JPH06510535A - 殺生物性蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 殺生物性蛋白質 本発明は殺生物性蛋白質（ｂｉｏｃｉｄａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）及び殺生物性蛋 白質組成物及びその製造方法及びその使用に関する。特に、本発明は種子貯蔵蛋 白質（ｓｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の抗菌活性（ａｎｔｉｍｉ ｃｒｏｂｉａｌａｃｔｉｖｉｔｙ）及びその、植物から単離された他の抗菌性蛋 白質との相乗活性に関する。

この関係において、抗菌活性は菌類（ｆｕｎｇｕｓ）及び／又はバクテリアに対 するある範囲の拮抗効果（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）を包含す る。

特に、本発明は抗菌活性（ａｎｔｉｆｕｎｇｕｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）　（部分 的な抑制又は死滅）〔抗酵母活性（ａｎｔｉ−ｙｅａｓｔ　ａｃｔｉｖｉｔｙ） を包含するコに関する。

植物は、通常、菌類生物（ｆｕｎｇａｌ　ｏｒｇａｎｉｓｍ）に著しく富む基体 （ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）上で生長するが、感染した状態になることは希である。

潜在的な侵入物（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　１ｎｖａｄｅｒ）を排斥するために、植 物はその構成要素として又は誘導可能な形で、広い範囲の抗菌性化合物を産生ず る。これらの抗菌性化合物の中で最も研究されているものはフィトアレキシン、 即ち、適当な防御関連信号分子（ｄｅｆｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｉｇｎａ ｌ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の知覚（ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）に基づいて特異的に合 成される、広範囲の抗菌活性を有する二次代謝産物（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔ ａｂｏｌｉｔｅ）である。フィトアレキシンの産生は、フィトアレキシン生合成 経路の酵素をエンコードする一連の遺伝子の転写活性化（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）に基づいている。しかしながら、最近の１ ０年間に幾つかの植物蛋白質は植物病原性菌類（ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉ ｃ　ｆｕｎｇｉ）の制御においてより直接的な役割を果たし得ることが次第に明 らかになった。現在では、ベーター−１，３−グルカナーゼ（Ｍａｕｃｈ等、１ ９８８．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８８，９３６−９４２）　、リポソー ム−不活性化蛋白質（Ｒｏｂｅｒｔｓ及び５ｅｌｉｔｒｅｎｎｉｋｏｆｆ、　１ ９８６゜Ｂｉｏｓｃｉ　Ｒｅｐ、６．１９−２９；　Ｌｅａｈ等、１９９１．　 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６６、１５６４−１５７３）、キチナーゼ（Ｓｃ ｈｌｕｍｂａｕｍ等、１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ、　３２４．３６３−３６７） 、キチン結合性レクチン（ｃｈｉｔｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｉｅｃｔｉｎ）（Ｂ ｒｏｅｋａｅｒｔ等、１９８９゜５ｃｉｅｎｃｅ、　２４５．１１００−１１０ ２）及びペルマチン（ｐｅｒｍａｔｉｎ）　（Ｖｉｇｅｒｓ等、１９９１、Ｍｏ １ｅｃ　Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ　Ｉｎｔｅｒａｃｔ、４，３１５−３２３ ；　１ｌｏｌｏｓｈｕｋ等、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ、　３．６１９−６２８）を 包含する、抗菌性を有する種々の蛋白質が確認されている。

チオニン（ｔｈｉｏｎｉｎ）の抗菌活性も報告されている（＾ｐｅ１等、１９９ ０、　Ｐｈｙｓｉｏｌ　Ｐｌａｎｔ、８０．３１５−３２１）　、チオニンは宿 主の防御（ｈｏｓｔｄｅｆｅｎｃｅ）に関係すると考えられる、システィンに富 む塩基性植物蛋白質である（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｐａｌｅｎｚｕｅｌａ等、１ ９８８．　Ｇｅｎｅ、　７０．２７１−２８０）。

２Ｓアルブミンは、７Ｓ及びＩＩＳグロブリンと共に、ブラシヵセアエ（Ｂｒａ ｓｓｉｃａｃｅａｅ）を包含する種々の異なる植物種の種子中の主要蛋白質成分 である（Ｈｉｇｇｉｎｓ、　１９８４．　Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙ ｓｉｏｌ、　３５．１９１−２２１）。

これらは生長しつつある若木について窒素と硫黄を提供する貯蔵分子（ｓｔｏｒ ａｇｅ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ）としての作用を行う。２Ｓアルブミンはアブラナ（ ｒａｐｅｓｅｅｄ）　［ブラシカ　ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　） 　］において十分に研究されており、この場合、これらの蛋白質はナビン（ｎａ ｐｉｎ）と呼ばれている。ナピンは、約４　ｋＤａ　（小サブユニット）と９． ５ｋＤａ　（大サブユニット）の２種の異なる鎖からなり、これらは２個のジス ルフィド結合によって保持されている。２つのサブユニットは翻訳後蛋白質分解 加工法（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｅｖ ｅｎｔ）により、同一の２１　ｋＤａプリカーサ−ポリペプチドから生成する（ Ｃｒｏｕｃｈ等、１９８３．Ｊ、ｉ［ｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇｅｎｅｔ、２，２７３ −２８３；　Ｅｒ１ｃｓｏｎ等、１９８６　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　 ２６１．１４５７６−１４５８１）。ナピンブリヵーサーをエンコードする遺伝 子又はｃＤＮＡは、アブラナ（Ｓｃｏｆｉｅｌｄ及びＣｒｏｕｃｈ等、１９８７ 、　Ｊ、ＢｉｏＩＣｈｅｍ、２６２．１２２０２−１２２０８　；　Ｊｏｓｅｆ ｓｓｏｎ等、１９８７．　Ｊ、ＢｉｏｌＣｈｅｍ、２６２．１２１９６−１２２ ０１）　、”ツカダイコン（ｒａｄｉｓｈ）　［う７７ヌスサチブス（Ｒａｐｈ ａｎｕｓ　５ａｔｉｖｕｓ　）（［１ａｙｎａ１等、１９９１．　Ｇｅｎｅ、９ ９．７７−８６）及びアラビドプシス　タリアナ（＾ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔ ｈａｌｉａｎａ　）（Ｋｒｅｂｂｅｒｓ等、１９８８．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、８７．８５９−８６６）から単離されている。２Ｓ遺伝子は祖原始遺伝 子（ａｎｃｅｓｔｒａｌ　ｐｒｏｔｏｇｅｎｅ）のトリプリケーション（ｔｒｉ ｐｌｉｃａｔｉｏｎ）により生ずると考えられている関連遺伝子（ｒｅｌａｔｅ ｄ　ｇｅｎｅ）の大きな科（ｆａｍｉｌｙ）に属している（Ｋｒｅｉｓ及びＳｈ ｅｗｒｙ、１９８９．　Ｂｉｏ　Ｅｓ５ａｙｓ、　１０．２０１−２０７）。こ の上材（ｓｕｐｅｒｆａｍｉ　ｌｙ）の他のメンバーとしては大麦［ホルジュー ム　プルガレ（［ｌｏｒｄｅｕｍ正■肛虹）トリプシン抑制剤、小麦α−アミラ ーゼ抑制剤及び穀類グリアジン（ｃｅｒｅａｌ　ｇｌｉａｄｉｎ）が挙げられ、 これらは、全て、種子貯蔵蛋白質であると考えられる。しかしながら、大部分の ２８アルブミンとは異なり、上記の関連蛋白質はその成熟した形においては非開 裂（ｕｎｃｌｅａｖｅｄ）ポリペプチドとして存在する。

種子貯蔵蛋白質は動物又は微生物によって惹起される損傷から種子を保護するこ とに関連する二次的機能を有し得ると推測されている。しカルながら、これまで 、かかる機能は２Ｓ貯蔵アルブミンによって示されていない。

今般、本発明者は２Ｓアルブミン及びその関連蛋白質（これらを“アルブミン型 蛋白質”と総称する）は驚くべき抗菌活性を示し従って抗菌剤として使用し得る ことを認めた。更に、これらの蛋白質は、これらがチオニンの抗菌活性を増大さ せること、ある場合には７０倍まで増大させるということにおいて驚くべきかつ 独特の性質を示す。

本発明によれば、アルブミン型蛋白質を含有する抗菌組成物（ａｎｔｉｍｉｃｒ ｏｂｉａｌ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）が提供される。上記蛋白質はオリゴマー 状蛋白質の機能ポリペプチド（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ）サブユニットであり得る。組成物は２種以上の蛋白質を含有し得る。

別の要旨において、本発明によれば、かかる組成物に菌類（ｆｕｎｇｉ）又はバ クテリアを暴露することからなる、菌類又はバクテリアの防除方法が提供される 。

２Ｓアルブミン及び関連蛋白質は驚くべき活性を示す：これらの蛋白質は種々の 植物病原菌の生長を抑制する。アブラナ及びハツカダイコンからの２３アルブミ ン及び大麦からのトリプシン抑制剤の抗菌特性を証明した。２Ｓアルブミンの抗 菌活性は、主として、これらの＋ 蛋白質の小サブユニットにあり、生理的濃度においてはＫ　及びＣａ２＋により 拮抗され得る。

アルブミン型蛋白質（２Ｓアルブミン及び関連蛋白質）は広範囲の抗菌活性を示 し、標準的な農園芸的方法（例えば噴霧）を使用して植物の部分（又は周囲の土 壌）に施すことにより殺菌剤として使用し得る。この蛋白質に暴露された病原体 は抑制される。この蛋白質は植物上に既に繁殖している病原体を根絶させる（ｅ ｒａｄｉｃａｔｅ）ことができ、或いは、この蛋白質は植物を将来における病原 体による攻撃から保護し得る。抗菌性蛋白質の根絶効果は特に有利である。

