CN110204602B - 一种抗真菌的抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

一种抗真菌的抗菌肽及其应用。本发明提供了一种新型的抗菌肽，利用小偃麦SN6306白粉病菌诱导的叶片转录组数据结合生物信息学方法获得了抗菌肽基因，通过转化大肠杆菌表达目的蛋白，通过PDA平皿试验、小麦叶片涂抹等方法分别验证这个抗菌肽的抗真菌活性。该抗菌肽含可以用于制备抗禾谷镰刀菌、抗小麦白粉病的抑制剂，是一种具有潜在利用价值巨大的抗真菌的抑制剂的原料。本专利提供的抗菌肽可以代替传统化学农药，防治小麦及其他作物的真菌病害。

Description

一种抗真菌的抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种抗真菌的抗菌肽及其应用。

背景技术

小麦是我国重要的农作物之一，且主要作为粮食作物。小麦赤霉病和小麦白粉病是严重影响黄淮海麦区小麦产量和品质的重要病害。目前的主流防治措施仍以化学防治为主。农药的施用加剧了环境污染，并且容易导致病原菌产生耐药性。抗菌肽是生物体内对细菌和真菌具有抑杀作用的小分子肽，很多生物体内抵抗病原体入侵的天然防御系统的组成部分，因其特殊的作用机制，能迅速杀菌而不容易导致耐药性，且对植物病原体具有广谱抗性，成为一种极具发展潜力的天然药物(燕晓翠等，2017)。

抗菌肽的生物学活性包括抗细菌、抗真菌和调节免疫功能。

大多数抗菌肽可以抑杀革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，不同来源不同类型的抗菌肽的抗菌活性有些差异。目前大多数认为抗菌机制是抗菌肽与细菌细胞膜相互作用(Bechinger B,Gorr SU.Antimicrobial Peptides.Journal of Dental Research,2017,96(3):254.；Tossi A,Scocchi M,Zahariev S,et al.Use of unnatural amino acids toprobe structure–activity relationships and mode-of-action of antimicrobialpeptides.Unnatural Amino Acids.Humana Press,2012:169-183.)。带正电荷的阳离子抗菌肽与革兰氏阴性细菌带负电荷的表面分子膜磷脂产生静电，结合于细菌细胞膜上，接着抗菌肽的疏水段造成膜结构变化(Ageitos JM,Sánchez-Pérez,A,Calo-Mata P,VillaTG.Antimicrobial peptides(AMPs):Ancient compounds that represent novelweapons in the fight against bacteria.Biochemical Pharmacology,2017,133:117-138)。

随着微生物对传统抗生素产生耐药性的问题不断升级，人们越来越关注抗真菌肽作为新型抗生素的潜力(Epand RM,Vogel HJ.Diversity of antimicrobial peptidesand their mechanisms of action.Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes,1999,1462(1-2):11-28)。抗真菌肽(Antifungal peptide，AFP)是抗菌肽(Antimicrobialpeptide，AMP)中的一个子集，AFP可分为线性肽，形成两亲性疏水螺旋的肽、β-片肽、α-螺旋和β-片混合肽、富含特定氨基酸的肽以及经修饰的环肽和脂肽(Nguyen LT,Haney EF,Vogel HJ.The expanding scope of antimicrobial peptide structures and theirmodes of action.Trends in Biotechnology,2011,29,(9):464-472；Tam JP,Wan S,WongKH,Tan WL.Antimicrobial peptides from plants.Pharmaceuticals,2015,8(4):711-757；Hamley IW.Lipopeptides:From self-assembly to bioactivity.ChemicalCommunications,2015,51(41):8574-8583)。目前抗菌肽对真菌的抗性机制主要3种假说：一是抗菌肽抑制几丁质、葡聚糖等细胞壁的重要组成成分的合成，阻碍真菌细胞壁的形成；二是抗菌肽与细胞膜互作，破坏细胞膜，使内容物外泄；三是抗菌肽作用于线粒体等真菌细胞器，最终达到抑杀真菌的目的。

