nach der Methode von
Bedbrook, 1981, isolierte Blatt-DNA der haploiden Linie AM
80/5793. Diese DNA wurde vollständig mit EcoRI verdaut.
EMBL4 DNA wurde mit EcoRI in drei Fragmente zerschnitten,
wobei über gelektrophoretische Auftrennung mit anschließender
Fragmentisolierung die beiden Vektor-Arme von dem Mittelfragment
getrennt werden konnten. Zusätzlich wurden auch
kommerziell erhältliche und gereinigte EMBL4-Arme verwandt
(Amersham).
Nach erfolgter Ligation der EMBL4-Arme mit der EcoRI
verdauen genomischen DNA wurde die ligierte, hochmolekulare
DNA in vitro in Phagenköpfe verpackt (Hohn und Murray, 1977;
Hohn, 1979). Das Verpackungsmaterial stammt aus einem "Lambda
in vitro packaging kit" der Firma Amersham. Die genomische
Bank wurde mit einer Konzentration von 25 000 plaques pro
Platte (25 × 25 cm) ausplattiert.
Das Auffinden cDNA homologer Lambda Klone erfolgte durch
Plaquehybridisierung nach Benton und Davies (1977) mittels
radioaktiv markierter cDNA. Positiv hybridisierende Plaques
wurden vereinzelt und nochmalig getestet.
20 ml einer C600 lysierten Bakterienkultur werden mit
Chloroform versetzt, um nach anschließender Zentrifugation
einen bakterienfreien Überstand zu erhalten. Das Sedimentieren
der Phagen aus dem Überstand gelingt durch 4stündiges
Zentrifugieren bei 10 000 rpm. Das Phagen-Sediment wird in
500 µl Phagen-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl₂)
aufgenommen und mit DNase und RNase behandelt. Nach der
Extraktion der DNA durch mehrmaliges Phenolisieren wird die
Phagen-DNA EtOH-präzipitiert, mit 70%igen EtOH gewaschen
und inTE aufgenommen.
Das zu untersuchende Fragment wurde in beiden Orientierungen
in M13mp19 kloniert. Da die Exonuclease III 5′ überstehende
Enden abverdaut, jedoch 3′ überstehende Enden verschont,
wurden 20 µg der zu analysierenden DNA mit zwei Restriktionsenzymen
verdaut, die auf einer Seite des klonierten Fragments
ein 5′ und ein 3′ Ende erzeugten. Da das 5′Ende dem Fragment
zugewandt war, konnte eine Exonuclease-Verdauung in das
Fragment hinein erfolgen. Durch sukzessives Stoppen dieser
Reaktion konnten jeweils 200 bp kleinere Fragmente isoliert
werden, deren überstehenden Enden durch eine nachfolgende
S1-Behandlung in ligierbare glatte Enden umgewandelt wurden.
Zuletzt folgte die Transformation dieser DNA in BMH 7118
Zellen mit anschließender Einzelstrang DNA Isolierung.
Die Sequenzierung von Einzelstrang DNA wurde nach der
Kettenabbruch-Methode von Sanger et al., (1977) durchgeführt.
Die Auftrennung der Reaktionsansätze erfolgte auf 6- und
8%igen Sequenzgelen (Ansorge und de Mäyer, 1980; Ansorge
und Barker, 1984).
Die Bestimmung des Transkriptionsstartpunktes wurde nach
Berk und Sharp (1987) durchgeführt. Dazu wurde aus dem
Plasmid pLS000 mit EcoRI und XhoI das 1,2 kb Fragment
isoliert und durch Behandlung mit Phosphatase dephosphoryliert.
Anschließend erfolgte eine radioaktive Markierung
der 5′ OH Enden durch die Kombination von Polynukleotidkinase
und y-³²P-ATP. Nach Denaturierung der DNA-Fragmente
wurden diese mit 50 µg Gesamt-RNA hybridisiert (Hybridisierungspuffer:
80% Formamid, 0,4 M NaCl, 40 mM PIPES
pH 6,4 und 1 mM EDTA. Diese Bedingung begünstigt RNA-DNA-Hybride
im Vergleich zu DNA-DNA-Hybriden (Casey und Davidson,
1977). Die Hybridisierungstemperatur beginnt bei 80°C und
wird über Nacht auf 40°C gesenkt. Eine anschließende S1-Nuklease
Verdauung (120 U/ml) entfernt ungepaarte Stränge.