抗菌性蛋白質は、植物物質から抽出し、精製するか、又は、標準的なペプチドシ ンセサイザー（ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ）を使用する化学合成 によりその既知のアミノ酸配列から製造するか、又は、組換えＤＮＡの発現によ り適当な生物内で生成し得る。この蛋白質をエンコードするＤＮＡは標準的な核 酸シンセサイザーを使用して製造することができ、或いは、（既知の配列から誘 導された）適当なプローブを使用して、実際の遺伝子及び制御配列を植物ゲノム から単離し得る。ついで、この遺伝物質を蛋白質を発現させる生物学的系にクロ ーンし得る。従って、蛋白質を適当な微生物又は培養細胞中で生しビシアエ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を挙げ得る。適当な細胞と しては培養昆虫細胞及び培養哺乳動物細胞を挙げ得る。

抗菌性蛋白質は前記した蛋白質の１種又はそれ以上をエンコードするＤＮＡをト ランスジェニック植物体内で発現させることにより、病害を防除するのにも使用 し得る。例えば、菌類又はバクテリアを植物に対する病原体の攻撃の部位で蛋白 質に暴露する。特に、適当な誘導性（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）遺伝子レギュレータ ー配列を使用することにより、アルブミン（種子蛋白質）を、これらが、通常、 多量には発現されないが、病害に対する抵抗性が重要な植物の一部（例えば、葉 ）の内部で、生体内で生成させ得る。

植物細胞は、組換えＤＮＡ構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）を使用して多数の既知 の方法［アグロバクテリウム（＾ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）　Ｔｉプラスミ ド、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）　、マイクロ インジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、マイクロプロジエクテイ ルガン（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ　ｇｕｎ）等］に従って形質転換し得 る。ついで、適当な場合には、形質転換細胞を、新規な核物質がゲノム中に安定 に組込まれている全植物（ｗｈｏｌｅ　ｐｌａｎｔ）内で再生させることができ る。

この方法によりモノコツト（ｍｏｎｏｃｏｔ）及びジコット（ｄｉｃｏｔ）植物 を得ることができるが、通常、後者の方が再生がより容易である。これらの−次 形質転換細胞の後代は抗菌性蛋白質をエンコードする組換えＤＮＡを受継いでい るであろう。

生産し得る遺伝的に修飾された植物の例としてはカノラ（ｃａｎｏｌａ）、ヒマ ワリ、タバコ、テンサイ、綿、大豆、トウモロコシ、小麦、大麦、ツルガム、ト マアト、マンゴ−、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、馬鈴薯、ニ ンジン、レタス、キャベツ、タマネギのごとき屋外作物、穀類、果実及び野菜を 挙げ得る。

本発明によれば、更に、菌又はバクテリア病原体に対する改善された抵抗性を有 するかつアルブミン型蛋白質を発現する組換えＤＮＡを含有する植物が提供され る。

病原体は植物上、植物中又は植物付近で成育しつつある任意の菌類又はバクテリ アであり得る。このこととの関係において、改善された抵抗性（ｉｍｐｒｏｖｅ ｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）は、野生型植物と比較した場合の、菌類又はバクテ リア病原体に対する増大した耐性と定義される。

抵抗性は病原体の影響に対する耐性の僅かな増加（この場合、病原体は部分的に 抑制される）から、植物が病原体の存在によって影響されない全体抵抗（ｔｏｔ ａｌ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）　（この場合、病原体は顕著に抑制されるか又は 死滅する）の範囲で変動し得る。特定の病原体に対する抵抗性の水準の増大又は 広範囲の病原体に対する抵抗性は両者共、抵抗性の改善を構成し得る。

組換えＤＮＡは植物中に導入された異型ＤＮＡ　（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｕｓ　Ｄ ＮＡ）である。組換えＤＮＡは病原体の攻撃の部位（例えば葉）への供給（引渡 しくｄｅｌｉｖｅｒｙ）のために発現させる抗菌性蛋白質をエンコードする。

ＤＮＡは実施例１０に記載される２Ｓアルブミンの小サブユニット（ｓｍａｌ１ ５１１ｂｕｎｉｔ）　（ＳＳ）のごとき、抗菌性蛋白質の活性サブユニットをエ ンコードし得る。

本発明によれば、更に、アルブミン型蛋白質とチオニン蛋白質を含有する抗菌性 組成物が提供される。これらの蛋白質の一方又は両者がオリゴマー状蛋白質の機 能ポリペプチド（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）サブユニット であり得る。この組成物は２種以上のアルブミン型蛋白質及び／又は２種以上の チオニン蛋白質を含有し得る。

別の要旨において、本発明によれば、かかる組成物に菌類又はバクテリアを暴露 することからなる、菌類又はバクテリアの防除方法が提供される。

アルブミンとチオニンとの間で示される相乗効果は、これらのもの自体の抗菌活 性より更に驚くべきものである。アルブミン／チオ二ン混合物の予期し得なかっ た程度に強力な抗菌活性は植物に病害を防除するのに利用し得る。前記したごと く、上記混合物は標準的な農園芸技術（例えば、噴霧）を使用して植物の部分（ 又は周囲の土壌）に施すことにより殺菌剤（ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ）として使用し 得る。蛋白質に暴露された病原体は抑制される。上記の蛋白質は植物上で既に繁 殖している病原体を根絶させることができ、或いは、この蛋白質は植物を将来に おける病原体による攻撃から保護し得る。抗菌性蛋白質の撲滅効果は特に有利で ある。

抗菌性蛋白質は、前記したごとく、植物物質から抽出し、精製するか、又は、標 準的なペプチドシンセサイザーを使用する化学合成によりその既知のアミノ酸配 列から製造するか、又は、組換えＤＮＡの発現により適当な生物内で生成し得る 。

抗菌性蛋白質は、前記したごとく、トランスジェニック植物体内で発現させるこ とにより、病害を防除するのにも使用し得る。

本発明によれば、更に、菌類又はバクテリア病原体に対する改善された抵抗性を 有するかつアルブミン型蛋白質及びチオニン蛋白質を発現する組換えＤＮＡを含 有する植物が提供される。

固有のチオニン含有量を有する植物を１種又はそれ以上のアルブミン型蛋白質を エンコードするＤＮＡを使用して形質転換し、その結果、２種の蛋白質の混合物 を生体内で製造しし得る。別法として、１種又はそれ以上のチオニンをエンコー ドするＤＮＡを使用して植物を形質転換しそして固有のアルブミン含有量を有す る組織内で上記ＤＮＡを発現させ得る。第３の方法は１種又はそれ以上のアルブ ミンをエンコードするＤＮＡと１種又はそれ以上のチオニンをエンコードするＤ ＮＡの両者を使用して植物を形質転換しそして両方の種類の蛋白質を同一の組織 内で発現させることである。アルブミン−エンコードＤＮＡをチオニシーエンコ ードＤＮ＾と同一の構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に導入するか、又は、別の構 築物に導入し得る。更に別の方法は、第１の植物をアルブミン型蛋白質をエンコ ードするＤＮＡによりを形質転換し、第２の植物をチオニンをエンコードするＤ ＮＡによりを形質転換しついで第１の植物と第２の植物を交雑して、両者の蛋白 質を発現する組換えＤＮＡを含有する植物を製造することである。

本発明を以下の実施例によりかつ図面を参照して例示する。

第１図はハツカダイコン種子から抽出された蛋白質フラクションのクロマトグラ ムである。

第２図はアブラナ種子から抽出された蛋白質フラクションのクロマトグラムであ る。

第３図は還元及び非還元ハツカダイコン２Ｓアルブミンの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 を示す。

第４図は還元及び非還元アブラナ２Ｓアルブミンの５Ｏ３−ＰＡＧＥ分析を示す 。

第５図は還元したかつカルボキシアミドメチル化したＲ５−２Ｓ５、ハツカダイ コン２Ｓアルブミンの逆相クロマトグラムである。

第６図は２ＳアルブミンＲ５−２Ｓ５　、ｐＢａ３及びナピンのアミノ酸配列で ある。

第７図は大麦及び小麦からのトリプシン抑制剤のＮ−末端アミノ酸配列である。

第８図は２Ｓアルブミンの施用割合に対する、テンサイにおけるセルフスポラ　 ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｌａ）による病害の程度を示す グラフである。

第９図は２Ｓアルブミンの施用時間に対する、テンサイにおけるセルコスポラ　 ベチコラ（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｌａ）による病害の程度を示す グラフである。

第１０図は２Ｓアルブミン遺伝子ｐＩＧ８のヌクレオチド配列を示す。

第１１図はＭｊ−ＡＭＰ２シグナルペプチドに融合された（ｆｕｓｅｄ）　、２ Ｓアルブミンの小サブユニットのヌクレオチド配列及び誘導アミノ酸配列を示す 。

第１２図は発現ベクターｐＩＧ１３の構造（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を示す 。

第１３図は発現ベクターｐＩＧ１５の構造を示す。

第１４図は植物形質転換ベクターｐＩＧ１９の構造を示す。

第１５図は植物形質転換ベクターｐＩＧ２０の構造を示す。

実施例　１ ハツカダイコン種子及びアブラナ種子からの２８アルブミンの単離。

硫酸アンモニウム分画、熱処理、アニオン交換クロマトグラフィー及びカチオン 交換クロマトグラフィーを含む４工程法により、ハツカダイコン種子及びアブラ ナ種子から２８アルブミンを単離した。

１ｋｇのハツカダイコン種子及びアブラナ種子をコーヒーミル中で粉砕し、得ら れた粗い粉末を、Ｉ　ＯｍＭのＮａＨ２ＰＯ４，１５ｍＭのして４℃で２時間抽 出した。ホモジネート（ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ）をチーズクロス（ｃｈｅｅｓｅ ｃｌｏｔｈ）を通して絞り、遠心分離（７０００ｘ　ｇで３０分間）により清澄 化した。上澄液に固体硫酸アンモニウムを添加して相対飽和度を３０％とし、室 温で一夜放置後に生成した沈殿を遠心分離（７０００Ｘ　ｇで３０分間）により 除去した。上澄液の硫酸アンモニウムの相対飽和度を７０％に調節しついで室温 で一夜放置して生成した沈殿を遠心分離（７０００ｘｇで３０分間）により捕集 した。ペレットを４００ｍＡ＋の水に再度溶解させた後、溶液を８０℃で１５分 間加熱した。凝集した不溶性物質を遠心分離（７０００ｘ　ｇで３０分間）によ り除去し、上澄液を１００００ａの分子量カットオワＶ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　 ｗｅｉｇｈｔ　ｃｕｔｏｆｆ）を有する透析チューブ（ｄｉａｌｙｓｉｓ　ｔｕ ｂｉｎｇ）　（ＳｐｅｃｔｒａｌＰｏｌ。

Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、　ＵＳＡ）を使用して水に対して長時間（ｅｘｔｅｎｓｉｖ ｅｌｙ）透析した。透析後、１０倍に濃縮した緩衝液（ｔｅｎ−ｆｏｌｄ　ｃｏ ｎｃｅｎｔｒａｔｅｄｂｕｆｆｅｒ）を添加することにより溶液を５０　ｍｋｌ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ９）に調整し、ライで、５０ｍｋｌ　Ｔｒｉｓ−Ｆ ＩＣｌｐＨ９と平衡なＱ−セファロ−スフ７スト７　ｏ　−（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム（１２ｘ５ｃｍ ）上を通過させた。カラムを通過した蛋白質フラクションを水に対して長時間透 析し、ついで、１０倍に濃縮した緩衝液を添加することにより溶液を５０ｍＭＮ −モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム（ＭＥＳ）（ｐｔｌ　６）に調整した 。このフラクションの約１５９　ｍｇの蛋白質を、予めナトリウムＭＥＳ緩衝液 で平衡化したＳ−セファロース高性能（Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｈｉｇｈ　Ｐ ｅｒｆｏｍａｎｃｅＸＰｈａｒｍａｃｉａ）カラム（１０ｘｌ、６　ｃｍ）上に 供給した。カラムを５０　ｍｉｌナトリウムＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６）　１０１０ ０Ｏを使用し、ＮａＣ１の濃度を０〜５００　ｍＭの直線的勾配で変化させて２ ．５ｍｌ／分の速度で溶離した。溶出液を２８０　ｎｍでの吸光度のオンライン 測定により蛋白質について監視した。

第１図にハツカダイコン種子抽出物についての結果が示されており、第２図にア ブラナ種子抽出物についての結果が示されている。

２５０〜４５０　ｍＭ　ＮａＣ１の間で溶離する広いグループの非分離ピーク（ ｎｏｎ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ　ｐｅａｋ）　（第１図及び第２図で数字１〜５で示 されている）は、２Ｓアルブミンの種々のイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）を示す。こ れらのピークに対応する蛋白質フラクションを以下においては、ハツカダイコン ２Ｓアルブミン（第１図）については、それぞれ、Ｒ５−２Ｓ１、Ｒ５−２Ｓ２ 、Ｒ５−２Ｓ３、Ｒ５−２Ｓ４及びＲ５−２Ｓ５と称し、アブラナ２Ｓアルブミ ン（第２図）については、それぞれ、Ｂｎ−２Ｓ１、Ｂｎ−２Ｓ２、Ｂｎ−２Ｓ ３、Ｂｎ−２Ｓ４及びＢｎ−２Ｓ５と称する。

実施例　２ 単離された２Ｓアルブミンの特性決定（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ）。

ハツカダイコン及びアブラナからの２８アルブミンの単離されたイソ型を、ジチ オトレイトールを使用して還元する前と還元した後に、ドデシル硫酸ナトリウム 　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥはファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）（Ｐｈａｒｍｃｉ ａ）電気泳動装置を使用して、予備注型された（ｐｒｅｃａｓｔ）市販のゲル［ Ｐｈａｒｍａｃｉａからのファストゲル　）１イ　デンシティ（ＰｈａｓｔＧｅ ｌ　［Ｉｉｇｈ　Ｄｅｎｓｉｔｙ）］上で行った。非還元蛋白質の分析のための 試料緩衝液は２００　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　（ｐＨ８，３）、１　％　（ ｗ／ｖ）のＳＤＳ。

１ｍＭのＥＤＴ＾、０．００５％のブロムフェノールブルーを含有しており、還 元蛋白質の分析のための試料緩衝液は１％（Ｗ／Ｖ）のジチオトレイトール（Ｄ ＤＴ）を更に含有していた。非還元蛋白質は３０％（Ｖ／Ｖ）エタノール７１０ ％（Ｖ／Ｖ）酢酸中で固定しくｆｉｘ）、Ｂｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ及びＤｅｒｎ ｉｃｋ　（１９８５，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ’ｒｅｓｉｓ　、６，１０３−１１ ２）に従って銀染色した（ｓｉｌｖｅｒ　５ｔａｉｎｅｄ）。還元蛋白質は電気 泳動の後にニトロセルロース上にプロットしライでプロットをＫｏｖａｒｉｋ等 （１９８７，ＦｏｒｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａ、　３３．２５３−２５７）に従っ て銀染色した。

第３図に還元されていない形（左側のパネル）及び還元された形（右側のパネル ）のハツカダイコン２Ｓアルブミンの５ＤＡ−ＰＡＧＥ分析結果が示されている 。レーン（ｌａｎｅ）　１はＲ５−２ＳＬを示し、レーン２はＲ５−２Ｓ２を示 し、レーン３はＲ５−２Ｓ３を示し、レーン４はＲ５−２Ｓ４を示し、レーン５ はＲ５−２Ｓ５を示す。第４図に還元されていない形（左側のパネル）及び還元 された形（右側の、（ネル）のアブラナ２ＳアルブミンのＳＤ＾−ＰＡＧＥ分析 結果が示されている。レーン（ｌａｎｅ）　１はＢｎ−２Ｓ１を示し、レーン２ はＢｎ−２Ｓ２を示し、レーン３はＢｎ−２Ｓ３を示し、レーン４はＢｎ−２Ｓ ４を示し、レーン５はＢｎ−２Ｓ５を示す。

５０ナノグラムの蛋白質をゲル上に供給した。レーンＶは次の大きさ：１７　ｋ Ｄａ、　１４．５　ｋＤａ、　８　ｋＤａ　、　６　ｋＤａ及び２．５ｋＤａを 有する分子量マーカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）として使用されたミオグロビンフ ラグメントを示す。

第３図から明らかなごとく、還元ハツカダイコン２Ｓアルブミンは、それぞれ、 約９及び４ｋＤａの２つのバンドとして移行する（ｍｉｇｒａｔｅ）。その還元 されていない形においては、異なるイソ型が、それぞれ、１７及び１８ｋＤａの 見掛は分子量を有するダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）を生ずる。Ｒ５−２Ｓ１に おいては１７ｋＤａバンドが優勢であるのに対し、Ｒ５−２３５においては１８ ｋＤａバンドが主成分である。還元アブラナ２Ｓアルブミン（第４図は）、それ ぞれ、約９及び４ｋＤａの２つのバンドとして移行するのに対し、非還元２Ｓア ルブミンは単一の］、７ｋＤａバンドとして移行する。還元ハツカダイコン及び アブラナ２Ｓアルブミンの５ＤＡ−ＰＡＧＥパターン中に４及び９ｋＤａのバン ドが存在することは、これらの蛋白質がジスルフィド結合によって連結された小 さい（４ｋＤａ）サブユニットと大きな（９ｋＤａ）サブユニットを含有してい るという以前の観察（Ｃｒｏｕｃｈ等、１９８３．　Ｊ　Ｍｏｌ　Ａｐｐｌ　Ｇ ｅｎｅｔ、２，２７３−２８３；　Ｌａｒｏｃｈｅ等、１９８４．　Ｐｌａｎｔ 　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　７４．４８７−４９３）と一致する。

２Ｓアルブミンとして単離された蛋白質の同一性を確認するために、イソ型の一 つ（Ｒｓ−２３５）をアミノ酸配列決定分析にかけた。２００μｇのＲ５−２３ ５をジチオトレイトールで還元し、システィンをＣｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８９ ，Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐ ｐｒｏａｃｈ、ＣｒｅｉｇｈｔｏｎＴ、Ｅ編、１５５−１６７）によって記載さ れるごとくＳ−カルボキシアミドメチル化（Ｓ−ｃａｒｂｏｘｙａｍｉｄｏｍｅ ｔｈｙｌａｔｉｏｎ）により修飾した。Ｓ−カルボキシアミドメチル化蛋白質を Ｐｅｐ　Ｓカラム（多孔質シリカＣ２／Ｃ１８，２５ｘＯ，４ｃｍ、　Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）上での逆相クロマトグラフィーにより分離した。カラムを０．１％ トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃度を０〜４５％までの直線的勾配（９０ 分）で変化させて１ｍ１７分の速度で溶離した。

第５図にかく得られたクロマトグラムが示されている・混合物は各々、３個のピ ークを有する２つの群に分離された。種々のピークの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結 果からピーク１．２及び３は小サブユニット（ＪｋＤ＾）に対応し、ピーク４． ５及び６は大サブユニット（ＱｋＤ＾）に対応することが明らかになった。ピー ク１（小サブユニット）とピーク４（大サブユニット）からの物質のＮ−末端配 列を、脈動液相シークエンサー（ｐｕｌｓｅｄ　１ｉｑｕｉｄ−ｐｈａｓｅ　５ ｅｑｕｅｎｃｅｒＸ＾ｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７＾／１２０型 ）を使用してエドマン分解法（Ｅｄｍａｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏ ｄ）により決定した。Ｒ５−２３５の小サブユニット（ピーク１１第５図）につ いては、３０残基が同定され、一方、Ｒ５−２３５の大サブユニット（ピーク４ 、第５図）については、２０アミノ酸が同定された。

