CN109207483A - 西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用，本发明西瓜抗病蛋白ClTLP3，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该基因的开放阅读框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。将抗病基因Cltlp3克隆到pET‑28a(+)原核表达载体上，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行体外表达，获得抗病蛋白。抑菌试验表明抗病蛋白ClTLP3对尖孢镰刀菌西瓜专化型、葫芦尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、蔓枯病菌、轮枝镰刀菌等具有显著的抑制作用。ClTLP3蛋白能够作为生防制剂用于西瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病的防治，也可作为抗性标记用于西瓜及其砧木抗病品种的选育。

Description

西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用。

背景技术

西瓜是重要的经济作物之一，我国是西瓜生产与消费的第一大国。对西瓜市场及产业发展趋势分析表明，随着市场需求的增加，我国西瓜种植面积和总产量将继续保持稳中有升的发展趋势。而西瓜枯萎病是严重制约西瓜生产的主要病害之一，枯萎病是一类土传维管束系统病害，由尖镰孢菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起。根据西瓜枯萎病菌对不同鉴别寄主的抗感反应，现已鉴定出4种尖镰孢菌西瓜专化型的生理小种(0、1、2和3)(Zhou等，2010)。其严重危害可造成减产80％以上甚至绝产。

嫁接技术是生产上有效防治由尖孢镰刀菌西瓜专化型侵染引起的西瓜枯萎病的重要手段。然而，随着嫁接西瓜设施栽培面积的不断增加，近年来在我国不同地区，葫芦砧木嫁接西瓜田间发现嫁接植株发生了与枯萎病症状很相似的病害，根系在土壤中染病，根部及茎基部腐烂，叶片逐渐枯萎直至全株死亡的死秧现象，如2005年浙江省温岭市首次出现嫁接西瓜连片枯萎，7.3hm²嫁接西瓜全部死亡。随后，在河北、湖北等地嫁接西瓜田也发生了此类病害，致使西瓜产量和品质下降，造成经济损失。发病部位及症状主要在根及根茎部，俗称根腐病。

蔓枯病是一种真菌性病害，可为害多种葫芦科作物。西瓜蔓枯病在西瓜生长各个生育阶段均可发生，特别是中后期，是严重危害西瓜生产的另一真菌病害。在适宜的温度和湿度条件下，蔓枯病可迅速发展，造成严重的经济损失。据统计，一般田块发病率为15％～25％，严重时可高达60％～80％，致减产30％以上。

培育抗病西瓜新品种尤为必要而且迫切。传统育种是培育西瓜抗病新品种的根本途径，但西瓜遗传基础狭窄，加上优质抗病种质资源极少，限制了西瓜抗病育种的进程。2013年，西瓜基因组测序的完成为西瓜分子生物学的研究提供了便利(Guo等，2013)。采用分子生物学手段，研究抗病基因的功能及其在作物与病原菌互作过程中的调控机制，通过分子植物育种手段创制转基因抗病材料，为抗病新品种的培育提供了可能。

病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)是寄主与病原物互作过程中诱导产生的一类蛋白，不仅在受侵染的组织中积累，在整个植株中都有表达(Hamamouch等，2011)。目前已鉴定出17个不同的PRs蛋白家族，其中有许多具有抗真菌活性(ParvathaReddy，2013)。PR-5蛋白，也称为类甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLP)，是其中非常重要的蛋白之一。研究证明，TLP蛋白不仅能诱导真菌细胞程序性死亡，抑制真菌侵染；还能诱导植物细胞的程序性死亡，激活植物防卫反应信号途径，增强植物抗逆境能力。目前已经从小麦(栗小英等，2014)、大豆(Hayashi等，2014)、罗勒(Rather等，2015)、荔枝(王树军等，2015)、香蕉(李健平等，2015)、樱桃番茄(Guo等，2016)等多种植物中克隆到了TLP基因。研究发现，植物基因组中TLP以基因家族的形式出现，如拟南芥、杨树、水稻、玉米基因组中分别有24、49、44、49个TLPs基因(Cao等，2015)。

