DE10040179A1 - Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen - Google Patents
Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen PflanzenInfo
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Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Metall-bindendes Protein und ein Verfahren zur Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen mittels Expression des Metall-bindenden Proteins.
Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Metall-bindendes Protein und ein Verfahren zur
Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen mittels Expression des
Metall-bindenden Proteins.
Mikronährstoffe, wie z. B. Eisen, Zink, Kupfer und Mangan, werden von der Pflanze aus dem
Boden aufgenommen und akropetal durch das Xylem in den oberirdischen Teilen der Pflanze
verteilt. Von diesen Speicherorten erfolgt über das Phloem eine gezielte Verteilung der
Mikronährstoffe zu bedürftigen Organen und Geweben. Richtung und Intensität dieser
Remobilisierung hängen von den Entwicklungsstadien und von Umweltfaktoren ab.
Bei der Verteilung von Metallen durch Langstreckentransport im Phloem während der
Entwicklung und in Reaktion auf das Mikronährstoffangebot spielen Metall-bindende
Proteine eine wichtige Rolle. Durch die Auffindung solcher Metall-bindenden Proteine und
ihre Expression in transgenen Pflanzen sollte es möglich sein, die Verteilung von Metallen zu
beeinflussen. So könnte die pflanzliche Verteilung essentieller wie toxischer Metalle
manipuliert werden. Auch die Wirkung von Umweltfaktoren wie Temperatur- und
Wasserstreß könnte durch Expression eines geeigneten Metall-bindenden Proteins beeinflußt
werden. Da entwicklungsspezifische Vorgänge wie Keimung, Wachstum, Reproduktion und
Seneszenz mit zum Teil drastischen Mikronährstoffumlagerungen einhergehen, können diese
Prozesse in transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Expression eines Metall-
bindenden Proteins beeinflußt werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Metall-bindendes Protein
aufzufinden, das sich für die Beeinflussung der Verteilung von Metallen durch Langstrecken
transport im Phloem von transgenen Pflanzen eignet.
Diese und weitere Aufgaben werden durch die in den Patentansprüchen definierten
Ausführungsformen gelöst.
Es wurde jetzt überraschenderweise im Phloemsaft von Ricinus communis-Keimlingen ein
Protein gefunden, das Eisen und andere Metalle bindet und über längere Strecken
transportiert.
Das erfindungsgemäße Protein eignet sich aufgrund seiner Eigenschaften für die Steigerung
des Pflanzenwachstums, die Erhöhung der Mikronährstoffeffizienz, die Verbesserung der
Spurenelementzusammensetzung von Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung
und die Steigerung der pflanzlichen Toleranz gegen toxische Schwermetalle.
Das Protein wird im folgenden als Metall-bindendes Protein, abgekürzt MBP bezeichnet.
Die Erfindung betrifft somit ein pflanzliches Metall-bindendes Protein, das natürlicherweise
im Phloem vorkommt und dessen Aminosäuresequenz die Aminosäureabfolgen
IEETLHIGGHKEEH und EGFMDK aufweist (vom N-Terminus in Richtung C-Terminus).
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich um ein Protein, das im Phloemsaft von
Ricinus communis vorkommt.
Den obigen Aminosäureabfolgen zufolge weisen die erfindungsgemäßen eine gewisse
Homologie zu LEA-Proteinen auf, wie z. B. dem SCR1-Protein aus Glycine max, dem
COR11-Protein aus Citrus vulgaris und dem S-linked protein aus Nicotiana tabacum. Die als
LEA (Late Embryogenesis Abundant)-Proteine bezeichneten Proteine bzw. deren cDNAs
wurden zuerst durch differentielles Absuchen oder subtraktive Hybridisierung von cDNA-
Banken aus reifen und unreifen Samen gefunden. Später kamen in der Primärstruktur
verwandte Proteine hinzu, die bei Trockenstreß und Abscissinsäuregabe induziert werden. Die
Aminosäuresequenz der LEA-Proteine erlaubt eine Einteilung in mindestens 6 Klassen.
Gemeinsam ist allen ein relativ hoher Gehalt an Glycin sowie polaren Resten. Entsprechend
sind die Proteine extrem hydrophil und weisen eine "random coil"-Sekundärstruktur auf. Die
meisten dieser Proteinen haben ein Molekulargewicht zwischen 8 und 16 kD, aber auch
Proteine mit einem MG von 40-60 kD und LEA-Ähnlichkeit sind bekannt.
