DE69731655T2

DE69731655T2 - Gegen pilze gerichtete proteine, dafuer kodierende dna und wirtsorganismen, die diese beinhalten

Info

Publication number: DE69731655T2
Application number: DE69731655T
Authority: DE
Inventors: Hendrik Maarten STUIVER; Hubertus Jerôme CUSTERS; Beatrix Marianne SELA-BUURLAGE; Sjoerd Leo MELCHERS; Pieternella Johanna VAN DEVENTER-TROOST; Wessel Lageweg; Silene Anne PONSTEIN
Original assignee: Syngenta Mogen BV
Current assignee: Syngenta Mogen BV
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2017-09-05
Also published as: EP0939798B1; US20020168735A1; CN1155714C; AU718274B2; US6864076B2; DE69731655D1; AU5853198A; JP2001502525A; ATE282706T1; CA2264567A1; WO1998013478A2; EP0939798A2; NZ334517A; WO1998013478A3; BR9711291A; CN1233290A; ES2227730T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Oxidasen, die als Antipilzproteine wirken können, dafür codierende DNA und Wirte, die die DNA beinhalten, sowie Verfahren zum Bekämpfen von pilzlichen Pathogenen, indem man die pilzlichen Pathogene mit dem Protein oder den Proteinen in Kontakt bringt. Die Erfindung betrifft ferner Pflanzen, die DNA beinhalten oder exprimieren, die für Antipilzproteine codiert, und Pflanzen, die als ein Ergebnis davon eine reduzierte Anfälligkeit für pilzliche Pathogene zeigen.
Stand der Technik
Pilzkrankheiten von Anbaupflanzen sind eine der Hauptursachen für Ertragsverluste in der Geschichte der Anbaupflanzenkultivierung. Das Anbauen von Anbaupflanzen als Monokulturen begünstigt die Verbreitung von virulenten Rassen von pilzlichen Pathogenen, und wenn eine neue Sorte einer Anbaupflanze im großen Maßstab angebaut wird, nehmen die Risiken drastisch zu, daß sich ein virulenter Stamm eines Pathogens entwickelt, der die Anbaupflanze angreift. Das Auftreten von Krankheit wird wesentlich verschlimmert durch den internationalen Transport von Pathogen-tragenden Pflanzenmaterialien, die Pflanzen mit Pathogenen zusammenbringen können, gegen die sie keine Möglichkeit zur Entwicklung von Resistenz hatten. Somit wurde durch den Eingriff des Menschen das natürliche Gleichgewicht zwischen Wirt und Pathogen mit der desaströsen Wirkung in einer Anzahl von Fällen zerstört. Katastrophale Verluste und sogar Hungersnöte, wie sie in Irland im 19. Jahrhundert auftraten, verursacht durch den Pilz der Kraut- und Knollenfäule der Kartoffel (Phytophthora infestans), haben aus solchen Aktivitäten resultiert. Pilzkrankheit kann es ebenfalls völlig unmöglich machen, bestimmte Anbaupflanzen in großen Flächen anzubauen, wie in dem Fall, als die Fusariumwelke die Tomaten auslöschte, die in großen Flächen der östlichen USA angebaut wurden, oder als der Falsche Mehltau (Plasmopara viticola) den in Teilen von Europa angebauten Wein verwüstete. Ausbrüche von Pilzkrankheit können ebenfalls eine ernsthafte Wirkung auf die Umwelt haben, wie es passierte, als beinahe die gesamte Population der englischen Ulme (Ulmus procera) durch das Ulmensterben (Ceratocystis ulmi) zerstört wurde. Zusätzlich zu den Verlusten, die während des Anbaus von Anbaupflanzen verursacht werden können, kann Pilzkrankheit zu weiteren Nachernteverlusten beitragen. Verschiedene Weichfäulen, wie Botrytis cinerea, sind besonders problematisch bei zum Beispiel Obst. Der Pilz Aspergillus flavus, obwohl er kein echter krankheitsverursachender Pilz ist, verursacht eine Nacherntefäule an gelagerten Erdnüssen und Mais, speziell in tropischen Ländern, und ist sehr schwerwiegend, weil er ein Toxin, Aflatoxin, erzeugt, das sehr toxisch für den Menschen ist.
Die wirtschaftlichen Hauptprobleme, die mit Pilzkrankheiten verbunden sind, werden in nasseren Teilen der Welt gefunden, prinzipiell in Westeuropa und in den feuchten Tropen. Verschiedene Ackerbautechniken, wie Fruchtwechsel und die Vermeidung der Verteilung von Erde auf dem Maschinenpark etc., werden verwendet, um den Aufbau und die Verbreitung von ernsthaften Befällen von Pilzkrankheit zu verhindern. Die Pflanzenzucht hat einen signifikanten Einfluß auf die Verbesserung der Resistenz vieler Anbaupflanzen gegen wichtige Krankheiten gehabt. Zum Beispiel führten Pflanzenzüchter erfolgreich die Resistenzgene 1 und 1–2, die wirksam gegen Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici sind, in die Tomate ein. Dennoch bleiben Probleme bestehen, insbesondere wenn viele Formen von rassenspezifischer Resistenz zusammenbrechen, wenn sich neue Rassen des Pathogens schnell entwickeln. In der Tomate ist ein anderer virulenter Stamm von F. oxysporum aufgetreten, und Züchter suchen nach einem dritten nützlichen Resistenzgen. In Getreide, das in Teilen von Westeuropa wächst, hat ein kürzlicher Ausbruch eines virulenten Stammes des Gelbrostes (Puccinia striiformis) zu einer rapiden Zunahme der Fungizidverwendung bei Sorten geführt, die resistent gegen andere Pilze bleiben. In diesen spezifischen Fällen werden weithin Chemikalien verwendet, um die Pilzkrankheit zu bekämpfen, wie in denjenigen Fällen, in denen es einfach keine natürlichen Resistenzquellen gibt, die dem Züchter zur Verfügung stehen. Chemische Fungizide bleiben ein Hauptfaktor in den Kosten der Anbaupflanzenproduktion in vielen Teilen der Welt. 1990 trugen Fungizide zu 21% aller agrochemischen Verkäufe bei (5,54 Millionen US $). Landwirte und Züchter sind sehr motiviert, ihre Eingangskosten zu reduzieren. Zusätzlich zur wirtschaftlichen Rechtfertigung gibt es eine zunehmend starke Umweltkomponente in der Gleichung. Es gibt einen wachsenden Druck in den stärker fortgeschrittenen Ökonomien, insbesondere in Nordamerika und Westeuropa, von Politikern und Verbrauchern, nach einer Landwirtschaft, die weniger auf dem chemischen Einsatz beruht. Der Rechtfertigung solcher Nachfragen mag eine fokussierte Argumentation oder wissenschaftliche Begründung fehlen, aber die Ängste wachsen mit Berichten über Pestizide, die im Grundwasser aufgespürt oder in Mengen nachgewiesen werden, die die als Lebensmittelrückstände akzeptablen Minimalwerte überschreiten. In den Niederlanden gibt es zum Beispiel ein zwingendes Erfordernis, die Pestizidgesamtverwendung bis zum Jahr 2000 um 50% zu reduzieren.
Phytophthora infestans gehört zur Gruppe der als Oomyzeten bezeichneten Pilze. Phytophthora infestans infiziert verschiedene Mitglieder der Solanaceae, wie Kartoffel, Tomate und einige Zierpflanzen. Es verursacht die Kraut- und Knollen- bzw. Fruchtfäule von Kartoffeln und Tomaten, die alle Teile ausgenommen die Wurzeln befällt. Geographisch ist der Pilz weitverbreitet und kann in allen kartoffelerzeugenden Ländern angetroffen werden. Wirtschaftlich ist die Kraut- und Knollenfäule der Kartoffel von großer Bedeutung, da eine Infektion frühzeitig in der Saison den Ernteertrag ernsthaft reduzieren kann. Derzeit wird die Krankheit durch regelmäßiges Versprühen chemischer Fungizide (Dithiocarbamate wie Mancozeb, Manec und Zineb) bekämpft. Sowohl aus Umwelt- als auch wirtschaftlicher Sichtweise könnte eine biologische Bekämpfung der durch Phytophthora infestans verursachten Krankheiten Vorteile gegenüber der Verwendung chemischer Fungizide haben.
Pythium gehört ebenfalls zur Gruppe der als Oomyzeten bezeichneten Pilze. Die Gattung Pythium unterscheidet sich von der verwandten Gattung Phytophthora durch Bildung relativ undifferenzierter Sporangien. Geographisch ist dieser Pilz auf allen Kontinenten weitverbreitet. Der erste Haupttyp der durch Pythium-Arten verursachten Krankheit ist das Absterben aufgrund plötzlicher und sich schnell entwickelnder Angriffe auf junge Pflänzlinge auf dem Feld oder in den Pflanzenzuchtbetrieben. Pythium-Arten verursachen einen zweiten Krankheitstyp, der die Wurzelnekrose ist und eine allgemeine Verlangsamung des Pflanzenwachstums (z. B. Weizen und Mais) und einen Ertragsverlust verursacht. Die durch Pythium in Europa verursachten Hauptverluste sind bei Feldfrüchten, wie bei der Zuckerrübe. Prinzipiell sind die Verluste alles oder nichts. In ähnlicher Weise können Aussaaten von Zierpflanzen und Waldbäumen durch Pflanzenzuchtbetriebe vollständig zerstört werden. (Für eine Übersicht über Oomyzeten siehe: European Handbook of Plant Diseases, herausgegeben von I. M. Smith et al., 1988, Blackwell Scientific Publications, Kap. 8).
Ein weiterer Pilz ist Botrytis, speziell B. cinerea, der zur Gruppe der Fungi Imperfecti gehört und Grauschimmelfäule oder Knospen- und Blütenfäule verursacht, was häufig an weichen reifen Früchten nach der Ernte ist, aber ebenfalls vor der Ernte auftreten kann. Er befällt ebenfalls verschiedene Gemüsearten, wie Salat, Bohnen und Tomaten. Andere Arten von Botrytis sind üblich auf Blumen, wie Lilien, Gladiolen und Tulpen.
Ein Protein mit Antipilzaktivität, isoliert aus TMV-induzierten Tabakblättern, das die Lyse von keimenden Sporen und Hyphenspitzen von Phytophthora infestans verursachen kann und das eine Verlangsamung der Wachstumsgeschwindigkeit der Hyphen verursacht, wurde in WO 91/18984 A1 offenbart. Dieses Protein hat ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 24 kDa und wurde AP24 genannt. Ein Vergleich seiner vollständigen Aminosäuresequenz, abgeleitet aus der Nukleinsäuresequenz des AP24-Gens, mit aus Datenbanken bekannten Proteinen zeigte, daß das Protein ein Osmotin-artiges Protein war.
Trotz eines anfänglichen Erfolges in der Bekämpfung von pilzlichen Pathogenen, wie Phytophthora infestans, und der Genmanipulation von Pflanzen, die diese Antipilzproteine mit Aktivität gegen dieses pilzliche Pathogen herstellen können, bleibt ein Bedarf zur Identifizierung und Isolation anderer Proteine mit Antipilzaktivität gegen diesen Pilz bestehen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes, aus einer Pflanzenquelle erhältliches Protein bereit, das Antipilzaktivität besitzt, am wirksamsten gerichtet gegen Oomyzeten und bevorzugt gegen Phythophthora und/oder Pythium, und ein Molekulargewicht von ca. 55–65 kDa gemäß Beurteilung durch SDS-PAGE-Elektrophorese hat. Bevorzugte Proteine sind diejenigen, die aus Sonnenblumen- oder Salatpflanzen erhältlich sind. Noch mehr bevorzugte Proteine sind aus Sonnenblumen- oder Salatblättern erhältlich, die mit Natriumsalicylat induziert wurden. Ein noch mehr bevorzugtes isoliertes Protein ist dadurch gekennzeichnet, daß es aus der Gruppe von Proteinen mit der Aminosäuresequenz ausgewählt ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die die in SEQ ID NOs: 1, 2 oder 6, 16, 20, 49, 50, 51, 58, 71, 73 oder 75 dargestellten Aminosäuresequenzen umfaßt, sowie Muteine davon, die Antipilzaktivität und speziell Aktivität gegen Phytophthora und/oder Pythium haben. Ein noch weiter bevorzugtes erfindungsgemäßes Protein ist eines, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es ein Protein umfaßt, das die Aminosäuresequenz umfaßt, wie sie durch SEQ ID NOs: 16, 20, 58, 71, 73 oder 75 oder durch einen Teil der Sequenz dargestellt ist, wie in SEQ ID NO: 6 dargestellt.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein neues Enzym bereit, wobei die enzymatische Aktivität die Oxidation von Kohlehydraten ist.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine isolierte DNA-Sequenz, die ein offenes Leseraster umfaßt, das ein erfindungsgemäßes Protein codieren kann, bevorzugt dadurch gekennzeichnet, daß das offene Leseraster ein erfindungsgemäßes Protein und DNA codieren kann, die damit unter stringenten Bedingungen hybridisieren kann.
Die Erfindung stellt ebenfalls eine chimäre DNA-Sequenz gemäß der Erfindung bereit, die ferner eine Transkriptionsstartregion und gegebenenfalls eine Transkriptionsterminationsregion umfaßt, so gebunden an das offene Leseraster, um die Transkription der DNA in einer lebenden Wirtszelle zu ermöglichen, wenn sie darin vorhanden ist, wodurch RNA erzeugt wird, die das offene Leseraster umfaßt. Eine bevorzugte erfindungsgemäße chimäre DNA-Sequenz ist eine, worin die RNA, die das offene Leseraster umfaßt, zu Protein in der Wirtszelle translatiert werden kann, wenn sie darin vorhanden ist, wodurch das Protein erzeugt wird. Speziell bevorzugt sind DNA-Sequenzen, die eine Sequenz wie in SEQ ID NOs: 15, 19, 57, 70, 72 oder 74 dargestellt umfassen.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine chimäre DNA-Sequenz, die eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz umfaßt, die ausgewählt werden kann aus Replikons, wie bakteriellen Klonierungsplasmiden, und Vektoren, wie ein bakterieller Expressionsvektor, ein (nicht-integrativer) pflanzlicher viraler Vektor, ein Ti-Plasmidvektor von Agrobacterium, wie ein binärer Vektor, und dgl., sowie eine Wirtszelle, die ein Replikon oder einen Vektor gemäß der Erfindung umfaßt und die das Replikon aufrechterhalten kann, sobald es darin vorhanden ist. Bevorzugt gemäß dieser Ausführungsform ist eine Wirtszelle, die eine Pflanzenzelle ist, wobei der Vektor ein nicht-integrativer viraler Vektor ist.
Die Erfindung stellt ferner eine Wirtszelle bereit, die in ihrem Genom eine erfindungsgemäße chimäre DNA-Sequenz stabil beinhaltet, wie eine Pflanzenzelle, sowie mehrzellige Wirte, die solche Zellen umfassen oder im wesentlichen aus solchen Zellen bestehen, wie Pflanzen. Speziell bevorzugt sind Pflanzen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die erfindungsgemäße chimäre DNA zumindest in einer Anzahl der Zellen der Pflanze exprimiert wird, was die Erzeugung des Antipilzproteins darin verursacht.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins mit Kohlehydratoxidaseaktivität bereitgestellt, dadurch gekennzeichnet, daß eine erfindungsgemäße Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Erzeugung des Proteins durch die Wirtszelle erlauben, gegebenenfalls gefolgt vom Schritt der Gewinnung des Proteins aus den Wirtszellen.
Ein anderer Teil der Erfindung ist auf die Antipilzverwendung eines Proteins gerichtet, das Kohlehydratoxidaseaktivität besitzt.
Die Erfindung sieht ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Proteins zur Verlangsamung des Wachstums von Pilzen vor, bevorzugt von Oomyzeten und besonders bevorzugt von Phytophthora und Pythium. Gemäß noch einer anderen Ausführungsform erfolgt die Verlangsamung des Wachstums der Pilze auf oder in der Nachbarschaft der Pflanze durch Ausbringung eines Mikroorganismus, der das Protein erzeugen kann, oder durch Ernten des Proteins aus einem mikrobiellen Wirt und Anwenden des Proteins in einer agrochemischen Formulierung.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zum Erhalten von Pflanzen mit reduzierter Anfälligkeit für Pilze bereit, speziell Phytophthora und/oder Pythium, umfassend die Schritte aus:

(a) Einführen in Ahnenzellen, die für die Regeneration zu einer ganzen Pflanze empfänglich sind,
– einer chimären DNA-Sequenz, die ein offenes Leseraster umfaßt, das ein Protein gemäß Anspruch 1 codieren kann, wobei das offene Leseraster operativ mit einer Transkriptions- und Translationsregion und gegebenenfalls einer Transkriptionsterminationsregion verbunden ist, was die Erzeugung des Proteins in einer Pflanzenzelle erlaubt, die anfällig für eine Infektion durch den Pilz ist, und
– einer chimären DNA-Sequenz, die einen pflanzlichen selektierbaren Marker codieren kann, der die Selektion von transformierten Ahnenzellen erlaubt, wenn der selektierbare Marker darin vorhanden ist, und
(b) Regenerieren der Ahnenzellen zu Pflanzen unter Bedingungen, die Ahnenzellen begünstigen, die den selektierbaren Marker aufweisen, und
(c) Identifizieren einer Pflanze, die ein Protein gemäß Anspruch 1 erzeugt, wodurch die Anfälligkeit der Pflanze für eine Infektion durch den Pilz reduziert wird.