Es wurde erwartet, daß die im 5′ untranslatierten Bereich
des wun1 Gens gelegene und radioaktiv markierte XhoI Schnittstelle
durch ihre Homologie zur mRNA geschützt ist. Zuletzt
wird der S1 geschützte DNA-Strang auf einem Sequenzgel elektrophoretisch
aufgetrennt, wobei als Längenvergleich die Sequenz
eines bekannten DNA-Fragment dient.
Die in E. coli klonierte DNA wurde nach der von Van Haute
et al., (1983) beschriebene Methode durch Konjugation nach
A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983) transferiert.
Die Überprüfung des DNA Transfers in das Agrobacterium
erfolgte durch die Isolierung von Agrobakterien DNA nach
der von Ebert et al. (1987) geschilderten Methode.
Restriktionsspaltung der DNA, der Transfer auf Nitrocellulose
und die Hybridisierung gegen die entsprechende
radioaktive Sonde gaben Aufschluß über einen erfolgreichen
DNA Transfer ins Agrobacterium.
Die zur Infektion benötigten Agrobakterien LBA4404Km wurden
in selektivem Antibiotika-Medium angezogen (Zambrisky et al.,
1983), durch Zentrifugation sedimentiert und in YEB-Medium
ohne Antibiotika gewaschen. Nach erneuter Sedimentation und
Aufnahme in 3MS-Medium konnten die Bakterien zur Infektion
verwandt werden.
Für die Blattscheiben-Infektion wurden sterile Blätter der
Tabaklinien SNN und W38 verwendet. Etwa 1 cm große Blattstücke,
in die wie oben beschriebene Agrobakteriensuspension
eingetaucht, mit anschließender Überführung auf 3MS-Medium.
Nach 2tägiger Inkubation bei 16 Stunden Licht und 25°C
bis 27°C wurden die Blattstücke mehrmals in flüssigem 3MS-Medium
gewaschen und auf 3MSC-Medium überführt. Nach 4-6 Wochen erscheinende
Sprosse wurde abgeschnitten und auf 2MSC-Medium
inkubiert.
Aus den Pflanzen wird die DNA nach einer abgewandelten
Methode von Murray und Thompson (1980) isoliert, mit
Restriktionsenzymen geschnitten und auf einem Gel aufgetrennt.
Nach dem Transfer dieser DNA auf Nitrocellulose wird sie mit
einer radioaktiv markierten Probe hybridisiert, die die
Anwesenheit dieser spezifischen DNA im Genom der untersuchten
Pflanze anzeigt.
Aus der Transformation regenerierte Pflanzen werden nach der
Methode von Jefferson (1987) auf die Stärke der Aktivität
des Enzyms β-Glucuronidase (GUS) untersucht. Ein zusätzlicher
histochemischer Test (Jefferson, 1987) zeigt die Lokalisation
im Gewebe an. Dazu werden Dünnschnitte der Pflanzen mit dem
Substrat X-Gluc, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Glucuronid,
inkubiert. Am Ort der Enzymaktivität bildet sich ein blaues
Präzipitat.
Die geringe Anzahl an wun1-mRNA codierenden und
exprimierenden Genen in Genom der haploiden Kartoffellinie
AM80/5793 sowie die Tatsache, daß aufgrund der
"Southern-Blot" Analyse (Fig. 4) mit der Präsenz des
vollständigen Gens auf einem EcoRI Fragment zu rechnen ist,
führten dazu, aus EcoRI totalverdauter genomischer DNA eine
genomische Bank anzulegen.
10 µg EcoRI geschnittene DNA aus AM80/5793 wurden mit EcoRI
geschnittenen EMBL4-Armen ligiert und auf einem C600
Bakterienrasen ausplattiert. Ca. 500 000 Plaques wurden
erhalten, die statisch gesehen das Genom der Kartoffel
repräsentieren sollten.
Nach dem Transfer dieser Plaques auf Nitrozellulose konnte
durch Plaquehybridisierungstechniken gegen radioaktiv
markierte wun1-cDNA zwei genomische Klone (wun1-22 und
wun1-85), identifiziert und gereinigt werden.