抗菌肽不仅有抗菌作用，还可以调节免疫系统，如趋化、激活免疫细胞和调节炎症。抗菌肽fowlicidin-1(6-26)具有很强的调节免疫系统、直接募集中性粒细胞、激活巨噬细胞、增强抗原特异性适应性免疫应答的能力，通过将肽注射到小鼠腹膜后，发现嗜中性粒细胞被特异性趋化，fowl-1(6-26)在与卵清蛋白共同给药后增强了抗原特异性免疫应答的总体趋势，表明了fowl-1(6-26)作为疫苗佐剂的效用(Bommineni YR,Pham GH,SunkaraLT,Achanta M,Zhang G.Immune regulatory activities of fowlicidin-1,acathelicidin host defense peptide.Molecular Immunology,2014,59(1):55–63)。

小麦和野生近缘植物在长期的抗病进化过程中，基因组中产生了丰富的抗菌肽基因，利用生物信息学结合分子细胞生物学技术进行新型抗菌肽的挖掘，寻找高效的抗植物病害的新型抗菌肽具有重要的实用价值。

发明内容

已报道的抗菌肽大多能够破坏膜结构，抑杀革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，促进免疫消除感染，保护宿主免受病原侵害。抗菌肽来源广泛，在动植物以及微生物体内都有发现，但目前对抗小麦白粉病和赤霉病的抗菌肽研究报道较少。

本专利利用小偃麦SN6306白粉病菌诱导的转录组数据结合生物信息学方法获得了抗菌肽基因，即Y5468，通过转化大肠杆菌表达目的蛋白，通过PDA平皿验证、小麦叶片涂抹等方法分别验证这个抗菌肽的抗真菌活性。本专利提供的抗菌肽可以代替传统化学农药，防治小麦及其他作物的真菌病害。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示

本发明提供的抗菌肽基因的cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。

本发明提供的抗菌肽可用于制备抗真菌的抑制剂。

本发明提供的抗菌肽可以用于制备抗禾谷镰刀菌的抑制剂。

本发明提供的抗菌肽可以用于制备抗小麦白粉病的抑制剂。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种新型的抗菌肽，该抗菌肽可以用于制备抗禾谷镰刀菌、抗小麦白粉病的抑制剂，是一种具有潜在利用价值巨大的抗真菌的抑制剂的原料。

附图说明

图1是Y5468基因的cDNA序列和编码的氨基酸序列。

图2是Y5468蛋白的氨基酸序列的信号肽分析。

图3是Y5468蛋白的跨膜螺旋预测。

图4是12％的SDS-PAGE电泳分析pET-32a(+)空载体中标签蛋白表达情况；其中：M，预混合蛋白标记物(宽)；1，未诱导对照；2:过夜诱导；3，超声破碎后的沉淀；4，超声破碎后的上清；5-7，纯化过程中的清洗液；8，纯化的目的蛋白；9，酶切的目的蛋白。

图5是12％的SDS-PAGE电泳分析Y5468重组蛋白表达情况；其中：M，预混合蛋白标记物(宽)；1，未诱导对照；2:过夜诱导；3，超声破碎后的沉淀；4，超声破碎后的上清；5-7，纯化过程中的清洗液；8，纯化的目的蛋白；9，酶切的目的蛋白。

图6是蛋白定量标准曲线。

图7是Western Blot检测pET-32a(+)标签蛋白、Y2944蛋白表达；其中：M，

II Protein Marker(14-120kDa)；1，pET-32a(+)标签蛋白；2，酶切后的pET-32a(+)标签蛋白；3，Y2944重组蛋白；4，Y2944重组蛋白酶切后；5，Y5468重组蛋白；6，Y5468重组蛋白酶切后；7，W662重组蛋白；8，W662重组蛋白酶切后。