Bevorzugt gemäß der Erfindung ist ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Schritt (a) unter Verwendung eines Agrobacterium tumefaciens-Stammes durchgeführt wird, der in der Lage zur T-DNA-Übertragung auf Pflanzenzellen ist und der die chimäre DNA beherbergt, kloniert in den binären Vektor pMOG800; ein anderes bevorzugtes Verfahren besteht darin, wenn Schritt (b) in Gegenwart eines Antibiotikums durchgeführt wird, das Zellen begünstigt, die eine Neomycinphosphotransferase aufweisen.
Die Erfindung stellt ferner eine Antipilzzusammensetzung bereit, die ein erfindungsgemäßes Protein und einen geeigneten Träger umfaßt.
Ein Antikörper, der mit einem N-terminalen Fragment eines erfindungsgemäßen Proteins reagieren kann, bevorzugt mit dem durch SEQ ID NOs: 6, 16, 20, 58, 71, 73 oder 75 dargestellten Peptid, wird ebenfalls bereitgestellt. Der Antikörper wird geeignet zur Detektion von Expressionsstärken der erfindungsgemäßen chimären DNA in Wirtszellen und mehrzelligen Wirten, bevorzugt Pflanzen, verwendet, die ein erfindungsgemäßes Protein herstellen können. Die Erfindung stellt ebenfalls eine Nukleinsäuresequenz bereit, die aus einem Gen erhältlich ist, das ein erfindungsgemäßes Protein codiert, wobei die Nukleinsäuresequenz gewebespezifische Transkriptionsregulationsaktivität in einer Pflanze aufweist. Die Erfindung stellt spezifisch eine Nukleinsäuresequenz bereit, die aus der Region stromaufwärts des Translationsstartortes der Gens erhältlich ist, bevorzugt wenigstens 500 Nukleotide unmittelbar stromaufwärts des Translationsstartortes des Gens.
Beschreibung der Figuren
1: SDS-PAGE (12,5%) der unterschiedlichen Reinigungsschritte des MS59-Sonnenblumenproteins. Mw = Molekulargewichtsmarker; 1 = roher Sonnenblumenproteinextrakt nach Gelfiltration (G25); 2 = Proteinfraktion, die an Kationenaustauscherchromatograpie gebunden ist (S-Sepharose); 3 = Sammlung von aktiven Fraktion nach Kationenaustauscherchromatographie (Mono S); 4 = Durchfluß aus hydrophober Wechselwirkungschromatographie (Phenylsuperose); 5 = aktive Fraktionen nach Gelfiltration.
2: SDS-PAGE (12,5%) der unterschiedlichen Fraktionen (Nummern 6 bis 16) der Gelfiltrationssäule (SD75). Fraktion 10 bis 15 wurde in 3 Verdünnungen auf Wachstumsinhibierung gegen Phytophthora infestans (Feld A) und auf Pythium ultimum (Feld B) untersucht.
3: SDS-PAGE (12,5%) der Fraktionen, die aus neun Gelscheiben (Spur 1 bis 9) eines nativen PAGE eluierten, in dem eine MS59-haltige SD75-Fraktion (SD75-Fraktion 13) getrennt wurde. Rechtes Feld: SDS-PAGE (12,5%) mit SD75-Fraktion 13 (L) und zwei Fraktionen aus Elutionsexperimentfraktion 2 (mit MS59) und Fraktion 5 (mit einem Protein mit ca. 30 kD). Unteres Feld: Wachstumsinhibierung von Phytophthora infestans, getestet mit Elutionsfraktion 1 bis 6, mit 5 μl und 1 μl hinzugegeben pro Vertiefung.
4: Mikroskopische Analyse eines pilzlichen Inhibierungstests in vitro 24 Stunden nach Zugabe von Phytophthora infestans-Zoosporangien zu PDA-Medium. Linkes Feld: Kontrollinkubation, nur MES-Puffer wurde hinzugegeben. Rechtes Feld: E. coli-erzeugtes MS59 in MES-Puffer wurde zur Inkubation hinzugegeben.
5: Mikroskopische Analyse eines pilzlichen Inhibierungstests in vitro 24 Stunden nach Zugabe von Phythium ultimum-Hyphenfragmenten zu PDA-Medium. Linkes Feld: Kontrollinkubation, nur MES-Puffer wurde hinzugegeben. Rechtes Feld: E. coli-erzeugtes MS59 in MES-Puffer wurde zur Inkubation hinzugegeben.
6: (A). SD75-Gelfiltrationsprofil von WL64. WL64 eluiert mit Fraktionen 13, 14 und 15. Molekulargewichtsmarker sind oberhalb der Pfeile oben im Diagramm angegeben. X-Achse: Fraktionszahl, Y-Achse: A280.
(B). Coomassie-angefärbtes 12,5%iges SDS-PAGE-Gel der Fraktionen 11–14 des SD75-Gelfiltrationsprofils. Molekulargewichtsmarker sind rechts angegeben und sind in kDa. Die Proteinbanden, die mit der Antipilzaktivität korrelieren, sind zwischen den Pfeilen angegeben.
(C). Antipilztest in vitro. 10 μl der jeweiligen Fraktionen (insgesamt 500 μl) wurden zur Durchmusterung der Wachstumsinhibierung von Rhizoctonia solani-Hyphenfragmenten verwendet.
7: Coomassie-angefärbtes 12,5%iges SDS-PAGE-Gel der Reinigung von WL64. Spur 1, Salatextrakt; Spur 2, HIC-Peak; Spur 3, Source S-Peak; Spur 4, Mono S-Peak; Spur 5, SD75-Peak; Spur 6, Mono P-Peak. Molekulargewichtsmarker sind auf beiden Seiten der Figur angegeben und sind in kDa.
8: (A). Lineweaver-Burk-Auftragung der MS59- (leere Rauten), WL64- (ausgefüllte Kreise) und GOX- (leere Quadrate) Oxidaseaktivitäten mit Glucose als Substrat. Die Mengen Protein pro Test waren 17, 29 und 45 ng für MS59, WL64 bzw. GOX.
(B). Lineweaver-Burk-Auftragung der MS59- (leere Rauten), WL64- (ausgefüllte Kreise) und GOX- (leere Quadrate) Oxidaseaktivitäten mit pilzlichen Zellwänden als Substrat. Die Mengen von Protein pro Test waren 17, 29 und 225 ng für MS59, WL64 bzw. GOX.
9: Substratspezifität für die Oxidaseaktivitäten von MS59 (gestrichelte Balken), WL64 (diagonal gestreifte Balken) und GOX (ausgefüllte Balken).
10: Angleichung der Proteine der Erfindung MS59, WL64 und der zwei Homologen aus A. thaliana At26 (SEQ ID NO: 71) und At27 (SEQ ID NO: 75) mit den bekannten "Berberine Bridge Enzymes" (EcBBE und PsBBE). Konservierte Veränderungen sind in Grau angegeben, während Identitätsgebiete (3 der 6 Aminosäuren identisch) in schwarz angegeben sind.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Antipilzwirkung des Proteins (der Proteine) der Erfindung wurde in In-vitro-Tests für die folgenden Pilze gezeigt: Phytophthora infestans, Phytophthora cactorum, Phytophthora nicotiana, Phytophthora megasperma, Pythium ultimum, Pythium sylvaticum, Pythium violae, Pythium Paroecandrum, Rhizoctonia solani, Tanatephorus cucumeris, Helicobasidium purpureum, Sclerotium cepivorum, Pichia pastoris und Botrytis cinerea für Erläuterungszwecke. Es ist ersichtlich, daß die Verwendung des Proteins (der Proteine) der Erfindung oder der dafür codierenden DNA zur Verwendung in einem Verfahren zur Bekämpfung von Pilzen nicht auf die genannten Pilze beschränkt ist. Es gibt keinen Grund zur Annahme, daß das erfindungsgemäße Protein (die erfindungsgemäßen Proteine) keine Antipilzaktivität gegen ein weit breiteres Spektrum von Pilzen als diejenigen besitzt, die hier getestet wurden, speziell in der Klasse der Oomyzeten.
Obwohl die Erfindung im Detail für transgene Tomaten-, Tabak-, Karotten-, Kartoffel- und Brassica napus-Pflanzen erläutert wird, versteht es sich, daß jede Pflanzenart, die Gegenstand einer Form von Pilzangriff ist, speziell von den oben genannten Pilzen, mit einem oder mehreren pflanzlichen exprimierbaren Genkonstrukten versehen werden kann, die bei Expression das Protein (die Proteine) der Erfindung in der Pflanze überexprimieren, um die Rate der Infektiosität und/oder die Wirkungen eines solchen Angriffs zu verringern. Die Erfindung kann sogar in Pflanzenarten ausgeführt werden, die derzeitig nicht der Transformation zugänglich sind, da die Zugänglichkeit solcher Arten nur eine Frage der Zeit ist und weil die Transformation als solche von keiner Relevanz für die der Erfindung zugrundeliegenden Prinzipien ist. Daher sollen Pflanzen für den Zweck dieser Beschreibung Bedecktsamer sowie Nacktsamer, einkeimblättrige sowie zweikeimblättrige Pflanzen, ob für Futter-, Lebensmittel- oder industrielle Verarbeitungszwecke einschließen; eingeschlossen sind Pflanzen, die für jeden landwirtschaftlichen oder gartenbaulichen Zweck verwendet werden, einschließlich Forstwirtschaft und Blumenkultur, sowie als Heimgärtnerei oder Zimmergärtnerei oder andere dekorative Zwecke.
Das erfindungsgemäße Protein kann durch seine Isolierung aus jedem geeigneten Pflanzenquellmaterial erhalten werden, das es enthält. Eine besonders geeignete Quelle umfaßt Blätter der Sonnenblume (Helianthus) und Blätter des Salats (Lactuca sativa cv. Lollo bionda). Die Gegenwart von erfindungsgemäßen Antipilzproteinen in Pflanzenquellmaterial kann leicht für jede Pflanzenart bestimmt werden, indem Pflanzenextrakte aus diesen Arten hergestellt und diese Extrakte auf die Gegenwart von Antipilzaktivität der hier beschriebenen Antipilztests in vitro getestet werden, ferner indem die erhaltenen Proben durch jede geeignete Proteinfraktionierungstechnik im Zusammenhang mit dem In-vitro-Test fraktioniert werden, bis eine Antipilzfraktion erhalten wird, die ein Protein mit ca. 55–65 kDa umfaßt, das intern als MS59 oder sein Homolog WL64 bezeichnet wird, das in isolierter Form Antipilzaktivität zeigt. Speziell können Fraktionen auf Antipilzaktivität an Oomyzeten, z. B. Phytophthora oder Pythium ultimum und dgl., oder anderen Pilzen, wie die Basidiomyzeten, Ascomyzeten, Zygomyzeten oder anderen Klassen oder Unterklassen, getestet werden.
Alternativ können erfindungsgemäße Antipilzproteine erhalten werden durch Klonieren von DNA, die ein offenes Leseraster umfaßt, das das Protein oder den Vorläufer davon codieren kann, Verbinden des offenen Leserasters mit einer Transkriptions- und gegebenenfalls einer Translationsstart- und Transkriptionsterminationsregion, Inserieren der DNA in eine geeignete Wirtszelle und Erzeugenlassen des Proteins durch die Wirtszelle. Anschließend kann das Protein aus den Wirtszellen gewonnen werden, bevorzugt nach Sezernierung des Proteins in das Kulturmedium durch die Wirtszellen. Alternativ können die Wirtszellen direkt in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bekämpfung von pilzlichen Pathogenen als eine pestizide akzeptable Zusammensetzung verwendet werden.
Wirtszellen, die geeignet zur Verwendung in einem Verfahren zum Erhalt eines erfindungsgemäßen Proteins sind, können aus prokaryontischen mikrobiellen Wirten, wie Bakterien, z. B. Agrobacterium, Bacillus, Cyanobacterien, E. coli, Pseudomonas und dgl., sowie aus eukaryontischen Wirten, einschließlich Hefen, z. B. Saccharomyces cerevisiae, Pilzen, z. B. Trichoderma, und Pflanzenzellen, einschließlich Protoplasten, ausgewählt werden.
In einem Verfahren zur Verlangsamung des Wachstums der Pilze auf oder in der Nachbarschaft der Pflanzenblätter können Wirtszellen geeignet aus jeder Art ausgewählt werden, die routinemäßig als biologisches Fungizid verwendet wird. Ebenfalls können die Proteine durch Mikroorganismen erzeugt, geerntet und in einer agrochemischen Formulierung angewendet werden.
Das Wort Protein bezeichnet eine Sequenz von Aminosäuren, die durch Peptidbindungen verbunden sind. Polypeptide oder Peptide werden ebenfalls als Proteine betrachtet. Muteine des Proteins der Erfindung sind Proteine, die aus den im Sequenzprotokoll dargestellten Proteinen durch Austauschen, Addieren und/oder Deletieren einer oder mehrerer Aminosäuren erhalten werden, während sie noch ihre Antipilzaktivität beibehalten. Solche Muteine können leicht durch Proteinmanipulation in vivo hergestellt werden, z. B. durch Veränderung des offenen Leserasters, das das Antipilzprotein codieren kann, so daß die Aminosäuresequenz dadurch beeinflußt wird. Solange die Veränderungen in den Aminosäuresequenzen nicht ganz die Antipilzaktivität aufheben, sind solche Muteine in der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt eine chimäre DNA-Sequenz bereit, die ein offenes Leseraster umfaßt, das ein erfindungsgemäßes Protein codieren kann. Der Ausdruck chimäre DNA-Sequenz soll bedeuten, daß er jede DNA-Sequenz umfaßt, die nicht natürlich in der Natur gefundene DNA-Sequenzen umfaßt. Zum Beispiel soll chimäre DNA bedeuten, daß sie DNA umfaßt, die das offene Leseraster in einem nicht-natürlichen Ort des Pflanzengenoms umfaßt, ungeachtet der Tatsache, daß das Pflanzengenom normalerweise eine Kopie des offenen Leserasters in seinem natürlichen chromosomalen Ort enthält. In ähnlicher weise kann das offene Leseraster in das Pflanzengenom eingeführt werden, wo es nicht natürlicherweise gefunden wird, oder in ein Replikon oder einen Vektor, wo es nicht natürlicherweise gefunden wird, wie ein bakterielles Plasmid oder ein viraler Vektor. Chimäre DNA soll nicht auf DNA-Moleküle beschränkt sein, die in einem Wirt replizierbar sind, sondern soll DNA umfassen, die in ein Replikon ligiert werden kann, z. B. aufgrund spezifischer Adaptersequenzen, physikalisch verbunden mit dem erfindungsgemäßen offenen Leseraster. Das offene Leseraster kann mit seinen natürlichen regulatorischen Elementen stromaufwärts und stromabwärts verbunden sein oder nicht.
Das offene Leseraster kann aus einer genomischen Bibliothek stammen. In diesem Fall kann es ein oder mehrere Introns enthalten, die die Exons trennen, die das offene Leseraster bilden, das ein erfindungsgemäßes Protein codiert. Das offene Leseraster kann ebenfalls durch ein ununterbrochenes Exon oder durch eine cDNA zur mRNA, die ein erfindungsgemäßes Protein codiert, codiert werden. Erfindungsgemäße offene Leseraster umfassen ebenfalls diejenigen, in denen ein oder mehrere Introns künstlich entfernt oder addiert wurden. Jede dieser Varianten wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Ebenfalls Teil der Erfindung sind chimäre DNA-Sequenzen, die für ein Antipilzprotein codieren und eine oder mehrere der in SEQ ID NOs: 21 bis 48 gezeigten EST-Sequenzen umfassen. Wie aus den Sequenzprotokollen abgeleitet werden kann, teilen diese ESTs, für die bisher keine Funktion bekannt war, eine beträchtliche Homologie mit der DNA-Sequenz, die für die aus Helianthus und Lactuca isolierten Proteine codiert.