Die Isolierung von rekombinanter EMBL4 DNA aus wun1-22,
wun1-85 sowie deren Restriktionskartierung und
Hybridisierung gegen radioaktive wun1-cDNA ergab folgende
Daten:
Das wun1-cDNA äquivalente Fragment in wun1-85 hat eine Größe
von 4 Kb. Es entspricht damit exakt mit der mit wun1-cDNA
hybridisierenden Fragmentgröße EcoRI verdauter DNA aus der
haploiden Kartoffel. Aufgrund der asymmetrischen
XhoI-Schnittstelle im 5′ Bereich des cDNA-Klons, und der
Verwendung radioaktiver cDNA-Proben die nur den 5′ Bereich
des cDNA-Klones abdecken, konnte die Orientierung des Gens
in dem 4 Kb Fragment ermittelt werden. Demnach liegt vor
dem wun1-Gen ein ca. 1 Kb großer Promotorenbereich, während
sich 3′ vom Gen ein ca. 2 Kb nicht homologer Teil befindet
(Fig. 5). Das zusätzlich in wun1-85 enthaltene 8 Kb
große EcoRI Fragment konnte nicht zur näheren Analyse des
wun1-Gens herangezogen werden. Aufgrund des Totalverdaus
der Kartoffel-DNA mit EcoRI ist es wahrscheinlich, daß bei
der anschließenden Ligation zwei nicht zusammengehörige
Fragmente in den EMBL4-Vektor gebracht wurden, also auch
nicht in funktionelle Beziehung zueinander gebracht werden
können.
Im folgenden wurde die genomische Analyse des wun1
kodierenden Gens durchgeführt. Da im Restriktionsverhalten
keine Unterschiede zwischen wun1-85 und wun1-22 festgestellt
wurden, wurde zur weiteren Analyse das 4 Kb Fragment von
wun1-85 in EcoRI geschnittenen pUC8 ligiert (Fig. 5). Zur
Sequenzierung des wun1-Promotors sowie des wun1-Gens
erfolgte eine weitere Umklonierungen des 4 Kb Fragments in
die EcoRI Schnittstelle von M13mp18. Die Bestimmung seiner
Orientierung wurde mittels Kontrollverdauungen an der
asymmetrisch gelegenen XhoI Schnittstelle durchgeführt. Die
Klone 85*mp18 und 85mp18 repräsentieren beide Orientierungen
des Fragments (Fig. 6). Das Schneiden dieser Plasmide mit
SphI und XbaI ermöglichte es, mit Hilfe der ExonukleaseIII
beim Klon 85mp18 das 3′ Ende des wun1-Gens und beim Klon
85*mp18 das 5′ Ende des wun1-Gens sukzessive abzudauen.
Daraus resultierende Deletionsklone mit unterschiedlichen
Fragmentgrößen wurden für die Sequenzierung benutzt.
Insgesamt gelangt es, das gesamte wun1-Gen bidirektional zu
Sequenzieren, sowie zusätzlich ca. 400 bp des 3′ Endes
unidirektional zu analysieren (Fig. 9).
Zur Identifikation des genauen Transkriptionsstarts des
wun1-Gens wurde die Methode der S1 Nuklease Kartierung
benutzt. Das Prinzip dieser Methode basiert darauf, daß
durch eine Hybridisierung von Einzelstrang DNA aus dem 5′
Bereich des wun1-Gens mit wun1-mRNA nur die Bereiche vor
einem Abbau der einzelstrangspezifischen Nuklease S1
geschützt sind, die aufgrund ihrer Homologie einen
Doppelstrang ausbilden können. Die Größe des geschützten
DNA Fragments kann auf einem Sequenzgel ermittelt werden und
somit der Transkriptionsstart zurückverfolgt werden.
Mit Hilfe der Schnittstelle XhoI und EcoRI wurde aus
pLS000 ein 1,1 Kb Fragment isoliert, das den Promotor und
Teile des 5′ untranslatierten Bereich des wun1-Gens
beinhaltet. Dieses Fragment wurde mit Polynukleotidkinase
an dem 5′ Ende der XhoI Stelle mit ³²P radioaktiv markiert
und gegen 50 µg Gesamt-RNA aus verwundeten Kartoffelknollen
hybridisiert. Nach S1-Behandlung des Hybrids wurde die
Größe des geschützten Fragments auf einem Sequenzgel
ermittelt; sie variiert zwischen 162-179 bp (Abb. 8). Geht
man von dem längsten Fragment aus, so beginnt der
Transkriptionsstart 179 bp stromaufwärts von der XhoI
Stelle, d. h. mit der Sequenz ACCATAC. Diese Sequenz stimmt
im zentralen Bereich (CAT) mit der von Joshi et al., 1987
ermittelten Konsensussequenz für Transkriptionsstart CTCATCA
überein. Aus der Position des Transkritionsstarts ergeben
sich weitere Informationen (Abb. 9, 10):
- 1. In Position -33, gesehen vom Transkriptionsstart, ist eine TATA-Box CTATATATT zu finden, die gut mit der von Joshi et al., 1987 ermittelten Konsensussequenz TCACTATATATAG übereinstimmt.