图8是蛋白抑制禾谷镰刀菌菌丝扩展图；其中A：加入了空载体标签蛋白；B：加入了Y2944蛋白；C:加入了Y5468蛋白。

图9是禾谷镰刀菌菌丝生长直径统计图。

图10是禾谷镰刀菌侵染小麦叶片图，其中A:加入了pET-32a(+)标签蛋白；B:加入了Y2944蛋白；C:加入了Y5468蛋白；D:加入了W662蛋白。

图11是统计小麦叶片上感赤霉病区域叶片长度。

图12是白粉病侵染YN15小麦叶片，其中A:涂抹了pET-32a(+)标签蛋白；B:涂抹了Y2944蛋白；C:涂抹了Y5468蛋白D:涂抹了W662蛋白。

图13是统计小麦叶片上感白粉病区域与叶片总面积的比值。

图14是叶片染色后的白粉病菌丝分布情况，其中A:涂抹了pET-32a(+)标签蛋白的叶片；B:涂抹了Y2944蛋白的叶片；C:涂抹了Y5468蛋白的叶片；D:涂抹了W662蛋白的叶片。

具体实施方式

实施例1利用的生物信息学分析方法发现抗菌肽

利用抗菌肽数据库APD(http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中已有的抗菌肽数据与本课题组已经完成的白粉病菌诱导的小偃麦SN6306叶片转录组测序数据进行比对，分析小麦中的抗菌肽编码基因序列，在转录组数据中挖掘到1个抗菌肽基因，即Y5468。分析了Y5468的基因序列、氨基酸序列，并分析了Y5468蛋白的一级结构(https://web.expasy.org/protparam/)、二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝npsa_sopma.html)、信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和跨膜螺旋(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)等。

Y5468基因是利用APD网站的已有抗菌肽序列与白粉病菌诱导的小偃麦SN6306叶片转录组测序数据比对结果中发现的新型抗菌肽基因，cDNA全长分别为312bp，氨基酸编码个数分别为103个(图1)。Y5468蛋白有信号肽，信号肽的切割位点在26-27氨基酸之间。通过在小麦数据库URGI上的比对结果得知，Y5468基因位于3B染色体上。Y5468没有保守结构域。通过ProtParam和SOPMA网站，预测了蛋白的等电点、分子量、疏水性和脂肪系数，以及蛋白的α-螺旋、β-折叠、延伸链和不规则卷曲等，并且α-螺旋和不规则卷曲在蛋白中所占比例较大(表1)。根据在Signal P4.1网站的预测，证明此蛋白都含有信号肽(图2)。借助TMHMM 2.0网站预测了蛋白拓扑结构，发现了位于胞外，Y5468蛋白可能是分泌蛋白(图3)。

表1 Y5468蛋白的结构分析

实施例2抗菌肽的抗菌功能的验证

No.1方法

No.1.1抗菌肽原核表达载体的构建，转入表达菌株

将从小偃麦SN6306转录组数据中挖掘到的Y5468基因序列进行信号肽预测，并去掉信号肽的序列。依据大肠杆菌对密码子的表达偏好性对Y5468进行密码子优化，序列两端分别添加了NcoI酶切位点和EcoRI酶切位点，交由济南博尚生物技术有限公司进行基因合成，并以NcoI和EcoRI为克隆位点连入载体pET-32a(+)。

将构建好的pET-32a(+)质粒转入表达菌株BL21(DE3)plysS感受态细胞。

(1)热击法转化E.coli BL21(DE3)plysS感受态细胞

1)取50μL保存于-80℃冰箱的感受态细胞，加入10μL重组质粒DNA，迅速混匀，冰浴30min(于超净工作台中操作)。

2)冰浴结束，将混合物在42℃金属浴中热激90s，迅速置冰上1～2min。

3)将装有混合物的反应管中加入800μL LB液体培养基，混匀，于200rpm、37℃恒温摇床孵育40～60min。

4)反应管于离心机中12000×g，短暂离心，吸弃600μL上清，剩余部分重悬滴加到含有相应抗生素的LB固体培养基上，用无菌涂布棒均匀的将转化的细菌涂到琼脂板上。(于超净工作台中操作)