Ein anderer Teil der Erfindung wird durch die intrinsische Aktivität der Proteine der Erfindung gebildet. Es wurde festgestellt, daß sie Kohlehydratoxidasen sind, die eine große Anzahl unterschiedlicher Mono- und Disaccharide oxidieren können. Die Substratspezifität ähnelt der Spezifität des Enzyms Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5), das ebenfalls bekannt ist als D-Hexose: Sauerstoff-1-oxidoreduktase bekannt ist. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß sie eine gereinigte Mischung aus pilzlichen (aus Rhizoctonia stammend) Zellwandkomponenten oxidieren können. Es wird angenommen, daß diese oxidative Fähigkeit den Proteinen die Antipilzeigenschaft verleiht. In der Literatur gibt es ein Beispiel einer Antipilzoxidase, die Glucoseoxidase aus dem Pilz Aspergillus (WO 95/14784). Die Proteine dieser Erfindung zeigen jedoch ein breiteres Substratspektrum als Hexoseoxidase und besitzen einen niedrigeren Km-Wert für das Substrat.
Aus Homologierecherchen wurde festgestellt, daß einige Teile der Aminosäuresequenz der Proteine der Erfindung stärker konserviert sind und verwandt mit Sequenzen sind, die üblicherweie in Oxidasen gefunden werden. Die höchste Homologie wurde mit Reticulinoxidase festgestellt, wobei das Enzym aus der Familie der Papaveraceae bekannt ist (Facchini, P. J. et al., Plant Physiol. 112, 1669–1677, 1996).
Um in einer Wirtszelle exprimiert werden zu können, wird eine erfindungsgemäße chimäre DNA gewöhnlich mit regulatorischen Elementen versehen werden, die seine Erkennung durch den biochemischen Mechanismus des Wirtes ermöglichen und die Transkription und/oder Translation des offenen Leserasters im Wirt erlauben. Sie wird gewöhnlich eine Transkriptionsstartregion, die geeignet aus jedem Gen stammen kann, das in der Wirtszelle der Wahl exprimiert werden kann, sowie eine Translationsstartregion für die Ribosomerkennung und -anknüpfung umfassen. In eukaryontischen Zellen umfaßt eine Expressionskassette gewöhnlich zusätzlich eine Transkriptionsterminationsregion, die sich stromabwärts des offenen Leserasters befindet und die Beendigung der Transkription und das Auftreten der Polyadenylierung des primären Transkripts erlaubt. Zusätzlich kann die Codonenverwendung an die akzeptierte Codonenverwendung des Wirtes der Wahl angepaßt werden. Die die Expression eines chimären DNA-Konstrukts in einer gewählten Wirtszelle regierenden Prinzipien werden üblicherweise von den Durchschnittsfachleuten verstanden, und die Konstruktion exprimierbarer chimärer DNA-Konstrukte ist heute Routine für jede Art von Wirtszelle, sei sie prokaryontisch oder eukaryontisch.
Um das offene Leseraster in einer Wirtszelle aufrechtzuerhalten, wird es gewöhnlich in Form eines Replikons bereitgestellt werden, das das erfindungsgemäße offene Leseraster gebunden an DNA umfaßt, die durch die gewählte Wirtszelle erkannt und vervielfältigt wird. Entsprechend wird die Wahl des Replikons weitgehend durch die Wirtszelle der Wahl bestimmt. Solche Prinzipien, wie sie die Auswahl geeigneter Replikons für einen besonderen gewählten Wirt beherrschen, sind im Bereich des Durchschnittsfachmanns.
Ein spezieller Typ von Replikon ist ein solcher, der sich selbst oder einen Teil davon auf eine andere Wirtszelle, wie eine Pflanzenzelle, übertragen kann, um dadurch das erfindungsgemäße offene Leseraster auf die Pflanzenzelle mitzuübertragen. Replikons mit einer solchen Fähigkeit werden hier als Vektoren bezeichnet. Ein Beispiel für einen solchen Vektor ist ein Ti-Plasmidvektor, der bei Vorhandensein in einem geeigneten Wirt, wie Agrobacterium tumefaciens, einen Teil von sich, die sogenannte T-Region, auf eine Pflanzenzelle übertragen kann. Unterschiedliche Typen von Ti-Plasmidvektoren (siehe EP 0 116 718 B1 ) werden heute routinemäßig verwendet, um chimäre DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen oder Protoplasten zu übertragen, aus denen neue Pflanzen erzeugt werden können, die die chimäre DNA stabil in ihren Genomen beinhalten. Eine besonders bevorzugte Form von Ti-Plasmidvektoren sind sogenannte binäre Vektoren, wie sie in EP 0 120 516 B1 und US 4 940 838 beansprucht werden. Andere geeignete Vektoren, die zur Einführung von erfindungsgemäßer DNA in einen Pflanzenwirt verwendet werden können, können aus den viralen Vektoren, z. B. nicht-integrativen pflanzlichen viralen Vektoren, wie sie aus doppelsträngigen Pflanzenviren (z. B. CaMV) und einsträngigen Viren, Gemini-Viren und dgl. ableitbar sind, ausgewählt werden. Die Verwendung solcher Vektoren kann vorteilhaft sein, insbesondere wenn es schwierig ist, den Pflanzenwirt stabil zu transformieren. Das kann der Fall bei hölzernen Arten sein, speziell Bäumen und Weinstöcken.
Der Ausdruck "Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße chimäre DNA-Sequenz in ihrem Genom beinhalten" soll Zellen sowie multizelluläre Organismen umfassen, die solche Zellen umfassen oder im wesentlichen aus solchen Zellen bestehen, die stabil die chimäre DNA in ihrem Genom beinhalten, wodurch die chimäre DNA aufrechterhalten und bevorzugt eine Kopie solcher chimären DNA auf daraus abstammende Zellen übertragen wird, sei es durch Mitose oder Meiose. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Pflanzen bereitgestellt, die im wesentlichen aus Zellen bestehen, die eine oder mehrere Kopien der chimären DNA in ihrem Genom beinhalten und die eine Kopie oder Kopien auf ihre Nachkommenschaft übertragen können, bevorzugt nach Mendel-Weise. Aufgrund der Transkription und Translation der erfindungsgemäßen chimären DNA in einigen oder allen Zellen der Pflanze werden diejenigen Zellen, die das Antipilzprotein erzeugen, eine erhöhte Resistenz gegen Pilzinfektionen, speziell gegen Phytophthora-Infektionen, zeigen. Obwohl die Prinzipien wie oben angegeben, die die Transkription von DNA in Pflanzenzellen beherrschen, nicht immer verstanden werden, ist die Schaffung von chimärer DNA, die in einer im wesentlichen konstitutiven Weise exprimiert werden kann, d. h. in den im wesentlichen meisten Zelltypen der Pflanze und im wesentlichen ohne ernsthafte zeitliche und/oder entwicklungsgemäße Beschränkungen, heute Routine. Transkriptionsstartregionen, die routinemäßig für diesen Zweck verwendet werden, sind Promotoren, die aus dem Blumenkohlmosaikvirus erhältlich sind, insbesondere die 35S RNA- und 19S RNA-Transkriptpromotoren und die sogenannten T-DNA-Promotoren von Agrobacterium tumefaciens, insbesondere zu erwähnen sind der Nopalinsynthasepromotor, der Octopinsynthasepromotor (wie in EP 0 122 791 B1 offenbart) und der Mannopinsynthasepromotor. Zusätzlich können Pflanzenpromotoren verwendet werden, die im wesentlichen konstitutiv sein können, wie der Reis-Actin-Genpromotor, oder z. B. organspezifisch, wie der wurzelspezifische Promotor. Alternativ können Pathogen-induzierbare Promotoren verwendet werden, wie der PRP1-Promotor (ebenfalls als gstl-Promotor bezeichnet), erhältlich aus der Kartoffel (Martini N. et al. (1993), Mol. Gen. Genet. 263, 179–186). Die Wahl des Promotors ist nicht wesentlich, obwohl gesagt werden muß, das konstitutive hochgradige Promotoren leicht bevorzugt sind. Es ist ferner bekannt, daß die Duplikation bestimmter Elemente, sogenannter Verstärker, den Expressionsgrad der DNA unter ihrem Regime beträchtlich steigern können (siehe z. B.: R. Kay et al. (1987), Science 236, 1299–1302: die Duplikation der Sequenz zwischen –343 und –90 des CaMV 35S-Promotors erhöht die Aktivität des Promotors). Zusätzlich zum 35S-Promotor, einfach oder doppelt verstärkt, sind Beispiele für hochgradige Promotoren der lichtinduzierbare Promotor der kleinen Untereinheit der Ribulosebisphosphatcarboxylase (rbcSSU) und der Promotor des Chlorophyll a/b-bindenden Proteins (Cab). Ebenfalls erwogen durch die vorliegende Erfindung werden Hybridpromotoren, die Elemente unterschiedlicher Promotorregionen umfassen, die physikalisch verbunden sind. Ein gutbekanntes Beispiel dafür ist der sogenannte CaMV-verstärkte Mannopinsynthasepromotor (US-PS 5 106 739), der Elemente des Mannopinsynthasepromotors umfaßt, gebunden an den CaMV-Verstärker.
Bezüglich der Notwendigkeit einer Transkriptionsterminationsregion wird allgemein angenommen, daß eine solche Region die Verläßlichkeit sowie die Effizienz der Transkription in Pflanzenzellen steigert. Ihre Verwendung ist deshalb im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung stark bevorzugt.
Bezüglich der Anwendbarkeit der Erfindung in unterschiedlichen Pflanzenarten muß erwähnt werden, daß eine besondere Ausführungsform der Erfindung bloß mit transgenen Tomaten- und Tabakpflanzen als ein Beispiel veranschaulicht wird, wobei die tatsächliche Anwendbarkeit in der Tat nicht auf diese Pflanzenarten beschränkt ist. Jede Pflanzenart, die einer Form von Pilzangriff ausgesetzt ist, insbesondere durch Oomyzeten wie Phytophthora infestans, kann mit erfindungsgemäßen Proteinen behandelt werden oder bevorzugt mit einer erfindungsgemäßen chimären DNA-Sequenz versehen werden, was die Erzeugung des Proteins in einigen oder allen Zellen der Pflanze erlaubt.
Obwohl einige der Ausführungsformen der Erfindung derzeit nicht ausführbar sein mögen, z. B. weil sich bislang einige Pflanzenarten noch der genetischen Transformation widersetzen, ist die Durchführung der Erfindung in solchen Pflanzenarten bloß eine Frage der Zeit und nicht eine Frage des Prinzips, weil die Zugänglichkeit für die genetische Transformation als solche von keiner Relevanz für die zugrundeliegende Ausführungsform der Erfindung ist.
Die Transformation von Pflanzenarten ist heute Routine für eine beeindruckende Zahl von Pflanzenarten, einschließlich sowohl die Dicotyledoneae als auch die Monocotyledoneae. Im Prinzip kann jedes Transformationsverfahren verwendet werden, um erfindungsgemäße chimäre DNA in eine geeignete Ahnenzelle einzuführen, solange die Zellen zu ganzen Pflanzen regeneriert werden können. Verfahren können geeignet ausgewählt werden aus dem Calcium/Polyethylenglykol-Verfahren für Protoplasten (Krens, F. A. et al., 1982, Nature 296, 72–74; Negrutiu I. et al., Juni 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363–373), aus der Elektroporation von Protoplasten (Shillito R. D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099–1102), aus der Mikroinjektion in Pflanzenmaterial (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179–185), aus der (DNA- oder RNA-beschichteten) Partikelbombardierung von unterschiedlichem Pflanzenmaterial (Klein T. M. et al., 1987, Nature 327, 70), aus der Infektion mit (nicht-integrativen) Viren und dgl. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren umfaßt den Agrobacterium-vermittelten DNA-Transfer. Speziell bevorzugt ist die Verwendung der sogenannten binären Vektortechnologie, wie sie in EP-A-120 516 und US-PS 4 940 838 offenbart wird. Die Tomatentransformation wird bevorzugt im wesentlichen wie von Van Roekel et al. beschrieben durchgeführt (Van Roekel, J. S. C., Damm, B., Melchers, L. S., Hoekema, A. (1993). Factors influencing transformation frequency of tomato (Lycopersicon esculentum). Plant Cell Reports, 12, 644–647). Die Kartoffeltransformation wird bevorzugt im wesentlichen wie von Hoekema et al. beschrieben durchgeführt (Hoekema, A., Huisman, M. J., Molendijk, L., van den Elzen, P. J. M. und Cornelissen, B. J. C. (1989). The genetic engineering of two commercial potato cultivars for resistance to potato virus X. Bio/Technology 7, 273–278). Allgemein werden Pflanzenzellen oder -zellgruppierungen nach der Transformation auf die Gegenwart eines oder mehrerer Marker selektiert, die durch pflanzenexprimierbare Gene codiert werden, die mit der Nukleinsäuresequenz zusammen übertragen werden, die das erfindungsgemäße Protein codiert, worauf das transformierte Material zu einer ganzen Pflanze regeneriert wird.
Obwohl sie als etwas widerspenstiger für die genetische Transformation betrachtet werden, sind einkeimblättrige Pflanzen der Transformation zugänglich, und fruchtbare transgene Pflanzen können aus transformierten Zellen oder Keimlingen oder anderem Pflanzenmaterial regeneriert werden. Derzeit sind bevorzugte Verfahren zur Transformation von Einkeimblättrigen die Mikroprojektierbombardierung von Keimlingen, Explantaten oder Suspensionszellen und die direkte DNA-Aufnahme oder Elektroporation (Shimamoto, et al. 1989, Nature 338, 274–276). Transgene Maispflanzen wurden durch Einführung des Streptomyces hygroscopicus bar-Gens, das Phosphinothricin-Acetyltransferase codiert (ein Enzym, daß das Herbizid Phosphinothricin inaktiviert), in embryogene Zellen einer Maissuspensionskultur durch Mikroprojektilbombardierung erhalten (Gordon-Kamm, 1990, Plant Cell, 2, 603–618). Die Einführung von genetischem Material in Aleuron-Protoplasten von anderen einkeimblättrigen Anbaupflanzen, wie Weizen und Gerste, wurde angegeben (Lee, 1989, Plant Mol. Biol. 13, 21–30). Weizenpflanzen wurden aus embryogener Suspensionskultur durch Auswahl allein der gealterten kompakten und knotenreichen embryogenen Kallusgewebe für die Einrichtung der embryogenen Suspensionskulturen regeneriert (Vasil, 1990 Bio/Technol. 8, 429–434). Die Kombination mit Transformationssystemen für diese Anbaupflanzen ermöglicht die Anwendung der vorliegenden Erfindung auf Einkeimblättrige.
Einkeimblättrige Pflanzen, einschließlich wirtschaftlich wichtiger Anbaupflanzen wie Reis und Mais, sind ebenfalls für den DNA-Transfer durch Agrobacterium-Stämme zugänglich (siehe WO 94/00977; EP 0 159 418 B1 ; Gould J., Michael D., Hasegawa O., Ulian E. C., Peterson G., Smith R. H. (1991) Plant. Physiol. 95, 426–434).
Im Anschluß an DNA-Transfer und Regeneration können mutmaßlich transformierte Pflanzen z. B. unter Verwendung der Southern-Analyse auf die Gegenwart der erfindungsgemäßen chimären DNA, auf Kopieanzahl und/oder genomische Organisation ausgewertet werden. Zusätzlich oder alternativ können Expressionsgrade der neu eingeführten DNA vorgenommen werden unter Verwendung der Nothern- und/oder Western-Analyse, Techniken, die Durchschnittsfachleuten wohlbekannt sind. Nach der anfänglichen Analyse, die optional ist, können transformierte Pflanzen, die die gewünschte Kopieanzahl und den gewünschten Expressionsgrad der neu eingeführten erfindungsgemäßen chimären DNA zeigen, auf Resistenzgrade gegen ein Pathogen getestet werden, das für das erfindungsgemäße Protein anfällig ist, wie Phytophthora infestans. Alternativ können die ausgewählten Pflanzen einer weiteren Runde der Transformation unterworfen werden, z. B. zur Einführung weiterer Gene, wie von Genen, die Chitinasen, Glucanasen, Osmotine, Magainine oder dgl. codieren, um die Resistenzgrade zu steigern oder die Resistenz gegen andere Pilze zu verbreitern, die als nicht anfällig für das erfindungsgemäße Protein in einem hier beschriebenen In-vitro-Test festgestellt werden.
Andere Auswertungen können das Testen der Pilzresistenz unter Feldbedingungen, die Überprüfung der Fruchtbarkeit, des Ertrags und anderer Eigenschaften einschließen. Solche Untersuchung wird heute routinemäßig durch Durchschnittsfachleute durchgeführt.
Im Anschluß an solche Auswertungen können die transformierten Pflanzen direkt angebaut werden, aber gewöhnlich können sie als parentale Linien in der Zucht neuer Sorten oder in der Schaffung von Hybriden und dgl. verwendet werden.
