CN101591384A

CN101591384A - 一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101591384A
Application number: CNA2008101246554A
Authority: CN
Inventors: 夏冰; 汪仁; 李晓丹; 江玉梅; 彭峰; 王春燕; 何丽斯
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2009-12-02
Anticipated expiration: 2028-08-28
Also published as: CN101591384B

Abstract

本发明提供了一种来源于石蒜的与抗真菌类病害相关的PR蛋白及其编码基因，将该基因或与之同源的编码相同功能蛋白的DNA序列导入大肠杆菌，诱导并纯化出活性蛋白，将该蛋白至于培养基上能有效的抑制稻瘟病等真菌类病菌的繁殖生长。本发明的蛋白及其编码基因对于植物抗真菌类病害机制的研究，以及提高植物的抗病性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物的抗病基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

Description

一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物在受到被真菌侵染后会表现出广泛的、长时间的系统性抗性，并积累一些新的蛋白质，称为病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins)，简称PR蛋白。PR蛋白不仅仅由病原体诱导，机械损伤、真菌细胞壁诱导物、乙烯、紫外线和重金属等同样可诱导其表达。PR蛋白大致分为14种。PR4蛋白是众多PR蛋白中的一种，分子量较小，一般认为其具有抗真菌的功能。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球有近一半的人口以大米为主食。在水稻生产中，稻瘟病是由真菌Magnaporthe grisea Barr.(无性态：Pyricularia grisea Sacc.)引起的水稻重大病害之一。稻瘟病的爆发严重影响水稻产量，全球每年因稻瘟病危害所引起的损失在50亿美元以上。我国南北稻区每年均受到不同程度危害，流行年份重病地区一般减产10％-20％，重的达40％-50％，局部田块甚至颗粒无收。实践证明，抗病品种的利用是控制该病最经济有效而又不污染环境的措施。

目前对抗稻瘟病基因的克隆仅局限于水稻中，而石蒜科植物作为一类抗病虫性良好的植物资源，在野外及生产栽培中均没有观察到其病虫害的发生，其可作为抗病虫害基因克隆的合适材料。目前，在实验研究及育种实践中广泛应用于防治稻飞虱、棉花蚜虫等虫害的凝集素基因(GNA)即最先来自于石蒜科雪花莲属植物。

本发明通过LrPR4基因的原核表达，获得活性蛋白，同时抑菌实验发现该基因所编码的蛋白对稻瘟病的几个常见生理小种(ZB₁₃、ZD₁、ZF₁和ZG₁)均有抗性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因。

本发明的石蒜PR4蛋白的基因由429个碱基组成，含一个完整的开放阅读框架，为序列表中的1号序列，将此基因命名为LrPR4。

本发明的石蒜PR4蛋白由142个氨基酸残基组成，为序列表中的序列2。其中第1-22位氨基酸为信号肽。开放读码框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。LrPR4蛋白的理论分子量为15.78Da，等电点为7.56。

含有上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸的载体，以及用上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞，均是本发明需要保护的内容。

本发明基因的发现，使通过转基因来控制稻瘟病成为可能，对于培育抗稻瘟病的转基因水稻具有重要意义。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为石蒜总RNA

图2为LrPR4基因全长PCR扩增产物

图3石蒜PR4蛋白序列与其它高等植物的PR4蛋白序列比对结果

图4为原核表达载体pET29-LrPR4的构建流程图

图5为载体pET29-LrPR4的酶切图谱

图6为诱导不同时间蛋白表达SDS-PAGE电泳图谱

图7为原核表达的LrPR4蛋白的平板抑菌实验

具体实施方式

实施例1、基因LrPR4的克隆

克隆LrPR4，具体步骤如下：

一、LrPR4基因中间片段的获得

石蒜在正常条件下栽培，并使用茉莉酸诱导，从材料中提取mRNA，利用RT-PCR技术进行聚合酶链式反应，最终获得LrPR4基因中间片段的获得。

1、总RNA的提取

1)在液氮冷冻条件下充分研磨，将样品转入预冷的离心管，并称重，保证样品在150-200mg之间，迅速加入1ml Trizol，在涡旋器上迅速混匀(小心防止离心管盖胀开)。