5)平板正向放置15～30min，置于37℃恒温培养箱中倒置培养16h。

(2)挑取单菌落

挑取平板上的单菌落加入5mL含有相应抗生素的LB液体培养基中，混匀，于37℃恒温振荡器200rpm振荡培养16h。待培养结束，保存菌并取部分菌液测序验证。

No.1.2抗菌肽蛋白的诱导表达

(1)将含有pET-32a(+)质粒的BL21(DE3)和含有pET-5468质粒的BL21(DE3)plysS按照5％的体积比加入30mL含有100mg/mL氨苄青霉素的自诱导培养基中，于37℃恒温振荡器中，200rpm振荡5h，再将振荡器温度调至25℃，继续以200rpm恒温振荡10～16h。

(2)SDS-PAGE检测诱导蛋白表达情况

1)配胶

表2配胶组分表

2)样品处理

取1mL诱导后的菌液13000×g，离心10min，弃上清，加入100uL的蛋白提取液重悬。将离心管置于95℃金属浴中30min。

3)SDS-PAGE电泳

取10uL加热后的样品点样，开始SDS-PAGE电泳。

电泳条件：开始电压110V，电泳30～40min后，电压设为120V，继续电泳100～120min，直至泳道中的考马斯亮蓝指示带移动到分离胶底部1cm处，停止电泳。

4)凝胶成像

按照考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液(北京索莱宝科技有限公司)说明书上的操作步骤进行凝胶染色。

使用方法如下：

工作液的配制，取100mL溶液B，加入2mL溶液A，混匀，此为工作液。

1.将电泳后的PAGE胶(以8cm×10cm大小为例)取下放入容器中，加入50mL去离子水，加热至沸腾后停止，继续在脱色摇床上摇动5分钟，弃去水溶液。

2.加入25mL快速染色工作液，加热至沸腾后保持沸腾状态30～60s，停止加热后继续在脱色摇床上摇动5～10min，弃去染色液(此时蛋白条带应已可见)。

3.加入约50mL去离子水，加热至沸腾后保持沸腾状态30～60s，停止加热后继续在脱色榣床上摇动5～10min，换水即可完成脱色，观察结果。

注意事项：

1.染色前的清洗步骤中，水的质量非常重要，质量越好灵敏度越高，研究证明若用自来水加热清洗，染色效果与灵敏度仅与常规甲醇考马斯亮蓝染色相同。

2.脱色时可用自来水清洗。

3.若要得到无背景的染色胶，可重复脱色步骤或将胶放在水中过夜。

4.经本产品染色的PAGE胶，胶的缩涨度小于5％，染色后的胶可在水中放置数月而无明显脱色。

5.每次加热后，继续在脱色摇床上摇动5min，可增强染色效果。

6.本染色液有轻微腐蚀性，需带手套操作。染色后的凝胶使用凝胶成像系统照相，观察结果。

No.1.3抗菌肽蛋白纯化

No.1.3.1抗菌肽蛋白纯化

按照Beaver Beads^TM His-tag Protein Purification试剂盒上的说明书进行蛋白纯化，操作流程如下：

(1)磁珠预处理：

1)将海狸磁珠产品置于漩涡混匀器上充分混匀，用移液器取5mL磁珠悬液于15mL离心管中,进行磁性分离，弃上清液，从磁性分离器上取下离心管。

2)加入5mL Binding Buffer到上述装有磁珠的离心管中，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮；进行磁性分离，移去上清液。重复洗涤2次。(注：在磁性分离过程中，为了减少磁珠在使用过程中的损耗，待溶液变澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁性分离器上，手持磁性分离器与离心管上下翻转数次，使澄清的溶液涮洗离心管盖上残留的磁珠，静置片刻，使溶液重新变澄清；以下同。)

(2)目标蛋白与磁珠结合

1)用10mL Binding Buffer悬浮2g湿重的菌体，进行破碎和裂解之后，即为目标粗蛋白样品，加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于漩涡混匀器振荡15s。