Viele Pflanzenproteine weisen Antipilzwirkungen auf, manche jedoch nicht als solche, sondern sie liefern eine signifikant synergistische Antipilzwirkung, falls sie in Kombination mit anderen Pflanzenproteinen verwendet werden. In EP 440 304 A1 wurde offenbart, daß die gleichzeitige relative Überexpression eines pflanzenexprimierbaren Glucanasegens in Verbindung mit einer basischen Chitinase aus Tabak in transgenen Pflanzen zu einem höheren Resistenzgrad gegen Pilze als in Pflanzen führt, die eine pflanzenexprimierbare Klasse I-Chitinase allein exprimieren.
Sowohl Chitinasen, Glucanasen, Osmotine, Magainine und das neue erfindungsgemäße Antipilzprotein reichern sich in infizierten Pflanzengeweben bei einer inkompatiblen Pathogen-Pflanzen-Wechselwirkung an. Aus dieser Beobachtung und der Tatsache, daß festgestellt wird, daß verschiedene Proteine miteinander synergistisch Antipilzwirkungen erzeugen, erwägen wir, daß das erfindungsgemäße Antipilzprotein geeignet in Verbindung mit anderen Proteinen verwendet werden kann, die mit Pathogenresistenz verbunden sind.
Beispiele für Proteine, die in Kombination mit den erfindungsgemäßen Proteinen verwendet werden können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf β-1,3-Glucanasen und Chitinasen, die erhältlich sind aus Gerste (Swegle M. et al., 1989, Plant Mol. Biol. 12, 403–412; Balance G. M. et al., 1976, Can. J. Plant Sci. 56, 459–466; Hoj P. B. et al., 1988, FEBS Lett. 230, 67–71; Hoj P. B. et al., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 31–42 1989), Bohne (Boller T. et al., 1983, Planta 157, 22–31; Broglie K. E. et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6820–6824; Vögeli U. et al., 1988 Planta 174, 364–372; Mauch F. & Staehelin L. A., 1989, Plant Cell 1, 447–457); Gurke (Motraux J. P. & Boller T. (1986), Physiol. Mol. Plant Pathol. 28, 161–169); Lauch (Spanu P. et al., 1989, Planta 177, 447–455); Mais (Nasser W. et al., 1988, Plant Mol. Biol. 11, 529–538), Hafer (Fink W. et al., 1988, Plant Physiol. 88, 270–275), Erbse (Mauch F. et al. 1984, Plant Physiol. 76, 607–611; Mauch F. et al., 1988, Plant Physiol. 87, 325–333), Pappel (Parsons, T. J. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7895–7899), Kartoffel (Gaynor J. J. 1988, Nucl. Acids Res. 16, 5210; Kombrink E. et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 782–786; Laflamme D. und Roxby R., 1989, Plant Mol. Biol. 13, 249–250), Tabak (z. B. Legrand M. et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6750–6754; Shinshi H. et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89–93), Tomate (Joosten M. H. A. & De Wit P. J. G. M. 1989, Plant Physiol. 89, 945–951), Weizen (Molano J. et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4901–4907) und dgl.
Zum Erhalt transgener Pflanzen, die konstitutiv mehr als ein chimeres Gen exprimieren können, sind eine Anzahl von Alternativen erhältlich, einschließlich der folgenden:

A. Die Verwendung von DNA, z. B. einer T-DNA auf einem binären Plasmid, mit einer Anzahl von modifizierten Genen, die physikalisch mit einem selektierbaren Markergen gekoppelt sind. Der Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, daß die chimären Gene physikalisch gekoppelt sind und deshalb als ein einzelner Mendelscher Locus wandern.
B. Fremdbestäubung transgener Pflanzen, die jeweils eines oder mehrere chimäre Gene exprimieren können, bevorzugt gekoppelt an ein selektierbares Markergen, mit Pollen aus einer transgenen Pflanze, die ein oder mehrere chimäre Gene enthält, gekoppelt an einen anderen selektierbaren Marker. Danach kann das Saatgut, das durch diese Kreuzung erhalten wird, auf der Basis der Gegenwart der zwei selektierbaren Marker oder auf der Basis der Gegenwart der chimären Gene selbst selektiert werden. Die aus den selektierten Samen erhaltenen Pflanzen können danach zur weiteren Kreuzung verwendet werden. Im Prinzip sind die chimären Gene nicht auf einem einzelnen Locus, und die Gene können deshalb als unabhängige Loci segregieren.
C. Die Verwendung einer Anzahl einer Mehrzahl chimärer DNA-Moleküle, z. B. Plasmide, die jeweils ein oder mehrere chimäre Gene und einen selektierbaren Marker aufweisen. Falls die Häufigkeit der Cotransformation hoch ist, dann ist die Selektion auf der Basis nur eines Markers ausreichend. In anderen Fällen ist die Selektion auf der Basis von mehr als einem Marker bevorzugt.
D. Konsekutive Transformation transgener Pflanzen, die bereits ein erstes, zweites, etc. chimäres Gen enthalten, mit neuer chimärer DNA, die gegebenenfalls ein selektierbares Markergen umfaßt. Wie in Verfahren B sind die chimären Gene im Prinzip nicht auf einem einzelnen Locus, und die chimären Gene können daher als unabhängige Loci segregieren.
E. Kombinationen der oben genannten Strategien.

Die tatsächliche Strategie kann von verschiedenen Erwägungen abhängen, wie sie leicht bestimmt werden können, wie der Zweck der parentalen Linien (direkter Anbau, Verwendung in einem Zuchtprogramm, Verwendung zur Herstellung von Hybriden), aber ist nicht kritisch in bezug auf die beschriebene Erfindung.
In diesem Zusammenhang sollte betont werden, daß Pflanzen, die bereits chimäre DNA enthalten, die Antipilzproteine codieren kann, einen geeigneten genetischen Hintergrund zur Einführung erfindungsgemäßer chimärer DNA bilden können, z. B. zur Steigerung von Resistenzgraden oder zur Verbreiterung der Resistenz. Die Klonierung anderer Gene, die Proteinen entsprechen, die geeignet in Kombination mit DNA verwendet werden können, und der Erhalt transgener Pflanzen, die diese relativ überexprimieren können, sowie die Bewertung ihrer Wirkung auf die Pathogenresistenz in der Pflanze ist heute im Umfang des Durchschnittsfachmanns.
Der Erhalt transgener Pflanzen, die erfindungsgemäße Proteine exprimieren oder relativ überexprimieren können, ist ein bevorzugtes Verfahren, um den durch Pilze, wie Oomyzeten wie Phytophthora infestans, verursachten Schäden entgegenzuwirken, wie aus der obigen Beschreibung ersichtlich sein wird. Jedoch ist die Erfindung nicht darauf beschränkt. Die Erfindung erwägt eindeutig ebenfalls die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine als solche, bevorzugt in Form einer fungiziden Zusammensetzung. Fungizide Zusammensetzungen schließen diejenigen ein, in denen das Protein als solches formuliert ist, aber ebenfalls in Form von Wirtszellen, wie bakteriellen Zellen, die das Protein erzeugen können, wodurch der Kontakt des Pathogens mit dem Protein verursacht wird. Geeignete Wirtszellen können z. B. aus harmlosen Bakterien und Pilzen selektiert werden, bevorzugt denjenigen, die Wurzeln und/oder Blätter von Pflanzen kolonisieren können. Beispiele für bakterielle Wirte, die in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, sind Stämme von Agrobacterium, Arthorbacter, Azospyrillum, Pseudomonas, Rhizobacterium und dgl., gegebenenfalls nachdem sie für diesen Zweck geeignet gemacht wurden.
Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Antipilzproteine enthalten, können zusätzlich osmotinartige Proteine wie in WO 91/18984 definiert umfassen. Unabhängig stellt die Erfindung Antipilzzusammensetzung bereit, die ferner inhibitorische Mittel umfassen, wie klassische pilzliche Antibiotika, SAFPs und chemische Fungizide, wie Polyoxine, Nikkomycine, Carboxyimide, aromatische Kohlehydrate, Carboxine, Morpholine, Inhibitoren der Sterolbiosynthese, Organophosphor-Verbindungen, Enzyme, wie Glucanasen, Chitinasen, Lysozyme und dgl. Entweder als solches oder in Kombination mit anderen aktiven Bestandteilen sollte das Antipilzprotein der Erfindung in Konzentrationen zwischen 1 ng/ml und 1 mg/ml, bevorzugt zwischen 2 ng/ml und 0,1 mg/ml, innerhalb der pH-Grenzen von 3,0 und 9,0, angewendet werden. Allgemein ist es erwünscht, gepufferte Zubereitungen zu verwenden, z. B. Phosphatpuffer zwischen 1 mM und 1 M, bevorzugt zwischen 10 mM und 100 mM, insbesondere zwischen 15 und 50 mM, wobei es im Fall niedriger Pufferkonzentrationen gewünscht ist, ein Salz zur Erhöhung der Ionenstärke hinzuzufügen, bevorzugt NaCl in Konzentrationen zwischen 1 mM und 1 M, bevorzugt 10 mM und 100 mM.
Pflanzen oder Teile davon, die ein erfindungsgemäßes Protein relativ überexprimieren, einschließlich Pflanzensorten, mit verbesserter Resistenz gegen Pilzkrankheiten, speziell Krankheiten, die durch Oomyzeten wie Phytophthora und Pythium verursacht werden, können auf dem Feld, im Gewächshaus oder zu Haus oder an anderer Stelle angebaut werden. Pflanzen oder eßbare Teile davon können als Tierfutter oder zum menschlichen Verzehr verwendet werden oder können zu Nahrungsmitteln, Futter oder anderen Zwecken in jeder Form der Landwirtschaft oder Industrie verarbeitet werden. Landwirtschaft soll Gartenbau, Holzwirtschaft, Blumenkultur oder dgl. einschließen. Industrien, die von erfindungsgemäßem Pflanzenmaterial profitieren können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die papier- und zellstoffherstellende Industrie, die zuckererzeugende Industrie, die Futter- und Lebensmittelindustrie, Enzymhersteller und dgl. Die Vorteile der Pflanzen oder Teile davon gemäß der Erfindung sind der verringerte Bedarf an Fungizidbehandlung, wodurch Kosten von Material, Arbeit und Umweltverschmutzung verringert oder die Haltbarkeit von Produkten (z. B. Frucht, Samen und dgl.) solcher Pflanzen verlängert werden. Pflanzen für den Zweck dieser Erfindung sollen multizelluläre Organismen bedeuten, die Photosynthese betreiben können und Gegenstand einer Form von Pilzkrankheit sind. Sie sollen wenigstens Bedecktsamer sowie Nacktsamer, einkeimblättrige als auch zweikeimblättrige Pflanzen einschließen.
Der Begriff "Pflanzen, die ein Protein relativ überexprimieren" soll Pflanzen bedeuten, die Zellen enthalten, die ein Transgen-codiertes Protein exprimieren, das entweder nicht natürlich in der Pflanze vorhanden ist oder, falls es aufgrund eines endogenen Gens vorhanden ist, das ein identisches Protein codiert, nicht in der gleichen Menge oder nicht in den gleichen Zellen, Zellkompartimenten, Geweben oder Organen der Pflanze vorhanden ist. Es ist zum Beispiel bekannt, daß Proteine, die sich normalerweise intrazellulär anreichern, auf den apoplastischen Raum ausgerichtet werden können.
Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann die regulatorische Region eines Pflanzengens, das für das Antipilzprotein der Erfindung codiert, zur Expression anderer heterologer Sequenzen unter seiner Kontrolle verwendet werden. Die Verwendung eines regulatorischen Elements mit wenigstens 1000 bp direkt stromaufwärts der Gen-codierenden Region ist ausreichend zum Erhalt einer Expression jeder heterologen Sequenz.
Heterologe Sequenzen in dieser Hinsicht bezeichnen Genregionen, die nicht natürlich mit der regulatorischen Region verbunden sind, und sie umfassen sowohl unterschiedliche Gen-codierende Regionen als auch antisense-Genregionen. Heterologe codierende Sequenzen, die vorteilhaft im Leitgewebe exprimiert werden können, umfassen diejenigen, die für antipathogene Proteine codieren, z. B. Insektizide, bakterizide, fungizide und nematozide Proteine. In einer solchen Strategie kann es sich als außergewöhnlich vorteilhaft erweisen, ein Protein mit Aktivität gegen ein Pathogen oder einen Schädling auszuwählen, das/der eine Präferenz für das Phloem als Nährmittelquelle (z. B. Blattläuse) oder als Eingang zum Befallen der Pflanze hat. Beispiele sind Extensin, Lectin oder Lipoxidase gegen Blattläuse (siehe WO 93/04177). Unter der Annahme, daß die erfindungsgemäße regulatorische Region aktiv im Xylem ist, können die Antipilzproteine unter der Kontrolle der regulatorischen Region zur Bekämpfung von Fusarium-, Verticillium-, Alternaria- und Ceratocystus-Arten exprimiert werden.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen regulatorischen Region kann ebenfalls vorteilhaft verwendet werden, um Phloem-Transportprozesse zu regulieren oder zu steuern. Zahlreiche andere Anwendungen werden den Fachleuten leicht einfallen.
Die Expression eines Teils (eines Teils) eines endogenen Gens in der antisense-Orientierung (wie in EP 0 233 399 A offenbart) kann effektiv die Expression des endogenen Gens abregulieren, mit interessanten Anwendungen. Außerdem kann das Gen, das das erfindungsgemäße Antipilzprotein selbst codiert, unter Verwendung des antisense-Ansatzes abreguliert werden, was zur Aufklärung der Natur und Funktion des Proteins beitragen kann. Die für die gewebespezifische Expression verantwortlichen Regionen können weiter unter Verwendung des GUS-Markers in einer Weise aufgeklärt werden, die analog zu der hier erläuterten Weise ist.
Der folgende Stand der Technik kann berücksichtigt werden, speziell als Veranschaulichung des allgemeinen Fachwissens, auf das sich diese Erfindung bezieht: EP-A 392 225 A2; EP-A 440 304 A1; EP-A 460 753 A2; WO 90/07001 A1; US-PS 4 940 840 .
Noch ein anderer Teil der Erfindung ist auf die Herstellung eines neuen oxidativen Enzyms gerichtet, das Kohlehydrate selbst bei niedrigen Konzentrationen aufgrund seines niedriges Km-Wertes oxidieren kann. Ganz spezifisch sind Hexosen das Substrat der enzymatischen Aktivität, obwohl ebenfalls andere Zucker in einem etwas geringeren Ausmaß betroffen sind. Die Enzyme können aus den Quellen isoliert werden, in denen sie natürlich auftreten (gemäß dem in dieser Erfindung beschriebenen Verfahren), oder sie können aus Pflanzen oder anderen Organismen isoliert werden, die mit einem exprimierbaren Gen transformiert wurden, das das Protein codiert. Diese Oxidasen können in industriellen Prozessen zur Oxidation von Kohlehydraten, wie Glucose, Mannose, Galactose, Cellobiose, Maltose und Lactose, verwendet werden.
Auswertung transgener Pflanzen
Anschließend transformierte Pflanzen werden auf die Gegenwart der gewünschten Eigenschaften und/oder das Ausmaß ausgewertet, mit dem die gewünschten Eigenschaften exprimiert werden. Eine erste Auswertung kann den Grad der Expression der neu eingeführten Gene, den Grad der Pilzresistenz der transformierten Pflanzen, die stabile Vererbbarkeit der gewünschten Eigenschaften, Feldversuche und dgl. einschließen.
Zweitens können die transformierten Pflanzen, falls gewünscht, mit anderen Sorten gekreuzt werden, z. B. mit Sorten von höherem wirtschaftlichem Wert, oder mit Sorten, in die andere gewünschte Eigenschaften schon eingeführt wurden, oder können zur Schaffung von Hybridsamen verwendet werden oder können einer weiteren Runde der Transformation und dgl. unterworfen werden.
Synergie
Es wird vorhergesagt, daß die Kombination aus einem der erfindungsgemäßen Antipilzproteine und anderen Antipilzproteinen aus pflanzlicher oder mikrobieller Quelle eine drastische synergistische Antipilzwirkung zeigt. Ähnliche synergistische Antipilzwirkungen wurden gezeigt, falls Kombinationen aus Antipilz-CBPs oder -Chi-V mit entweder β-1,3-Glucanasen oder Chitinasen aus anderen pflanzlichen Ursprüngen kombiniert werden. Offensichtlich ist die synergistische Wirkung von Kombinationen aus Pathogen-induzierten Proteinen ein allgemeineres Phänomen, das wichtige Konsequenzen für die Manipulation von pilzresistenten Pflanzen hat.