Die molekulare Funktion der LEA-Proteine ist weitgehend unklar. Sie könnte in der Bindung
von Wasser bei Trockenstreß bestehen oder in der filmartigen Anlagerung an cytosolische
Proteine als Schutzmechanismus. Neben Trockenstreß werden Mitglieder der Familie auch
durch Temperaturstreß induziert. Sie kommen vermutlich ubiquitär in Pflanzen vor.
Funktional verwandte Proteine treten offenbar in allen Organismengruppen auf.
LEA-Proteine wurden allerdings bisher nicht im Zusammenhang mit der Bindung oder
Verteilung von Metallen in Pflanzen beschrieben.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Metall-bindenden
Protein ein Protein verstanden, das in nativer Konformation die Metalle des Periodensystems
mit unterschiedlicher Affinität bindet. Bevorzugt handelt es sich bei dem Metall-bindenden
Protein um ein Protein, das in Pflanzen vorkommende essentielle wie toxische Metallionen,
zumindest aber Fe(III), Fe(II), Zn, Cu und Mn reversibel bindet.
Die Erfindung betrifft weiter Oligonukleotide, die zur Amplifizierung der für das
erfindungsgemäße Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenz mittels PCR
(Polymerase Chain Reaction) eingesetzt werden können und eine erfolgreiche Isolierung der
DNA-Sequenz gewährleisten.
Bei den erfindungsgemäßen PCR-Primern handelt es sich um folgende Oligonukleotide:
Zur Isolierung der für die erfindungsgemäßen Metall-bindenden Proteine kodierenden DNA-
Sequenz werden die Oligonukleotide wie folgt verwendet:
Die obigen drei Oligonukleotide werden in den beiden möglichen Kombinationen (also a) und c) unten oder b) und c) unten) als PCR-Primer eingesetzt. Die PCR-Reaktion erfolgt mit cDNA von R. communis-Keimlingen als Template. Dazu wird Gesamt-RNA und daraus mRNA durch kommerzielle Isolierungsverfahren gewonnen (Qiagen, Hilden). Die Synthese von cDNA erfolgt durch das Marathon-System (Clontech, Heidelberg).
Die obigen drei Oligonukleotide werden in den beiden möglichen Kombinationen (also a) und c) unten oder b) und c) unten) als PCR-Primer eingesetzt. Die PCR-Reaktion erfolgt mit cDNA von R. communis-Keimlingen als Template. Dazu wird Gesamt-RNA und daraus mRNA durch kommerzielle Isolierungsverfahren gewonnen (Qiagen, Hilden). Die Synthese von cDNA erfolgt durch das Marathon-System (Clontech, Heidelberg).
Zusammensetzung der PCR-Reaktion: Primer (je 1-100 µmol), cDNA (0,01-10 µg),
hitzestabile DNA-Polymerase und Puffer nach Herstellerangaben unter Anwendung von
Standard PCR-Optimierungs-Kits (z. B. Pwo, Taq, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
PCR-Programm: 1 min bei 94°C; 0,5-3 min bei 30-60°C; 1 min bei 72°C. Die optimale
Annealing-Temperatur wird durch Gradienten-PCR im angegebenen Temperaturbereich
bestimmt.
PCR-Produkte werden nach Standardverfahren gereinigt und kloniert (z. B. in pCAP-Vektor,
Roche Diagnostics GmbH). Verifizierung der klonierten PCR-Produkte erfolgt durch DNA-
Sequenzierung nach Standardverfahren und Vergleich der translatierten Aminosäuresequenz
mit den vorliegenden internen Peptidsequenzen.
Isolierung der full length-cDNA kann durch eines der folgenden Verfahren erfolgen:
- 1. PCR-Reaktion mit den 5'- bzw. 3'-Adapter-Primern des Marathon (Clontech)-cDNA-Pools in entsprechender Kombination mit internen, auswärts gerichteten Primern des klonierten und verifizierten PCR-Produkts. Klonierung der PCR-Produkte wie oben beschrieben und anschließendes Zusammenfügen der DNA-Fragmente zur vollständigen cDNA durch Klonierung an geeigneten Restriktionsschnittstellen.
- 2. RACE-Protokoll 5' und 3' mit internen Primern wie unter 1. angegeben (RACE-Kit von Roche Diagnostics GmbH). Erstellen der vollständigen cDNA wie unter 1.