2)将离心管置于旋转混合仪上，室温旋转混合20～30min(如果需要，可以在2-8℃的低温环境下，旋转混1h防止目标蛋白降解)。

3)将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测，从磁性分离器上取下离心管进行后续洗涤步骤。

(3)磁珠洗涤

1)加入10mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管中，轻轻翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，移出清洗液到新的离心管中，以备取样检测。重复此步骤1次。

2)加入10mL Washing Buffer到装有磁珠的离心管，使磁珠重新悬浮，将磁珠悬液转移到新的离心管(避免原离心管壁上非特异性吸附蛋白污染目标蛋白)，磁性分离，移出上清液到清洗液收集管。

(4)目标蛋白洗脱

1)用户可根据需要改变洗脱体积调整目标蛋白浓度，加入2～10mL ElutionBuffer，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管中，即为纯化的目标蛋白样品。

2)如果需要，可以重复上述步骤1次，收集样品到新的离心管中，以检测目标蛋白是否洗脱完全。

(5)磁珠后处理

1)在装有磁珠的离心管中加入5mL Elution Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。

2)重复上述步骤2次。

3)在离心管中加入5mL ddH₂O，上下翻转离心管数次，使磁珠悬浮，磁性分离，去除上清液。

4)重复上述步骤2次。

5)加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5mL，保存于2-30℃(长期保存，置于2-8℃)，可用于下一次同种蛋白的纯化。

(6)磁珠再生

磁珠连续使用三次以上，其结合目标蛋白的能力可能会明显降低，建议进行磁珠再生处理。以5mL 10％(v/v)磁珠悬液为例，详细说明磁珠再生操作：

1)将磁珠悬液进行磁性分离，去除上清液，从磁性分离器上取下离心管，在离心管中加入5mL ddH₂O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。

2)加入5mL Stripping Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5min，磁性分离，去除上清液。重复此步骤1次。

3)加入5mLddH2O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液，重复此步骤2次。

4)碱处理：加入5mL Beads Washing Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合5min，磁性分离，去除上清液。加入5mL ddH₂O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复ddH₂O洗涤步骤3～5次，至洗涤液呈中性为止。

5)加入5mL Recharge Buffer，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，室温旋转混合20min，磁性分离，去除上清液。

6)加入5mL ddH₂O，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，磁性分离，去除上清液。重复此步骤4次以上，保证镍离子去除完全。

7)加入Storage Buffer到磁珠中使总体积为5mL，保存于2-30℃(长期保存，置于2-8℃)。

(7)SDS-PAGE凝胶电泳检测蛋白纯化情况，使用考马斯亮蓝蛋白胶快速染色液染胶观察结果。

No.1.3.2抗菌肽蛋白透析

将装有纯化后的蛋白的透析袋置于盛有33mM的磷酸钠溶液中，置于4℃磁力搅拌器上进行透析，每4h更换一次透析液，共透析一天一夜。将透析后的蛋白分装于2mL离心管中，保存在-80℃冰箱。

No.1.3.3抗菌肽蛋白浓度的测定

按照简易蛋白质定量试剂盒(Bradford)说明书上的操作方法进行蛋白浓度测定，操作方法如下：

(1)准备蛋白标准溶液

蛋白标准溶液稀释到使终浓度为0.22mg/ml。蛋白标准品应与待测蛋白样品使用相同的溶液稀释。

(2)蛋白定量

根据Easy Protein Quantitativr Kit(Bradford)试剂盒说明书进行蛋白定量操作。

按照下表稀释牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(0.22mg/mL)

表3稀释牛血清白蛋白(BSA)标准溶液

将各体积的标准样品加入酶标板中，用无菌水补至20μL，加入200μL的考马斯亮蓝染液，室温静置10～20min，用酶标仪测定各样品在595nm处的吸光值，记录读数，重复此操作3次，保证数据准确。以不含有BSA的样品的吸光值作为空白对照，绘制蛋白浓度标准曲线。按照上述方法计算蛋白浓度，如得到的蛋白浓度不在标准曲线之内，建议稀释样品重新测定。

