DE10204910A1

DE10204910A1 - Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen

Info

Publication number: DE10204910A1
Application number: DE10204910A
Authority: DE
Inventors: Daguang Dr. Cai; Tim Dr. Thurau; Christian Prof. Dr. Jung
Original assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Current assignee: KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date: 2002-02-06
Filing date: 2002-02-06
Publication date: 2004-03-04
Also published as: DE10390419D2; WO2003066865A3; WO2003066865A2; AU2003206654A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, einen chimären Promotor, die Verwendung eines solchen Nukleinsäuremoleküls oder eines solchen Promotors zur pflanzlichen Pathogenabwehr sowie transgene Zellen und Pflanzen. Mit der vorliegenden Erfindung ist es erstmalig möglich, pflanzliche Abwehrreaktion gegen Nematoden lokal zu begrenzen. Bei dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül handelt es sich um ein Molekül, das DOLLAR A a. eine Sequenz gemäß SEQ ID NO.1 aufweist oder DOLLAR A b) eine mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO.1 komplementäre Sequenz aufweist oder DOLLAR A c. ein Derivat der Sequenz gemäß a oder b aufweist oder DOLLAR A d. eine Sequenz aufweist, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert, und das ein 5'-Ende und ein 3'-Ende besitzt, wobei stromaufwärts von dem 5'-Ende keine weiteren regulatorischen Sequenzen vorhanden sind, die eine pathogeninduzierte Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens derart beeinflussen, daß nach Pathogenbefall einer Pflanze neben einer lokalen Expression des Gens eine Genexpression auch in nicht vom Pathogenbefall unmittelbar betroffenen Gewebeteilen der Pflanze erfolgt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, einen chimären Promotor, die Verwendung eines solchen Nukleinsäuremoleküls oder eines solchen Promotors zur pflanzlichen Pathogenabwehr sowie transgene Zellen und Pflanzen.
Nukleinsäuremoleküle zur Regulation der Genexpression in Pflanzen sind grundsätzlich bekannt. WO 98/12335 beschreibt einen wurzelspezifischen Promotor aus Beta procumbens, der die Expression des Hs1^pro-1-Gen aus Beta procumbens reguliert. Der in WO 98/12335 beschriebene Promotor ist jedoch nicht näher untersucht und weist vor allem den Nachteil auf, daß die durch ihn regulierte Expression des Resistenzgens nicht lokal begrenzt ist. Hierdurch ergibt sich der Nachteil, daß bei transgenen Pflanzen die mit Hilfe eines solchen Promotor angestrebte Genexpression auch in solchen Geweben oder Gewebeteilen stattfindet, in denen nach Möglichkeit keine Expression erfolgen soll. Dies kann unter Umständen dazu führen, daß nach Pathogenbefall die gesamte Pflanze geschädigt wird.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Möglichkeit zu schaffen, eine pflanzliche Pathogenabwehrreaktion lokal zu begrenzen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch ein Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, das

a. eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist oder
b. eine mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementäre Sequenz aufweist oder
c. ein Derivat der Sequenz gemäß a oder b aufweist oder
d. eine Sequenz aufweist, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert,

Bevor weitere Lösungen der gestellten Aufgabe und besondere Ausgestaltungen der Erfindung im einzelnen beschrieben werden, soll zunächst eine Erläuterung einiger der in dieser Anmeldung verwendeten Begriffe erfolgen:
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen kann es sich insbesondere um DNA-Moleküle handeln. DNA-Moleküle können synthetisch hergestellt oder genomische oder cDNA-Moleküle sein.
"Derivate" einer Sequenz sind verkürzte oder verlängerte oder abschnittsweise identische Versionen dieser Sequenz oder Homologe mit im wesentlichen gleichen oder singulären Eigenschaften.
Der Ausdruck "Homologie" bedeutet hierbei eine Homologie von mindestens 70 % auf DNA-Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (S.F. Altschul et al. (1990), Basic Local Alignment search tool, J. Mol. Biol. 215: 403-410) bestimmt werden kann.
"Komplementäre Nukleotidsequenz" bedeutet bezogen auf eine doppelsträngige DNA, daß der zum ersten DNA Strang komplementäre zweite DNA Strang entsprechend den Basenpaarungsregeln die Nukleotidbasen aufweist, die zu den Basen des ersten Stranges korrespondieren.
