CN116103315A - 一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，公开了一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用，三七病程蛋白基因PnPR4的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。三七病程蛋白基因PnPR4在提高三七对真菌抗性中的应用。应用验证方法包括：分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌对目的基因进行原核表达，并验证所述基因进行重组表达后的蛋白是否能抑制病原菌生长，为三七抗病育种中基因的选择应用提供了相应的参考。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，尤其涉及一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用。
背景技术
目前，三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]抗病品种少，在种植过程中易受根腐病危害，防治根腐过程中农药的使用会导致农药残留及重金属超标等诸多问题，使三七品质下降，不利于三七产业的可持续发展。三七抗病品种的选育是解决三七根腐问题的有效策略，抗病基因的挖掘是三七抗病育种的重要环节。
与多数植物一样，三七受到致病菌侵染后，一系列基因响应而上调表达，产生防御反应，其中一些基因与防御反应相关，包括病程相关蛋白(PR)和抑菌基因，病程相关蛋白(PR)的合成和积累已被证实在防御致病性感染中发挥重要作用。根据PR蛋白的结构和功能，PR蛋白被分为17个家族，存在于单子叶植物和双子叶植物中。其中PR-4蛋白是病程相关蛋白中的一类，PR-4蛋白(13-16kDa)最初被归为内几丁质酶。这类蛋白包含三个分子内二硫键和一个保守的c结构域BARWIN结构域。根据PR4蛋白质n端富含半胱氨酸区域的存在，被细分为两类。I类PR-4蛋白在保守的n端部分有一个富含半胱氨酸的几丁质结合域(称为hevein域)，这种结构可使蛋白质与病原体几丁质结合，这解释了它们抗真菌的能力。II类PR-4蛋白不含几丁质结合域，功能多样化，涉及生物和非生物胁迫，在多种植物中都已分离得到。
三七根腐病主要通过施用化学农药进行防治，对药材品质和安全性有一定程度的影响；现有技术尚没有利用三七病程蛋白基因PnPR4进行三七根腐病抗性增强的方法。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术尚没有利用三七病程蛋白基因PnPR4增强三七根腐病抗性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种三七病程蛋白基因PnPR4及其应用。
本发明是这样实现的，一种三七病程蛋白基因PnPR4，所述三七病程蛋白基因PnPR4的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
进一步，所述三七病程蛋白基因PnPR4包含完整的开放阅读框，编码为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明的另一目的在于提供一种所述三七病程蛋白基因PnPR4在提高三七对真菌抗性中的应用。
进一步，所述真菌包括：草茎点霉(Phoma herbarum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusarium solani)、毁灭柱孢菌(Ilyonectria destructans)。
本发明的另一目的在于提供一种验证方法包括：
分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌对目的基因进行原核表达，并验证所述基因进行重组表达后的蛋白是否能抑制病原菌生长。
进一步，所述验证方法包括以下步骤：
步骤一，采用RNA提取试剂盒提取三七的总RNA，以提取的所述三七的总RNA为模板，进行逆转录，通过逆转录聚合酶链式反应将所述三七的总RNA逆转录为cDNA，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆；
步骤二，设计带有和载体具有相同位点的同源臂引物，从有目的基因的pGEM-T载体中扩增，并将扩增产物通过同源重组连接到原核表达载体pET-32a中；
步骤三，pET-32a-PnPR4重组质粒插入E.coliBL21细胞，诱导产生重组蛋白并进行所述重组蛋白的纯化；分析重组蛋白体外抑菌效果。
进一步，所述步骤一中，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆，包括：