注意事项：

考马斯亮蓝G-250与石英比色皿可产生强烈的结合，可使用玻璃或者塑料比色皿；

按蛋白浓度由低到高的顺序进行测定，勿反复清洗比色皿，水质会影响测定结果；

反应5～20min之内的吸光值最稳定，保持各管的反应时间一致，最好在同一时间内测量，保证读数准确；

标准曲线的绘制可分为2～3组，做平行操作，以获得更准确的结果。No.1.3.4Western Blot检测

(1)取样品5ul，依次上样，进行SDS-PAGE电泳，先100V电压下跑30min浓缩胶，待样品已进入分离胶，再120V电压下跑至电泳结束。

(2)PVDF膜在100％甲醇中浸泡30s；按照“海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵”的顺序由负极到正极依次摆放入转膜槽，倒入转膜缓冲液；在200V电压下转膜2h，恒流150mA。

(3)转膜结束后，将PVDF膜放入1×TBST缓冲液中洗涤3次，每次5min。

(4)将PVDF膜置于含有5％的脱脂奶粉的封闭液中室温封闭1h。

(5)从封闭液中取出PVDF膜，放入1×TBST缓冲液中洗涤3次，每次5min；用封闭液稀释一抗(His，1:2000)，膜放入一抗稀释液中，置于摇床4℃孵育2h。

(6)将PVDF膜从一抗中取出，放入1×TBST缓冲液中洗涤3次，每次5min；用含5％的脱脂奶粉的封闭液稀释二抗(羊抗鼠，1:1000)；膜放入二抗稀释液中，置于摇床室温孵育1h。

(7)将PVDF膜取出，放入1×TBST缓冲液中洗涤3次，每次5min。

(8)将ECL显影液的A液和B液按照1：1的比例混合，使膜充分接触显影液。

(9)凝胶成像分析。

No.1.3.5Y5468蛋白抑制真菌的功能分析

No.1.3.5.1蛋白对禾谷镰刀菌菌丝发展的影响

(1)PDA平皿法验证Y5468蛋白对禾谷镰刀菌菌丝伸展的影响

1)诱导蛋白表达

步骤同前述相同实验的步骤。

2)SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况

步骤同前述相同实验的步骤。

3)超声波破碎细胞

离心，弃上清，收集过夜诱导的大肠杆菌，以1g湿重菌体加入5mL无菌水的比例重悬菌体，于低温条件下以最大功率50W、破碎时间5s、间歇时间3s超声波破碎细胞，直至菌体澄清不粘稠。离心收集粗蛋白上清，并保存于-20℃冰箱。

4)蛋白定量

按照2.6.4.3(2)的方法进行粗蛋白定量。

5)PDA平皿法验证Y5468蛋白对禾谷镰刀菌菌丝发展的影响

按照每25mL培养基加入200μL粗蛋白的用量(粗蛋白浓度：471～540μg/mL)将pET-32a(+)、Y5468的粗蛋白上清加入融化的PDA培养基，混匀后倒板。待培养基凝固后，在培养基中央放置一块直径8mm的禾谷镰刀菌菌饼，于25℃倒置培养。本实验设置3次重复。

(2)离体叶片接菌法验证Y5468蛋白对禾谷镰刀菌菌丝发展的影响

方法参照孔令让等(2016)，选取若干一叶一心的小麦叶片，剪下长度为5cm的叶片中间部分，用打孔器或移液器枪尖在叶片上表面中间造成直径为1mm²的圆形伤口。将由5μL粗蛋白和1μL的禾谷镰刀菌分生孢子液制成的蛋白-孢子混合液滴加在叶片中央的圆形伤口上。将叶片两端插入保湿鉴定板中，使叶片呈拱形立于鉴定板，使圆形孔处于拱形顶部。最后，将鉴定板置于25℃恒温培养箱培养3d。培养结束，观察圆形孔部位的感菌情况，分析蛋白对赤霉病的抗性。