Der hier verwendete Begriff "hybridisieren" bedeutet hybridisieren unter üblichen Bedingungen, wie sie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Aufl. 1989) beschrieben sind, bevorzugt unter stringenten Bedingungen. Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise:
Hybridisieren in 4 × SSC bei 65 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 0,1 × SSC bei 65 °C für insgesamt etwa 1 Stunde. Wenig stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise: Hybridisieren in 4 x SSC bei 37 °C und anschließendes mehrfaches Waschen in 1 × SSC bei Raumtemperatur. Der hier verwendete Begriff "stringente Hybridisierungsbedingungen" kann auch bedeuten: Hybridisieren bei 68 °C in 0,25 M Natriumphosphat, pH 7,2, 7 % SDS, 1 mM EDTA und 1 % BSA für 16 Stunden und anschließendes zweimaliges Waschen mit 2 × SSC und 0,1 % SDS bei 68 °C.
"Minimalpromotor" meint eine Nukleotidsequenz, die bei der Initüerung der Transkription eine Rolle spielt und beispielsweise eine TATA-Box umfassen kann. Ein derartiger Minimalpromotor sollte allerdings keine regulatorischen Elemente beinhalten, die eine nicht-lokale Genexpression bewirken und sich beispielsweise im Bereich des 5'-Endes des aus WO 98/12335 bekannten Hs1^pro-1-Promotors befinden. Ein geeigneter Minimalpromotor kann aus dem bekannten CaMV35S-Promotor (Cauliflower Mosaic Virus 35S-Promotor) stammen und die Sequenz
enthalten. Ebenso kann ein solcher Minimalpromotor auch aus Sequenzdaten von Promotoren hochexprimierter pflanzlicher Gene entwickelt werden (Sawant et al., Theor. Appl. Genet., 2001, 102: 635–644).
"Pathogenabwehrgene" sind solche Gene, die für Toxine oder andere Stoffe codieren, die gegen Pathogene, insbesondere Nematoden wirken. Pathogenabwehrgene umfassen aber auch Gene, die für cytotoxisch wirkende Stoffe codieren. Beispiele hierfür sind das Barnase-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens (Maxiani et al., 1992, Plant Cell, Vol. 10: 1307–1319) und das NPP1-Gen aus Phytophthora parasitica (National Center for Biotechnology Information, GenBank, Accession No. AF352031).
Mit dem erfindungsgemäßem Nukleinsäuremolekül ist erstmals eine lokale Expression von Genen in Reaktion auf einen Pathogenbefall einer Pflanze möglich. So kann beispielsweise im Falle eines Pathogenbefalls einer Pflanze durch Zystennematoden die Abwehrreaktion der Pflanze auf den Bereich eines Syncytiums beschränkt werden. In anderen Gewebeteilen findet dann keine oder eine zumindest die Pflanze insgesamt nicht beeinträchtigende Abwehrreaktion statt. Dabei ist die Erfindung nicht auf die Abwehr von Zystennematoden beschränkt. Die Erfindung läßt sich auch zur Abwehr von anderen Nematoden einsetzen, indem sich eine Abwehrreaktion der Pflanze erzeugen läßt, die auf Zellen der Pflanze im Bereich einer Nematodenbefallsstelle beschränkt ist. Wie später im einzelnen dargelegt wird, weist die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 eine Länge von 606 Basenpaaren auf, wobei hiermit eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 umfaßt ist, die eine Länge von 56 Basenpaaren besitzt. Die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 verfügt trotz ihrer geringen Länge über wesentliche, für die lokale Genexpression erforderliche Proteinbindedomänen.
Der Erfindung liegt hierbei die Erkenntnis zugrunde, daß regulatorische Sequenzen innerhalb des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls für die lokale Genexpression verantwortlich sind, wobei weitere regulatorische Sequenzen, die in dem bekannten Hs1^pro-1-Promotor gemäß WO 98/12335 stromaufwärts von dem erfindungsgemäßen Nukleinsäueremolekül vorkommen, gerade dazu führen, daß die Genexpression nicht lokal begrenzt ist. Solche regulatorischen Sequenzen, die außerhalb des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls für eine lokale Genexpression zu vermeiden sind, sind beispielsweise Elicitorbindungsdomänen und/oder cis-Elemente.