利用PnPR4基因CDS序列设计引物从cDNA中扩增出PnPR4基因编码区，并将所述PnPR4基因编码区连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。
进一步，所述步骤三中，诱导产生重组蛋白并进行所述重组蛋白的纯化包括：
利用0.5mmol/L异丙基β-d-硫代半乳糖苷诱导产生重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析柱纯化PnPR4重组蛋白。
进一步，所述步骤三中，分析重组蛋白体外抑菌效果包括：
将毁灭柱孢菌、草茎点霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌在28℃平板PDA培养基上培养，直到菌落直径达到2cm；在菌落周围放置多个无菌滤纸盘，分别用10、15和20μg重组蛋白溶液润湿，并将平板在28℃培养箱培养3-5天，确定重组蛋白对真菌生长的抑制作用并计算抑制面积。
本发明的另一目的在于提供一种所述三七病程蛋白基因PnPR4在制备增强三七根腐病抗性药物中的应用。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。
本发明主要从三七中克隆出PnPR4蛋白基因，利用大肠杆菌进行原核表达，并通过体外平板抑菌试验验证了该基因重组蛋白的抑菌活性。
具体描述如下：
本发明利用三七病程蛋白基因PnPR4原核表达及体外平板抑菌试验验证了该基因重组蛋白的抑菌活性，证明了其在后续抗病育种中的价值。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：克隆并验证一个具有抑制三七根腐病病原真菌活性的PnPR4基因，为后续三七抗病育种提供相应的参考基因及技术支持。
附图说明
图1是本发明实施例提供的应用验证方法流程图；
图2是本发明实施例提供的PnPR4基因在毁灭柱孢侵染叶片中的相对表达变化示意图；
图3是本发明实施例提供的PnPR4基因在不同年份不同部位三七组织中的相对表达变化示意图；
图4是本发明实施例提供的PnPR4基因，在根腐后的二年生三七中的相对表达变化示意图；
图5是本发明实施例提供的PnPR4基因在不同根腐程度的三七根部PnPR4基因表达量变化示意图；
图6是本发明实施例提供的PnPR4基因在茉莉酸甲酯处理后一年生三七叶片中PnPR4基因表达量变化示意图；
图7是本发明实施例提供的pET-32a-PnPR4重组蛋白诱导结果SDS-PAGE胶图；图中：M为蛋白MARKER，1为pET-32a空载，2为0.5mMIPTG小量诱导PnPR4-pET-32a重组蛋白6h，3为包涵体破碎后的上清液，4为包涵体破碎后的沉淀，5为包涵体破碎后上清液过柱，6为包涵体增容液过柱，7为洗脱液I(50mM)咪唑过柱洗脱结果，8为洗脱液II(100mM咪唑)过柱洗脱结果，9为洗脱液III(100mM咪唑)过柱洗脱结果；
图8是本发明实施例提供的体外平板抑菌结果示意图；图中从左到右依次为草茎点霉(Phoma herbarum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、毁灭柱孢菌(Ilyonectria destructans)；
图9是本发明实施例提供的平板抑菌试验结果面积计算结果示意图；“*”表示与buffer相比具有显著差异。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
本发明实施例提供的三七病程蛋白基因PnPR4从三七中克隆得到，三七病程蛋白基因PnPR4核苷酸序列如SEQ ID NO:1：
atgcaagttg tacacataaa aatgaagacg gagactttat gtttagtgtt cttgttctgt
ttagttgccg gggcagctgc acaaagtgca tcaaacgtac gcgccacgta caatatctac
cagccggaga atattgggtg ggactataat actgctaggg tatattgcgc aacgtgggat
gctggtaagc cccttgcatg gcggagaaag tacggatgga ccgccttctg tggtcccgtc
ggacctcgtg gccaggcttc ctgtggcagg tgcttaaagg ttactaacac cgccacgaac
acttttgtaa ctgtgagaat cgtcgaccag tgcagcaatg gcggcctgga tctggatgtt
ggcgttttcc ggcaactgga cagagatgga aggggtaatg ctcgaggctt tctcacggtg
aactacgaat ttgtgaactg cggagactga。