2)室温下保温5分钟后，裂解蛋白复合体。然后每管加0.2ml氯仿，剧烈震荡15秒，室温放置2-3分钟，4℃下12,000g离心15分钟。

3)转移上清到新管，加0.5mI异戊醇，混匀。室温放置10分钟后，4℃下12,000g离心10分钟。

4)弃去上清，每管加至少1ml 75％的乙醇后，振荡，洗涤沉淀。4℃下7,500g离心5分钟。

5)室温干燥5-10min，加入20μl Rnase-free的无菌水溶解沉淀，重溶沉淀，存于-20℃。

6)1.2％凝胶电泳检测。紫外观察，有三条清晰的带，结果表明得到总RNA没有降解(图1)。

将的总RNA进行反转录合成第一链，按以下成分调和第一链合成反应液：

1.0μl 接头引物

6.0μl RNA

1.0μl dNTP

5.0μl DEPC-H₂O

65℃，5min，冰上冷却，瞬时离心。然后加入

5 X buffer 4.0μl，

RNase抑制剂 1.0μl，

AMV 1.0μl

轻轻混匀，37℃，60min。保存于-20℃。

注：AP序列来自Gibco公司的3’RACE System for Rapid Amplification ofcDNA Ends试剂盒。其序列为：AP：

5’-ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt-3’。反应得到第一链cDNA。

通过对GenBank(http://www.ncbi.nlm，nih.gov/)中拟南芥，水稻，烟草等14种植物的PR4基因核普酸序列采用ClustalW生物软件进行多重序列比较，在保守序列处设计简并引物，如图2。

LrPR4-F1：5’-gcntwytgyg chacntggga ygc-3’

LrPR4-F2：5’-aartayggmt ggacbgcntt ctg-3’

LrPR4-R1：5’-tcyarrtcma rsccnccrtt-3’

LrPR4-R2：5’-cartyracra aytsrtagty gac-3’。

以上述得到的第一链cDNA为模板，以LrPR4-F1和LrPR4-R2为引物，通过RT-PCR进行扩增，扩增反应体系为：

2.0μl(2.0μg) cDNA

13.3μl H₂O

0.5μl(10mM each) dNTP

2.0μl 10 X PCR buffer

0.2μl(5U/μl) ExTaq DNA polymerase

1.0μl(10nM) 引物LrPR4-F1

1.0μl(10nM) 引物LrPR4-R2

按以下程序进行扩增反应：先94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃ 延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。电泳检测PCR产物，有一大小约为250bp的条带，与理论值相符。再以上一轮扩增产物为模板，以LrPR4-F2和LrPR4-R1为引物，相同条件下扩增，电泳检测有一大小约为150bp的条带，与理论值相符。

回收150bp的条带，将该DNA中间片段连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌DH5，经测序后在GenBank中进行Blastn比较，结果表明，该cDNA与多种植物PR4基因有较高的同源性，因此推测所扩增的DNA为一个LrPR4基因片段。测序后进行BLAST检索，结果表明已分离得石蒜PR4基因的部分序列。

二、石蒜cDNA文库的构建

根据Clontech公司Creator SMART cDNA Library Construction Kit的操作程序。至此，构建成了一个两端含有接头的石蒜cDNA文库。

三、LrPR4基因全长的获得

根据获得的PR4基因中间片段核酸序列，设计保守引物LrPR4-Fp和LrPR4-Rp，如图2，序列如下：

LrPR4-Fp：5’-ggcagaagta cggaggacc-3’

LrPR4-Rp：5’-agatggcctt gagcataacc-3’