Pflanzen oder Teile davon von kommerziellem Interesse mit verbesserter Resistenz gegen phytopathogene Pilze können auf dem Feld oder in Gewächshäusern angebaut und anschließend als Tierfutter, zum direkten Verzehr durch den Menschen, zur anhaltenden Lagerung, in der Lebensmittel- und anderer industrieller Verarbeitung und dgl. verwendet werden. Die Vorteile der Pflanzen oder der Teile davon gemäß der Erfindung sind der verringerte Bedarf an Fungizidbehandlung, wodurch die Kosten von Material, Arbeit und Umweltverschmutzung verringert oder die Haltbarkeit der Produkte (z. B. Früchte, Samen und dgl.) solcher Pflanzen verlängert werden.
Experimenteller Teil
Standardverfahren zur Isolierung, Manipulation und Amplifikation von DNA sowie geeigneter Vektoren zur Replikation von rekombinanter DNA, geeigneter Bakterienstämme, Selektionsmarker, Medien und dgl. werden z. B. beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; DNA Cloning: Bände I und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985); und "From Genes To Clones" (E.-L. Winnacker, Hrsg. 1987).
Antipilztest in vitro
Alle Pilze wurden auf Kartoffeldextroseagar (Difco) bei 25°C kultiviert, ausgenommen Botrytis cinerea und Phoma lingam, die auf einem Hafermehlagar (Difco) bei 25°C gezüchtet wurden. Phytophthora infestans wurde auf Roggenagar bei 18°C im Dunkeln gezüchtet (Caten und Jinks, 1968). Botrytis cinerea und Phoma lingam wurden unter UV-Licht kultiviert.
Sporen von sporenbildenden Pilzen wurden durch Fluten der Agarplatten mit Wasser geerntet. Die Sporenkonzentration wurde auf 10 000 Sporen/ml eingestellt. Im Fall von Rhizoctonia solani und Pythium ultimum wurden flüssige Schüttelkulturen in Kartoffeldextrosebouillon bei 25°C kultiviert. Zur Herstellung eines Inokulums aus diesen Schüttelkulturen wurde Mycel geerntet und für 1 Minute geschleudert. Nach Hindurchleiten durch ein feines Sieb wurde die Inokulumdichte auf 2500 bis 5000 Fragmente (mit jeweils 1 bis 3 Zellen) pro ml eingestellt.
Im Fall von sporenbildenden Pilzen wurden alle sowohl mit als auch ohne Vorkeimen der Sporen vor der Anwendung der Proteinproben getestet. Im Falle von nicht-sporenbildenden Pilzen wurden Hyphenfragmente verwendet.
Die Antipilzaktivität wurde während der Reinigung in einem Mikrotiterplattentest unter Verwendung der Pilze Phytophthora infestans und Pythium ultimum gemäß Woloshuk et al., 1991, oder unter Verwendung anderer Pilze in einer ähnlichen Weise überwacht. In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen wurden 250 μl Kartoffeldextroseagar (PDA) pipettiert. Pilzsporen im Fall von z. B. Phytophthora infestans und Hyphenfragmente im Fall von z. B. Pythium ultimum wurden in Wasser suspendiert, und 400 bis 600 Sporen oder 200 Fragmente in 50 μl wurden zu den Vertiefungen hinzugegeben. Anschließend wurden 100 μl filtersterilisierte (0,22 μm Filter) Proteinlösung (in 50 mM MES, pH 6,0) hinzugegeben. Mikrotiterplatten wurden mit Parafilm eingewickelt und bei Raumtemperatur inkubiert. Zu mehreren Zeitpunkten nach dem Start der Inkubation wurde der Pilz mikroskopisch auf Wirkungen des hinzugegebenen Proteins überwacht. Nach 2 bis 3 Tagen wurde das Mycel des wachsenden Pilzes in den Vertiefungen mit Lactophenol-Baumwollblau angefärbt, und das Ausmaß des Wachstums wurde abgeschätzt.
GI: Wachstumshemmung; eine Skala von 0 bis 4 wird verwendet, 0 = keine sichtbare Hemmung, 1 = schwache (0 bis 30%) Hemmung, 2 = moderate (30 bis 60%) Hemmung, 3 = starke (60 bis 90%) Hemmung, 4 = sehr starke (100%) Hemmung.
Beispiel 1
Reinigung eines Antipilzproteins MS59 aus mit Salicylsäure induzierter Sonnenblume
Blätter von 7 bis 8 Wochen alten Sonnenblumenpflanzen (Helianthus annuus cv. zebulon) wurden täglich 5-mal mit 10 mM Natriumsalicylat besprüht. Nach 3 Stunden wurden die Pflanzen umfassend mit Wasser zur Entfernung des Natriumsalicylats gespült. Drei Tage nach der letzten Besprühung wurden die Blätter (400 g) in flüssigem Stickstoff geerntet und bei 4°C in 500 ml 0,5 M NaOAc pH 5,2 und 4 g Aktivkohle unter Verwendung eines Waring-Mischers homogenisiert. Das Homogenat wurde durch vier Schichten aus Seihtuch filtriert, und anschließend wurde das Filtrat für 50 Minuten mit 20 000 g bei 4°C zentrifugiert und durch Hindurchleiten durch eine Sephadex G25-Säule (mittelgrob; Pharmacia), Länge 60 cm, Durchmesser 11,5 cm, äqulibriert in 40 mM NaOAc, pH 5,2, entsalzt. Die entsalzte Proteinlösung wurde über Nacht bei 4°C gelagert und anschließend für 45 Minuten mit 20 000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine S-Sephadex-Säule (Fast-flow, Pharmacia), Länge 5 cm, Durchmesser 5 cm, die mit 40 mM NaOAc pH 5,2 äquilibriert worden war, geleitet. Die Säule wurde mit dem oben genannten Puffer gespült, Fließgeschwindigkeit 400 bis 500 ml/h), bis der OD₂₈₀-Wert auf Null abfiel. Die gebundenen Proteine wurden unter Verwendung von 400 mM NaCl in 200 ml des oben genannten Puffers eluiert.
Nach Dialyse gegen 50 mM MES pH 6,0 wurde das Eluat auf Antipilzaktivität analysiert. Antipilzaktivität wurde in einem Mikrotiterplattentest unter Verwendung des Pilzes Phytophthora infestans und Pythium ultimum überwacht. Siehe oben für Einzelheiten betreffend den In-vitro-Test. Anschließend wurde erneut Kationenaustauscherchromatographie angewendet, wobei das Eluat durch eine Säule FPLC Mono-S HR 5/5 (Pharmacia) geleitet und mit einem linearen Gradienten von 0 zu 400 mM NaCl eluiert wurde. Alle Fraktionen wurden durch Elektrophorese (Laemmli (1970), Nature 227: 680–685) unter Verwendung eines 12,5%igen Polyacrylamidgels in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS) unter Verwendung vorangefärbter Molekulargewichtsmarker (15–105 kDa) als Referenz analysiert. Zusätzlich wurde die Antipilzaktivität aller Fraktionen gegenüber Phytophthora infestans und Pythium ultimum überwacht. Antipilzaktivität eluierte aus der Säule bei 45–60 mM NaCl, und in allen aktiven Fraktionen war eine 59 kD-Bande sichtbar. Fraktionen, die die Antipilzaktivität enthielten, wurden vereinigt und gegen 1 M Ammoniumsulfat in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7 dialysiert. Die Ansammlung wurde der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unterworfen, wobei die Probe auf eine Säule FPLC Phenyl Superose HR 5/5 (Pharmacia), äquilibriert im gleichen Puffer, aufgetragen und mit einem linear abnehmenden Gradienten von 1 zu 0 M Ammoniumsulfat in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7 eluiert wurde. Wie oben wurden wieder alle Fraktionen an SDS-PAGE analysiert und auf Antipilzaktivität überwacht. Ebenfalls wurde so die Ansammlung von Proteinen, die nicht an diese Säule (Durchfluß, Flow Through, FT) binden konnten, unter den hier gewählten Bedingungen analysiert. Antipilzaktivität war am reichlichsten im FT und als zweites ebenfalls in den Fraktionen vorhanden, die zwischen 0,76 und 0,45 mM Ammoniumsulfat eluierten. In beiden Fällen war ein 59 kD-Protein auf SDS-PAGE sichtbar. FT und die Gradientenfraktionen wurden separat gegen 50 mM MES, 0,2 M NaCl dialysiert und separat an einer Säule FPLC Superdex 75 HR 10/30 (Pharmacia), die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden war, chromatographiert. Proteine eluieren aus dieser Säule gemäß ihrer Molekülgröße. In beiden Fällen fiel wiederum die Gegenwart eines 59 kD-Proteins mit Antipilzaktivität gegen Phytophthora infestans und Pythium ultimum zusammen, gemäß Bewertung aus SDS-PAGE und In-vitro-Antipilztests. Das im FT der hydrophoben Wechselwirkungssäule vorhandene 59 kD-Protein war reichlich vorhanden und wurde als MS59 bezeichnet, und seine Reinigung wird in 1 dargestellt. Ergebnisse seiner Trennung über die Gelfiltrationssäule und anschließende Analyse sowohl an SDS-PAGE als auch an Phytophthora infestans sind in 2 gezeigt. Verschiedene Eigenschaften (Antipilzaktivität, chromatographische Eigenschaften, Molekulargewicht) des Gradientenproteins und MS59 zeigen, daß die zwei Proteine sehr ähnlich sind.
Zur weiteren Charakterisierung von MS59 wurde seine Aminosäuresequenz teilweise bestimmt. Deshalb wurde MS59 in Gegenwart von 0,1 mM Thioglycolat im oberen Reservoirpuffer und SDS an einem 12,5%igen Polyacrylamidgel getrennt, das für 2 Stunden mit 50 V mit 0,05 mM Glutathion im oberen Reservoirpuffer vorgelaufen lassen wurde. Das Gel wurde mit 5% (G/V) Serva Blue G in 45% (V/V) Methanol und 10% Essigsäure für 30 Minuten angefärbt und in 20% (V/V) Essigsäure für 30 Minuten entfärbt, und die 59 kDa-Bande wurde ausgeschnitten und unter Verwendung des Edman-Abbaus an einem Applied Biosystems 477A-Proteinsequenzer gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll sequenziert. Die N-terminale Aminosäuresequenzierung von MS59 zeigte, daß der N-Terminus blockiert war. Zum Erhalt der internen Sequenzen wurde MS59 mit Trypsin verdaut. Trypsin spaltet Protein an Arginin- und Lysin-Resten. Die Verdauungsprodukte wurden an einer Umkehrphasensäule getrennt und durch Edman-Abbau analysiert. Zwei tryptische Fragmente wurden sequenziert: Pep1 und Pep2. Von Pep1 wurden 25 Aminosäurereste identifiziert: S-I-N-V-D-I-E-Q-E-T-A-W-V-Q-A-G-A-T-L-G-E-V-Y-Y-R (SEQ ID NO: 1). Die Aminosäuresequenz ist unter Verwendung des Ein-Buchstaben-Codes angegeben. Von Pep2 wurden weitere 25 Aminosäurereste identifiziert: D-P-S-F-P-I-T-G-E-V-Y-T-P-G-(?)-S-S-F-P-T-V-L-Q-N-Y (SEQ ID NO: 2). Der Aminosäurerest in Klammern konnten nicht eindeutig identifiziert werden.
Beispiel 2
Elution von Antipilzprotein aus nativem PAGE und anschließende Untersuchung
Es ist aus den 1 und 2 offensichtlich, daß MS59 nicht völlig rein ist. Um weiter sicherzustellen, daß das 59 kDa-Protein tatsächlich für die beobachtete Antipilzaktivität verantwortlich ist, wurde die Fraktion, die die Spitzenmenge von 59 kDa enthielt, an einem nativen Gel unter Verwendung des gleichen Systems elektrophoretisch behandelt, wie es oben beschrieben wurde, jedoch ohne SDS und ohne Sieden der Proben vor der Auftragung. Die Gelspur wurde in 0,5 cm horizontale Stücke geschnitten, und jedes Stück wurde individuell für 48 Stunden in 50 mM MES, pH 6 eluiert. Nach Zentrifugieren wurde der resultierende Überstand sowohl an SDS-PAGE als auch in vitro auf Antipilzaktivität analysiert. Ergebnisse sind in 3 gezeigt. Nur in denjenigen Fraktionen, die MS59 enthielten, wurde Antipilzaktivität gegen Phytophthora infestans und Phythium ultimum beobachtet.
Beispiel 3
Antipilztests in vitro an Nicht-Oomyzeten
Pilztests in vitro wurden wie im allgemeinen experimentellen Teil beschrieben durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde Phytophthora infestans getestet. Der Peak von MS59 befindet sich in Fraktion 4. Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Antipilzwirkungen von MS59-haltigen Fraktionen aus Mono-S, pH 6

GI: Wachstumshemmung; eine Skala von 0–4 wird verwendet,
0: keine sichtbare Wachstumshemmung,
1: schwache (0 bis 30%) Hemmung,
2: moderate (30 bis 60%) Hemmung,
3: starke (60 bis 90%) Hemmung,
4: sehr starke (100%) Hemmung.

Wie ersichtlich ist, schienen Phytophthora und Pythium spp. sehr empfindlich gegen MS59 zu sein.
Beispiel 4
Reinigung eines Antipilzproteins WL64 aus mit Salicylsäure induziertem Salat
Blätter von 7 bis 8 Wochen alten Salatpflanzen (Lactuca sativa cv. Lollo bionda) wurden täglich mit 10 mM Salicylat für 4 Tage besprüht. Nach zwei Stunden wurden die Pflanzen umfassend mit Wasser gespült, um das Natriumsalicylat zu entfernen. Am Tag 5 wurden die Blätter in flüssigem Stickstoff geerntet und bei –80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Salatblätter wurden aufgetaut und bei 4°C in 0,5 M NaOAc, pH 5,2, 0,1% β-Mercaptoethanol (Salat : Puffer = 1 : 1,5 (G/V)) und 10 g Aktivkohle pro kg Blätter unter Verwendung eines Waring-Mischers homogenisiert. Das Homogenat wurde für 60 Minuten mit 9000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde anschließend über 10 Schichten aus Seihtuch filtriert. Das Filtrat wurde mit Ammoniumsulfat auf 40% Sättigung gebracht und für 30 Minuten mit 9000 g zentrifugiert. Der resultierende Überstand, der 85% Protein und > 95% Antipilzaktivität relativ zum rohen Homogenat enthielt, wurde der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie unterworfen.
Der Überstand wurde über ein Papierfilter filtriert und auf eine Phenyl-Sepharose 6FF High Sub-Säule aufgetragen (Pharmacia, 100 ml Bettvolumen in einer Pharmacia XK 50/20-Säule), voräquilibriert mit 40% (1,45 M) Ammoniumsulfat in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6,0 (als Puffer A bezeichnet), mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min oder weniger. Die Säule wurde mit wenigstens 10 Säulenvolumina von Puffer A gespült, worauf gebundenes Protein mit einem abnehmenden Salzgradienten von 100% Puffer A zu 20% Puffer A (50 mM KPi, pH 6,0 als Puffer B) über einen Zeitraum von 40 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min, gefolgt von einem linearen abfallenden Gradienten von 20% A zu 0% A (= 100% B) über einen Zeitraum von 30 min mit der gleichen Fließgeschwindigkeit eluiert wurde. Die Säule wurde für weitere 45 min mit Puffer B gespült, worauf die Elution beendet wurde. Einminütige Fraktionen wurden aufgefangen (10 ml/Fraktion). Die Fraktionen 40 bis 75 (als HIC-Peak bezeichnet) enthielten Antipilzaktivität.
Die gesammelten Fraktionen wurden aufkonzentriert (unter Verwendung einer gerührten Flußzelle und einer YM 30 kDa-Membran (Amicon)) und anschließend 15-fach mit 25 mM Natriumacetat, pH 4,5 verdünnt. Diese Lösung wurde auf eine vorgepackte Source S-Säule (16/20, Pharmacia) mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/min aufgetragen. Nach Spülen der Säule mit 5 Säulenvolumina des Puffers wurde das Protein aus der Säule mit einem zunehmenden NaCl-Gradienten (0–0,4 M NaCl in 25 mM NaOAc, pH 4,5) über einen 60-minütigen Zeitraum, 2,5 ml/min, 1 min-Fraktionen, eluiert. Die Fraktionen wurden in 250 μl 1 M Kaliumphosphat, pH 7,0 aufgefangen, um den relativ sauren NaOAc-Puffer zu neutralisieren. Die Antipilzaktivität enthaltenden Fraktionen (Fraktionen 25–45 (0,2–0,3 M NaCl)) wurden vereinigt und werden als Source S-Peak bezeichnet.