No.1.3.5.2蛋白对白粉病菌侵染小麦叶片的影响

(1)纯化的目的蛋白涂抹YN15(烟农15)小麦叶片

选取长至一叶一心的YN15小麦叶片中间5cm部分，并用马克笔标记出该区域。取部分纯化后保存于-80℃的纯化的目的蛋白，经肠激酶酶切(酶切条件：每300μL浓度为241～252μg/mL的纯化蛋白，加入0.06U的重组肠激酶，于25℃金属浴中恒温酶切16h)后，加入终浓度为0.025％的吐温，混匀后，用棉签沾取蛋白涂抹于叶片标记区域，叶片正反两面都要涂抹均匀。每个蛋白做多个重复。将涂抹完的YN15小麦放置于温度23℃、光照16h/d的培养箱中。

(2)基于Photoshop软件分析YN15小麦叶片感病情况

参照李任辉等(2016)的方法。根据白粉侵染区域与正常绿色叶片区域的比值等于白粉侵染区域和正常绿色叶片区域的像素比，用手机相机拍摄蛋白涂抹5d后的YN15小麦叶片的图像，在Photoshop软件上分别得到白粉侵染区域和正常绿色叶片区域的像素，以及二者像素之和，即叶片总像素。通过比较白粉侵染区域的像素和叶片总像素的比值，分析蛋白对白粉病菌侵染小麦叶片的影响。

(3)显微镜下观察YN15小麦叶片感病情况

1)YN15小麦叶片的脱色、染色

将待观察的小麦叶片用脱色液浸泡过夜，用灭菌水漂洗2次，放入染色液中染色15～30min，用无菌水反复冲洗多次，即可观察，或者存放于保存液中，最多可保存3d。

2)显微镜下观察YN15小麦叶片感病情况

取出待观察叶片，平展的铺于载玻片上，置于显微镜的载物台上，在4倍物镜下观察叶片并拍照。

No.2试验结果与分析

No.2.1Y5468蛋白的表达和纯化

将公司制备完成的重组质粒转化BL21(DE3)plysS表达菌株，经测序之后，将序列验证正确的含重组质粒的菌株自诱导蛋白表达。自诱导蛋白表达条件为：在200rpm、37℃的恒温振荡器中，含重组质粒的表达菌株在自诱导培养基中呈对数生长至OD600值为0.6～1时，将振荡器温度降至25℃，乳糖进入细胞诱导蛋白表达。待诱导表达结束后，取部分菌体加入适量蛋白提取液，进行12％的SDS-PAGE电泳，检测蛋白表达情况。经初步的电泳检测到目的蛋白在菌体上清中高表达后，收集菌体，超声破碎，将离心收集的破碎后的粗蛋白上清，通过特异吸附His标签蛋白的海狸磁珠纯化目的蛋白。再次进行12％的SDS-PAGE电泳检测蛋白表达以及纯化效果。根据DNAMAN软件预测出pET-32a(+)标签蛋白、Y5468目的蛋白分子量分别为22kD和25kD，观察到图4和5的目的条带的大小与预测的蛋白分子量基本一致，表明目的蛋白表达成功，纯化效果良好。根据图6的蛋白定量标准曲线测得pET-32a(+)、Y5468纯化目的蛋白的浓度分别是252μg/mL、259μg/mL，测得pET-32a(+)标签蛋白、Y5468粗蛋白浓度分别是540μg/mL、532μg/mL。

通过Western blot检测纯化后的目的蛋白和经肠激酶酶切后的目的蛋白，结果显示条带大小与预期一致。因酶切后的目的蛋白与His标签蛋白分离，所以PVDF膜上无法显示酶切后的目的蛋白的杂交信号，只有目的蛋白前段的His标签蛋白的杂交信号(图7)。

No.2.2蛋白的功能验证

No.2.2.1蛋白对禾谷镰刀菌菌丝发展的影响

(1)PDA平皿法验证蛋白功能

通过将粗蛋白按一定浓度加入PDA培养基中，培养基中央放置一块直径8mm禾谷镰刀菌菌饼，倒置放在25℃培养箱培养5日，观察到与加入了pET-32a(+)蛋白的培养基相比，Y5468粗蛋白对培养基中央的禾谷镰刀菌有延缓菌丝扩展速度的作用(图8、9)。