これらの分析結果は第６図に示されている：第６図においては、上記で得られた 配列と、ハツカダイコン２ＳアルブミンｃＤＮ＾クローンｐＢ＾３から推測され た配列（Ｒａｙｎａｌ等、１９９１．　Ｇｅｎｅ、９９．７７−８６）及びアブ ラナ２Ｓアルブミン、ナピンのＮ−末端配列決定によって得られたデーター（Ｅ ｒｉｃｓｏｎ等、１９８６．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２６１．１４５７６− １４５８１）が比較されている。Ｒ５−２３５配列中の対応する残基と異なるア ミノ酸は小文字で示されている。かく得られたＲ５−２３５の小サブユニットの 部分的配列はｐＢ＾３配列と１００％同一であり、ナピン配列と８７％同一であ る。大サブユニットは対応するｐ＾３及びナピン配列と９０％の同一性を示した 。

実施例　３ 大麦種子からのトリプシン抑制剤及び小麦種子からのα−プロチオニンの単離。

大麦［ホルジューム　プルガレ　Ｌ　（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ） Ｊが双子葉植物種からの２８アルブミンと高度に相同性であるトリプシン抑制剤 を含有していることは文献から知られている。しかしながら、そのポリペプチド が小及び大サブユニットに分裂される２Ｓアルブミンとは異なり、大麦トリプシ ン抑制剤（以下においては、ｂｔｉｏと称する）は単一の非分裂性１３　ｋＤａ ポリペプチドからなる（Ｏｄａｎｉ等、１９８３、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、２１ ３　：　５４３−５４５）。

トリプシン抑制剤と２８アルブミンの抗菌活性を比較するために、ｂｔｉｏをＭ ｉｋｏｌａ及び５ｕｏｌｉｎｎａの手法（１９６９，Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅ ｌｌｌ、　９゜５５５−５６０）により単離した。単離した薬剤をＰｅｐ　Ｓ　 （多孔質シリカＣ２／Ｃ１８）カラム（２５ｘＯ，９３ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）上での逆相り０７トグラフイーからなる追加の工程により更に精製した。

カラムをアセトニトリル濃度を０〜４０％までの直線的勾配（４０分）で変化さ せて５ｒｎｌ　／分の速度で溶離した。ｂｔｉＯとしての精製された蛋白質の同 一性をＮ−末端アミノ酸配列決定により確認した。最初の１１個のＮ−末端残基 は従来報告されているもの（Ｏｄａｎｉ等、１９８３．　Ｊ　ＢｉｏＬｃｈｅｍ 、　２５８＋　７９９８−８０００）と同一であった。

更に、トリプシン抑制剤活性についてカチオン交換クロマトグラムを検討するこ とにより、ｂｔｉｏと異なるトリプシン抑制剤フラクションが発見された。この フラクションを上記した逆相クロマトグラフィーからなる追加の工程により更に 精製した。３３％及び３５％のアセトニトリル濃度で溶離する２つのピーク［以 下において、それぞれ、ｂｔｉｔ　（大麦トリプシン抑制剤１）及びｂｔｉ２　 （大麦トリプシン抑制剤２）と称する］が得られた。アミノ末端配列分析により ２種の蛋白質はＷＦｌｌ、小麦からのバウマン−パーク型（Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉ ｒｋ　ｔｙｐｅ）プロテアーゼ抑制剤（Ｏｄａｎｉ等、１９８６．Ｊ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、１００：　９７５−８８３）と相同性であることが示された。

バウマン−パーク型トリプシン抑制剤は大麦内乳（ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ）におい ても見出だされることは知られており（Ｂｏｉｓｅｎ及びＤｊｅｒｔｏｆｔ。

１９８２、　Ｊ　Ｓｃｉ　Ｆｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ、　３３：　４３１−４４０） 、また、リシニス（Ｒｉｃｉｎｉｓ）２Ｓアルブミン大サブユニツトと、ライマ メ（ｌｉｍａ　ｂｅａｎ）からのバウマン−パーク型抑制剤（５ｈａｒｉｆ及び Ｌｉ、　１９８２．　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２５７　：１４５７３−１４ ５７９）との間には若干の相同性が認められている。

第７図に大麦及びｆＧｌｌからのトリプシン抑制剤のＮ−末端アミノ酸配列が示 されている。

α−プロチオニンはＲｅｄｍａｎ及びＦｉｓｈｅｒによって記載された方法（１ ９６９，Ｊ　Ｓｃｉ　Ｆｏｏｄ　、Ａｇｒｉｃ、　２０．４２７−４３２）と実 質的に同一の方法により小麦［トリチクム　アエスチブム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　 ａｅｓｔｉｖｕｍ）種子粉末から単離した。単離した薬剤をＰｅｐ　Ｓ　（多孔 質シリカＣ２／Ｃ１８）カラム（２５ｘＯ，９３ｃｍ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 上での逆相り０７トグラフイーからなる追加の工程により更に精製した。カラム を０，１％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度を０〜４０％までの直線的勾配（４０ 分）で変化させて５ｍｌ　／分の速度で溶離した。溶離されたプロチオニンは３ ４％及び３５％のアセトニトリル濃度における２つの不完全に分離されている（ ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ピークであり、これらは、それぞれ、Ｃ１及びα２イソ型を 表している（Ｍａｋ及びＪｏｎｅｓ、　１９７７、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｗ、 ５４゜５１１−５２３）。α−プロチオニン製剤を得るために両者のイソ型を貯 蔵した。

実施例　４ 抗菌活性の評価。

抗菌活性は従来の文献（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ、　１９９０．　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ。

６９、５５−６０）に記載されているごとき顕微分光分析（ｍｉｃｒｏｓｐｅｃ ｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）により測定した。試験は、慣用的に、２０μｍΦ （フィルター−殺菌）試験溶液と菌胞子懸濁液（胞子数２ｘ１０’　／ｖａｌ） を使用して行った。菌胞子懸濁液は増殖培地Ａ［１／２濃度馬鈴薯デキストロー スブロス（ｈａｌｆ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ　ｐｏｔａｔ。

ｄｅｘｉｔｒｏｓｅ　ｂｒｏｔｈ）（Ｄｉｆｃｏ）　］又は増殖培地Ｂ　［１ｍ ＭのＣａＣ１２及び５０　ｍＨのＫＣＩＩを補充した、１／２濃度馬鈴薯デキス トロースブロス（Ｄｉｆｃｏ）　］中で調製した。

カチオンの拮抗作用の実験については合成増殖培地を使用した。

（２ｍｇ＃　）　、ビオチン（０，２ｍｇ／Ａ’　）　、チアミン−ＨＣｌ　（ １ｔａｇ／ｌ　）及びピリドキシン−ＨＣｌ　（０，２ｍｇ／ｌ　）から構成し た。対照ミクロ培養液（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｍ１ｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）は２０μ ／の（殺菌）蒸留水と８０ｕｌの菌胞子懸濁液を含有していた。

特に説明がない限り、インキュベーションは２５℃で４８時間行った。

生長抑制率（％）は５９５　ｎｍにおける対照ミクロ培養液の修正吸光度（ｃｏ ｒｒｅｃｔｅｄ　ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ）に対する、対照ミクロ培養液の修正吸 光度から供試ミクロ培養液の修正吸光度を差し引いたものの比の１００倍と定義 される。修正吸光度値は４８時間後に測定した培養液の５９５止での吸光度から 、３０分後に測定した５９５　ｎｍでの吸光度を差し引いた値に等しい。

実施例　５ ハツカダイコン及びアブラナ２Ｓアルブミン、大麦トリプシン抑制剤及びα−プ ロチオニンの抗菌活性。

ハツカダイコン２Ｓアルブミン、アブラナ２Ｓアルブミン、大麦トリプシン抑制 剤及びα−プロチオニンの抗菌活性を実施例４に記載したごとき顕微分光分析（ ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ）により評価し た。菌の生長、菌胞子の捕集と収穫は従来の方法（Ｂｒｏｅｋａｅｒｔ、等；　 １９９０　；　ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｌｅｔｔ、６９．５５−６０） で行った。供試微生物として４種の異なる植物病原菌を使用した：フサリウム　 ９ｚＬ。

モルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｃｕｌｍｏｒｕｍ）　ＩＭＩ　１８０４２０、アル テルナリア　ブラシコラ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｂｒａｓｓｉｃｏｌａ）　Ｍ ＵＣＬ　２０２９７、アスコキタ　ビシ（＾５ｃｏｃｈｙｔａ　ｐｉｓｉ）輩Ｕ ＣＬ　３０１６４及びベルチシリウム　ダリアエ（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ　 ｄａｈｌｉａｅ　）　ＭＬＩＣＬ　１９２１０゜これらの試験においては２種の 異なる増殖培地を使用した：培地＾は１／２濃度馬鈴薯デキストロースブロスで あり、培地Ｂは培地＾に類似するようにした。

種々の蛋白質の連続的稀釈物を培地＾又は培地Ｂ中の菌に施した。

接種から４８時間後に５０％の生長抑制率を得るのに必要な濃度（工Ｃ５゜値） を投与量一応答曲線から算定した。これらの試験の結果は表１に要約されている 。菌については下記の略語を使用した：Ｆｃ、７９リウム　クルモルム；Ａｂ、 アルテルナリア　ブラシコラ；Ａｐ、アスコキタ　ビシ、　Ｖｄ、ベルチシリウ ム　ダリアエ。

八 培地＾（低イオン濃度）においては、ハツカダイコン及びアブラナからの２８ア ルブミン、大麦トリプシン抑制剤ｂｔｉｌ及びｂｔｉ２及びα−プロチオニンは ４種の供試菌の全てに対して活性であった。

ハツカダイコン２Ｓアルブミンの５個のイソ型フラクションは同様の活性を有し ていた。アブラナ２Ｓアルブミン及び大麦トリプシン抑制剤１及び２は、ハツカ ダイコン２Ｓアルブミンと比較して約２〜３倍低い活性を有しており、これに対 して、チオニンはハツカダイコン２Ｓアルブミンと比較して約５〜１０倍の活性 を有していた。

しかしなが呟培地Ｂ（高イオン濃度）においては、２ｓアルブミンと大麦トリプ シン抑制剤はＩｍｇ／ｍ／までの濃度において完全に不活性であった。これに対 して、チオニンは培地Ｂにおいて活性を保持していたが、その特異的な活性は培 地Ｂにおいては培地式における場合と比較して約２〜４倍まで低下した。