Der Source S-Peak wurde aufkonzentriert und der Puffer zu 25 mM NaOAc, pH 4,5 ausgetauscht, was zu einer Fraktion von ca. 10 ml führte, und unter Verwendung einer Mono S-Säule (5/5, Pharmacia) der Kationenaustauscherchromatographie unterworfen. Die Säule wird mit den folgenden NaCl-Gradienten eluiert (NaCl in 25 mM NaOAc, pH 4,5): 0–5 min, 0–0,1 M NaCl; 5–20 min, 0,1–0,16 M NaCl; 20–21 min, 0,16–0,25 M NaCl; 21–31 min, 0,25 M NaCl; 31–32 min, 0,25–1,0 M NaCl, gefolgt von 1,0 M NaCl für 10 min, worauf die Elution vollständig ist. Die Antipilzaktivität eluierte aus der Säule während des 0,25 M NaCl-Schrittes (gewöhnlich Fraktionen 22–30; der Mono- S-Peak). Fließgeschwindigkeit 1 ml/min, 1 ml-Fraktionen, aufgefangen in 100 μl Kaliumphosphat, pH 7,0.
Der Mono-S-Peak wurde auf ca. 0,5–1,0 ml aufkonzentriert und mit 200 mM NaCl in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,0 als Laufpuffer der Gelfiltrationschromatographie unterworfen (Superdex 75, 10/30, Pharmacia). Das Probenvolumen betrug 200 μl; die Fließgeschwindigkeit 0,5 ml/min; 0,5 ml/Fraktion. Die Antipilzaktivität eluiert aus der Säule bei der Position des 66 kDa-Markers. Ein Vergleich der aktiven Fraktionen (SD 75-Peak) mit dem Proteinmuster an SDS-PAGE zeigt ein 64 kDa-Protein als wahrscheinlichsten Kandidaten für das Salat-Antipilzprotein (6A–C). Dieses Protein wurde WL64 genannt.
Der SK-75-Peak wurde auf pH 9,5 zur Chromatofokussierung an einer Mono P-Säule (Pharmacia) gemäß den Herstelleranweisungen pufferausgetauscht. Die gesamte Aktivität wurde im Durchfluß der Säule gefunden (selbst im Fall, als die Säule auf pH 11,0 äquilibriert wurde), obwohl es eine gewisse Trennung gab (3 überlappende Peaks im Durchfluß). Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/min; 0,5 ml/Fraktion. Die Fraktionen, die die Antipilzaktivität enthielten, wurden vereinigt und zu 50 mM MES, pH 6,0 pufferausgetauscht. Coomassie-Anfärbung der am höchsten gereinigten Proteinfraktion nach SDS-PAGE zeigte ca. 6 Proteinbanden, von denen zwei Banden mit 64 und 55 kDa die hervorstechendsten waren (7). Die abgeschätzten relativen Mengen beider Proteine in der Endfraktion betrugen 1/6–1/8 für das 64 kDa-Protein und 1/2–1/3 für das 55 kDa-Protein. Obwohl auf Gel gezeigt wird, daß diese Säule deutlich zur Reinigung des 64 kDa-Proteins beiträgt, fielen die spezifische Aktivität sowie die Gewinnung des Proteins in den gesammelten Fraktionen beträchtlich ab (siehe Tabelle 2). Ein repräsentatives Reinigungsverfahren ist in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Tabelle 2. Reinigung von WL64
Die Aktivität wird als Wachstumshemmungseinheiten (GI-Einheiten) dargestellt. Vier GI-Einheiten stellen die Proteinmenge dar, die zur Wachstumshemmung von 100% im In-vitro-Test führt, wie er im allgemeinen Teil der Beispiele beschrieben wird.
Beispiel 5
Elution von WL64 aus nativem PAGE und anschließende Untersuchung
Da WL64 nicht völlig rein war, wurde weiter untersucht, ob das 64 kDa-Protein tatsächlich verantwortlich für die beobachtete Antipilzaktivität war oder nicht. Die Mono P-Fraktion, die die Spitzenmenge von Antipilzaktivität enthielt, wurde der Elektrophorese an einem nativen 10%igen Polyacrylamidgel unter sauren Bedingungen in Abwesenheit von SDS und β-Mercaptoethanol und ohne Kochen unterworfen. Zwei benachbarte Gelspuren wurden in 0,3 cm horizontale Stücke geschnitten. Ein Teil wurde direkt im Antipilztest verwendet, der andere Teil wurde dem SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen unterworfen. Die Wachstumshemmung korrelierte deutlich mit dem 64 kDa-Protein und nicht mit dem 55 kDa-Protein.
Beispiel 6
Glycosylierung von WL64
WL64 sowie das 55 kDa-Protein sind glycosyliert, wie es durch die Bindung an Concanavalin A und durch das DIG-Glycan-Nachweiskit (Boehringer) veranschaulicht wird. Beide Proteine waren nicht empfindlich gegenüber Glycopeptidase-F-Behandlung, was anzeigt, daß die Glycosylierung wahrscheinlich O-gebunden ist.
Beispiel 7
Aminosäuresequenzierzug von WL64
Zur N-terminalen Aminosäuresequenzierung wurde eine Menge von 21 μg des gereinigten Proteins (was ca. 4 μg WL64 darstellt) an einem 7,5%igen Polyacrylamidgel getrennt und anschließend auf PVDF-Membran geblottet. Die Membran wurde mit 0,1% Serva Blue G in 45% Methanol, 10% Essigsäure für 5 Minuten bei Raumtemperatur angefärbt und mit 45% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt. Die 64 kDa-Bande wurde ausgeschnitten und unter Verwendung von Edman-Abbau an einem Applied Biosystems 477A-Proteinsequenzer gemäß dem vom Hersteller bereitgestellten Protokoll sequenziert.
Zur internen Proteinsequenzierung wurden 105 μg des gereinigten Proteins (was ca. 20 μg WL64 darstellt) an einem 7,5%igen SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Das Gel wurde mit 0,2% Serva Blue G in 20% Methanol, 0,5% Essigsäure für 20 min bei Raumtemperatur angefärbt und mit 30% Methanol bei Raumtemperatur für ca. 1 Stunde entfärbt. Die 64 kDa-Bande wurde ausgeschnitten und das Protein anschließend mit Trypsin verdaut. Die Verdauungsprodukte wurden an einer Umkehrphasensäule getrennt und durch Edman-Abbau analysiert.
Neben der N-terminalen Sequenz (SEQ ID NO: 49) wurden zwei tryptische Fragmente sequenziert (SEQ ID NO: 50 und SEQ ID NO: 51).
Die Aminosäurereste in Klammern konnten nicht eindeutig identifiziert werden.
Beispiel 8
Antipilzaktivität von MS59 und WL64
Auf der Basis der Sequenzhomologie zwischen MS59 und WL64 scheinen beide Proteine sehr miteinander verwandt zu sein. Dies könnte ebenfalls der Fall für ihre Antipilzaktivität sowie für ihre spezifischen Aktivitäten gegen die jeweiligen Pilze sein. Diese Hypothese wurde untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3. Antipilzaktivität von MS59 und WL64¹

n. t.: nicht getestet

Beispiel 9
Oxidaseaktivitäten
Eine 50 ml-Kultur von Rhizoctonia solani in Kartoffeldextrosebouillon wurde umfassend auf Eis ultraschallbehandelt und anschließend mit 3 000 g für 20 min bei 4°C zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde dann mit 25 000 g für 1 Stunde zentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal mit entmineralisiertem Wasser gewaschen und in 1 ml Wasser resuspendiert, das 1,0% Triton X-100 enthielt. Auf diese Weise wurde eine pilzliche Zellwandsuspension erhalten.
Die Oxidaseaktivität wurde unter Verwendung des Reagens 4-Aminoantipyrin (4-AAP) auf Basis von Gallo, 1981 gemessen (Gallo, Methods in Enzymology, 71: 665–668, 1981). Ein Reaktionsvolumen von 500 μl enthielt 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,0, 25 μM FAD, 10 mM NaN₃, 0,01% Triton X-100, 6 mM 2,4,6-Tribromhydroxybenzoesäure, 2 mM 4-AAP und 10 Einheiten Meerrettichperoxidase. Die Wasserstoffperoxid-Erzeugung wurde bei 510 nm gemessen. Bekannte Mengen von Wasserstoffperoxid wurden zur Kalibrierung eingeschlossen.
WL64 sowie MS59 lieferten Oxidaseaktivitäten unter Verwendung der pilzlichen Zellwandsuspension als Substrat. Unterschiedliche Substanzen wurden anschließend als mögliche Substrate getestet, unter anderem einige Kohlehydrate und Aminosäuren (siehe Beispiel 10). Es wurde festgestellt, daß Glucose und andere Kohlenhydrate als Substrat für die Oxidaseaktivität von sowohl MS59 als auch WL64 dienen.
Da MS59 und WL64 Kohlehydrat- und speziell Glucoseoxidase-Aktivität zeigten, wurde untersucht, ob die pilzliche Zellwandsuspension als Substrat für Glucoseoxidase (GOX) aus Aspergillus niger (Sigma, G 2133) dienen könnte. Dies war tatsächlich der Fall. Kinetische Untersuchungen zeigten, daß MS59, WL64 und GOX eine Michaelis-Menten-Kinetik zeigen, wenn Glucose als Substrat verwendet wird, wie es mittels einer Lineweaver-Burk-Auftragung veranschaulicht wird (8A). Die K_m-Werte für MS59 und WL64 waren mehr als eine Größenordnung niedriger als derjenige für GOX: 19,5 μM und 23,3 μM für WL64 bzw. MS59 und 359 μM für GOX. Dies bedeutet, daß die Affinität für Glucose viel höher für MS59 und WL64 als für GOX ist. Die V_max-Werte waren jedoch vergleichbar mit 5,7, 16,8 und 6,7 μmol H₂O₂/min/mg Protein für WL64, MS59 bzw. GOX.
Kinetische Untersuchungen unter Verwendung der pilzlichen Zellwandsuspension als Substrat zeigten eine Michaelis-Menten-Kinetik für sowohl MS59 als auch WL64, aber nicht für GOX, wie es in 8B gezeigt wird. Die K_m-Werte für MS59 und WL64 betrugen 4,7 μl bzw. 24,3 μl unter Verwendung der oben beschriebenen Suspension. Die V_max-werte betrugen 22,0 und 11,2 μmol H₂O₂/min/mg Protein für MS59 bzw. WL64. Da GOX mit pilzlichen Zellwänden als Substrat keine lineare Beziehung in einer Lineweaver-Burk-Auftragung zeigt, konnten K_m und V_max nicht aus der Auftragung extrapoliert werden. Die kinetischen Daten sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Tabelle 4. Kinetische Parameter von MS59, WL64 und Glucoseoxidase
Beispiel 10
Substratspezifitäten
Unterschiedliche Substanzen wurden als mögliche Substrate untersucht. Von Saccharose, Sorbit, Fructose, Carboxymethylcellulose, β-Alanin, Asparaginsäure, Chitin, Cellulose, Glutamat, Glycin-Glycin, Laminarin und Glucose diente nur letztere als Substrat für zumindest WL64. Konzentrationen der verschiedenen Substrate variierten zwischen 5 mM und 50 mM. Es wurde weiter untersucht, ob Glucose das einzige Substrat für MS59 und WL64 war oder ob auch andere Kohlehydrate oxidiert werden konnten. Die Enzymtests wurden wie in Beispiel 9 beschrieben durchgeführt, wobei die Substratkonzentrationen 50 mM betrugen. Es wurde gezeigt, daß GOX ausschließlich Glucose oxidiert (9). Die gleiche Figur zeigt, daß MS59 und WL64 eine viel breiterer Substratspezifität zeigen, die von C₄-Zuckern bis zu Di- und Polysacchariden reicht. Die höchsten (und beinahe gleichen) Aktivitäten wurden mit D-Glucose, D-Mannose, D-Galactose, Cellobiose, Maltose und Lactose erhalten (9). Diese Reihe von Substraten ähnelt der Reihe, von der festgestellt wurde, daß sie durch Hexoseoxidase (EC 1.1.3.5) umgewandelt werden kann.
Beispiel 11
Identifikation und Charakterisierung von Genen, die homolog zur abgeleiteten MS59-Nukleotidsequenz sind
Auf der Basis der Aminosäuresequenzen von pep1 (Aminosäuren 12 bis 22 von SEQ ID NO: 1) und pep2 (Aminosäuren 2 bis 12 von SEQ ID NO: 2) wurden Primer zur PCR konstruiert. Genomische DNA wurden aus Sonnenblume cv. Zebulon isoliert, und die PCR-Primer 4 (5'AAC TTC TCC IAG IGT IGC ICC IGC TTG IAC CCA3', SEQ ID NO: 3) und 5 (5'GAT CCI TCT TTC CCI ATT ACT GGI GAG GTT TA3', SEQ ID NO: 4) wurden zur Amplifikation eines DNA-Fragments mit 354 bp aus dem Sonnenblumengenom mit PCR verwendet. Dieser Fragmentgröße entsprechende PCR-Produkte wurden kloniert (SEQ ID NO: 5). Die Sequenzanalyse des Produkts zeigte die Gegenwart eines ununterbrochenen offenen Leserasters (ORF) (SEQ ID NO: 6), dessen erster und letzter Abschnitt von Aminosäuren mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 übereinstimmte. Mehrere sequenzierte Klone enthielten Punktmutationen, die von 1 bis 4 in diesem PCR-Fragment variierten. Alle außer einer dieser Mutationen waren stumme Mutationen (Nukleotid Nr. 57 T zu C, Nukleotid Nr. 63 C zu A, Nukleotid Nr. 225 A zu G), die daher nicht die codierten Aminosäuresequenzen veränderten. Ein Klon enthielt jedoch eine Punktmutation (Nukleotid Nr. 203 G zu A), die die Aminosäuresequenz an Aminosäure 68 von Arg zu Lys veränderte.
Ein Southern-Blot der genomischen Sonnenblumen-DNA, sondiert mit SEQ ID NO: 5, zeigte die Existenz multipler homologer Sequenzen im Genom an. Unter Verwendung von SphI wurden 6 Banden, mit EcoRV 5 Banden, mit SpeI 3 Banden und mit NdeI 4 Banden detektiert. Mit anderen Enzymen wurden zuvor 3 bis 4 Banden erkannt. Diese Analyse legt die Existenz von 3 Genen mit (partieller) Homologie mit den MS59-Sequenzen nahe.
Neue PCR-Primer wurden auf Basis der nicht-variablen Gebiete zwischen den ursprünglichen PCR-Primersequenzen entwickelt. Primer: für 3'-RACE: 5' CAG GCA GCT GTG GTT TGT GGC 3' (SEQ ID NO: 7), für 5'-RACE: 5' GTC CAC AAT GAA GAA GGG TTG 3' (SEQ ID NO: 8) und für verschachteltes 3'RACE: 5' ACG TAG ATA TCG AAC AAG AAA CCG C 3' (SEQ ID NO: 9).
Poly(A)-enthaltende RNA wurde aus Blattmaterial der Sonnenblume isoliert, das durch 5-maliges Besprühen mit einer 10 mM Natriumsalicylat-Lösung induziert wurde. cDNA wurde hergestellt, und 5'- und 3'-RACE-PCR-Reaktionen wurden wie in den Anweisungen des Marathon^TM-Kits beschrieben durchgeführt (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Partielle cDNA-Klone wurden durch 5'- und 3'-RACE-PCR-Reaktionen isoliert. Sequenzanalyse bestätigte die Identität der partiellen cDNA-Klone. Wieder wurden neue PCR- und verschachtelte PCR-Primer auf Basis neu erhaltener Sequenzinformationen aus klonierten 5'- und 3'-RACE-PCR-Produkten entwickelt. Primer für 5'-RACE: 5' CTG GGG AAG CCC GTG TAG TAA AGC 3' (SEQ ID NO: 11), 5' CGG GAA GTT GCA GAA GAT TGG GTT G 3' (SEQ ID NO: 13), für verschachteltes 5'-RACE: 5' GAG CAA GAG AAG AAG GAG AC 3' (SEQ ID NO: 14), für 3'-RACE: 5' GCT TTA CTA CAC GGG CTT CCC CAG 3' (SEQ ID NO: 10) und für verschachteltes 3'-RACE: 5' GGT ACT CCA ACC ACG GCG CTC 3' (SEQ ID NO: 12). Vier partielle cDNA-Klone wurden isoliert, die zusammen das gesamte offene Leseraster, einschließlich eines mutmaßlichen Signalpeptids, gefolgt von einem Protein mit etwa 59 kDa und 5'- und 3'-UTRs (untranslatierte Regionen) codieren (SEQ ID NO: 15). Ein cDNA-Klon voller Länge mit 1784 bp, dessen ORF (Position 21 bis Position 1608) 529 Aminosäurereste codiert (SEQ ID NO: 16), konnte aus diesen vier partiellen cDNA-Klonen und den oben genannten PCR-Fragmenten zusammengesetzt werden (SEQ ID NO: 5). Die Amino-terminale Signalsequenz (Von Heijne et al., 1983 und Von Heijne, 1985) wird wahrscheinlich nicht vollständig innerhalb der ersten 19 Aminosäurereste dargestellt. Eine Vorhersage für den mutmaßlichen Spaltort wurde vorgenommen.