抗真菌活性是TLP蛋白主要生理功能之一。体外抑菌试验证明，TLP蛋白能够抑制多种植物病原真菌如尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、腐皮镰刀菌(F.solani)、轮枝菌(V.dahliae)、丝核菌(R.solani)、大麦云纹病菌(R.secalis)、炭疽病菌(C.gleosporoides)、链格孢菌(A.alternata)等的孢子萌发和菌丝生长(Wang等，2013；Singh等，2013；Rather等，2015；Guo等，2016；Rout等，2016)。TLP蛋白通过诱导孢子裂解、抑制孢子萌发、降低菌丝活力、消耗细胞膜势能等方式抑制真菌侵染(姜晓玲等，2012)。TLP蛋白的抗真菌活性可能与其具有β-1,3-葡聚糖酶活性有关。β-1,3-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，葡聚糖酶活性可以使TLPs结合并降解真菌细胞壁。但是并非所有的TLPs都具有抗菌活性，如大麦TLPs蛋白HvPR5b、Pr22-1和Pr22-2(Liu等，2010)、橡胶osmotin-like蛋白(Freitas等，2015)不能抑制真菌生长。TLP蛋白显著的抑菌活性，已广泛应用于植物抗真菌基因工程。大量研究表明，TLP基因在土豆(Acharya等，2013)、烟草(Singh等，2013)、栎树(Mallón等，2014)、拟南芥(Rout等，2016)等不同植物中的过量表达均显著提高了转基因植株的抗真菌能力。经过LePR5重组蛋白处理过的樱桃番茄，在接种链格孢菌5天后，黑腐病发病率比对照降低了49％(Guo等，2016)。

发明内容

本发明主要提供了一种西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用，编码得的ClTLP3蛋白能够作为生防制剂用于西瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病等的防治，也可作为抗性标记用于西瓜及其砧木抗病品种的选育。其技术方案如下：

一种西瓜抗病基因Cltlp3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

由所述西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一对用于扩增西瓜抗病基因Cltlp3的引物tlp3，其正向引物的核苷酸序列如SEQID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

一种表达载体，包含西瓜抗病基因Cltlp3。

优选的，所述的表达载体是将西瓜抗病基因Cltlp3插入pET-28a(+)载体制得。

一种西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过NcoI/XhoI双酶切，将pET-28a(+)载体线性化，将回收到的pET-28a(+)线性化载体片段与基因Cltlp3连接，构建制得pET-ClTLP3重组原核表达载体；

(2)将pET-ClTLP3重组原核表达载体用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，获得融合表达工程菌Rosetta(DE3)/pET-ClTLP3，将工程菌在2xYT培养基中培养并诱导蛋白表达，上清纯化后，即得到目的抗病蛋白。

西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白在增强植物对病原真菌抗性中的应用。

优选的，所述病原真菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株、葫芦尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、蔓枯病菌或轮枝镰刀菌。

采用上述方案，本发明具有以下优点：

(1)本发明利用枯萎病菌侵染不同时期西瓜转录组测序和蛋白质双向电泳数据，成功获得一个抗病蛋白基因Cltlp3，为利用生物信息学手段鉴定植物源抗病蛋白奠定了基础，提供了一种新的途径；

(2)本发明首次从西瓜基因组中克隆得到一种西瓜抗病蛋白ClTLP3编码基因Cltlp3，并验证了该基因的抑菌活性。抑菌试验结果表明原核表达纯化的西瓜抗病蛋白ClTLP3可以有效抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型、葫芦尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、蔓枯病菌和轮枝镰刀菌等病原真菌的生长；

(3)本发明Cltlp3基因从西瓜基因组中克隆得到，属于植物源的抗病基因，可以作为抗性标记用于西瓜抗病育种。

附图说明

图1为西瓜Cltlp3基因的PCR扩增图；

图2为融合表达载体pET-ClTLP3的酶切鉴定图；

图3为ClTLP3融合蛋白的体外表达纯化图；

图4为ClTLP3原核表达蛋白对病原真菌的抑菌活性图。

具体实施方式

申请人利用枯萎病菌侵染不同时期西瓜的转录组测序和蛋白质双向电泳数据，发现ClTLP3蛋白同时参与调控转录水平和蛋白水平西瓜对枯萎病菌的响应，预示ClTLP3在西瓜与枯萎病菌互作过程中发挥了重要作用。我们进一步对ClTLP3蛋白的基因序列进行克隆，通过TLP家族保守结构域分析和病原菌抑菌活性分析，发现ClTLP3能够显著抑制病原真菌的生长。