実施例　６ 抗菌活性に対するイオンの影響。

ハツカダイコン２Ｓアルブミンの抗菌活性に対するイオンの影響をより詳細に検 討した。フサリウム　クルモルム及びトリコデルマハマ゛ンム（丁ｒｉｃｈｏｄ ｅｒｍａ　ｈａｍａｔｕｍ　）　ＭＵＣＬ　２９７３６１こ対するＲ５−２Ｓ３ のＩＣ５−を５種の異なる培地中で測定した。参照培地は実施例４に記載した合 成増殖培地であり、これは全体で２．５ｍＭのｍ個カチオンと０．１ｍ１ｌの二 価カチオンを含有していた。４種の他の培地は、それぞれ、１０　ｍＭのＫＣｌ 、　５０　ｍＷのＭＣＩ　、１　ｍＭのＣａＣ１２又は５ｍＭのＣａＣ１２を更 に含有していた。

結果を表２に示す。

表２ ＋２＋ Ｋ　及びＣａ　の存在下でのＲ５−２３３の抗菌活性の変化下記のイオンを添加 した参照培地 ２＋ −１０ｍＭ　Ｋ　５０ｍＭ　Ｋ　１ｍＭ　Ｃａ　５ｍＭ　Ｃａ２＋Ｌ　クルモル ム１２　２５　＞４００　＞４００　＞４００培地に５０ｍＭ　Ｋ　を添加する ことにより、Ｌ　クルモルムに対する度で存在することにより、抗菌活性はＦ　 クルモルムについては３０倍以上まで、丁　ハマッムについては約３０倍まで減 少した。

実施例　７ ２Ｓアルブミン、大麦トリプシン抑制剤及びα−プロチオニンの間での相乗作用 。

２Ｓアルブミンとα−プロチオニンとの組合せ及び大麦トリプシン抑制剤とα− プロチオニンとの組合せの相乗効果を下記のごとくして測定した。

α−プロチオニンの連続稀釈物に一定の、準抑制濃度（ｓｕｂｉｎｈｉｂｉｔｏ ｒｙ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）の２８アルブミン又は大麦トリプ列いつい て投与量一応答曲線から算定した。この実験で使用した２Ｓアルブミン及び大麦 トリプシン抑制剤の準抑制濃度は、培地＾での試験については１０μｇ／ｍＪ（ 最終濃度）であり、培地Ｂでの試験については１０．５０及び２５０μｇ／ωｌ であった。相乗効果係数（Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ　Ｆａｃｔｏｒ）は、２Ｓアルブ ミン又は大麦トリプシン抑制剤を添加した系列における■Ｃ５−の、対照系列（ ２Ｓアルブミン又は大麦トリプシン抑制剤を添加しいない系列）における工Ｃ５ −の比として算定した。相乗効果係数は四捨五入して最も近い整数で表されてい る。　これらの試験結果は表３に示されている。菌について下表３ ２Ｓアルブミン／ａ−ブＯチオニンの組合せ及びトリプシン抑制剤ｌブロチオニ ン供試蛋白質　供試蛋白質 濃度　ｉμ９／ａ＋ｌｌ　ＫＡ度　Ｔμｇ／ｍｌ　１ｘｂ　Ｒ５−２５３４０， ８６＋５１　１１　６（２＋　０．４５（２５１０，２５（＜４１Ｂｎ−２５３ ４０，２２（１８）　１１　２Ｔ５１　０．３２（３４１０，１５（７３１ｂｔ ｉｏ　４　０．２０（２０１１１２，５（４１１，２（９）　０．３５＋３１１ Ｍ１１　４　０．８ＴＳ＋　１１１１（１１２，５＋４］　ＮＤＭｉ２　４　０ ．２８（１４１１１１］［１）　１．５＋７１　０．２ｉＳＳＩＡＰ　Ｒ５−２ ５３８２，５（３１１２５，５＋２１１＋１１）　０．８Ｔ１４Ｊａｎ−２５３ ８２（４１１２７＋２１　３＋４１　１．５（ｆｉｌｂＬｉｏ　８　３（３１１ ２１０＋１１　６＋２１　１．２（ｉｏｔｂｔｉｌ　Ｂ　？＋１１　１２　１１ （１１９＋ｌｌ　１．４（８）ｂｅｉ２　８　４＋２１　１２　１２＋１）　９ ＋ｌｌ　１．２（１０１ｒｃ　Ｒ５−２５３４０，４５＋９）　ｌｌ　３＋４１ 　０．４（２７ン　０．６＋１８１ａｎ−２Ｓ３　４　０．２５（１６１１１５ （２１１＋ｉｌｌ　１．５（７１ｂｔｉｏ　４　０．４＋１０１　１１１０＋１ １　７（２＋　０．９＋１２１ｂｔｉｌ　４　１．５（３１１１１０＋１１　２ ．５（４１１，１＋１０１ｂｔｉ２　４　０．９＋４１　１１　１０＋１１　２ ．５（４１１，２（９１Ｖｄ　Ｒ５−２５３２０，４（５１８１，１＋７１　０ ．４（２０１０，４＋２０１ａｎ−２ｓ３　２　０．１５Ｔ１３）　８　０．７ ＋１ｌｌｏ、２２＋３６１　０．２（４０１ｂｔｉｏ　２　０．１４（１４）　 ８　２．８（３１０，９＋９１　０．４（２０１ｂｔｉｌ　２　０．６（３１８ ３＋３１　０．９＋９１　１．２（７１ｂｔｉ２　２　０．３（７１８１，５（ ５１０，４（２０１０，８（１０１ＮＤ＝測定せず 若干の例外はあるが、培地Ａにおいて得られた相乗効果係数は培地Ｂにおいて得 られたものより、一般的に、約２〜３倍大きい。最大相乗効果係数（７３）は培 地Ｂにおいて、菌、アルテルナリア　ブラ＞ｖ５に対するα−プロチオニンとＢ ｎ−２Ｓ３との組合せ（２５０μｇ／　ｍｌ）について得られた。培地Ｂにおけ る２Ｓアルブミンの準抑制濃度をｌＯから５０μｇ／　ｔｎｌに上昇させた場合 には、相乗効果係数が劇的に増大したが、Ａ　ブラシコラについては、５０から ２５０μｇ／　ｍｌに増大させても、それ以上の実質的な増加は認められなかっ た。大麦トリプシン抑制剤については、相乗効果係数は、一般的に、２Ｓアルブ ミン、Ｒ５−２Ｓ３及びＢｎ−２Ｓ３と比較して２〜５倍低かった。

実施例　８ バクテリアの生長に対する２Ｓアルブミンとα−プロチオニンの影響。

抗バクテリア活性は顕微分光分析により以下に述べるごとき方法で測定した。軟 質アガロース培地Ｃ（１０ｇ／ｌのトリプトン、５　ｇｅｌのジ−プラーク（Ｓ ｅａｐｌａｑｕｅ）アガロース、ＦＭＣ）又は軟質アガロース培地Ｄ（１０ｇ／ ｌのトリプトン、５ｇ／ｌのジ−プラークアガロース（ＦＭＣ）　、１　ｍＭの ＣａＣ１’　２及び５０　ｍＭのＫＣＡ’　）に接種することによりバクテリア 懸濁液を調製した。バクテリア懸濁液のアリコート（８０μＩ）（１０５コロニ ー形成単位／ｍＡ’　）を平底９６−ウェル（ｗｅｌｌ）マイクロプレート（ω １ｃｒｏｐｌａｔｅ）中のフィルター殺菌試料（２０μｌ）に添加した。２８℃ でのインキュベーションを３０分（ブランク値）及び２４時間行った後、マイク ロプレートリーダーを使用して、培養液の５９５　ｎｍでの吸光度を測定した。

生長抑制率は抗菌活性評価について実施例４で述べたごとくして算定した。

下記のバクテリア種を使用した：アグロバクテリウム　ツメファシェンス（＾ｇ ｕｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓｅ）　ＬＭＧ　１８８　、 アルカリゲ圓　１ト０フス（什姐旦銭凹シｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　）　ＬＭＧ　１ １９５．７ｉ／ＸピＩＪ／Ｉｚム　ブラシレンス（＾ｚｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　 ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）ＡＴＣＣ２９１４５、バジルス　メガテリウム（Ｂａｃ ｉｌｌｕｓ　＄）　ＡＴＣＣ１３６３２゜エルウィニア　カロトボラ（Ｅｅｗｉ ｎｉａ　ｃａｒａｔｏｖｏｒａ）菌株３９１２、ニジエリシア　コリ（Ｅｓｃｈ ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）菌株ＨＢＩＯＩ、シュウトモナス　ソラナセアルム （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）　ＬＭＧ　２２９３及 びサルシナ　ルテア（Ｓａｒｃｉｎａ　１ｕｔｅａ　）　ＡＴＣＣ９３４２ｏ　 Ｒ５−２Ｓ３の抗バクテリア活性はバクテリア懸濁液に蛋白質の連続稀釈物を添 加することにより測定した。最高試験濃度は５００μｇ／ｍｌ（最終濃度）であ った。

Ｒ５−２Ｓ３だけがグラム陽性バクテリア、Ｌ　メガテリウム（ＩＣ５゜＝１０ μｇ／　ｍＡ　）とグラム陰性バクテリア、Ｌ　カロトボラ（ＩＣ５゜＝２５０ μｇ／　ｍｌ）の生長を抑制した。しかしながら、増殖培地Ｃに１　ｍＭのＣａ Ｃ１２と５０　ｍＭのＫＣＩを添加した場合（増殖培地Ｄ）にはＲ５−２Ｓ３は これらのバクテリアに対する抑制活性を失った。

抗バクテリア活性における相乗効果を実施例７と同様の方法を使用してＲ５−２ ３３とα−プロチオニンの組合せについて評価した。相乗効果はＢ　メガテリウ ムについて認められた。増殖培地り中で試験を行った場合には、α−プロチオニ ンの連続稀釈物に１０．５０及び２５０μｇ／　ｒｎｌの準抑制濃度のＲ５−２ Ｓ３を添加することにより、それぞれ、４．１５及び１７の相乗効果係数が得ら れた（表４）。従って、２Ｓアルブミンのチオニシー強化活性（ｔｈｉｏｎｉｎ −ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｎｇ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）は菌類のみに限られず、若干 のバクテリア種についても明らかに認められる。