本发明实施例提供的三七病程蛋白基因PnPR4蛋白质编码区段全长序列为450bp，包含完整的开放阅读框，编码如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。本发明实施例提供的三七病程蛋白基因PnPR4有2个外显子，其编码区被1个长度为987bp的内含子打断。编码的蛋白质分子量为16.45kDa，由149个氨基酸残基组成，如下：SEQ ID NO:2：
Met Gln Val Val His Ile Lys Met Lys Thr Glu Thr Leu Cys Leu Val Phe
Leu Phe Cys Leu Val Ala Gly Ala Ala Ala Gln Ser Ala Ser Asn Val Arg
Ala Thr Tyr Asn Ile Tyr Gln Pro Glu Asn Ile Gly Trp Asp Tyr Asn Thr
Ala Arg Val Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ala Gly Lys Pro Leu Ala Trp Arg
Arg Lys Tyr Gly Trp Thr Ala Phe Cys Gly Pro Val Gly Pro Arg Gly Gln
Ala Ser Cys Gly Arg Cys Leu Lys Val Thr Asn Thr Ala Thr Asn Thr Phe
Val Thr Val Arg Ile Val Asp Gln Cys Ser Asn Gly Gly Leu Asp Leu Asp
Val Gly Val Phe Arg Gln Leu Asp Arg Asp Gly Arg Gly Asn Ala Arg Gly
Phe Leu Thr Val Asn Tyr Glu Phe Val Asn Cys Gly Asp。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明的应用实施例将三七病程蛋白基因PnPR4进行克隆及原核表达，体外验证PnPR4基因重组蛋白对草茎点霉、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、毁灭柱孢菌的抗性，最终获得一个具有抑菌作用的PnPR4基因。
如图1所示，本发明实施例提供的应用验证方法包括：
S101，采用RNA提取试剂盒提取三七的总RNA，以提取的所述三七的总RNA为模板，进行逆转录，通过逆转录聚合酶链式反应将所述三七的总RNA逆转录为cDNA，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆；
S102，设计带有和载体具有相同位点的同源臂引物，从有目的基因的pGEM-T载体中扩增，并将扩增产物通过同源重组连接到原核表达载体pET-32a中；
S103，pET-32a-PnPR4重组质粒插入E.coli BL21细胞，诱导产生重组蛋白并进行所述重组蛋白的纯化；分析重组蛋白体外抑菌效果。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
本发明克隆了三七病程相关蛋白基因PnPR4，通过原核表达出该蛋白，通过体外平板抑菌试验验证该基因重组蛋白抑菌活性，结果表明，该基因重组蛋白具有抑菌活性，对草茎点霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌、毁灭柱孢菌的生长具有抑制作用。该基因有望利用在三七抗病育种中，构建该基因的超表达植株，提高三七对上述真菌的抗性。
本发明实施例提供的三七病程蛋白基因PnPR4的编码区段是序列SEQ ID NO:1中第1-450位所示的核苷酸序列。
本发明实施例分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌(Escherichia coli)对目的基因进行原核表达，并通过进一步试验验证该基因进行重组表达后的蛋白是否具有抑制病原菌生长的功能，具体步骤如下：
(1)PnPR4基因克隆及序列分析
三七样品提取总RNA，用液氮将三七样品磨成粉末，装入离心管中，采用magenRNA提取试剂盒提取总RNA，采用宝生生物公司反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit(TAKARA RR047A)进行逆转录反应，反应体系跟操作过程为：取1μg总RNA，依次加入2.0μL5×gDNA Eraser Buffer，1.0μL gDNA Eraser，加入RNase Free dH2O到10μL，42℃反应2min或室温放置5min，反应完成后放在冰上，分别加入1.0μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，1.0μL RT Primer Mix，4.0μL 5×PrimeScript Buffer 2(forRealTime)，4.0μL RNaseFree dH2O，37℃反应15min，85℃反应5s，放入-20℃保存待用。