1.Cltlp3基因的克隆

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Matsum.&Nakai)品种‘苏蜜1号’由江苏省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究室提供。西瓜种子种植于灭菌的育苗钵，25-30℃，60％相对湿度的人工气候箱中培养，培养15d的幼苗用于枯萎病菌侵染。

根据枯萎病菌侵染不同时期西瓜的转录组测序和蛋白质双向电泳数据，筛选与抗病相关的基因，发现tlp基因的表达受到了枯萎病菌的显著诱导。以此tlp基因序列为探针，利用生物信息学的方法进行分析，设计Cltlp3基因开放阅读框(ORF)正向和反向引物，应用RT-PCR方法，以枯萎病菌侵染后的西瓜根cDNA为模板进行克隆，具体方法如下：

正向引物:5’-ATGGCGATCGCCTTCCTATC-3’(SEQ ID No.3)

反向引物:5’-CTAATGGCAGAAAATGACTTTAAGCTCACG-3’(SEQ ID No.4)；

取枯萎病菌侵染24h的西瓜根组织，置于液氮中研碎，RNA提取依据CWBiotech总RNA提取试剂盒RNAPure Plant Kit with DNaseI进行。cDNA第一链合成依据Biouniquer试剂公司cDNA第一链合成试剂盒BU-Superscript RT Kit，具体详见操作说明。以得到的cDNA片段为模板，用上述引物对进行PCR扩增反应。25μl PCR反应体系为：1μlcDNA第一链(0.05μg)、1μl引物(SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4，5μM)、12.5μl 2×PCR缓冲液、0.5U ExTaq DNA聚合酶，用超纯水补足25μl。反应在AB Applied Biosystems 9902型PCR仪上进行，其程序为94℃变性5min；94℃30sec，56℃40sec，72℃1min，共30个循环；然后72℃延伸10min；4℃保存。PCR产物回收后经连接pGEM-T easy载体(Promega)、转化大肠杆菌DH5α、蓝白斑筛选、摇菌、测序、序列分析结果表明PCR产物具有序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列，命名为Cltlp3。Cltlp3基因的PCR扩增见图1，其扩增条件为：M：标准DNA分子量(DL2,000DNAMarker)；ck1、ck2：水对照；Cltlp3：Cltlp3基因扩增。

2.Cltlp3原核表达载体构建

(1)采用Nco I和Xho I双酶切将原核表达载体pET-28(a+)线性化，反应体系如下：20μl体系，其中NEBbuffer3 2μl，Nco I 1μl、Xho I 1μl，pET-28(a+)质粒1μg，ddH2O补足20μl。37℃酶切20min，65℃20min灭活。酶切产物经割胶后采用gel kit进行割胶回收。

(2)根据Cltlp3基因去除N端转移肽后的cDNA序列设计如下引物：

Cltlp3-n:AAGAAGGAGATATACCATGGACATATCCGGGCAGCGGCCTC(下划线标示的为NcoI位点)；Cltlp3-x:TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATGGCAGAAAATGACTTTAAGC(下划线标示的为XhoI位点)。以枯萎病菌侵染后西瓜根的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR程序同实施例1。扩增产物采用同源重组的方法，定向连接到经Nco I和Xho I双酶切的线性化载体pET-28(a+)上，得到重组表达载体pET-ClTLP3。

具体方法如下：按照线性化pET-28(a+)载体片段：Cltlp3基因片段摩尔比1:5的比例混合样品，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在固体LB平板(含50ng/μl卡那霉素)上筛选单克隆，对单克隆进行PCR鉴定，筛选阳性克隆，阳性克隆送南京擎科生物公司测序，测序正确的为Cltlp3基因融合表达载体pET-ClTLP3。融合表达载体pET-ClTLP3酶切鉴定结果见图2，其扩增条件为：M：DL5,000DNA Marker；1：pET-ClTLP3质粒；2：ClTLP3酶切片段。

3.ClTLP3蛋白的体外诱导表达及纯化

(1)将重组质粒pET-ClTLP3采用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中，筛选阳性克隆，摇菌、测序正确的阳性克隆用于ClTLP3蛋白的体外诱导表达；