表４ Ｒｓ−２３３とα−プロチオニンの組合せのバシルス　メガテリウムに対する相 乗的抗バクテリア活性 Ｒ５−２Ｓ３濃度　μｇ／　ｍｌ！で表したα−プロチオニンのＩ　Ｃ５゜（μ ｇ／　ｍｌ）　（相乗効果係数） 増殖培地Ｃ増殖培地Ｄ ２５０　／　０．１５（１７） 実施例　９ 培養ヒト細胞に対する２Ｓアルブミンとα−プロチオニンの影響。

ヒト細胞に対する毒性の評価は９６−ウェル（９６−ｗｅｌｌ）マイクロプレー ト中で培養した、へそ（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ）静脈内皮細胞（＾１ｅｓｓｅｉ等 。

１９８８、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７５．５３１−５４０）又は皮膚 筋肉繊維芽細胞（ＶａｎＤａｍｍｅ等、　１９８７．　Ｅｕｒ　Ｊ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、１７．１−７）について行った。増殖培地の代わりに、８０μｌの無血清 培地［内皮細胞についてはオプチメン（Ｏｐｔｉｍｅｎ）　１　、繊維芽細胞に ついてはイーグルの最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’　ｓ　ｍｉｎｉｍａｌ　ｅｓｓ ｅｎｔｉａｌ　ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、両者共、ＧＩＢＣＯ製］を使用し 、これに２０μｌのフィルター殺菌供試溶液を添加した。

ルー（燐酸緩衝液、　ＰＢＳ中、４００　ｍｇ／　ｌ　）で１０分間染色した後 、顕微鏡で評価した。別法として、細胞をニュウトラルレッド（ｎｅｕｔｒａｌ 　ｒｅｄ）　（ＰＢＳ中、５６　ｒｎＩ／　ＩＩ　）で３７℃で２時間染色した 。

ニュウトラルレッド処理した細胞をＰＢＳで洗浄し、酸性エタノール（５０％の エタノールを含有する３０　ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ４，２）中に溶解さ せ（ｌｙｓｅ）、染料の遊離（ｒｅｌｅａｓｅ）を５４０止での顕微分光分析に より測定した。

２Ｓアルブミンの哺乳動物細胞に対する潜在的毒性を評価した。

培養したヒトへそ静脈内皮細胞又はヒト皮膚筋肉繊維芽細胞に５００μｇ／　ｆ ｆ１ｌｌまで添加した場合、Ｒ５−２３３は２４時間のインキュベートの後に、 細胞の生存率に影響を与えなかった。これに対して、α−プ０チオニンは、５０ μｇ／　ｒｎｌ及び２０μｇ／　ｍｌ添加した場合、両者の細胞の生存率を、そ れぞれ、９０％及び５０％以上まで減少させた。

一連のα−プロチオニンの連続稀釈物にＲ５−２３３を２５０μｇ／　ｍＡ’の 一定の濃度で添加した場合に、α−プロチオニンの毒性は増加しなかった。

実施例　１０ ２Ｓアルブミンの小及び大サブユニットの抗菌活性。

Ｒ５−２３３の小サブユニット（ＳＳ）及び大サブユニット（ＬＳ）を下記のご とく調製した。Ｒ５−２３３を１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ８ ，４，１００ＩｎＭ　ＤＴＥ中で還元しかつ４５℃に１時間保持した。還元後、 製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を実施例２におけるごとく逆相カラム上を通過 させた。それぞれ、ＳＳ及びＬＳに相当するピークをプールし、真空乾燥した。

ＳＳ及びＬＳ製剤のシスティン残基をＪａｅｎｉｃｋｅ及びＲｕｄｏｌｐｈによ って記載された方法（１９８９，Ｉｎ　：　Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ　（編）　、Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａ ｃｈ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、　Ｌｔｄ、　０ｘｆｏｒｄ　、ｐｐ　１９１−２２４ ）により還元グルタチオンとグルタチオンジスルフィドからなるオキシド−シャ ラフリング（ｏｘｉｄｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）系を使用して再酸化した。再酸 化工程後、再酸化ＳＳ及びＬＳを逆相クロマトグラフィーにより精製した。これ らのチオール含量をＣｒｅｉｇｈｔｏｎによって記載された方法（１９８９，Ｉ ｎ：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ　（編）　、Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　： 　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、ｐｐ１５５−１６７）により測 定し、それぞれ、ＳＳ及びＬＳについて、還元された形のチオール含量の９％及 び２２％であることが認められた。

還元及び再酸化ＳＳ及びＬＳの抗菌活性を実施例４に記載のごとくしてフサリウ ム　クルモルムについて測定した。還元型の抗菌活性は自生的ジスルフィド形成 （Ｍｏｎｓａ　ｌｖｅ等、１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋　Ｂｉｏｐｈｙｓ＾ ｅｔａ、　１０７８．２６５−２７２）を防止するために準抑制濃度のジチオト レイトール（０，２５ｍＭ）の存在下で行った。還元ＬＳは４００μｇ／　ｍｌ 以下酸化ＳＳは３２μｇ／　ｍｌのＩＣ５ｏ値を有しており、これに対し、酸化 ＬＳは４００μｇ／　ｔｎ１以下では活性を示さなかった。培地Ｂにおいては、 酸化ｓｓ及びＬＳのＩＣ５ｏ値は、それぞれ、２００μｇ／　ｍｌ及び４００μ ｇ／　ｍｌより高かった。

同様の方法により酸化ＳＳ又はＬＳとα−プロチオニンの組合せについて評価し た。これらの実験の結果を表５に示す。

表５はＳＳ及びＬＳはα−プロチオニンの活性を強化し得ることを示している（ ＬＳの場合はその程度がより小さい）。酸化ＳＳをα−プロチオニンの稀釈物に １０μｇ／　ｒｎｌの濃度で添加しかつ培地Ａ中で評価した場合には３３まての 相乗効果係数を得ることができた。培地Ｂ中ではこれらの条件下で相乗効果係数 は２であった。酸化ＳＳを培地Ｂに５０μｇ／　ｍｌの濃度で添加した場合には １４の相乗効果係数が得られた。同一の実験で酸化ＬＳを使用した場合には低い 相乗効果係数が測小サブユニットによっても提供されることは明らかである。こ れらの結果は、新規な種類の抗菌性蛋白質を発現させるためには、ＳＳ領域（Ｓ Ｓ　ｄｏｍａｉｎ）だけをエンコードするトランケートされた２Ｓアルブミン遺 伝子を使用し得ることを示している。分子間ジスルフィド結合は精製された還元 ＳＳ分子内で自生的に形成されることが示されているので（Ｍｏｎｓａｌｖｅ等 、１９９１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ、　１０７８．２６ ５−２７２）、発現された蛋白質は抗菌活性を発揮するのに必要な立体配置（ｃ ｏｎ　ｆ　ｉ　ｇｕ　ｒａ　ｔ　ｉ　ｏｎ　）に適合すると考えられる。

実施例　１１ 葉の病害に対する２Ｓアルブミンの抗菌活性：生体内試験。

ハツカダイコン２Ｓアルブミンが生体内で抗菌活性を示すか否かを調べるために 、上記アルブミンをテンサイの葉の病原菌セルコスポ之　ベチコラ（Ｃｅｒｃｏ ｓｐｏｒａ　ｂｅｔｉｃｏｌａ）に対して試験した。

テンサイ植物を直径４ｃｍの小鉢内のジョンインネス（Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ） 堆肥（Ｎｏ、　１及び２）中で成長させた。２７日令（２７ｄａｙ　ｏｌｄ）の 植物を試験に使用した。蛋白質製剤の調製は殺菌蒸留イオン水に溶解しついで適 当な濃度まで稀釈することにより使用直前に行った。製剤試料は葉噴霧物として 、個々の小滴の滞留が最大になるまで植物に施した。蛋白質製剤は病原菌を接種 する１日前［１日前保護試験（１ｄａｙ　ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ　ａｓｓａｙ） 又は病原菌を接種してから４８時間後［２８後根絶試験（２ｄａｙ　ｅｒａｄｉ ｃａｎｔ　ａｓｓａｙ）に施した。病原菌は葉噴霧物として５０．０００胞子／ ｍｌの濃度で施した。接種後、植物を湿潤室内に４８時間放置しついで２４℃の 生長室に移した。病害の評価は更に１２日後に行った。

試験結果は第８図に示されている。病原菌を接種してから２日後に製剤を施した 場合（根絶活性）には、２Ｓアルブミンは１００μＭ〜７００μ証の施用割合で 病害を良好に抑制した。しかしながら、驚（べきことに、蛋白質を病原菌を接種 する１日前に保護剤として施した場合には、７００μ証までの施用割合で病害を 抑制しなかった。

この相違を更に検討するために、２Ｓアルブミンを病原菌に施す時期を変化させ 、その後の病害の抑制を調べた。試験方法は上記の場合と実質的に同一であり、 蛋白質は３５０μ証の単一の割合で施した。

この試験の結果は第９図に示されている。病原菌は時間０で接種し、その後、保 護剤を接種後９６時間までの種々の時期に噴霧した。

全ての植物を病原菌を接種してから１４日後に評価した。各々の時点での植物の 病害の程度を、蒸留水を噴霧したこと以外、同一の方法で処理した対照植物と比 較した。病原菌を接種してから２４〜７２時間後に蛋白質を施した場合に最大抗 菌活性が得られることが判る。