- 2. Die von Benoist et al., 1980, beschriebene CAAT-Box im Bereich zwischen -60 und -80 ist im wun1-Promotor an Position -58 (CAAACT) zu finden.
- 3. Der 5′ untranslatierte Bereich des wun1-Gens erstreckt sich über 217 bp und ist damit verhältnismäßig groß.
- 4. Das wun1-mRNA kodierende Gen umfaßt somit 794 bp, was sehr genau der Größenbestimmung von wun1-mRNA aufgrund der "Northern-Blot" Analysen entspricht.
- 5. Dem cDNA-Klon wun1-25A2 fehlen 97 bp des 5′ untranslatierten Bereichs im wun1-Gen.
- 6. Neben den bereits im cDNA-Klon ermittelten offenen Leserastern, können keine weiteren im 5′untranslatierten Bereich des genomischen Klons gefunden werden.
- 7. Das wun1-Gen verfügt über keine Introns.
Die durch Exonuclease III erzeugten
Promoterdeletionsfragmente mit den Endpunkten -571 bp, -111 bp
und -86 bp, sowie der Promoter bis zum Bereich -1022 bp
im 5′ gelegenen Bereich wurden in den Vektor pPR69
umkloniert. Zur gerichteten Umklonierung wurden die
Deletionsfragmente über die XhoI-Schnittstelle aus M13mp18
ausgeschnitten. Zur Herstellung der Kontrolle, die den
Vektor in umgekehrter Orientierung trägt, wurden die
5′ überhängenden Enden der Schnittstellen durch das
Klenowfragment der DNA-Polymerase I aufgefüllt und in den
Vektor kloniert. Die Aufnahme der Deletionsfragmente im
Vektor wurde über Hybridisierung gegen eine radioaktiv
markierte wun1-Promoterprobe, sowie über Restriktionsanalyse
getestet.
Verschiedene wun1-Promotor-Deletionen wurden in transgenen
Pflanzen bezüglich ihrer Organspezifität und ihrer
Wundinduzierbarkeit getestet. Dazu wurden die Plasmide
pLS034-1022, -571, -111, -89, -1022R in den
Agrobakterienstamm LBA4404 transformiert. Diese
Agrobakterien wurden nun über die Methode der
Blattscheibeninfektion zur Transformation der Tabaksorte
Wisconsin 38 (W38) benutzt. Unter Kanamycin-Selektion
wurden entstehende Kalli zur Pflanze regeneriert und auf
Southern-Ebene auf korrekte Integration der pLS034-DNA ins
Pflanzengenom untersucht.
Die funktionelle Analyse der transgenen Tabakpflanzen
erstreckte sich auf den Nachweis von GUS-Aktivität in
Gewächshauspflanzen.
Dazu wurden unabhängige Transformanten der verschiedenen
Konstruktionen auf ihre GUS-Aktivität in unterschiedlichen
Geweben analysiert. Nicht-transformierte Tabakpflanzen
dienten als Kontrolle (K).
Ein Vergleich der Gusaktivität in Tabakblättern zeigte eine
geringe Aktivität für Pflanzen der Konstruktion pLS034-86,
-111 und pLS034-1022R, die im Bereich der Aktivität von
Kontrollpflanzen lag. Die GUS-Aktivität von pLS034-571 ist
im Vergleich zu diesen ca. 4fach höher. Während die
Aktivität des ganzen Promoters 13 bis 370fach stärker ist
als die der kürzesten Konstruktion (pLS034-86), s. Fig. 7.
Über die histochemische in-situ Analyse wurde die Aktivität
des Enzyms in verschiedenen Geweben der Pflanze analysiert.