In WO 98/12335 wurde zwar der Hs1^pro-1-Promotor als ein Promotor beschrieben, der für eine spezifische Expression des GUS-Gens in Syncytien bei Zuckerrüben und Kartoffeln verantwortlich ist (Brückenabsatz Seiten 21 und 22). Allerdings wurde bei den gemäß WO 98/12335 durchgeführten Untersuchungen zum Nachweis der Syncytienspezifität lediglich die Expression des GUS-Gens geprüft. Eine solche Methode gibt aber keine zuverlässige Auskunft darüber, ob in anderen Geweben noch eine schwache Genexpression vorhanden ist. Erst mit Hilfe sehr empfindlicher Nachweismethoden, wie beispielsweise unter Verwendung des Barnase-Gens, läßt sich zuverlässig erkennen, welche Spezifität eine Genexpression wirklich hat. Mit der vorliegenden Erfindung konnte daher überraschenderweise gezeigt werden, daß der bekannte Hs1^pro-1-Promotor in seiner gesamten Länge nicht zur lokalen Genexpression in Syncytien geeignet ist.
Insofern betrifft die vorliegende Erfindung auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, bestehend aus

a. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder
b. einer mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementären Sequenz oder
c. einem Derivat der Sequenz gemäß a oder b oder
d. einer Sequenz, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert und der Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 entspricht. Ein derartiges Nukleinsäuremolekül verfügt über alle wesentlichen Promotoreigenschaften, die erforderlich sind, um ein hiermit operativ verbundenes Gen in einer Pflanze lokal zu exprimieren.

Die Erfindung betrifft ferner einen chimären Promotor, der zusammengesetzt ist aus

a. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder
b. einer mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 komplementären Sequenz oder
c. einem Derivat der Sequenz gemäß a oder b oder
d. einer Sequenz, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert sowie
e. einem Minimalpromotor.

Ein solcher chimärer Promotor kann eine Sequenz gemäß a – d entweder stromaufwärts oder stromabwärts vom Minimalpromotor enthalten. Dabei kann die Sequenz gemäß a – d einfach oder in Wiederholungen und auch invers vorliegen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Vektor oder ein mobiles genetisches Element, in den/das ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Promotor nach Anspruch 3 integriert wurde.
Des weiteren betrifft die Erfindung eine eukaryotische oder prokaryotische Wirtszelle, in deren Genom ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Promotor nach Anspruch 3 integriert wurde. Dabei wird als Genom die Gesamtheit aller DNA-Bereiche einer Zelle verstanden unabhängig von der Funktion einzelner DNA-Bereiche.
Eukoryotische Zellen sind insbesondere Pflanzenzellen. Prokaryotische Zellen sind insbesondere Agrobacterium-Zellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine transgene Pflanze oder deren Teile mit den zuvor genannten Zellen. Dabei ist das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder der Promotor nach Anspruch 3 vorzugsweise mit einem Gen operativ verbunden. Der Begriff "operativ verbunden" meint in diesem Zusammenhang, daß das Nukleinsäuremolekül oder der Promotor die Expression des mit ihm verbundenen Gens beeinflußt.
Die vorliegende Erfindung hat insbesondere bei der Herstellung einer transgenen Pflanze Beta vulgaris ihre Bedeutung. Zur Verbesserung von Zuckerrübenpflanzen gegenüber einem Befall durch Nematoden lassen sich mittels des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls transgene Zuckerrübenpflanzen herstellen, deren Abwehrreaktion lokal begrenzt ist. Hierdurch wird einem Nematodenbefall gezielt entgegengewirkt, ohne daß der Großteil der Pflanze hiervon in Mitleidenschaft gezogen wird. Von transgenen Pflanzen dieser Art lassen sich weiterhin Samen produzieren, die zur Saatgutherstellung geeignet sind. Dabei ist die Anwendung der vorliegenden Erfindung auch nicht auf Beta vulgaris beschränkt. Vielmehr lassen sich auch andere Pflanzen beispielsweise der Gattungen Beta, Brassica, Glycine und Solanum in vergleichbar vorteilhafter Weise verändern, um auch in ihnen eine lokale Genexpression im Falle eines Pathogenbefalls zu ermöglichen.