この期間に植物自身の防御機構も誘発され、病原菌の攻撃から４４時間以内にチ オニンを含む多くの八ＦＰｓの発現が最大になると考えられる（１３０１１１ｍ ａｎｎ等、１９８８．　ＥＭＢＯＪ、　７　：　１５５９−１５６５）。従って 、これらの生体内試験の結果を生体外で示される相乗効果（実施例７）に反映さ せることが可能であり、また、２Ｓアルブミンの適用によって得られ得る病害の 抑制を、蛋白質と、植物内で病原体にによって誘発される要因とを組合せること によって生じさせることが可能である。このことは２Ｓアルブミンを病原体の接 種と同時に又はその直後に適用した場合には、２Ｓアルブミンは病害を抑制し得 ないことを説明している。病原体の接種から９６時間後に蛋白質を施した場合の 病害の抑制の出現は、恐らく、菌類が十分に繁殖した事実を反映している。　実 施例　１２ ハツカダイコン２ＳアルブミンｃＤＮＡの分子クローニング。

屋外で生長させたラファヌス　サチブス（即辿凹匹５ａｔｉｖｕｓ　）植物から 、６つの異なる生長段階の種子を捕集し、液体窒素中で冷凍し、−８０℃で貯蔵 した。乳鉢と乳棒で均質化した後、Ｄｅ　Ｖｒｉｅｓ等の方法（１９８８，ＰＩ ａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｒ６，Ｍ３）に より、但し、組織１ｇ当り、６ｒｎｌの１：２フェノール：ＲＮＮ油抽出緩衝液 混合物２ｍｌのクロロホルムを使用して、６つの異なる生長段階の種子の混合物 １６ｇから全ＲＮ＾を抽出した。Ｓｉｆｌｏｗ等により文献に記載されたオリゴ （ｄＴ）−セルロース上でのアフィニテイクロマトグラ＋ フィー　（１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１８．２７２５−２７３１ ）によりポリ　（Ａ）　ＲＮＡを精製して、組織１ｇ当り、約１０μｇのポリ（ Ａ）　ＲＮＡを得た。

Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎの方法（１９８３，Ｇｅｎｅ、　２５．２６３ −２６９）に従って、１．５μｇのポリ　（＾）　ＲＮＡから二重鎖ｃＤＮ＾を 調製しついでＰｈａｒｍａｃｉａからのｃＤＮ＾ンンセシスキット（ｃＤＮＡ　 ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ）を使用してＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩアダプターに連 結した。ｃＤＮＡをλＺＡＰ　ＩＩファージベクター　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ）中に製造業者の取扱説明書に従ってクローンした。

鋳型ＤＮＡとして２μｇの全ｃＤＮＡ上でＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）（ｐｏ ｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を行うことにより（標準的 条件下：Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、１９８９．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎ ｇ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｒｏｙ　Ｐｒｅｓｓ ）　、かつ、センスオリゴヌクレオチド０ｆＢ１８（５゛Ｔ＾＾ＧＧＡＴＣＣＣ ＡＴＡＣＡＣＧＡＡＴＧＧＣＧ＾＾Ｃ＾＾ＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧ　３°）及び アンチセンスオリゴヌクレオチド０ＷＢ２０ （５°ＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＣＴＣＧＡＧＧＧＴＴＴＣＧＴＴＴＧＧ　３°） をアンブリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）として使用して、ハツカダイコン２Ｓアル ブミンｃＤＮ＾一つをクローンした。０ＴＢ２０はハツカダイコン２Ｓアルブミ ンｐＢ＾３　ｃＤＮＡについて公表されている配列（Ｒａｙｎａｌ等、１９９１ ゜Ｇｅｎｅ、　９９．７７−８６）に基づいて設計した。このクローンはその５ °　末端でトランケート（ｔｒｕｎｃａｔｅ）されているので、０ｆＢ１８は脂 肪種子アブラナ（ｏｉｌｓｅｅｄ　ｒａｐｅ）ナピンｐＮＡＰ１　ｃＤＮＡにつ いて公表されている配列（Ｅｒｉｃｓｏｎ等、１９８６．　Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、２６１．１４５７６−１４５８１）に基づいて設計した。０ＷＢ１８はそ の５°末端にＴＡＡＧＧＡＴＣＣ（’　ＴＡ＾°の後に素で予備消化したｐＥＭ ＢＬ１８．中にサブクローンしついでファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　Ａ ＬＦ自動ヌクレオチドシークエンサーを使用して自動ヌクレオチド配列決定（ｎ ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。このクローン（以下に おいてはｐｌＧ８と称する）のヌクレオチド配列は第１０図に示されている（単 一ペプチドには点線でアンダーラインが引かれており、成熟小サブユニットには 実線でアンダーラインが引かれており、成熟大サブユニットは四角で囲まれてい る）。

実施例　１３ ハツカダイコン２Ｓアルブミン小サブユニツトｃＤＮ＾の分子クローニング及び ｐＩＧｌｌの構築。

２Ｓアルブミン小サブユニツトｃＤＮ＾を得るために、センスオリゴヌクレオチ ド０ＷＢ１９ （５°ＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＡ　ＡＣＣＧＧＡＣＴＧＣＣＴＴＧＣＣＴＧＣＣ ３°）及びアンチセンスオリゴヌクレオチド０ＷＢ２１（５°＾＾ＴＴＧＣＴＡ ＧＣＧＣＣＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＴＴＣＣ３°）を使用したこと以外、実 施例１２で述べた方法と同一の方法を行った。

０ＷＢ１９はその５°末端にＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴ＾配列を有しており（’　 ＴＡＡ’　の後にＸＢａ　Ｉ認識部位と停止コドノＴＡＧ’　を誘導する°ＣＴ ＾°が続いている）、０ＷＢ２１はその５°末端にＡＡＴＴＧＣＴＡＧＣ配列を 有している（＾＾１丁の後にＮｈｅ　１認識部位が続いている）。鋳型ＤＮＡと しての１−へＭＰ２ｃＤＮ＾クローンｐＭＪ９５０ｎｇ及びＭ１３普遍プライマ （ｕｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍｅｒ）及びアンブリマーとしてのアンチセンスオ リゴヌクレオチド０ＷＢ２２ （５゛＾＾ＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＧＣＴＡＧＣＴＴＣＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＡＧ ＣＡＴＧＧ３’　）１９９２、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６７．２２２８− ２２３３）シグナルペプチドを得た。

はｐＭＪ９のポリリンカー中で生起する）ついでこれらと同一の酵素で予備消化 したｐＥＭＢＬ１８＋中にサブクローンした。得られた構築物をＥｃｏ　ＲＶ及 びＳｍａ　Ｉで切断することによりＭｊ−ＡＭＰ２開始コドンの上流にある追加 の＾ＴＧ開始コドンを除去しついでプラント連結を行った。

これによりクローンｐｌＧ１０を得た。

ついで、ハツカダイコン２Ｓアルブミン小サブユニツトＰＣＲ生成物せるので、 挿入小サブユニットを、異なるクローンをＮｈｅ　ＩとＢａｍＨＩで消化するこ とにより検査した。正しく挿入された小サブユニットを有するクローンにの一つ 、ｐＩＧｌｌを自動ヌクレオチド配列分析にかけた。ｐＩＧ１１インサートのヌ クレオチド配列と誘導アミノ酸配列は第１１図に示されている。小サブユニット の最初のアミノ酸（プロリン、第１０図参照）がセリンに変化していることに注 意せよ。脂肪種子　アブラナ　ナピンはその小サブユニットの最初のアミノ酸と してセリンを有しており（Ｅｒｉｃｓｏｎ等、１９８３．　Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６１．１４５７６−１４５８１）　、抗菌活性を示シかツα−プ ロチオニント相乗効果を示すので（実施例５及び１０）、この置換はこの変化し たハツカダイコン２Ｓアルブミン小サブユニツトの抗菌活性にも、相乗効果にも 影響するとは考えられない。

実施例　１４ 発現ベクターｐＩＧ１３及びｐＩＧ１５の構築。

発現ベクターｐＩＧ１３　（第１２図）はＲ５−２３アルブミンｃＤＮＡの完全 コーディング領域であって、その５°末端に、高い転写活性を与えるための重複 （ｄｕｐｌｉｃａｔｅｄ）エンハンサ−成分（Ｋａｙ等、　１９８７゜５ｏｃｉ ｅｎｃｅ、　２３６．１２９９−１３０２）を有するカリフラワーモザイクウィ ルス（Ｏｄｅ　Ｉ　１等、　１９８５．Ｎａｔｕｒｅ、３１３，８１０−８１２ ）の３５Ｓ　ＲＮＡの強力な構成プロモーターが隣接（ｆｌａｎｋ）　している ものを含有している。Ｒ５−２３アルブミンｃＤＮＡのコーディング領域は、そ の３°末端側にカリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ　ＲＮＡ　（ＣａＭＶ３ ５Ｓ　）のポリアゾニレ−ジョン配列が隣接している。このベクターのプラスミ ド主鎖はファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）　ｐＵｃ１２０　（Ｖｉｅｉｒａ及 びＭｅｓｓｉｎｇ、　１９８７．ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ、　１５３．３− １１）である。ｐＩＧ１３は次の方法で構築した。Ｒ５−２３アルブミンｃＤＮ Ａ　（第１０図）からなるクローンｐＩＧ８をｐＥＭＢＬ１８、　（Ｂｏｅｈｒ ｉｎｇｅｒ）のｋｐｎ　Ｉ／Ｐｓｔ　Ｉ部位にクローンした。２９８　ｂｐｋｐ ｎ　Ｉ／　Ｐｓｔ　Ｉフラグメントを、腺ＬＩとＰｓｔ　Ｉで予備消化した発現 ベクターｐＦＡＪ３００２中のサブクローンした。ｐＦＡＪ３００２はユニーク Ｅｃｏ　ＲＩ部位がＨｉｎｄＩＩＩ部位によって置換されている、発現ベクター ｐＦＦ１９（Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ等、１９９０．　Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ 、１４，３３３−３４４）の誘導体である。発現ベクターｐＩＧ１５　（第１３ 図）はＲ５−２Ｓアルブミン小サブユニツトが続いているＭｊ−ＡＭＰ２シグナ ルペプチドをコードするハイブリッドヌクレオチド配列を含有しており、ｐＩＧ ｌｌ　（第１１図）から出発してｐＩＧ１３と同様の方法で構築される。