以合成的cDNA为模板，扩增目的基因片段，所用上下游引物如SEQ ID NO:7：5'atgcaagttgtacacat3'5'tcagtctccgcagttcac3'，采用PCR克隆，反应条件为94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、60s，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，取4μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性及大小。对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-TVector SystemⅠ(Promega，USA)，反应体系和操作过程为：取1.5μL PCR产物，依次加入1μLpGEM-T Vector(50ng/μL)和2.5μL 2×Ligation solutionI，混匀后置于16℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中；使用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用通用引物鉴定出插入的PnPR4克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的PnPR4 cDNA与预测的CDS序列完全一致，总长450bp，为完整的开放阅读框，编码含149个氨基酸残基的蛋白质，分子量为16.45kDa。PnPR4编码的蛋白质序列具有BARWIN保守蛋白结构域，表明其属于三七PR4基因。
(2)PnPR4表达分析
对PnPR4基因进行表达分析，所用上游引物为SEQ ID NO:3：5'gttcttgttctgtttagttgccg3'以及所用下游引物为SEQ ID NO:4：5'catccgtactttctccgcc3'，使用诺唯赞SYBRqPCRmix酶，在QuantStudioTMDesign&AnalysisSoftware系统上进行反应分析，反应条件为预变性30s，进入循环反应，95℃变性10s，60℃反应30s，进行40个循环的循环反应，再进行溶解曲线反应，95℃反应15s，60℃反应60s，95℃反应15s。反应体系为1μLcDNA，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，10μLSYBRqPCRmix酶，8μLddH2O，qPCR结束后，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
(3)原核表达载体构建
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入PnPR4的大肠杆菌质粒pGEM-T-PnPR4以及原核表达载体pET-32a的质粒，取1μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；以质粒pGEM-T-PnPR4为模板，利用带有同源臂的特异性引物扩增基因，引物序列为SEQ ID NO:5：5'acgacgacaaggccatggctgatatccaaagtgcatcaaacgtacg3'及SEQ ID NO:6：5'gcaagcttgtcgacggagctcggaattccgtctccgcagttcacaaat3'，使扩增后的基因片段带有与pET-32a载体有相同的位点；利用限制性内切酶EcoRV(Takara)对蛋白表达载体进行单酶切，利用同源重组将PnPR4基因编码区片段与酶切后的pET-32a载体相连。反应体系如下：依次加入pET-32a(+)1μg，EcoV 1μl，10XBuffer 1μl，ddH2O Up to 10μl，30℃保温5min进行酶切。用同源重组酶(B632219-0020，BBI)连接酶切载体胶回收产物与目的基因片段，获得原核表达重组载体pET32a-PnPR4，反应体系如下：目的基因片段50ng，酶切载体100ng，同源重组酶2.5μl，ddH2O To 5μl，50℃水浴20min。得到的重组载体pET32a-PnPR4放入-20℃保存备用。
(4)原核表达及体外平板抑菌
将pET-32a-PnPR4重组质粒转入E.coliBL21细胞，按2％接种量到500mL对应抗性LB液体培养基，37℃活化3-4小时，使OD值达到0.5-0.6，用0.5mmol/L异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导6h，将菌体进行破碎得到包涵体沉淀，将沉淀中的包涵体进行破碎，收集上清液与沉淀，利用Ni-NTA柱对蛋白质进行收集洗脱。本发明中使用的4种真菌：毁灭柱孢菌(Ilyonectriadestructans)、草茎点霉(Phomaherbarum)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)在28℃平板PDA培养基上培养，直到菌落直径达到约2cm。在菌落周围放置5个无菌滤纸盘(直径0.6mm)，用10、15和20μg重组蛋白溶液润湿。空白对照为20μL无菌水和洗脱缓冲液。平板在28℃培养箱培养3-5天，对重组蛋白的抑菌效果进行观察。