Da das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül zunächst nur regulatorische Funktionen besitzt, ist die Pathogenabwehrreaktion abhängig von dem mit einem solchen Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gen. Soweit mit dieser Erfindung nicht ausdrücklich einzelne für die Pathogenabwehr geeignete Gene beschrieben sind, kann der Fachmann aus bekannten Pathogenabwehrgenen auswählen und diese mit dem regulatorischen Nukleinsäuremolekül kombinieren. Eine gute Abwehrreaktion bei Pflanzen, insbesondere bei Beta vulgaris läßt sich allerdings dadurch erreichen, daß das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder der erfindungsgemäße chimäre Promotor mit einem Nekrose induzierendes Gen aus Phytophthora parasitica operativ verbunden wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird daher erstmals eine transgene Pflanze der Gattung Beta mit der Fähigkeit zur Abwehr von Nematoden bereitgestellt, bei der die Pathogenabwehrreaktion lokal auf den Bereich eines Syncytiums beschränkt ist, erhältlich durch Transformation einer Pflanzenzelle dieser Gattung mit einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Promotor nach Anspruch 3, wobei das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder der Promotor nach Anspruch 3 operativ mit einem Pathogenabwehrgen verbunden ist, und anschließender Regeneration der Pflanze. Dabei wird vorzugsweise ein Pathogenabwehrgen verwendet, bei dem es sich um ein Nekrose induzierendes Gen aus Phytophthora parasitica oder das Barnase-Gen handelt.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder 2 oder eines chimären Promotors nach Anspruch 3 zur pflanzlichen Pathogenabwehr, insbesondere von Nematoden.
Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit der Fähigkeit zur Pathogenabwehr, bei dem man eine Pflanzenzelle mit einem Pathogenabwehrgen transformiert und anschließend die Pflanze regeneriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pathogenabwehrgen unter die regulatorische Kontrolle eines Nukleinsäuremolekül bringt, wobei das Nukleinsäuremolekül

a. eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist oder
b. eine mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementäre Sequenz aufweist oder
c. ein Derivat der Sequenz gemäß a oder b aufweist oder
d. eine Sequenz aufweist, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert, und ein 5'-Ende und ein 3'-Ende besitzt, wobei stromaufwärts von dem 5'-Ende keine weiteren regulatorischen Sequenzen vorhanden sind, die eine pathogeninduzierte Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens derart beeinflussen, daß nach Pathogenbefall einer Pflanze neben einer lokalen Expression des Gens eine Genexpression auch in nicht vom Pathogenbefall unmittelbar betroffenen Gewebeteilen der Pflanze erfolgt.

Die Erfindung betrifft aber auch ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit der Fähigkeit zur Pathogenabwehr, bei dem man eine Pflanzenzelle mit einem Pathogenabwehrgen transformiert und anschließend die Pflanze regeneriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pathogenabwehrgen unter die regulatorische Kontrolle eines chimären Promotors bringt, wobei der chimäre Promotor zusammengesetzt ist aus

Beide Verfahren lassen sich vorzugsweise dazu verwenden, daß man die Abwehrreaktion der Pflanze gegenüber einem Befall von Nematoden stärkt. Insbesondere wird hierbei die Abwehrreaktion der Pflanze auf den Bereich eines Syncytiums gerichtet, wobei in anderen Gewebeteilen der Pflanze keine Abwehrreaktion auftritt. Das Verfahren wird bevorzugt zur Herstellung einer transgenen Pflanze der Art Beta vulgaris genutzt. Es läßt sich aber auch auf andere Pflanzen anwenden, die anfällig sind gegenüber einem Befall von Nematoden.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß SEQ ID NO. 1 oder 2 zur Identifizierung und Isolierung eines regulatorischen Nukleinsäuremoleküls in Pflanzen, das nach Pathogeninfektion der Pflanze eine lokale Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens steuert. Mit Hilfe dieser gut handhabbaren Sequenzen kann der Fachmann leicht zu anderen entsprechend kurzen und spezifischen regulatorischen Sequenzen oder Basispromotoren gelangen, die entsprechende Proteinbindungsdomänen aufweisen. Das methodische Vorgehen zum Auffinden homologer Sequenzen ist dem Fachmann bekannt, unter anderem aus WO 98/12335.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert.