- 3. Absuchen einer cDNA-Phagenbank, erstellt von Keimlingen von R. communis, mit dem radioaktiv markierten PCR-Produkt nach Standardverfahren. Die Herstellung kann z. B. im Phagen λgt11 nach Herstellerangaben (Promega, Mannheim) erfolgen.
Die vollständige cDNA wird in geeignete binäre Vektoren kloniert, z. B. pBI101 (Clontech),
der für konstitutive Expression durch den CMV 35S Promotor geeignet ist.
Es ist für den Fachmann klar, dass z. B. die Position "N" (= G, A, T oder C) im
Oligonukleotid durch Inosin ersetzt werden kann. Grundsätzlich besteht aber auch immer die
Möglichkeit mehrere Oligonukleotide einzusetzen, um alle Möglichkeiten abzudecken.
Die DNA-Sequenz, die ein erfindungsgemäßes Metall-bindendes Protein kodiert, kann aus
natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden. Mittels
gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte Konstrukte für die Transfor
mation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die für die gentechnische Mani
pulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten Klonierungs-, Mutagenisie
rungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere biochemisch-molekularbiolo
gischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. So können nicht nur
geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von Promotor und MBP-DNA-
Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder Signalsequenzen hergestellt werden,
vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich mittels Routmetechniken,
verschiedenartige Mutationen in die das Metall-bindende Protein kodierende DNA-Sequenz
einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell veränderten biologischen
Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von Deletionsmutanten möglich,
bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-Ende der kodierenden DNA-
Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht werden kann. Ferner ist es
möglich, gezielt Proteine herzustellen, die durch Addition entsprechender Signalsequenzen in
bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert sind. Derartige Sequenzen sind in
der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt (siehe z. B. Braun et
al. (1992) EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter F. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85: 846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1: 95-106). Weiterhin ist auch die Einführung
von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen eine Veränderung der Aminosäure
sequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Bindungsaffinität oder -spezifität oder die
Regulierung des Proteins hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt werden, die
nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanismen über
allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Weiterhin können
Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder pH-Profil
aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungs
gemäßen DNA-Sequenzen oder Teile davon in Plasmide eingebracht werden, die eine
Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-Sequenzen
erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al. (1989), vide supra)
können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische Sequenzen
hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander können an die
Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner können mittels
enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen zur Verfügung
gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden. Wo Inser
tionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese,
"primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analysemethoden werden
im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere biochemisch-molekular
biologische Methoden durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die DNA-Sequenz, die das erfindungsgemäße
Metall-bindende Protein kodiert, mindestens eine Nukleotidsequenz auf, ausgewählt aus der
Gruppe bestehend aus:
- a) C A T/C A A A/G G A G/A G A G/A C A T/C
- b) C A T/C A T T/C/A G G N G G N C A T/C
- c) G A G/A G G N T T T/C A T G G A T/C A A A/G
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform stammt die beschriebene, für ein Metall
bindendes Protein kodierende DNA-Sequenz aus Ricinus communis.
Für die Expression der DNA-Sequenz in pflanzlichen Zellen ist diese mit regulatorischen
Sequenzen verknüpft, die die Transkription in pflanzlichen Zellen gewährleisten. Hier kommt
jeder in pflanzlichen Zellen aktive Promotor in Frage. Dabei können die für das erfindungs
gemäße Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenzen mittels herkömmlicher
molekularbiologischen Methoden (siehe z. B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
New York) mit regulatorischen Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors
verknüpft werden.
Der Promotor kann so gewählt sein, dass die Expression konstitutiv erfolgt oder nur in einem
bestimmten Gewebe oder Organ, zu einem bestimmten Zeitpunkt der Pflanzenentwicklung
und/oder zu einem durch äußere Einflüsse, biotische oder abiotische Stimuli bestimmten
Zeitpunkt (induzierte Genexpression). In Bezug auf die zu transformierende Pflanze kann der
Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z. B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und
der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression, ein Promotor, der eine
Expression lediglich in photosynthetisch aktiven Geweben garantiert, z. B. der ST-LS1-
Promotor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7943-7947; Stockhaus et al.
(1989) EMBO J. 8: 2445-2451) oder ein Promotor, der während der Pflanzentransformation,
der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv ist, wie z. B.
zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) InVitro
Cell Cev. Biol. Plant 29: 27-32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor-System (Gatz
et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229-237). Weitere geeignete Promotoren können der
Literatur, z. B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22: 361-366), entnommen werden. Gleiches gilt für
induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristem-spezifische
Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der
Erfindung ebenfalls geeignet sind.