用排除法得到含有一定数量阳性单克隆的最小克隆群体，从中直接挑选单个单克隆做PCR验证，对有阳性信号的单克隆，进一步提取其质粒DNA做PCR再验证，以去除假阳性单克隆；然后对阳性单克隆的质粒DNA进行酶切验证后，测序，blast结果表明已分离得石蒜PR4基因的全长，全长扩增图谱见图2。

四、LrPR4蛋白的同源性分析及二级结构分析

为了将石蒜PR4的蛋白序列与其它高等植物的PR4基因编码的蛋白进行同源性分析，从NCBI网站上检索到拟南芥(Arabidopsis thaliana)，辣椒(Capsicumannuum)，大麦(Hordeum vulgare)，水稻(Oryza sativa)，小麦(Triticumaestivum)，烟草(Nicotiana tabacum)，葡萄(Vitis vinifera)等植物同源基因的蛋白序列。通过DNAMAN软件分析结果表明：石蒜PR4蛋白氨基酸序列与葡萄中PR4蛋白氨基酸序列的同源性达70％，与其它几种植物的同源性在40％-60％左右，与拟南芥的PR4蛋白同源性最低，仅为41％。

序列比对结果显示PR4蛋白具有典型的barwin类蛋白特有的6个半胱氨酸保守结构，见图3。通过NCBI在线比对分析，预测其中第1-22氨基酸残基为信号肽。

实施例2，LrPR4基因的功能验证

一、LrPR4基因在大肠杆菌中的高效表达

为了表明LrPR4基因的编码功能，本发明将LrPR4基因克隆到novogen公司的pET29a(+)的Nde I和Xho I位点之间，并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了高效表达。

本发明是利用novogen公司的pET29a(+)高效表达载体的多克隆位点来实现LrPR4的高效表达的。本实验采用的酶切位点使pET29a(+)表达载体表达出的产物是3’端附加6个连续His的融合蛋白，这6个连续的His构成了Ni-NTA凝胶特异结合的位点，因此可利用亲和层析来纯化表达产物。设计并合成一对特异引物，按分子克隆常规实验程序用PCR扩增出两端带有特定酶切位点的基因编码序列，引物见图2：

PR4-nde-F：5’-ggcatatggc aatggagaga gtg-3’

PR4-xho-R：5’-ccctcgagac aattaacaaa ctggta-3’

基因和载体用相同的酶(Nde I和Xho I)酶切后，再连接，将连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，并用含50μg/ml卡那霉素的LB平板筛选重组子。载体的构建流程见图4。经质粒酶切鉴定(如图5所示)，1为质粒pET29-LrPR4用Nde I和Xho I酶切后，2为质粒pET29-LrPR4用Nde I酶切后，而3为质粒pET29(+)用Nde I酶切后，再经过PCR鉴定后，将筛出的连接正确的重组子进行测序，证明插入载体的DNA序列的阅读框架是正确的。把构建成带有LrPR4基因的表达载体，命名为pET29-LrPR4，用于诱导表达分析。

将筛选并经鉴定确认的重组子，接种于3ml LB(含50μg/ml卡那霉素)培养基中，37℃培养过夜，然后按5％比例接种到50ml LB培养液中，37℃继续培养至A600＝0.6，加入50μl 1M的IPTG溶液(IPTG终浓度为1mM)进行诱导，每1小时取1ml菌液离心收集菌体，按Qiagen公司提供的方法提取细胞总蛋白，进行12.5％ SDS-PAGE电泳检测，结果如图6所示，其中，I：含有质粒pET29a(+)的BL21；H：含有质粒pET29-LrPR4的BL21但未诱导；G，F，E，D和C分别为含有质粒pET29-LrPR4的BL21，IPTG诱导后1，2，3和4小时；B：超声波破碎IPTG诱导4小时后含有质粒pET29-LrPR4的BL21后的上清；A：超声波破碎IPTG诱导4小时后含有质粒pET29-LrPR4的BL21后的沉淀。从图中可以看出，LrPR4基因在BL21中得到了高效表达，且表达的蛋白为可溶性蛋白。