Unter Verwendung eines Xhol/Xbal-Fragments (SEQ ID NO. 1) wurde ein Promotor-Gen-Konstrukt (1832XMT6) erstellt, das eine syncytienspezifische Expression eines Reportergens ermöglicht. Als Reportergen diente das sogenannte GUS-Gen, das dazu verwendet wurde, eine Genexpression in bestimmten Gewebebereichen nachzuweisen (Jefferson et al., 1987, EMBO Journal, Vol. 6: 3901–3907). Bei der mit Hilfe des GUS-Reportergen-Systems entstehenden Farbreaktion wird das Substrat 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glucuronsäure (X-Gluc) durch die β-Glucuronidase, welches durch das GUS-Gen kodiert wird, zu farblosem Indoxyl gespalten. Aus dieser Verbindung entsteht durch oxidative Dimerisierung das Endprodukt Indigoblau, welches nachzuweisen ist. Fusioniert man das GUS-Reportergen mit Promotor-DNA-Abschnitten, lassen sich Aussagen über die regulatorische Aktivität dieser Sequenzen machen. Zudem ist es mittels dieser Methode möglich, eine grobe quantitative Abschätzung der Expressionsintensität vorzunehmen. Zuckerrüben-hairy roots wurden für diese Analyse auf Saccharose-Medium ausgelegt und 7 Tage später mit Substrat-Lösung vollständig überdeckt. Eine Auswertung der GUS-Signale erfolgte nach einer Inkubation von 2 Tagen bei 37 °C.
Der Promotor des so hergestellten Promotor-GUS-Konstrukts (1832XMT6) hat sein 3'-Ende stromabwärts des nicht näher dargestellten Transkriptionsstarts an Position -29 vom Startkodon aus. Eine interne Xbal-Schnittstelle an dieser Position wurde genutzt, um das Fragment in den binären Vektor pBin19[GUS-Intr.] zu klonieren (1).
Zusätzlich zu dem Fusionskonstrukt 1832XMT6 wurde ein Vergleichskonstrukt 1832WXR2 hergestellt. Das Konstrukt 1832WXR2 überlappt mit dem Konstrukt 1832XMT6 (2). Im Gegensatz zu dem Konstrukt 1832XMT6 enthält das Konstrukt 1832WXR2 jedoch nicht die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1. 1832WXR2 umfaßt 888 Basenpaare und wurde mittels PCR unter Verwendung modifizierter Primer hergestellt. Am 5'-Ende wurde es auf diese Weise mit einer Xhol-Schnittstelle, am 3'-Ende mit einer Xbal-Schnittstelle ausgestattet und somit in definierter Orientierung in den binären Vektor pBin19[GUS-Intr.] kloniert.
Transgene hairy roots wurden dazu verwendet, die Expression des GUS-Reportergens unter der regulatorischen Kontrolle der Deletionsfragmente zu untersuchen. Sogenannte hairy roots entstehen nach Infektion von Pflanzen mit Agrobacterium rhizogenes. An der Infektionsstelle werden im Gegensatz zur Infektion durch Agrobacterium tumefaciens nur Adventivwurzeln in großer Zahl ausdifferenziert. Von Agrobacterium rhizogenes induzierte transgene Zuckerrüben hairy roots können in einem in vitro Nematodenresistenztest geprüft werden (Kifle, Dissertation 1998, Christian-Albrechts-Universität zu Kiel). Mit Hilfe dieses Experiments wurde die Aktivität der Fragmente nach einer Infektion mit Nematoden beobachtet. Für die GUS-Analyse wurden 1 – 2 etwa 2 cm lange Wurzelspitzen nach 21 Tagen Kultur entnommen und auf Medium umgesetzt. Nach 5 – 7 Tagen wurden die Wurzeln mit 150 J2-Nematodenlarven inokuliert und bei 24 °C im Dunkeln für 16 Tage gelagert. Durch die Zugabe des GUS-Substrates wurden die Nematoden in ihrer Entwicklung gestoppt. Die Wurzeln wurden für 48 Stunden bei 37 °C und Dunkelheit inkubiert. Unter der Stereolupe wurde das Auftreten einer GUS-Färbung bei einer 10- bis 40fachen Vergrößerung im Durchlicht untersucht und fotografisch dokumentiert. Die GUS-Versuche wurden mit 3 Kulturen je individueller Wurzel mit jeweils 2 Wiederholungen durchgeführt. Als Positivkontrollen diente eine Wurzelkultur, die mit einem CaMV35S-GUS-Fusionskonstrukt transformiert war. Als Negativkontrolle dienten 5 Wurzelkulturen transformiert mit dem pBin19[GUS-Intr.]-Vektor.