Besonders bevorzugt sind Phloem-spezifische Promotoren, am meisten bevorzugt
Geleitzellen-spezifische Promotoren. Hier sind als Beispiele zu nennen der rolC-Promotor
von Agrobacterium rhizogenes (Schmülling et al. (1989) Plant Cell 1: 665-670) und der
AtSUC2 Saccharose-Symporter-Promotor von Arabidopsis thaliana (Imlau et al. (1999) Plant
Cell 11: 309-322).
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendi
gung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript
dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird.
Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z. B. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29)
und beliebig austauschbar, z. B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium
tumefaciens.
Die für das MBP kodierende Sequenz kann in sense- oder antisense-Orientierung vorliegen.
Soll die endogene MBP-Aktivität in der transgenen Pflanze unterdrückt werden, wird die
Expression endogener MBP-Sequenzen durch Antisense- oder Co-Suppression verringert
bzw. ausgeschaltet.
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen
eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.
coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, Ml3mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün
schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt
werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen
det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und an
schließend geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysen
methode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen
Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische
Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und
gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Die erfindungsgemäßen Vektoren und Nukleinsäuremoleküle können weitere regulatorische
Sequenzen und/oder Funktionseinheiten besitzen, die z. B. als Enhancer wirken oder eine
Stabilisierung des Vektors in der Wirtszelle bewirken. Wie oben erwähnt, können die
kodierenden Sequenzen auch durch Signalsequenzen ergänzt sein, die für den Transport des
Genprodukts zu einem bestimmten Kompartiment sorgen.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, die erfindungsgemäße rekombinante Nuklein
säuremoleküle oder Vektoren enthalten, wobei die Moleküle oder Vektoren transient oder
stabil vorliegen können. Wirtszelle kann dabei jede Zelle und jeder Organismus sein, die bzw.
der in der Lage ist, rekombinante DNA aufzunehmen und ggf. aufgenommene DNA-Sequenz
zu exprimieren. Hier kommen prokaryontische und eukaryontische Zellen bzw. Organismen
in Frage, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien, Viren, Pilze, Hefen und Algen, aber
auch Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle oder Vektoren oder
Teile oder Derivate davon enthalten.
Durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und
Vektoren ist es möglich, Pflanzen zu erzeugen, die eine im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen
veränderte Verteilung von Metallen aufweisen.
Weiter kann die Akkumulation von toxischen und nicht-toxischen Metallen in
Pflanzenorganen beeinflußt werden. Hierdurch können eine erhöhte Mikronährstoffeffizienz
und/oder eine erhöhte Metalltoleranz in Kulturpflanzen erzielt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit auch ein Verfahren zur Erzeugung von transgenen
Pflanzen mit veränderter Verteilung von Metallen, umfassend die Schritte:
- a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend
- a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors;
- b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz, die ein Metall-bindendes Protein kodiert, operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Terminations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können,
- b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus i) auf Pflanzenzellen.
In der Regel werden im Anschluß an die Übertragung des Nukleinsäuremoleküls auf
Pflanzenzellen aus den transformierten Pflanzenzellen transgene Pflanzen regeneriert.
Voraussetzung für die Einführung der erfindungsgemäßen rekombinanten Nukleinsäure
moleküle und Vektoren in Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformations
systeme. Hier wurde während der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transfor
mationsmethoden entwickelt und etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation
pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder
Agrobacterium rhizogenes als Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den
direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von
DNA in Pflanzenzellen, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie
weitere Möglichkeiten, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos
ermitteln kann. Sämtliche Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und
gehören zweifelsohne zum Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekular
biologie, Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe
ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten
Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen
aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesen
heit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen
Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker
auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-
Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti-
oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die
rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken
bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation
Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer
den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme
diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA
sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert
werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region.
Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas
mids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon
jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E coli als auch in Agrobakterien replizieren.
Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der
rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro
bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid,
das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die
Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor
mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen
dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und
ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans
formation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßiger
weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus
dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch
Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten
Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten
kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der
Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle
erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen
zellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418,
Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Genta
mycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die
Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestat
ten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker
(wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek
tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf
einhergeht. Falls der eingesetzte Selektionsmarker nach erfolgter Transformation und
Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll,
stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z. B.
sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z. B. in Form der Retransformation
einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach
erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z. B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Lloyd et al.