Die Aminosäuresequenz dieses cDNA-Klons wurde in einer BLAST-Homologierecherche verwendet. Diese Sequenz zeigt eine hohe Homologie mit den "Berberine Bridge Enzymes" (BBE) aus Kalifornischem Mohn (Eschscholtzia californica) (Dittrich und Kutchan, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9969–9973) und Schlafmohn (Papaver somniferum) (Facchini et al., 1996, Plant Physiol., 112, 1669–1677). BLAST-Durchmusterung von "Expressed Sequence Tag"-(dbEST)-Datenbanken mit der Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO: 16 gezeigt, zeigte Homologe des MS59-Proteins in Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 21 bis SEQ ID NO: 47) und Reis (SEQ ID NO: 48). Die EST-Sequenzen sind in der sense-Orientierung aufgeführt, die als die Orientierung der Homologie zu MS59 betrachtet wird. Sequenzen der EST-Klone wurden durch Inserieren eines oder zwei zusätzlicher unbekannter Nukleotide (N oder NN) in Rasterverschiebungspositionen verändert, um ein einzelnes Translationsraster mit Homologie zu MS59 zu erhalten.
Beispiel 12
Isolation des Gens, das WL64 codiert, und Bestimmung der Nukleotidsequenz
Auf der Basis der Aminosäuresequenz des Amino-Terminus des WL64-Proteins (SEQ ID NO: 59, Thr-Ser-Thr-Ser-Ile-Ile-Asp, Arg-Phe-Thr-Gln-(Cys/Ser)-Leu-Asn-Asn-Arg-Ala-Asp-Pro-(Ser)-(Phe)-) wurde ein Primer (Aminosäuren 1 bis 11 von SEQ ID NO: 49) zur PCR entwickelt. Die N-terminale Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 49) zeigte eine hohe Homologie mit dem entsprechenden Teil des MS59-Proteins (Aminosäurereste 20 bis 39 in SEQ ID NO: 16). cDNA wurde aus Poly(A)-enthaltender RNA hergestellt, die aus Salatblättern (Lactuca sativa cv. Lollo bionda) isoliert wurde, die durch 5-maliges Besprühen mit einer 10 mM Natriumsalicylat-Lösung induziert wurden. PCR-Primer FR-WL64-142 (5'ACT TCT ACT TCT ATT ATT GAT AGG TTT ACT CA3', SEQ ID NO: 52) und MS59-Primer 4 (5'AAC TTC TCC IAG IGT IGC ICC IGC TTG IAC CCA3', SEQ ID NO: 3) wurden zur Amplifikation eines Fragments mit 405 bp aus dem Salat-cDNA-Reservoir verwendet. Diesem PCR-Fragment entsprechende PCR-Produkte wurden kloniert und sequenziert (SEQ ID NO: 53) und zeigten ein ununterbrochenes offenes Leseraster (SEQ ID NO: 54).
Tabelle 5. EST-Sequenzen, die Homologie mit MS59 zeigen
Rasterverschiebungen wurden zur optimalen Angleichung der ESTs mit der MS59-Sequenz eingeführt. In den Spalten mit Rasterverschiebung 1 und Rasterverschiebung 2 sind die Position der Rasterverschiebung und die Verschiebung (Raster → Raster) aufgeführt. Das (–)-Zeichen bedeutet, daß keine Rasterverschiebung vorhanden ist.
Neue PCR-Primer wurden auf der Basis der Sequenz von SEQ ID NO: 53 entwickelt, die sich zwischen den ursprünglichen PCR-Primern befindet. Primer für 5'-RACE: 5'CAC GTT TAT GGA GCG TAA GTT GAA C3' (SEQ ID NO: 55) und für 3'-RACE: 5'CAC CCT TCA CAC ATT CAA GCA GC3' (SEQ ID NO: 56) wurden synthetisiert und in 5'- und 3'-RACE-PCR-Reaktionen verwendet, durchgeführt wie in den Anweisungen des Marathon^TM-cDNA-Amplifikationskits beschrieben (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). Zwei partielle cDNA-Klone wurden durch 5'- und 3'-RACE-Reaktionen amplifiziert. Sequenzanalyse bestätigte die Identität der partiellen cDNA-Klone, die zusammen das gesamte offene Leseraster codieren, einschließlich eines mutmaßlichen Signalpeptids und 5'- und 3'-UTRs (untranslatierte Regionen). Ein cDNA-Klon voller Länge mit 1981 bp (SEQ ID NO: 57) wurde konstruiert, dessen ORF (Position 7 bis Position 1629) 540 Aminosäurereste codiert (SEQ ID NO: 58). Die Amino-terminale Signalsequenz wird durch die ersten 27 Aminosäurereste dargestellt.
Beispiel 13
Charakterisierung und Isolierung von "Berberine Bridge Enzyme"-Genen aus Papaver somniferum und Eschscholtzia californica
Genomische DNA wurde aus Blättern von voll ausgewachsenen Pflanzen von Kalifornischem Mohn (Eschscholtzia californica) und Schlafmohn (Papaver Somniferum cv. Marianne) hergestellt. Primer wurden für das Gen des Kalifornischen Mohns (EcBBE) am Beginn des reifen Proteins (5' GGT AAT GAT CTC CTT TCT TGT TTG ACC 3', SEQ ID NO: 59) und am Stoppcodon konstruiert, wobei ein NotI-Restriktionsort gerade stromabwärts des TAG-Stoppcodons eingeführt wurde (5' AGA GCG GCC GCT ATA TTA CAA CTT CTC CAC CAT CAC TCC TC 3', SEQ ID NO: 60). Für das Gen des Schlafmohns (PsBBE) wurden Primer in einer ähnlichen Weise am Beginn des vermuteten reifen Proteins (5' GGT GAT GTT AAT GAT AAT CTC CTC 3', SEQ ID NO: 61) und am TAG-Stoppcodon konstruiert, wobei ein NotI-Restriktionsort eingeführt wurde (5' AGA GCG GCC GCT ACA ATT CCT TCA ACA TGT AAA TTT CCT C 3', SEQ ID NO: 62).
Diese Primer wurden verwendet, um den reifen Teil beider BBE-Gene zu amplifizieren. Die PCR-Produkte wurden mit NotI verdaut und in Vektor pET32a (Novagen, Madison, WI) ligiert, verdaut mit EcoRV und NotI. Die korrekte Insertion des Fragments wurde unter Verwendung der Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 14
Charakterisierung und Isolierung von MS59-Homologen aus Arabidopsis thaliana
In unserer BLAST-Durchmusterung identifizierten wir 26 ESTs mit Homologie zu MS59. Ein EST wurde in Reis gefunden, und die verbleibenden 25 wurden alle in A. thaliana gefunden. Homologe ESTs wurden über die gesamte Länge der MS59-Sequenz gefunden. Eine Analyse der Arabidopsis-exprimierten Sequenz-Tags zeigte, daß es 3 ESTs mit hoher Homologie am 5'-Ende des Proteins gibt (SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40), von denen SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40 überlappende Sequenzen sind. Der 3'-Teil von MS59 zeigte Homologie mit 7 EST-Sequenzen (SEQ ID NO: 24, 27, 32, 34, 41, 43 und 45), von denen SEQ ID NO: 24 mit SEQ ID NO: 43 überlappt und SEQ ID NO: 32 mit SEQ ID NO: 45 überlappt.
Primer wurden geschaffen, die sich am Beginn des vermuteten reifen Teils (mögliche Spaltorte wurden gemäß den consensus-Sequenzen vorhergesagt, die von Von Heijne et al., 1983 und Von Heijne, 1985 beschrieben wurden) der zwei unterschiedlichen ESTs befanden, homolog mit dem 5'-Teil von MS59 (SEQ ID NO: 16). Der durch SEQ ID NO: 21 dargestellten EST-Sequenz fehlen möglicherweise die ersten drei Aminosäurereste des vorhergesagten reifen Teils im Vergleich mit der MS59-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 16), und daher wurden die Aminosäurereste 20 bis 22 von SEQ ID NO: 16 durch Einschließen von 9 Nukleotiden am 5'-Ende des Primers eingeführt. Primer befindlich 5' in SEQ ID NO: 21, wodurch Reste 20 bis 22 von MS59 zugefügt werden (SEQ ID NO: 16): 5' ACT TCC CGT AGA AAC TCG GAG ACT TTC ACA CAA TGC 3' (SEQ ID NO: 63). Primer befindlich hinter dem vorhergesagten Spaltort von SEQ ID NO: 39 und SEQ ID NO: 40: 5' TCC ATC CAA GAT CAA TTC ATA AAC TGT GTC (SEQ ID NO: 64).
Primer wurden ebenfalls hergestellt, die sich um das Stoppcodon der fünf unterschiedlichen ESTs befinden, homolog mit dem 3'-Teil der MS59-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 16), wobei ein NotI-Restriktionsort zur Klonierung im pET32a E. coli-Expressionsvektor eingeführt wurde. Primer befindlich in SEQ ID NO: 24 und SEQ ID NO: 43: 5' AGA GCG GCC GCT TTC ATG AAC CTA GCT TCT AGT AGG 3' (SEQ ID NO: 65). Primer in SEQ ID NO: 27: 5' AGA GCG GCC GCG AAA TGG CCC CCC TTT TAA AAC GGG G 3' (SEQ ID NO: 66). Primer in SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 41: 5' AGA GCG GCC GCA AAT GAT ATC TTC AGG TAA CTT TGT TCA C (SEQ ID NO: 67). Primer in SEQ ID NO: 34: 5' AGA GCG GCC GCA TAA TCA AAT AAA TAC ACT TAT GGT AAC ACA G (SEQ ID NO: 68), und der Primer in SEQ ID NO: 45: 5' AGA GCG GCC GCT GGT TTT GTA TTG AGG ACT CAA AAC AG 3' (SEQ ID NO: 69).
Alle möglichen Kombinationen der 5'-Primer mit den 3'-Primern wurden in einem PCR-Experiment an genomischer DNA verwendet, isoliert aus Arabidopsis thaliana cv. Columbia. In einem PCR-Experiment mit den Primern SEQ ID NO: 63 und SEQ ID NO: 68 wurde eine Bande mit etwa 1800 bp amplifiziert. Diese Bande wurde kloniert, und die Identität des PCR-Produkts wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt. Das klonierte PCR-Produkt mit 1757 bp (SEQ ID NO: 70) enthielt ein Intron von Position 570 bis Position 801, das offene Leseraster von SEQ ID NO: 70 besteht aus 508 Aminosäureresten (SEQ ID NO: 71). Vollständige RNA wurde aus Arabidopsis thaliana Col-0 aus 12 Tage alten sterilen etiolierten Keimlingen, die im Dunkeln auf Murashige-Skoog-Agar gezüchtet wurden, aus 12 Tage alten sterilen Keimlingen, die in flüssigem Murashige-Skoog-Medium mit einer 16-stündigen Photoperiode gezüchtet wurden, und aus Blättern, Stengeln, Blüten und Schoten aus ausgewachsenen Pflanzen isoliert (Newman et al., 1994 Plant Physiol. 106: 1241–1255). Die RNA aus den unterschiedlichen Entwicklungsstadien wurde vereinigt. Poly(A)⁺-RNA wurde unter Verwendung des Poly(A) Quick^® mRNA Isolation-Kits (Stratagene, La Jolla, CA) isoliert, und cDNA wurde unter Verwendung des Marathon^TM cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) hergestellt.
PCR-Reaktionen wurden mit dem cDNA-Reservoir mit unterschiedlichen Kombinationen von 5'-Primern und 3'-Primern eingerichtet. Ein PCR-Produkt wurde mit der Primer-Kombination SEQ ID NO: 63 und SEQ ID NO: 68 mit ca. 1600 bp amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in die EcoRV- und NotI-Restriktionsorte des des bakteriellen Expressionsvektors pET32a (Novagen, Madison, WI) kloniert. Die Sequenz des PCR-Produkts wurde bestimmt und zeigte ein ununterbrochenes offenes Leseraster mit 1527 bp (SEQ ID NO: 72), das ein Protein mit 508 Aminosäureresteb darstellt (SEQ ID NO: 73).
Ein zweiter cDNA-Klon mit ca. 1600 bp wurde mit der Primerkombination SEQ ID NO: 64 und SEQ ID NO: 65 amplifiziert. Dieser cDNA-Klon wurde ebenfalls in die EcoRV- und NotI-Restriktionsorte von pET32a (Novagen, Madison, WI) ligiert. Dieser cDNA-PCR-Klon wurde ebenfalls durch DNA-Sequenzierung charakterisiert und bestand aus einem ununterbrochenen offenen Leseraster mit 1530 bp (SEQ ID NO: 74), das 509 Aminosäurereste codiert (SEQ ID NO: 75).
Beispiel 15
Expression von MS59, der "Berberine Bridge Enzymes" aus Papaver somniferum und Eschscholtzia californica und von zwei homologen Proteinen aus Arabidopsis thaliana cv Columbia in E. coli
Ein PCR-Fragment, das den vermuteten reifen Teil von MS59 enthielt, wurde in Vektor pET32c (Novagen, Madison, WI) eingeführt, und die korrekte Insertion des Fragments wird unter Verwendung von DNA-Sequenzierung bestätigt. Dann wurde das Plasmid in E. coli AD494 (DE3) pLysS (Novagen, Madison, WI) eingeführt. Kulturen im kleinen Maßstab (2 ml) von mehreren Kolonien wurden dann begonnen, von denen die Hälfte durch Zugabe von IPTG auf 1 mM Endkonzentration induziert wird. Vollextrakte aus E. coli wurden auf SDS-Gelen laufen gelassen und durch Coomassie Brilliant Blue-Anfärbung analysiert. Mehrere Klone wiesen eine starke Überexpression des MS59-Proteins auf. Ein Klon, der eine starke Überexpression aufwies, wurde für eine Kultur im großen Maßstab selektiert. 500 ml von LB, ergänzt mit 0,4 mM Glucose, wurden mit Kultur dieses E. coli geimpft und zu einer optischen Dichte von 0,5–0,7 kultiviert. Dann wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben und die Proteinproduktion für 3 Stunden bei 30°C erlaubt. Ein großer Anteil des MS59-Proteins wurde in der unlöslichen Proteinfraktion gefunden, eine kleine Menge erschien löslich. Die resultierende unlösliche Proteinzubereitung enthielt hauptsächlich MS59-Protein. Diese Zubereitung wird zur Entwicklung von Antikörpern verwendet (Beispiel 17). Die lösliche Fraktion wurde in einem In-vitro-Test zur Überprüfung verwendet, ob das MS59-Protein noch Antipilzaktivität aufwies.
Die pET32a-Plasmide, die die offenen Leseraster der vier MS59/WL64-Homologen enthielten, wurden in E. coli AD494(DE3)pLysS (Novagen, Madison, WI) eingeführt. Kulturen im kleinen Maßstab (25 ml) von mehreren unabhängigen Klonen wurden zu einer optischen Dichte von 0,5–0,7 inkubiert. Dann wurde IPTG auf eine Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben und die Proteinproduktion für 4 Stunden bei 30°C erlaubt. Lösliche und Vollproteinfraktionen wurden isoliert. Die Proben wurden unter Verwendung von SDS-PAGE gefolgt von Neuhoff-Anfärbung und Western-Analyse unter Verwendung des S-Tag-Western-Blotting-Detektionskit (Novagen, Madison, WI) analysiert. Ein großer Teil des Proteins wurde in der unlöslichen Fraktion gefunden, nur eine kleine Menge schien löslich zu sein. Klone, die die homologen Proteine stark überexprimierten, wurden zur Produktion der Proteine in Kulturen in großem Maßstab mit jeweils 1,5 l selektiert.
Beispiel 16
In-vitro-Antipilztests von MS59, MS59/WL64-Homologen aus Kalifornischem Mohn (Eschscholtzia californica) und Schlafmohn (Papaver somniferum) und von zwei homologen Proteinen aus Arabidopsis thaliana
Das in E. coli hergestellte MS59-Protein enthielt N-terminale trxA-, His- und S-Tags. Das His-Tag wurde zur Reinigung des löslichen MS59 an einer IMAC-Säule (immobilisierte Metallaffinitätschromatographie), die mit Ni²⁺ beladen war, verwendet. Gebundenes Protein wurde durch Erhöhen der Imidazol-Konzentration eluiert. Dies Spitzenfraktion aus dieser Reinigung enthält einige verunreinigende E. coli-Proteine.