(2)离体叶片接菌法验证蛋白功能

将粗蛋白与禾谷镰刀菌分生孢子悬液按一定比例混匀，取2μL蛋白孢子混合液滴加在YN15小麦叶段中心的贯穿孔上。处理好的叶片呈拱形放置在保湿鉴定板上，在25℃培养箱中封闭培养3日。通过观察可见，添加Y5468蛋白的小麦叶片比滴加了pET-32a(+)标签蛋白的叶片感病轻(图10，图11)。

No.2.2.2蛋白对白粉病菌侵染小麦叶片的影响

将纯化后的目的蛋白用肠激酶酶切，以0.025％的吐温作为表面活性剂，涂抹于一叶一心的YN15小麦叶片中段，正反两面反复涂匀，确保蛋白充分接触叶片。将处理完毕的小麦安置在恒温白粉培养箱中接种白粉病菌。5日后，观察到涂抹了Y5468蛋白的小麦叶片未感菌或感病轻，而涂抹了空载体蛋白的叶片和未涂抹蛋白的区域感病重，证明Y5468蛋白有抑制白粉病菌侵染小麦叶片的作用(图12)。

通过Photoshop软件计算出蛋白涂抹后的感染白粉病的叶片区域像素和叶片总像素之比，比较叶片感病程度。可见涂抹了空载体蛋白的叶片感病严重，感病区域与全叶段的比值达到13％，而涂抹了Y5468的叶片仅为0.92％。，抑制白粉病侵染效果较好(图13)。

通过小麦叶片脱色、染色和显微镜下观察可见，涂抹了目的蛋白的叶片感染白粉病菌较涂抹了空载体蛋白和未涂抹区域要轻，菌丝少。表明Y5468蛋白对抑制白粉病菌侵染的作用明显(图14)。

经基因合成、载体构建、蛋白原核表达、PDA平皿试验和离体叶片试验证明目的蛋白能够抑制禾谷镰刀菌菌丝的发展，抑制白粉病菌的侵染。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种抗真菌的抗菌肽及其应用

<140> 2019104949850

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 312

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagagga aggcggtgtg catctctctt gtcatcttcg cgctcgtatt gttcgctggc 60

ccggacccag tggccgcggc ggtctacagc gtgggcgagg tggtgatgcc aatgtcaccg 120

tccttgaggc tggaggacag cgtgtcgccg gagctcgggg tggacctgga cgtgcaccac 180

cgcgtcttcg gcgacgtcgg caagggagcc ctggacccca acaagtcagc ctgcaagccg 240

aagtgcgccg gggacggaca gccgtacacc ggccggggat gccaagccat ttacggttgc 300

gtccctaaat aa 312

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Arg Lys Ala Val Cys Ile Ser Leu Val Ile Phe Ala Leu Val

1 5 10 15

Leu Phe Ala Gly Pro Asp Pro Val Ala Ala Ala Val Tyr Ser Val Gly

20 25 30

Glu Val Val Met Pro Met Ser Pro Ser Leu Arg Leu Glu Asp Ser Val

35 40 45

Ser Pro Glu Leu Gly Val Asp Leu Asp Val His His Arg Val Phe Gly

50 55 60

Asp Val Gly Lys Gly Ala Leu Asp Pro Asn Lys Ser Ala Cys Lys Pro

65 70 75 80

Lys Cys Ala Gly Asp Gly Gln Pro Tyr Thr Gly Arg Gly Cys Gln Ala

85 90 95

Ile Tyr Gly Cys Val Pro Lys

100

Claims (1)

1.一种抗菌肽的应用，其特征在于：所述抗菌肽由 SEQ ID NO.2 中第 27-103 位氨基酸残基组成，所述应用为抑制禾谷镰刀菌和/或小麦白粉病。

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