Dazu wurden Dünnschnitte des Gewebes mit dem Substrat des
Enzyms, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl Glucuronid (X-Gluc) über
Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Am Ort der
Enzymaktivität bildet sich ein blaues Präzipitat.
Die Analyse ergab, daß in Pflanzen der Konstruktionen
pLS034-86, -111, -571 und -1022R keine Aktivität in Blättern,
Stamm oder Wurzel nachweisbar ist.
Pflanzen, die den vollen wun1-Promotor in der Konstruktion
tragen, zeigen Aktivität in allen genannten Geweben.
Ein anderes Bild ergab sich bei der Analyse der Blüten. Hier
zeigten alle Transformanten GUS-Aktivität, die sich nur in
ihrer Intensität unterschied. In Blütenquerschnitten mit den
verschiedenen Konstruktionen zeigte sich folgende Verteilung
der Enzymaktivität: Pflanzen der Konstruktion pLS034-1022
zeigten GUS-Aktivität im Stomium der Antheren, sowie in den
Pollenkörnern. 30% der Pollenkörner zeigten nach Inkubation
mit X-Gluc Blaufärbung. Antheren von pLS034-571 und-86
zeigten das gleiche Muster der Aktivität jedoch mit
geringerer Intensität. In Kontrollpflanzen, wie auch in
Pflanzen der Konstruktion pLS034-111 und pLS034-1022R ließ
sich keine Blaufärbung im Stomium nachweisen, die Färbung
der Pollenkörner reduzierte sich auf 0.75% (Fig. 8).
Ein Vergleich der gemessenen GUS-Aktivitäten von Antheren
der veschiedenen Konstruktionen zeigte eine 2-10fach
stärkere Aktivität von pLS034-1022 gegenüber pLS034-571. Die
mittlere Aktivität des vollen Promotors erreichte in
Antheren eine Enzymaktivität von 1276 pmol MU/mg/min.
Antheren der Konstruktion pLS034-571 zeigten eine 2fach
höhere Aktivität als Antheren von pLS034-86. Die mittleren
Enzymaktivitäten liegen bei 217 pmol MU/mg/min,
beziehungsweise 97 pmol MU/mg/min.
Bekanntlich ist der 35S-Promotor aus Cauliflower Mosaik
Virus in Antheren aktiv. Seine Aktivität liegt bei 500 pmol
MU/mg/min. Da es sich bei dem 35S-Promotor des CaMV um einen
starken, in Pflanzen aktiven Promotor handelt, lassen sich
die Deletionsfragmente des wun1-Promotors durchaus in diesen
Aktivitätsbereich einreihen.
Claims (9)
1. DNA-Sequenz, die bei Pflanzen eine antherenspezifische
Expression bewirkt.
2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 aus Solanum tuberosum.
3. DNA-Sequenz nach Ansprüchen 1 und 2, mit einem bp-Bereich
von -571 bis +179 des wun1-Promotors bzw. wun1-Gens.
4. Wun1-Gen, dessen Promotorteil am 5′-Ende um so viele bp
verkürzt worden ist, daß es von der ursprünglich vorhandenen
verwundungsinduzierbaren Aktivität und Antherenaktivität
nur noch die Antherenaktivität aufweist.
5. Wun1-Gen nach Anspruch 4, dessen Promotorteil um so viele
bp verkürzt worden ist, daß dieses höchstens noch 571 bp
aufweist.
6. Verwendung der DNA-Sequenz nach Ansprüchen 3, 4 und 5 zur
Erzeugung männlicher Sterilität bei Kulturpflanzen, insbesondere
bei Getreide, Tomaten, Kartoffeln und Tabak.
7. DNA-Übertragungsvektoren mit insertierter DNA-Sequenz nach
Ansprüche 3 und 4.
8. DNA-Übertragungsvektoren nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß er den Promotorteil oder
seine aktiven Bereiche in Verbindung mit einem Strukturgenteil
enthält, das von dem Strukturgenteil des wun1-Gens
verschieden ist.
9. Pflanzen oder Pflanzenmaterial enthaltend eine DNA-Sequenz
nach Ansprüchen 3 und 4.
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Logemann, J. etb al., 5`Upstream sequences from the wun 1 gene are responsible for Gene Activation by Wounding in Transgenic Plants, The Plant Cell,1,151-158,1989 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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