(1994) Mol. Gen. Genet. 242: 653-657; Mäser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176;
Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch
durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli
chen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedium und Phytohormone.
Die so erhaltenen Pflanzen können dann, falls erwünscht, mittels üblicher Verfahren,
einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, oder bioche
mischer Verfahren auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein erfindungsgemäßes
Metall-bindendes Protein kodiert, untersucht werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Regeneration von transformierten Pflan
zenzellen erhältlichen transgenen Pflanzen. Bei der transgenen Pflanze bzw. den transgenen
Pflanzenzellen kann es sich um jede beliebige monokotyle oder dikotyle Pflanze bzw.
Pflanzenzelle handeln, vorzugsweise handelt es sich um Nutzpflanzen bzw. Zellen von
Nutzpflanzen. Besonders bevorzugt handelt es sich um Weizen, Gerste, Reis, Kartoffel,
Citrusfrüchte, Raps, Rübe und Futterpflanzen und -gräser.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial transgener Pflanzen,
deren Zellen oder Geweben ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül enthalten und eine
veränderte Verteilung von Metallen aufweisen. Bei den Ernteprodukten und dem Vermeh
rungsmaterial handelt es sich insbesondere um Früchte, Samen, Knollen, Wurzelstöcke,
Sämlinge, Stecklinge, etc.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die
Expression der für das Metall-bindende Protein kodierenden DNA-Sequenz steht, steht dem
Fachmann ein breites Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren
für die Analyse der transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile,
Ernteprodukte und Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z. B. PCR, Northern Blot-Analyse
zum Nachweis von MBP-spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der Akkumu
lation von MBP-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur Identifizierung von MBP
kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot-Analyse zum Nachweis des durch die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten Metall-bindenden Proteins. Selbstver
ständlich kann der Nachweis des Proteins auch durch Bindungsstudien mit Metallen erfolgen.
Weiter kann man z. B. den durch Selbstung oder Kreuzungen erhaltenen Samen auf Medium
auslegen, das das zu dem zusammen mit der MBP-DNA-Sequenz übertragenen Selektions
marker passende Selektionsmittel enthält, und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums
der Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der
jeweiligen Pflanze schließen.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen, die ein erfindungs
gemäßes Metall-bindendes Protein kodieren, für die Erzeugung von Pflanzen, die eine erhöhte
Mikronährstoffeffizienz aufweisen, besonders bevorzugt durch Expression der MBP-
kodierenden Sequenz unter Kontrolle eines Phloem-spezifischen Promotors. Hierdurch kann
das Pflanzenwachstum verbessert werden.
Weiter können die MBP-kodierenden Sequenzen genutzt werden, um den Mikronährstoff
gehalt in Pflanzenteilen zu steigern, die zur menschlichen und tierischen Ernährung dienen.
Hier sind besonders solche Promotoren als regulatorische Sequenzen geeignet, die eine
gewebe- bzw. organspezifische Expression des MBP vermitteln, also vor allem Samen-,
Frucht-, Blatt-, Knollen- oder Wurzel-spezifische Promotoren.
Eine weitere sinnvolle Anwendung besteht in der Verbesserung der Toleranz gegenüber
Mikronährstoffkonzentrationen im Boden, die im Pflanzenanbau für Nahrungs- und
Futtermittelzwecke zu hoch sind. Hier kann die endogene MBP-Expression durch konstitutive
Co- oder Antisense-Suppression des MBP in allen Organen gehemmt werden.
Dagegen kann die Toleranz gegenüber toxischen Metallen durch konstitutive Expression des
MBP in allen Organen erhöht wetden. In diesem Zusammenhang ist der Einsatz zur
Phytoremediation zu nennen.
Weitere Anwendungsbereiche des MBP können im technischen oder Umwelt-Bereich liegen.
So kann die Expression des Wildtyp-Proteins oder eines durch Mutation veränderten Derivats
des MBP mit geeigneten Bindungsaffinitäten für Metalle für den Entzug der Metalle aus
Lösungen oder Abwässern eingesetzt werden.
Schließlich kann die im Phloemtransport begründete reversible Natur der Metallbindung
genutzt werden, um katalytische Metalle wie Zn, Mn, Cu, Fe in in vitro isolierte oder
rekombinant hergestellte technische Enzyme oder Proteine einzufügen, die solche Metalle
benötigen (z. B. Lipoxygenasen).