Die Spitzenfraktion dieser MS59-Reinigung wurde in 50 mM MES, pH 6,0 dialysiert und in einem In-vitro-Test mit Phytophthora infestans und Pythium ultimum verwendet. Für die Standardaufstellung des In-vitro-Antipilztestes mit Phytophthora infestans und Pythium ultimum siehe oben.
Als Kontrollbehandlung testeten wird ein unabhängiges Protein mit His-Tag, gereinigt aus dem gleichen Expressionswirt, mit etwas E. coli-Proteinhintergrund. Ebenfalls wurde eine gekochte MS59-Kontrolle (erwärmt für 10 Minuten auf 100°C) eingeschlossen. Ca. 40 ng Fusionsprotein wurden im Phytophthora infestans-Test untersucht, das doppelte der Menge wurde für den Pythium ultimum-Hemmtest verwendet.
Mikrotiterschalen wurden mit Parafilm umwickelt und im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 2 bis 3 Tagen wurde das Mycel des wachsenden Pilzes in den Vertiefungen mit Lactophenol-Baumwollblau angefärbt, und das Ausmaß des Wachstums wurde abgeschätzt.
IMAC-Fraktionen aus der löslichen Fraktion von E. coli, das MS59 enthielt, zeigten eine vollständige Hemmung von P. infestans und P. ultimum bei Konzentrationen von 20–40 ng.
Tabelle 6. Antipilzwirkungen von MS59 aus E. coli auf Phytophthora infestans
Die Wachstumshemmung (GI) wird visuell auf einer linearen Skala von 0 (keine Hemmung) bis 4 (vollständige Wachstumshemmung) bewertet.
Tabelle 7. Antipilzwirkungen von MS59 aus E. coli auf Pythium ultimum
Eine mikroskopische Analyse der Vertiefungen zeigt die schnelle Keimung und das anschließende Wachstum von Phytophthora infestans-Zoosporen in jeder der Kontrollen. Die Keimung wird beinahe vollständig in den Reaktionen gehemmt, die das MS59-Protein aus E. coli enthalten. Einige Sporen keimen, aber das Wachstum der Hyphenspitzen scheint bald nach dem Start aufzuhören. Nach 48 Stunden Wachstum von Phytophthora infestans existiert reichlich Mycel in den Kontrollen, aber ist beinahe nicht nachweisbar im MS59 enthaltenden Test. Selbst nach 72 Stunden wird kein substantielles Wachstum beobachtet. Pilzhyphen erscheinen etwas granular und verdickt in den MS59-Protein enthaltenden Reaktionen. Beispiele für die charakteristischen Muster des Pilzwachstums in Inkubationen mit und ohne E. coli-erzeugtem MS59 sind in 4 dargestellt. Nach 48 und 72 Stunden ist das Pilzwachstum in den Kontrollinkubationen so umfassend, daß kein photographisches Material gewonnen werden konnte. Inkubationen in Gegenwart von MS59 führen zur vollständigen Blockierung des weiteren Wachstums, die Keimschläuche, die nach 24 Stunden beobachtet werden, dehnen sich nicht merklich weiter aus.
In gleicher Weise ist im Pythium ultimum-Hemmtest, in dem Mycelfragmente verwendet werden, kein Wachstum nach Behandlung mit MS59 ersichtlich (siehe 5). Nach 24 Stunden waren die Kontrollreaktionen vollständig durch Mycel überwachsen. Nur kleine Mycelfragmente sind in diesem Stadium in der MS59-behandelten Probe ersichtlich.
Die Mohn-Homologen wurden in E. coli (pET32a) exprimiert und auf In-vitro-Antipilzaktivität gegen Phytophthora infestans und Pythium ultimum getestet. Phytophthora infestans-Sporen und Hyphenfragmente von Pythium ultimum wurden in sterilem Wasser bzw. Kartoffeldextrosebouillon (PDB) suspendiert. 400–600 Sporen oder 200 Fragment/50 μl wurden zu jeder Vertiefung hinzugegeben.
Die exprimierten Proteine wurden teilweise mittels IMAC-Säulenchromatographie gereinigt. Fraktionen, die die exprimierten Proteine enthielten, wurden gegen 50 mM MES, pH 6,0 pufferausgetauscht, filtersterilisiert und auf ihre Antipilzaktivität mit IMAC-gereinigtem E. coli pET32-MS59 als Positivkontrolle getestet.
Keine Antipilzaktivität wurde für sowohl Eschscholtzia californica- als auch Papaver somniferum-MS59/WL64-Homologe beobachtet, nicht einmal bei Konzentrationen, die 10-mal höher als diejenigen der Positivkontrolle sind, die zu einer 100%igen Wachstumshemmung beider Pilze führt. Dies könnte bedeuten, daß diese E. coli-exprimierten Proteine nicht die korrekte Faltung besaßen und deshalb keine biologische Aktivität zeigten.
Beispiel 17
Entwicklung von Antikörpern gegen denaturiertes MS59
Antikörper wurden in Kaninchen gegen denaturiertes MS59 (die solubilisierte Form aus der unlöslichen E. coli-Fraktion) in PAG-Scheiben erzeugt. Die Antikörper zeigten eine Kreuzreaktion mit einer Bande von ca. 60 kDa nur im IF von pMOG1180- (Beispiele 18 und 19) -Tabakpflanzen, die Antipilz- und Glucoseoxidase-Aktivität enthalten. Überraschend wird keine Kreuzreaktion mit WL64 festgestellt.
Beispiel 18
Zuschneiden eines MS59-Klons zur Expression in transgenen Pflanzen
PCR-Primer wurden auf Basis der Sequenz um das ATG-Startcodon und das TGA-Stoppcodon zur Klonierung des offenen Leserasters (ORF) entwickelt. Ein NcoI-Restriktionsort wurde am ATG-Startcodon zur Fusion an einen konstitutiven Promotor durch PCR eingeführt, wobei der folgende Primer verwendet wurde: 5' CC GCC ATG GAG ACT TCC ATT CTT ACT C 3' (SEQ ID NO: 16). Das zweite Codon des ORF wurde von caa (Q) zu gag (E) als Ergebnis des eingeführten NcoI-Restriktionsortes verändert. Stromabwärts des TGA-Stoppcodons wurde ein BamHI-Restriktionsort durch PCR eingeführt, wobei der folgende Primer verwendet wurde: 5' GCC GGA TCC TCA AGA TGA CAA AGT TGG GAT GCT 3' (SEQ ID NO: 18). Unter Verwendung einer PCR-Reaktion mit Pfu-DNA-Polymerase amplifizierten wir das gesamte ORF unter Verwendung der PCR-Primer, um den NcoI-Restriktionsort am Startcodon ATG und den BamHI-Restriktionsenzym-Erkennungsort gerade stromabwärts des Stoppcodons einzuführen. Die Integrität der DNA-Sequenz wurde durch Sequenzierung bestätigt (SEQ ID NO: 19). Das gesamte ORF wurde mit einem konstitutiven Promotor verbunden, der eine hochgradige Proteinexpression in den meisten Teilen der Pflanze erlaubt. Nach dem ORF wurde eine 3'-untranslatierte Region des Kartoffelproteinaseinhibitors II (Thornburg et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 744–748), der die zur Polyadenylierung erforderlichen Sequenzen enthält (An et al., 1989, Plant Cell 1, 115–122), eingeführt. Das erzeugte chimäre Gen wurde in den binären Vektor pMOG800 eingeführt (hinterlegt im Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Niederlande, unter CBS 414.93 am 12. August 1993). Der resultierende Klon pMOG1180, der das MS59-Konstrukt unter der Kontrolle des ocs-mas-Hybridpromotors beherbergt (WO 95/14098), wurde in den Agrobacterium fumefaciens-Stamm EHA105, der zur Transformation von Zielanbaupflanzen Tomate und Kartoffel geeignet ist, den Stamm MOG101 zur Transformation von Tabak und Arabidopsis und MOG301 zur Transformation von Brassica napus eingeführt.
Beispiel 19
Herstellung und Analyse von transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen, die das MS59-Genkonstrukt enthalten
Unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems wurden binäre Konstrukte, die das MD59-Genkonstrukt wie in Beispiel 18 beschrieben enthalten, in Tabak und Kartoffel eingeführt. Die transgenen Schößlinge dieser unterschiedlichen Pflanzenarten wurden zu ganzen Pflanzen regeneriert, und anschließend wurden primäre Transformanten auf Expression des neu eingeführten MS59-Gens analysiert. Für diese Analyse wurden Western-Blotting-Techniken unter Verwendung von Antikörpern gegen MS59-spezifisches Peptid, gekoppelt an BSA, verwendet. Alle Antiseren wurden 1 : 5000 verdünnt. Eine Konzentrationsreihe von gereinigten Proteinen (12,5, 25, 50 und 100 ng) wurde zur Beurteilung des Expressionsgrades der eingeführten Proteine in den transgenen Pflanzen verwendet. Transgene Proben wurden in 50 mM Natriumacetatpuffer pH 5,2 homogenisiert, und die Extrakte wurden durch Zentrifugieren geklärt. Die Überstände wurden entweder direkt analysiert oder über Nacht auf Eis ausfällen gelassen. Der Ausfällung über Nacht folgte immer eine Klärung (durch Zentrifugieren). Die Proteinkonzentration der auf jedem Weg erhaltenen Überstände wurde unter Verwendung von Bradford-Reagens (Bradford 1976, Anal. Biochem. 72, 248–254) und BSA als Standardprotein bestimmt. So viel Protein wie möglich (aber nie mehr als 10 μg) wurde auf ein 12,5%iges SDS-PAGE-Gel geladen (Laemmli, supra) und wie zuvor beschrieben immungeblottet (Ponstein et al., supra).
Extrakte aus Blättern von MS59-transgenen Tabak- und Kartoffelpflanzen wurden durch Behandeln von Blattfragmenten in einem 50 mM NaAc (pH = 5,2) enthaltenden Puffer hergestellt. Danach wurde unlösliches Protein durch Zentrifugieren entfernt. Der lösliche Gesamtproteingehalt wurde gemessen, und das Äquivalent von 10 μg wurde auf ein SDS-Gel aufgetragen. Nach Durchlaufen des Gels wurden die Proteine zum Blotten übertragen. Dieser Blot wurde unter Verwendung des gegen gereinigtes MS59 hergestellten Antiserums (Beispiel 17) entwickelt. Das MS59-spezifische Antiserum wurde in einer 1 : 5000-Verdünnung verwendet. Gereinigtes MS59 wurde ebenfalls mit dem Gel laufen gelassen und ist als Referenz eingeschlossen. Eine Anzahl transformierter Pflanzen, die auf Basis ihrer hochgradigen Expression von MS59-Protein ausgewählt werden, und S1-Abkömmlingpflanzen werden in Pilzinfektionstests getestet werden.
Beispiel 20
Reinigung von MS59-Transproteinen aus transgenen Tabakpflanzen
Transgene Tabakpflanzen wurden hergestellt, die konstitutiv MS59 exprimieren. Expressionsgrade werden unter Verwendung von Western-Analyse bestimmt. Extrakte des transgenen Materials werden auf Wachstumshemmaktivität in vitro gegen Phytophthora infestans und Pythium ultimum getestet. Vollextrakte in kleinem Maßstab wurden aus In-vitro-Blättern von Tabak, der das pMOG1180-Konstrukt enthielt (mas-ocs-Promotor-pMS59), und von Tabak-Kontrollinien hergestellt. Die Extrakte wurden durch Mahlen von Blattmaterial in 50 mM NaAc pH 5,2 hergestellt. Der Überstand wurde gegen 50 mM MES pH 6,0 dialysiert und auf In-vitro-Pilzaktivität gemäß den im allgemeinen experimentellen Teil beschriebenen Verfahren getestet. Einige der Tabak-pMOG1180-Linien zeigten eine hohe Antipilzaktivität auf P. infestans und P. ultimum im Vergleich mit anderen Linien oder Kontrollinien.
Beispiel 21
Kohlehydratoxidaseaktivität/Lokalisierung von MS59 in transgenen Tabakpflanzen
Gleiche Mengen von teilweise gereinigtem löslichem MS59 und löslichen homologen Fraktionen (Papaver, Eschscholtzia, Arabidopsis-A11 und -B7) wurde auf Kohlehydratoxidaseaktivität getestet. Die Kohlehydratoxidaseaktivität für MS59 betrug 0,011 ODu/min und für die Homologen 0,0003–0,0012 ODu/min, ein Unterschied von einem Faktor 10.
Aus den transgenen pMOG1180-Tabaklinien aus Beispiel 20, die Antipilzaktivität in vitro zeigten, wurde IF in einem späteren Stadium isoliert und auf Kohlehydratoxidaseaktivität getestet. Ebenfalls wurde das Material getestet, das nach der IF-Isolierung zurückblieb (bezeichnet als "-IF"). Die gleichen Linien, die Antipilzaktivität zeigten, besitzen eine hohe Kohlehydratoxidaseaktivität. Die Aktivität befindet sich im IF.
Beispiel 22
Einführung der vier Genkonstrukte, die Chi-I, Glu-I, AP24 und MS59 unter der Kontrolle eines konstitutiven Pflanzenpromotors enthalten, in Tomate, Kartoffel, Karotte, Brassica napus und Arabidopsis
Unter Verwendung eines Agrobacterium-vermittelten Transformationssystems werden die binären Konstrukte pMOG1145 und pMOG1180, die die Gene enthalten, die Chi-I, Glu-I, AP24 und MS59 codieren, oder pMOG1146, das die Gene enthält, die Chi-I, Glu-I, bPR-1 und MS59 codieren, in verschiedene Anbaupflanzenarten eingeführt, einschließlich Tomate, Kartoffel, Karotte, Brassica napus und Arabidopsis. S1-Abkömmlingpflanzen werden in Pilzinfektionstests untersucht.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Erhalt einer Pflanze mit reduzierter Anfälligkeit für einen Phytophthora-Pilz und/oder einen Pythium-Pilz, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt aus: (a) Einführen, in Ahnenzellen, die für die Regeneration zu einer ganzen Pflanze empfänglich sind, einer chimären DNA-Sequenz, die ein offenes Leseraster umfaßt, das ein Protein, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die als SEQ ID NO: 15; 19; 57; 70; 72; und 74 wiedergegeben ist, oder ein Mutein, das sich von dem Protein durch den Austausch, die Addition oder Deletion einer Aminosäure unterscheidet und worin das Mutein Anti-Phytophthora- und/oder Anti-Pythium-Aktivität aufweist, codieren kann, wobei das offene Leseraster operativ mit einer Transkriptions- und Translationsstartregion und einer Transkriptionsterminationsregion verbunden ist, wodurch es dem Protein oder dem Mutein erlaubt wird, in den Ahnenzellen erzeugt zu werden, die für eine Infektion durch den Pilz anfällig sind, und (b) einer chimären DNA-Sequenz, die einen pflanzlichen selektierbaren Marker codiert, der die Selektion der transformierten Ahnenzellen erlaubt, wenn der selektierbare Marker darin vorhanden ist, und (c) Regenerieren der Ahnenzellen zu einer Pflanze unter Bedingungen, die Ahnenzellen begünstigen, die den selektierbaren Marker aufweisen, und (d) Identifizieren einer Pflanze, die das Protein oder das Mutein erzeugt, wodurch die Empfänglichkeit der Pflanze für eine Infektion durch den Phytophthora-Pilz und/oder den Pythium-Pilz reduziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protein als SEQ ID NO: 15 wiedergegeben wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protein als SEQ ID NO: 57 wiedergegeben wird.
Isoliertes Antipilzprotein, das aus der als SEQ ID NO: 15 wiedergegebenen Sequenz besteht, oder ein Mutein, das sich von dem Protein durch den Austausch, die Addition oder Deletion einer Aminosäure unterscheidet, worin das Protein oder das Mutein Anti-Phytophthora- und/oder Anti-Pythium-Aktivität aufweist.
Nukleotidsequenz, die das Protein oder Mutein gemäß Anspruch 4 codiert.
Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 5, die die in SEQ ID NO: 15 wiedergegebene Protein-codierende Sequenz umfaßt.
Nukleotidsequenz, die mit der Sequenz gemäß Anspruch 6 unter stringenten Bedingungen hybridisiert, worin die Nukleotidsequenz noch ein Protein codiert, das Anti-Phytophthora- und/oder Anti-Pythium-Aktivität aufweist.
Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, die ferner eine Transkriptionsstartregion und eine Transkriptionsterminationsregion umfaßt.
Wirtszelle, die eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 stabil in ihrem Genom aufgenommen aufweist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 9, die eine Pflanzenzelle ist.
Verwendung eines Proteins, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die als SEQ ID NO: 15; 19; 57; 70; 72; und 74 wiedergegeben ist, oder eines Muteins, das sich von dem Protein durch den Austausch, die Addition oder Deletion einer Aminosäure unterscheidet, zur Verlangsamung des Wachstums eines Phytophthora-Pilzes und/oder eines Pythium-Pilzes.