実施例　１５ 植物形質転換ベクターｐＩＧ１９及びｐＩＧ２０の構築。

発現ベクターｐＩＧ１３をＨｉｎｄＩＩＩで消化しついでＲ５−２３アルブミン ｃＤＮ八発現カセットを含有るフラグメントをｐＢｉｎ１９Ｒｉのユニーク（ｕ ｎｉｑｕｅ）肛匹ＩＩＩ部位中にサブクローンした。ｐＢｉｎ１９Ｒｉは植物形 質転換ベクターｐＢｉｎ１９の修飾体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖｅｒｓｉｏｎＸＢ ｅｖａｎ、　１９８４゜Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　、　 １２　：　２２．８７１１−８７２１）であり、このｐＢｉｎ１９Ｒｉにおいて はユニークＥｃｏ　ＲＩ及び■ｎｄＩＩＩ部位がスイッチされておりかつ欠陥（ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）　匣ＬＩＩ発現カセット（Ｙｅｎｏｆｓｋｙ等、１９９０ 、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｏｃ、　ＵＳＡ、８７　：３４３５−３４ ３９）が導入されている。

新規な植物形質転換ベクターをｐＩＧ１９と称する（第１４図）。新規な植物形 質転換ベクターｐＩＧ２０の構築は、ｐＩＧ１５のＨｉｎｄＩＩＩフラグメント （ハイブリッドわ一へＭＰ２シグナルペプチド／　Ｒ５−２３アルブミン小サブ ユニツト発現カセットを含有）をｐＢｉｎ１９Ｒｉ　（第１５図）中にサブクロ ーンしたこと以外、ｐＩＧ１９と同様の方法で行った。

実施例　１６ 植物形質転換。

安全化した（ｄｉｓａｒｍｅｄ）アグロバクテリウム　ツメファシェンス（Ａ　 ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）菌株ＬＢ＾４４０４　［ ｐＡＬ４４０４］（Ｈｏｅｋｅｍａ等、１９８３．Ｎａｔｕｒｅ、　３０３：１ ７９−１８０）をＦｒａｍｏｎｄ等の方法（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１　 ：２６２−９）を使用して、ベクターｐＩＧ１９又はｐＩＧ２０により形質転換 した。

１（ｏｒｓｃｈ等の方法（１９８５，５ｃｉｅｎｃｅ、　２２７．１２２９−３ １）に基づいて、ニコチ土　タバクム　サムスン（Ｎｉｃｏｔｉｎａ　ｔａｂａ ｃｕｍ　Ｓａｍｓｕｎ）の葉の円盤を使用してかっｐＩＧ１９又はｐＩＧ２０を 含有するアグロバクテリウム菌株と共に共培養することによりタバコの形質転換 を行った。共培養は１００　ｕｇ／　ｍｌのカナマイシンの選択圧（ｓｅｌｅｃ ｔｉｖｅ　ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下で行った。トランスジェニック植物（ｐＩＧ１ ９又はｐＩＧ２０で形質転換）を１００μｇ／　ｍＪのカナマイシンを含有する 培地で再生した。これらのトランスジェニック植物は標準ウェスタンブロッティ ング技術を使用して、新規に導入された遺伝子の発現について分析し得る。導入 された遺伝子の構成的発現を行うことのできる植物を選択し、白花受粉させて種 子を得ることができる。トランスジェニック植物のＦ１苗木は更に分析し得る。

最終的に、トランスジェニックホモ接合（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）植物（ｐＩＧ １９又はｐＩＧ２０　）レイト（ｔｒａｉｔ）中）をトランスジェニックホモ接 合タバコ植物と交雑し得る。新規なトランスジェニック植物は上記のごとくして 分析し得る。

（ＩＩＩＵ　０ＦＩＺ’）　誼　某　葡□（毎’ＪＯＩＩＩＺ）　：ｍ　γ　萄 □％　１ｒ（ｉ（＝４斗、１−−−−−−Ｒ５−２５５ＰＡＧＰＦＲＩＰＲＣＲ ＲＥＦＱＱＡＱＨＬＲＡＣＱＱＷＬＨＲＱナピン　５ＡＧＰＦＲＩＰｋＣＲｋＥ ＦＱＱＡＱＨＬＲＡＣＱＱＷＬＨｋＱＲｓ−２５５ＰＯＧＰＯＱＲＰＰＬＬＱＱ ＣＣＮＮＬＬＱｐＢＡ３　ＰＱＧＰＱＱＲＰＰＬＬＱＱＣＣＮｅＬｋＱｆ　ピン 　ＰＯＧＰＱＯＲＰＰＬＬＱＯＣＣＮｅＬｋＯｂｔｉＯＦＧＤＳＣＡＰＧＤＡＬ ｂｔｉｌ　ＡＧＫＫＲＰＷＫＣＣ ｂｔｉ２　ＡＧＫにＩＰＷにＣＣ ＷＧＩＩ　ＭＫＫＲＰＷＫＣＣ ＦＩＧ、９ 時　間　（時間） 国際調査報告 １−１．−ｍ−蟲−１６−紬、１ρ（７／ＩＩＰ＋ｌりｌロ１５７４国際調査報 告 ；””　”’：、＝ｉ＝：：；＝ｊ１：ｓ＝％ｉ　Ｓｗａｍ　ｒａ、ｌａ二ｌ； ；Ｉｓ　、、ｌｌｔ＠：Ｉｓ；：　ｍＷ　ｍＷ　ｌ＠　１゛高V？ｉｌ、ｉ７ｍ ＋ヨ７Ｍｗｍ１　ｓｍｒｄ　ゝＴｈｅ１＠＋’ｓ−−ＮＩ＊ｍ＠−啼１ｅ＠１参 喜内ｍｅｗｅｙｌｌａ−−４１番−−ｒ引ｍ＃ｅ＋ｔｌｃｗ１ｍｗｅｉｍ−拳ｆ １−＃＋ｗ撃凾Pｍｌｅｒ＠＠％ｒ−−シーｓｍｌａｍｂフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＡＯＩＮ　６５１００　 Ｚ　９１５９−４ＨＣ１２Ｎ　１５／２９　ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｃ８２１４−４Ｂ／／　Ｃ１２Ｎ　５／１０ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＡＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　 ＲＯ，ＲＵ、　ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　オスポーン、ルパート、ウィリアムイギリス国、ミドルセック ス・テイダブリュ２・６エスダブリユ、ツウイケンハム。

ワーウイツク・ロード、３６ ＦＩ （７２）発明者　リーズ、サラ、プランウエンイギリス国、バークシャー・アー ルシイ１２・３エツクスエツクス、ブラックネル。

フォーレスト・パーク、マイケルデヴアー・ウェイ、３２ （７２）発明者　テラス、フランキイ、レイモンド、ジエラルド ベルギー国、ビイ−８５７０・アンゼゲム、シャーグシュトラート、９６ （７２）発明者　ヴアンデルレイデン、ジョセフベルギー国、ビイ−３００１・ へヴアーレー。

カスタンイエラーン、１２

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．１種又はそれ以上のアルブミン型蛋白質を含有する抗菌性組成物。
2. ２．１種又はそれ以上のチオニン蛋白質を含有する、請求の範囲１に記載の抗菌 性組成物。
3. ３．少なくとも１種の蛋白質は機能ポリペプチドサブユニットである、請求の範 囲１又は２に記載の組成物。
4. ４．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は２Ｓアルブミン又はナピンである、 請求の範囲１〜３のいずれかに記載の組成物。
5. ５．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は２Ｓアルブミンの小サブユニットで ある、請求の範囲４に記載の組成物。
6. ６．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は大麦トリプシン抑制剤、大麦α−ア ミラーゼ抑制剤又は穀類ダリアジンである、請求の範囲１〜５のいずれかに記載 の組成物。
7. ７．殺菌剤である、請求の範囲１〜６のいずれかに記載の組成物。
8. ８．菌類又はバクテリアを請求の範囲１〜７のいずれかに記載の組成物に暴露す ることからなる、菌類又はバクテリアの防除方法。
9. ９．組成物を植物に外部的に施す、請求の範囲８に記載の方法。
10. １０．組成物を植物内で発現させる、請求の範囲８に記載の方法。
11. １１．菌類又はバクテリア病原体に対する改善された抵抗性を有するかつ病原体 の攻撃部位に供給するためのアルブミン型蛋白質を発現する組換えＤＮＡを含有 する植物。
12. １２．組換えＤＮＡは病原体の攻撃部位に供給するためのチオニン蛋白質を発現 する、請求の範囲１１に記載の植物。
13. １３．菌類又はバクテリア病原体に対する改善された抵抗性を有するかつ病原体 の攻撃部位に供給するための第１及び第２の蛋白質を発現する生物学的系であっ て、かつ、上記第１の蛋白質はアルブミン型蛋白質であり、第２の蛋白質はチオ ニンである生物学的系において、上記第１及び第２の蛋白質の少なくとも１つは 組換えＤＮＡから発現させることを特徴とする、生物学的系。
14. １４．病原体の攻撃部位は葉である、請求の範囲１１〜１３のいずれかに記載の 植物。
15. １５．少なくとも１種の蛋白質は機能ポリペプチドサブユニットである、請求の 範囲１１〜１４のいずれかに記載の植物。
16. １６．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は２Ｓアルブミン又はナピンである 、請求の範囲１１〜１５のいずれかに記載の植物。
17. １７．第１０図に示される配列を実質的に有する組換えＤＮＡを含有する、請求 の範囲１６に記載の植物。
18. １８．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は２Ｓアルブミンの小サブユニット である、請求の範囲１６に記載の植物。
19. １９．第１１図に示される配列を実質的に有する組換えＤＮＡを含有する、請求 の範囲１８に記載の植物。
20. ２０．少なくとも１種のアルブミン型蛋白質は大麦トリプシン抑制剤、大麦α− アミラーゼ抑制剤又は穀類ダリアジンである、請求の範囲１１〜１９のいずれか に記載の植物。
21. ２１．範囲１１〜２０のいずれかに記載の植物の種子又は後代。