(2)将含表达质粒pET-Cltlp3的大肠杆菌Rosetta(DE3)接种至含50mg/mL卡那2xYT液体培养基，37℃振荡培养过夜；

(3)按1:100的比例转接于50mL培养基中，37℃培养2-3小时，至OD600约为0.6-0.7，加入1mmol/L的IPTG诱导，16℃培养过夜；

(4)4℃，7,000-8,000离心1min，弃上清，沉淀用1x PBS重悬洗一遍；

(5)沸水浴3min，12,000离心1min，取20μl上清液进行SDS-PAGE电泳检测，在其中一个泳道中加入5μl蛋白预染Marker；

(6)140V电泳55min，当溴酚蓝迁移到凝胶底部时停止运行，取出凝胶，转移到染色皿中，加入考马斯亮蓝染色液适量，放置于脱色摇床上，室温、低速摇动60-90min；

(7)染色结束后弃染色液，蒸馏水洗涤凝胶两次。加入适量强脱色液，放置于脱色摇床上，室温、低速(约70rpm)摇动45-60min，弃脱色液，水洗涤凝胶两次，更换脱色液，重复脱色60min；弃强脱色液，蒸馏水洗涤凝胶两次，更换弱脱色液，脱色过夜(12-16h)；弃弱脱色液，蒸馏水洗涤凝胶两次，并将凝胶保存在水中；

(8)将凝胶放在白色底板上，将气泡除去，用扫描仪拍照，保存图片；根据重组目的蛋白序列，CITLP3蛋白的分子量约为26.1kD。SDS-PAGE鉴定结果(见图3)显示与理论分子量一致，且样品纯度大于90％。利用Nanodrop-2000测定CITLP3蛋白含量，浓度为1.9mg/ml。

4.ClTLP3蛋白的抑菌活性

配制含50μmol pET-ClTLP3融合蛋白的PDA培养基，用打孔器(5mm)分别打取尖孢镰刀菌西瓜专化型、葫芦尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、蔓枯病菌和轮枝镰刀菌菌块放置于PDA平板中央，25℃暗培养4d后观察pET-Cltlp3融合蛋白对五种病原菌生长的抑制情况，以PDA固体培养基为对照，每个处理重复3次。

结果如图4所示，a为尖孢镰刀菌西瓜专化型，b为葫芦尖孢镰刀菌，c为茄病镰刀菌；d：蔓枯病菌，e为轮枝镰刀菌。左侧为对照组，右侧为含有pET-ClTLP3融合蛋白的PDA平板培养基。与对照组相比，加有pET-ClTLP3融合蛋白的PDA平板上五种病原菌的生长都受到抑制，而对照PDA平板上菌丝能够正常生长。

pET-ClTLP3融合蛋白的抑菌直径和抑菌率的计算结果见表1。结果显示体外表达的ClTLP3蛋白可以抑制尖孢镰刀菌西瓜专化型(r1-1、r1-2、r1-3)菌丝生长，抑制率为68.8％；可以抑制葫芦尖孢镰刀菌(Fo-1、Fo-2、Fo-3)菌丝生长，抑制率为62.5％；可以抑制茄病镰刀菌(Fs-1、Fs-2、Fs-3)菌丝生长，抑制率为51.9％；可以抑制蔓枯病菌(Sc-1、Sc-2、Sc-3)菌丝生长，抑制率为62.5％；可以抑制轮枝镰刀菌(Fv-1、Fv-2、Fv-3)菌丝生长，抑制率为48.4％。

表1体外表达ClTLP3蛋白的抑菌效果

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 西瓜抗病基因Cltlp3及其编码蛋白和应用

<130> 2

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgatcg ccttcctatc ttcctctctc tatctccttc ttactttgtc ctctctttcc 60