Nach 2 zeigen die verwendeten Promotordeletionskonstrukte deutliche Unterschiede in der räumlichen Lokalisation der beobachteten GUS-Signale. Es zeigten sich Unterschiede in dem Muster und der Intensität der GUS-Signale im Vergleich zu den Kontrollen. Innerhalb der Negativ-Kontrollwurzeln kam es zu keiner GUS-Färbung, das Reportergen wurde nicht exprimiert. Wurzeln, die das Fusionskonstrukt 1832XMT6 enthielten, zeigten nach Nematodeninokulation eine schwache Promotoraktivität, die auf Syncytien beschränkt war. Alle übrigen Gewebe der Wurzeln zeigten keinerlei GUS-Färbung. Ohne Nematodeninfektion wurde das Reportergen nicht exprimiert.
Die histochemische Untersuchung der 1832WXR2-Wurzeln ergab eine überdurchschnittlich starke GUS-Expression. Bei den Inokulationsversuchen zeigten die mit diesem Konstrukt transformierten Wurzeln eine starke GUS-Färbung, die sich über unterschiedlich große Bereiche der Wurzel hinweg erstreckte und deren Lokalisation nicht mit der Nematodeninfektion in Verbindung zu bringen war. Der Promotorabschnitt des Konstrukts 1832WXR2 ist folglich in der Lage, als eigenständiger regulativer Bereich eine konstitutive Genexpression zu kontrollieren, die unspezifisch und nicht auf Syncytien beschränkt ist (2).
Durch weitere Versuche konnte gezeigt werden, daß Proteine aus isolierten Zellkernen von Zuckerrübenpflanzen an die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 binden, nachdem eine Infektion der Zuckerrübenpflanzen durch Nematoden erfolgte. Ohne Nematodenbefall konnte eine solche Proteinbindung nicht nachgewiesen werden. Der Nachweis konnte mit Hilfe eines Electrophoresis Mobility Shift Assays (EMSA) erbracht werden. Markierte doppelsträngige DNA-Fragmente werden hierzu auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen, daneben ein DNA-Proteingemisch. Kommt es zu einer DNA-Protein-Interaktion, wird ein Teil der radioaktiv markierten Moleküle in seiner Bewegung im elektrischen Feld verlangsamt und ein sogenannter shift entsteht.
Nachdem die Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 in ca. 7 gleichgroße Fragmente A–G unterteilt wurde (3), konnte eine Proteinbindung nur an dem Fragment A nachgewiesen werden (4). Das Fragment A wurde weiter in 5 sich überlappende Abschnitte (A1-A5) geteilt. Mit Hilfe der gelshift-Analyse war deutlich zu erkennen, daß die Fragmente A4 und A5 durch eine Proteinbindung bei ihrer Wanderung im elektrischen Feld gebremst werden. Diese Ergebnisse belegen, daß im Sequenzbereich, der durch die Fragmente A4 und A5 abgedeckt wird, eine spezifische Proteinbindung stattfindet, so daß die Proteinbindedomäne auf diese Region eingegrenzt werden kann (5). Die Position der Proteinbindedomäne belegt, daß gerade die Sequenzabschnitte A4 und A5 (SEQ ID NO. 2) für die hochspezifische und lokale Induktion verantwortlich sind.
Beispiele für Promotor-Gen-Fusionen
Wenn nicht anders angegeben, wurden alle rekombinanten DNA Techniken so durchgeführt, wie in Sambrock (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY angegeben.
1. Transformation von Zuckerrübenpflanzen
Die Promotorfragment-Gen-Fusion XMT6-NPP1 wurde in einen binären Vektor kloniert und eingesetzt zur Transformation von Pflanzen der anfälligen Zuckerrübenlinien VRB und 8T0015 wie beschrieben bei D'Halluin et al. (1992), Biotechnology Vol. 10, 309 – 314. Es wurden 17 Pflanzen als transgen mittels PCR identifiziert. Der Phänotyp dieser transgenen Linien unterscheidet sich nicht vom Phänotyp der jeweiligen Ausgangslinien.