图2是PnPR4基因在毁灭柱孢侵染叶片中的相对表达变化示意图；
图3是PnPR4基因在不同年份不同部位三七组织中的相对表达变化示意图；
图4是PnPR4基因，在根腐后的二年生三七中的相对表达变化示意图；
图5是PnPR4基因在不同根腐程度的三七根部PnPR4基因表达量变化示意图；
图6是PnPR4基因在茉莉酸甲酯处理后一年生三七叶片中PnPR4基因表达量变化示意图；
图7是pET-32a-PnPR4重组蛋白诱导结果SDS-PAGE胶图；图中：M为蛋白MARKER，1为pET-32a空载，2为0.5mMIPTG小量诱导PnPR4-pET-32a重组蛋白6h，3为包涵体破碎后的上清液，4为包涵体破碎后的沉淀，5为包涵体破碎后上清液过柱，6为包涵体增容液过柱，7为洗脱液I(50mM)咪唑过柱洗脱结果，8为洗脱液II(100mM咪唑)过柱洗脱结果，9为洗脱液III(100mM咪唑)过柱洗脱结果；
图8是体外平板抑菌结果示意图；图中从左到右依次为草茎点霉(Phomaherbarum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、茄腐镰刀菌(Fusariumsolani)、毁灭柱孢菌(Ilyonectriadestructans)；
图9是平板抑菌试验结果面积计算结果示意图；“*”表示与buffer相比具有显著差异。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种三七病程蛋白基因PnPR4，其特征在于，所述三七病程蛋白基因PnPR4的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.如权利要求1所述三七病程蛋白基因PnPR4，其特征在于，所述三七病程蛋白基因PnPR4包含完整的开放阅读框，编码为SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。
3.一种如权利要求1-2任意一项所述三七病程蛋白基因PnPR4在提高三七对真菌抗性中的应用。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述真菌包括：草茎点霉、尖孢镰刀菌、茄腐镰刀菌、毁灭柱孢菌。
5.一种验证如权利要求3所述应用中提高三七对真菌抗性效果的方法，其特征在于，验证方法包括：
分离三七的一个病程相关蛋白基因的蛋白质编码区段，利用大肠杆菌对目的基因进行原核表达，并验证所述基因进行重组表达后的蛋白是否能抑制病原菌生长。
6.如权利要求5所述验证方法，其特征在于，所述验证方法包括以下步骤：
步骤一，采用RNA提取试剂盒提取三七的总RNA，以提取的所述三七的总RNA为模板，进行逆转录，通过逆转录-聚合酶链式反应将所述三七的总RNA逆转录为cDNA，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆；
步骤二，设计带有和载体具有相同位点的同源臂引物，从有目的基因的pGEM-T载体中扩增，并将扩增产物通过同源重组连接到原核表达载体pET-32a中；
步骤三，pET-32a-PnPR4重组质粒插入E.coli BL21细胞，诱导产生重组蛋白并进行所述重组蛋白的纯化；分析重组蛋白体外抑菌效果。
7.如权利要求6所述验证方法，其特征在于，所述步骤一中，基于所述cDNA进行PnPR4基因的克隆包括：
利用PnPR4基因CDS序列设计引物从cDNA中扩增出PnPR4基因编码区，并将所述PnPR4基因编码区连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。
8.如权利要求6所述验证方法，其特征在于，所述步骤三中，诱导产生重组蛋白并进行所述重组蛋白的纯化包括：
利用0.5mmol/L异丙基β-d-硫代半乳糖苷诱导产生重组蛋白；通过Ni-NTA亲和层析柱纯化PnPR4重组蛋白。
9.如权利要求6所述验证方法，其特征在于，所述步骤三中，分析重组蛋白体外抑菌效果包括：
将毁灭柱孢菌、草茎点霉、茄腐镰刀菌、尖孢镰刀菌在28℃平板PDA培养基上培养，直到菌落直径达到2cm；在菌落周围放置多个无菌滤纸盘，分别用10、15和20μg重组蛋白溶液润湿，并将平板在28℃培养箱培养3-5天，确定重组蛋白对真菌生长的抑制作用并计算抑制面积。
10.一种如权利要求1所述三七病程蛋白基因PnPR4在培育增强三七根腐病抗性植株中的应用。
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