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, ohne diese in irgendeiner
Weise einzuschränken.
Das MBP kann durch folgendes Reinigungsverfahren rein dargestellt werden:
1 ml unbehandelter Phloemsaft von Ricinus communis (180 µg Protein, Proteinmengen
bestimmung nach Bradford (1976, Anal. Biochem. 84: 248-254) wird mittels einer NAP-10-
Säule (Amersham-Pharmacia, Freiburg) in 2 ml Startpuffer äquilibriert (Startpuffer: 20 mM
HEPES pH 7,2; 1 M NaCl).
Eine HiTrap-Affinitätssäule (von Pharmacia) mit einem Volumen von 1 ml wird mit 0,5 ml
0,1 M FeCl3 (oder: ZnCl2, CuCl2, FeCl2, MnCl2) beladen. Dann wird Phloemsaft-Protein
aufgetragen, und anschließend wird die HiTrap-Affinitätssäule mit 5 ml Startpuffer plus
250 mM Imidazol gewaschen. Die Elution erfolgt mit 5 ml Startpuffer plus 400 mM Imidazol und
ergibt 16 µg des MBP.
Die anschließende SDS-PAGE-Analyse mit Silbernitrat-Färbung zeigt ein einzelnes Protein
von 17-18 kD.
Mittels dieses Verfahrens kann das MBP auch aus Gesamtproteinextrakten von Endosperm,
Cotyledonen und Hypokotyl gereinigt und nachgewiesen werden.
Das Protein enthält Eisen, wenn es aus nativem Phloemsaft isoliert wird. Nach Fütterung von
Ricinus-Cotyledonen mit radioaktivem Eisen ist das Protein nach Isolierung aus Phloemsaft
im gelelektrophoretischen Test mit Eisen markiert (in vivo-Nachweis).
Nach gelelektrophoretischer Auftrennung von Phloemsaft kann dieses auf einer Membran
immobilisierte Protein radioaktives Eisen binden (in vitro-Nachweis).
Das Protein kann durch eine Eisen-Affinitätschromatographie zur gelelektrophoretischen
Homogenität gereinigt werden. In diesem Nachweisverfahren bindet das Protein an Fe3+,
Zn2+, Cu2+, Mn2+. An diesen Metallen gereinigtes und wieder befreites Protein bindet in freier
Lösung an die genannten Metalle.
Das Protein hat in apparentes Molekulargewicht von 16-17 kD und einen isoelektrischen
Punkt von pH 7,1-7,3.
Das MBP wurde mittels Edman-Abbau partiell sequenziert und davon die folgenden
Peptidsequenzen erhalten:
- 1. IEETLHIGGHKEEH
- 2. EGFMDK
Unter Verwendung folgender Oligonukleotide als PCR-Primer:
5'-CAT/C AAA/G GAG/A GAG/A CA-3' (oben erwähnter Primer a))
5'-TT A/GTC CAT G/AAA NCC C/TTC-3' (oben erwähnter Primer c))
wird die PCR-Reaktion nach dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt. Amplifiziert wurde ein ca. 140 bp langes Fragment, das in ein geeignetes Plasmid kloniert und nach Standardverfahren sequenziert wurde.
5'-CAT/C AAA/G GAG/A GAG/A CA-3' (oben erwähnter Primer a))
5'-TT A/GTC CAT G/AAA NCC C/TTC-3' (oben erwähnter Primer c))
wird die PCR-Reaktion nach dem oben beschriebenen Protokoll durchgeführt. Amplifiziert wurde ein ca. 140 bp langes Fragment, das in ein geeignetes Plasmid kloniert und nach Standardverfahren sequenziert wurde.
Dieses PCR-Produkt wurde anschließend zur Isolierung der vollständigen cDNA eingesetzt.
Hierbei wurde zum einen eine PCR-Reaktion mit den 5'- bzw. 3'-Adapter-Primern des
Marathon (Clontech)-cDNA-Pools in entsprechender Kombination mit internen, auswärts
gerichteten Primern des klonierten und verifizierten PCR-Produkts. Klonierung der PCR-
Produkte wie oben beschrieben und anschließendes Zusammenfügen der DNA-Fragmente zur
vollständigen cDNA durch Klonierung an geeigneten Restriktionsschnittstellen.