二、功能鉴定

采用平板对峙法。在酵母淀粉培养基(培养基配方：玉米粉40g，酵母抽提物2g，稻壳粉(米糠)20g，琼脂粉16g)平板中心首先接种稻瘟病菌丝块(直径1cm)，放置于28℃恒温箱内培养24h后，在平板的4个角点(距中心2.5cm)接种石蒜PR4蛋白粗酶液，再在28℃恒温箱中培养7d后观察，测量接种位置与稻瘟病菌落边缘之间的抑菌距离，试验重复3次，以无菌水为对照。

结果证实重组表达的石蒜PR4蛋白对稻瘟病几个常见生理小种(ZB₁₃、ZD₁、ZF₁和ZG₁)都有抑制作用(分别如图7A、B、C和D)，抗真菌实验验证了重组表达PR4蛋白的体外活性。

序列表

<110>江苏省中国科学院植物研究所

<120>一种抗植物真菌病害相关蛋白及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>429

<212>DNA

<213>石蒜(Lycoris radiate)

<400>1

atggcaatgg agagagtgag tcttgttatc gtgctcttgc ttggtctagc agcagcatca 60

tttgcgcagc aagcttcaaa tgttcgtgca acgtataata tttataatcc tgcgcaaaac 120

aattgggatc tcaataaagt tggtgcatac tgcgcaacgt gggacgccgg tcagccttta 180

tggtggaggc agaagtacgg atggaccgca ttctgcggac cagttgggcc gactggccaa 240

gcttcatgtg gcaggtgctt gctggtcact aaccaggcaa caggggcgcg acaaacggtt 300

agaatcatag accagtgctc aaatggggga ttggacttag atcaaggcgt ctttaaccaa 360

ttggacacta atggtcaagg ttatgctcaa ggccatctga ccgtcagcta ccagtttgtt 420

aattgttaa 429

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>石蒜(Lycoris radiate)

<400>2

Met Ala Met Glu Arg Val Ser Leu Val Ile Val Leu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Ser Phe Ala Gln Gln Ala Ser Asn Val Arg Ala

20 15 30

Thr Tyr Asn Ile Tyr Asn Pro Ala Gln Asn Asn Trp Asp Leu Asn

35 40 45

Lys Val Gly Ala Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Gly Gln Pro Leu

50 55 60

Trp Trp Arg Gln Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Val

65 70 75

Gly Pro Thr Gly Gln Ala Ser Cys Gly Arg Cys Leu Leu Val Thr

80 85 90

Asn Gln Ala Thr Gly Ala Arg Gln Thr Val Arg Ile Ile Asp Gln

95 100 105

Cys Ser Asn Gly Gly Leu Asp Leu Asp Gln Gly Val Phe Asn Gln

110 115 120

Leu Asp Thr Asn Gly Gln Gly Tyr Ala Gln Gly His Leu Thr Val

125 130 135

Ser Tyr Gln Phe Val Asn Cys

140 142

Claims

1、一种抗植物真菌类病害蛋白，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白：

1)序列表中的SEQ ID No：2；

2)将序列表中的SEQ ID No：2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且抗植物真菌类病的蛋白质。

2、根据权利要求1所述植物抗真菌类病害相关蛋白的编码基因，其特征在于：所述植物抗真菌类病害相关蛋白的基因cDNA，具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列；

2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白氨基酸序列的DNA；

3)与序列表中SEQ ID No：1的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。

3、含有权利要求2任一所述的基因的重组表达载体。

4、含有权利要求2任一所述的基因的转基因细胞系。

5、含有权利要求2任一所述的基因的工程菌。

6、权利要求1任一所述的蛋白在培育抗真菌类病害植物中的应用。

7、权利要求2任一所述的基因在培育抗真菌类病害植物中的应用。