tctctcaccg aagccacata tccgggcagc ggcctcatcc tgaccctcgt caacaactgc 120

ccttacccga tctggcccgc cattcagccc aacgccggcc accccgtccc cgaacgcggt 180

ggcttcttcc tcccttccct ctcccaccgc tccttccctg ctccctacca gcactggtcc 240

ggccgcgtct gggctcgaac cggctgcgtc ggtgaccaca accatttaac ctgcgaaacc 300

ggtgactgcg gcggaaaact cgaatgcaac ggcgccggcg gcaaaacccc cgccactctc 360

gcccagttca gccttcacca tggccacaaa gacttttcct catacggcgt tagcctcgtc 420

gatggcttta acgtcccact aaccgttacc ccacatgaag gccaaggcgt gtgccctgta 480

gtcggctgca aagccaacct cctccagact tgcccacgcg agctccaagt ccacgctccg 540

caccgctacg gccaagtcat agcctgtaag agcggctgcg aagccttcaa caacgacgcg 600

ctctgctgta gaggacatta caatagccca cagacttgca aagcgtcgtc gttttcactc 660

ttttttaaac acgcttgtcc ttctacattc acctacgctc acgatactcc gtcgctcatg 720

cgcgagtgcg ctgcgccacg tgagcttaaa gtcattttct gccattag 768

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Ala Ile Ala Phe Leu Ser Ser Ser Leu Tyr Leu Leu Leu Thr Leu

1 5 10 15

Ser Ser Leu Ser Ser Leu Thr Glu Ala Thr Tyr Pro Gly Ser Gly Leu

20 25 30

Ile Leu Thr Leu Val Asn Asn Cys Pro Tyr Pro Ile Trp Pro Ala Ile

35 40 45

Gln Pro Asn Ala Gly His Pro Val Pro Glu Arg Gly Gly Phe Phe Leu

50 55 60

Pro Ser Leu Ser His Arg Ser Phe Pro Ala Pro Tyr Gln His Trp Ser

65 70 75 80

Gly Arg Val Trp Ala Arg Thr Gly Cys Val Gly Asp His Asn His Leu

85 90 95

Thr Cys Glu Thr Gly Asp Cys Gly Gly Lys Leu Glu Cys Asn Gly Ala

100 105 110

Gly Gly Lys Thr Pro Ala Thr Leu Ala Gln Phe Ser Leu His His Gly

115 120 125

His Lys Asp Phe Ser Ser Tyr Gly Val Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn

130 135 140

Val Pro Leu Thr Val Thr Pro His Glu Gly Gln Gly Val Cys Pro Val

145 150 155 160

Val Gly Cys Lys Ala Asn Leu Leu Gln Thr Cys Pro Arg Glu Leu Gln

165 170 175

Val His Ala Pro His Arg Tyr Gly Gln Val Ile Ala Cys Lys Ser Gly

180 185 190

Cys Glu Ala Phe Asn Asn Asp Ala Leu Cys Cys Arg Gly His Tyr Asn

195 200 205

Ser Pro Gln Thr Cys Lys Ala Ser Ser Phe Ser Leu Phe Phe Lys His

210 215 220

Ala Cys Pro Ser Thr Phe Thr Tyr Ala His Asp Thr Pro Ser Leu Met

225 230 235 240

Arg Glu Cys Ala Ala Pro Arg Glu Leu Lys Val Ile Phe Cys His

245 250 255

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcgatcg ccttcctatc 20

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctaatggcag aaaatgactt taagctcacg 30

Claims (8)

1.一种西瓜抗病基因Cltlp3，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.由权利要求1所述的西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一对用于扩增权利要求1所述的西瓜抗病基因Cltlp3的引物，其正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.包含权利要求1所述的西瓜抗病基因Cltlp3的表达载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述的表达载体是将西瓜抗病基因Cltlp3插入pET-28a(+)载体制得。

6.权利要求2所述的西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)通过NcoI/XhoI双酶切，将pET-28a(+)载体线性化，将回收到的pET-28a(+)线性化载体片段与基因Cltlp3连接，构建制得pET-ClTLP3重组原核表达载体；

(2)将pET-ClTLP3重组原核表达载体用热激法转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，获得融合表达工程菌Rosetta(DE3)/pET-ClTLP3，将工程菌在2xYT培养基中培养并诱导蛋白表达，上清纯化后，即得到目的抗病蛋白。

7.权利要求2所述的西瓜抗病基因Cltlp3编码的蛋白在增强植物对病原真菌抗性中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述病原真菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株、葫芦尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌、蔓枯病菌或轮枝镰刀菌。