Die Wurzeln von 10 der 17 transgenen Pflanzen wurden einem in vitro Nematoden Resistenztest unterzogen. Dabei wurden Pflanzen mit gegenüber der anfälligen Kontrolle deutlich reduzierter Zystenzahl gefunden. Eine Pflanze NR73-7 wies mit durchschnittlich 3 Zysten im Vergleich zu durchschnittlich 25 Zysten bei der anfälligen Kontrolle eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Nematoden auf. Acht Wochen nach Inokulation wurde der Inhalt der Zysten an den Wurzeln der Pflanze NR73-7 untersucht. Zum Zeitpunkt der Untersuchung des Zysteninhalts waren die Zysten immer noch sehr klein und weniger reif als bei nicht transgenen Pflanzen. Von 17 untersuchten Zysten war die überwiegende Zahl sehr klein (ca. 5 – 20 Larven). Dieses Beispiel zeigt, daß eine Resistenz gegen Nematoden erreicht werden kann.
2. Transformation von Kartoffelpflanzen
Das Fusionskonstrukt XMT6-NPP1 kann mittels Agrobacterium Transformation in anfällige Kartoffellinien wie beispielsweise die Linie Desirée eingebracht werden. Derart transgene Linien sind resistent gegen Nematoden, wie zum Beispiel solchen der Gattungen Globodera oder Meloidogyne.
3. Fusion XMT6-Barnase
Das Fusionskonstrukt XMT6-Barnase wurde über den Vektor pBin19 mittels A. rhizogenes in die anfällige Zuckerrübenlinie 93161 eingebracht. Als Kontrollen wurden der Vektor pBin19 ohne Fusionskonstrukt sowie der Wildtyp A. rhizogenes eingesetzt. Anhand des Transformationsergebnisses und des anschließenden Resistenztests konnte gezeigt werden, daß auch mit dem Fusionskonstrukt XMT6-Barnase eine Resistenz erreicht werden konnte. Transgene Linien und Kontrollen wurden mit je 6 Wiederholungen geprüft. Die Transformanten wiesen gegenüber den Kontrollen eine um ca. 70 % geringere Zystenzahl auf. Insbesondere konnte gezeigt werden, daß die Kontrolle der Expression durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül so spezifisch auf die Syncytien beschränkt war, daß es zu keiner erkennbaren Schädigung der übrigen Wurzelbereiche kommt.
4. Fusion eines chimären Promotors mit dem Barnase- oder NPP1-Gen
Chimäre Promotoren, die aus verschiedenen Elementen bestehen, können in Verbindung mit einem Resistenzgen eine Abwehrreaktion in Pflanzen hervorrufen, ohne schädliche Effekte in nicht infizierten Zellen der Pflanze zu bewirken. Ein geeignetes Konstrukt besteht beispielsweise aus dem 35S Minimalpromotor (–46 bis +8) mit dem spezifisch Nematoden responsiven Promotorfragment gemäß SEQ ID NO. 2. Zwischen die beiden Elemente läßt sich vorzugsweise eine Spacer-Region einsetzen, um Schwierigkeiten aufgrund von sterischen Behinderungen zu vermeiden. Eine solche Promotorkassette kann mit dem Barnase-Gen oder mit dem NPP1-Gen verbunden und in einen Vektor kloniert werden. Mit diesem Konstrukt lassen sich transgene und resistente Zuckerrübenpflanzen herstellen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, das a. eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist oder b. eine mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementäre Sequenz aufweist oder c. ein Derivat der Sequenz gemäß a oder b aufweist oder d. eine Sequenz aufweist, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert, und das ein 5'-Ende und ein 3'-Ende besitzt, wobei stromaufwärts von dem 5'-Ende keine weiteren regulatorischen Sequenzen vorhanden sind, die eine pathogeninduzierte Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens derart beeinflussen, daß nach Pathogenbefall einer Pflanze neben einer lokalen Expression des Gens eine Genexpression auch in nicht vom Pathogenbefall unmittelbar betroffenen Gewebeteilen der Pflanze erfolgt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül zur Regulation der Genexpression in Pflanzen, bestehend aus a. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder b. einer mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementären Sequenz oder c. einem Derivat der Sequenz gemäß a oder b oder d. einer Sequenz, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert und der Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 entspricht.