Alternativ wurde eine cDNA-Phagenbank aus Cotyledonen von R. communis mit dem PCR-
Produkt als radioaktiv markierte Sonde nach Standardverfahren gecreent. Die Herstellung im
Phagen λgt11 erfolgte nach Herstellerangaben (Promega, Mannheim).
In einer alternativen Klonierungsstrategie wird die oben erwähnte cDNA-Bank mit einem
endmarkierten Oligonukleotid als Sonde durchmustert.
Folgendes Oligonukleotid wird aus dem Peptid HIGGHKEEH abgeleitet:
Dabei werden die Positionen mit N ( = G, A, T oder C) bei der Synthese durch Inosin ersetzt.
Die Endmarkierung erfolgt mit γ(32P)dATP und T4 Polynukleotid-Kinase (Sambrook et al.,
1989). Das Absuchen der cDNA-Bank folgt Standardprotokollen unter Anwendung nicht
stringenter DNA-DNA-Hybridisierungsbedingungen (z. B. bei 42°C). Die Präparation von
λgt11-Phagen und Subklonierung des cDNA-Inserts in geeignete Plasmide (pBluescript,
Stratagene, La Jolla, USA) für die anschließende Sequenzanalyse erfolgt nach
Standardprotokollen.
Claims (11)
1. Pflanzliches Protein, das in der Lage ist, Metalle zu binden und dessen Amino
säuresequenz die Aminosäureabfolgen IEETLHIGGHKEEH und EGFMDK aufweist.
2. Pflanzliches Protein nach Anspruch 1, das natürlicherweise im Phloem vorkommt.
3. Pflanzliches Protein nach Anspruch 1 oder 2 aus Ricinus communis.
4. DNA-Sequenz, die für das Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 kodiert,
umfassend mindestens eine Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
- a) C A T/C A A A/G G A G/A G A G/A C A T/C
- b) C A T/C A T T/C/A G G N G G N C A T/C
- c) G A G/A G G N T T T/C A T G G A T/C A A A/G
5. Oligonukleotid mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus:
6. Verfahren zur Erzeugung von transgenen Pflanzen mit veränderter Verteilung von
Metallen, umfassend die Schritte:
- a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend
- a) regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- b) operativ daran gebunden eine DNA-Sequenz nach Anspruch 4,
- c) operativ daran gebunden regulatorische Sequenzen, die als Transkriptions-, Termi nations- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können,
- b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus i) auf Pflanzenzellen.
7. Transgene Pflanzen, hergestellt nach Anspruch 6, sowie Teile dieser Pflanzen,
transgene Ernteprodukte und transgenes Vermehrungsmaterial dieser Pflanzen, wie
Protoplasten, Pflanzenzellen, Kalli, Samen, Knollen, Stecklinge, sowie die transgenen
Nachkommen dieser Pflanzen.
8. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4 zur Erzeugung von Pflanzen mit
veränderter Verteilung von Metallen.
9. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4 zur Steigerung des
Pflanzenwachstums, zur Erhöhung der Mikronährstoffeffizienz, zur Verbesserung der
Spurenelementzusammensetzung von Pflanzen für die menschliche und tierische Ernährung
und zur Steigerung der pflanzlichen Toleranz gegentoxische Schwermetalle.
10. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4 zur Verbesserung der Toleranz
gegenüber Mikronährstoffkonzentrationen im Boden.
11. Verwendung einer DNA-Sequenz nach Anspruch 4 zur Entfernung von Metallen
aus Lösungen oder Abwässern.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE2000140179 DE10040179A1 (de) | 2000-08-17 | 2000-08-17 | Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen |
| PCT/EP2001/009518 WO2002014363A2 (de) | 2000-08-17 | 2001-08-17 | Beeinflussung der verteilung von metallen in transgenen pflanzen |
| AU9547901A AU9547901A (en) | 2000-08-17 | 2001-08-17 | Influencing the distribution of metals in transgenic plants |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| DE2000140179 DE10040179A1 (de) | 2000-08-17 | 2000-08-17 | Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE10040179A1 true DE10040179A1 (de) | 2002-02-28 |
Family
ID=7652723
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000140179 Withdrawn DE10040179A1 (de) | 2000-08-17 | 2000-08-17 | Beeinflussung der Verteilung von Metallen in transgenen Pflanzen |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4569794A (en) * | 1984-12-05 | 1986-02-11 | Eli Lilly And Company | Process for purifying proteins and compounds useful in such process |
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Also Published As
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