Chimären Promotor, der zusammengesetzt ist aus a. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder b. einer mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 komplementären Sequenz oder c. einem Derivat der Sequenz gemäß a oder b oder d. einer Sequenz, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert sowie e. einem Minimalpromotor.
Vektor oder mobiles genetisches Element, in den/das ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Promotor nach Anspruch 3 integriert wurde.
Eukaryotische oder prokaryotische Zelle, in deren Genom ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder ein Promotor nach Anspruch 3 integriert wurde.
Transgene Pflanze oder deren Teile mit Zellen gemäß Anspruch 5.
Transgene Pflanze oder deren Teile nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder der Promotor nach Anspruch 3 mit einem Gen operativ verbunden ist.
Transgene Pflanze oder deren Teile gemäß Anspruch 6, die eine Resistenz gegenüber pathogenen Nematoden aufweisen.
Transgene Pflanze oder deren Teile nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Gen um ein Pathogenabwehrgen handelt.
Transgene Pflanze mit der Fähigkeit zur Abwehr von Nematoden, bei der die Pathogenabwehrreaktion lokal auf Zellen der Pflanze im Bereich einer Nematodenbefallsstelle beschränkt ist, erhältlich durch Transformation einer Pflanzenzelle mit einem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder einem Promotor nach Anspruch 3, wobei das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2 oder der Promotor nach Anspruch 3 operativ mit einem Pathogenabwehrgen verbunden ist, und anschließender Regeneration der Pflanze.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze ausgewählt ist aus einer der Pflanzengattungen Beta, Brassica, Solanum oder Glycine und insbesondere eine Pflanze der Art Beta vulgaris ist.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Pathogenabwehrgen um Nekrose induzierendes Gen aus Phyfophthora parasitica handelt.
Transgene Pflanze nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Pathogenabwehrgen um das Barnase-Gen handelt.
Saatgut von Pflanzen nach einem der Ansprüche 6 bis 13.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 oder 2 oder eines chimären Promotors nach Anspruch 3 zur pflanzlichen Pathogenabwehr, insbesondere von Nematoden.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls gemäß SEQ ID NO. 1 oder 2 zur Identifizierung und Isolierung eines regulatorischen Nukleinsäuremoleküls in Pflanzen, das nach Pathogeninfektion der Pflanze eine lokale Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens steuert.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit der Fähigkeit zur Pathogenabwehr, bei dem man eine Pflanzenzelle mit einem Pathogenabwehrgen transformiert und anschließend die Pflanze regeneriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pathogenabwehrgen unter die regulatorische Kontrolle eines Nukleinsäuremolekül bringt, wobei das Nukleinsäuremolekül a. eine Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist oder b. eine mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 1 komplementäre Sequenz aufweist oder c. ein Derivat der Sequenz gemäß a oder b aufweist oder d. eine Sequenz aufweist, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert, und ein 5'-Ende und ein 3'-Ende besitzt, wobei stromaufwärts von dem 5'-Ende keine weiteren regulatorischen Sequenzen vorhanden sind, die eine pathogeninduzierte Expression eines mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verbundenen Gens derart beeinflussen, daß nach Pathogenbefall einer Pflanze neben einer lokalen Expression des Gens eine Genexpression auch in nicht vom Pathogenbefall unmittelbar betroffenen Gewebeteilen der Pflanze erfolgt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit der Fähigkeit zur Pathogenabwehr, bei dem man eine Pflanzenzelle mit einem Pathogenabwehrgen transformiert und anschließend die Pflanze regeneriert, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pathogenabwehrgen unter die regulatorische Kontrolle eines chimären Promotors bringt, wobei der chimäre Promotor zusammengesetzt ist aus a. einer Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder b. einer mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO. 2 komplementären Sequenz oder c. einem Derivat der Sequenz gemäß a oder b oder d. einer Sequenz, die mit einer der Sequenzen gemäß a bis c hybridisiert sowie e. einem Minimalpromotor.
Verfahren nach Anspruch 17 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man die Abwehrreaktion der Pflanze gegenüber einem Befall von Nematoden stärkt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Abwehrreaktion der Pflanze auf den Bereich eines Syncytiums richtet und in anderen Gewebeteilen der Pflanze keine Abwehrreaktion auftritt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Pflanze um Beta vulgaris handelt.