CN110760538A - 一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，属于分子育种技术领域，首先针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，然后构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32‑CAS9‑gRNA‑Clpsk1载体；利用农杆菌介导法将基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；对转化植株进行Clpsk1基因编辑检测和枯萎病抗性鉴定，所得阳性植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。本发明方法可快速高效地获得西瓜抗病新种质，极大地缩短了育种周期，提高了育种效率，获得的材料不含有任何外源基因，除提高了西瓜抗枯萎病的能力，其他农艺性状不受影响。

Description

一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法

技术领域

本发明涉及一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，特别是一种利用CRISPR/Cas9技术定向敲除Clpsk1基因创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，属于分子育种技术领域。

背景技术

西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.etNakai)是一种重要的水果类作物，具有较高的经济价值，在世界范围内广泛种植。中国是西瓜主产国，产量占世界西瓜总产量的60％以上，居世界首位(杨念等，2017)。西瓜生产受到各种生物和非生物胁迫的影响。枯萎病是其中最为严重的病害，其病原菌是半知菌亚门尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveurn)，其危害可造成西瓜减产80％以上甚至绝产。嫁接技术是目前普遍采用的解决西瓜枯萎病抗性的方法，但因其技术要求、砧木品种选择、或嫁接瓜品质等因素不被部分西瓜种植大户和消费者接受。通过常规育种方法培育抗枯萎病西瓜新品种是解决西瓜连作障碍同时保持西瓜风味的最佳方案。但是，西瓜遗传基础狭窄，种质资源缺乏等因素限制了抗病品种的选育。

基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，其关键步骤是利用工程核酸酶诱导基因组产生DNA双链断裂，进而激活细胞内源修复机制，实现对基因组的精确的修饰(替换、插入或缺失)。CRISPR/Cas9(Clusteredregularly interspacedshortpalindromic repeats CRISPR-associated)是一项全新的基因编辑技术革命，相比ZFN(zinc-fingernucleases)和TALEN(transcription activator-likeeffectornucleases)技术过程繁琐、细胞毒性和脱靶率高的缺点，CRISPR/Cas9技术具有载体构建简单易行，成本更低，多靶点的同时定点修饰，染色体大片段缺失，靶向效率更高，且成本更低的优势(周想春等，2016)。目前，该技术已被广泛应用于基因功能研究和作物改良中，如拟南芥(Feng等，2013)，水稻(Kim等，2019)、玉米(Liu等，2017)、油菜(Zhai等，2019)、高粱(Jiang等，2013)、小麦(Upadhyay等，2013)、西瓜(Tian等，2017，2018)等，为培育新品种带来了更多的可能性。现有的报道多集中在不同物种中的CRISPR/Cas9技术体系的建立，而关于提高作物抗病性的报道相对较少。Kim等(2019，Rice,12:67)利用CRISPR/Cas9技术对水稻Os8N3基因进行了靶向突变，提高了水稻对稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)的抗性；Wang等(2019，Plant Biotechnology Reports)通过编辑CsWRKY22基因，降低了柑橘对溃疡病菌(Xanthomonas citri subsp.citri)的敏感性；Tian等(2018，Plant Cell Reports，37:1353-1356)获得了抗除草剂的西瓜株系。然而，目前尚没有利用CRISPR/Cas9技术精准地创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法。

发明内容

为了解决背景技术中提及的上述技术问题，本发明提供了一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法。

技术方案

一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，包括如下步骤：

(1)针对西瓜的Clpsk1基因(序列如SEQ ID NO.1所示)的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CTCTCTTCTTTTCCTCTGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；

(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；

(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；

(5)将步骤(4)中鉴定出的突变体植株的T0代株系，自交收获T1代种子，用枯萎病菌孢子悬浮液侵染T1代植株，表现为抗病的植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。

进一步，步骤(2)中，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建方法，包括以下步骤：

1)pRGEB32-AtU6载体的构建

人工合成含有AtU6.3启动子序列、两个BsaI酶切位点以及一个gRNA重复区的片段，即为AtU6.3启动子片段，片段大小252bp；以质粒pBI121为模板，设计引物35sF，35sR，扩增2x35s启动子序列，得到35s启动子片段，片段大小930bp；通过融合PCR将AtU6.3和2x35s两个启动子片段进行融合，得到PCR融合产物；采用NcoI和HindIII对pRGEB32质粒、PCR融合产物进行双酶切和酶连，获得载体pRGEB32-AtU6；

2)pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建

以CRISPR-P软件对西瓜基因组进行分析，获得gRNA编辑位点，分别设计AtU6F、AtU6R、ClPSK1-gRNAR和ClPSK1-gRNAF引物，以质粒pGTR为模板进行PCR扩增，分别获得AtU6.3和ClPSK1-gRNA的目的片段，长度分别为127bp和210bp；以BsaI酶切pRGEB32-AtU6载体骨架，利用Gibson Mix进行载体骨架和目的片段的重组，将目的片段插入到载体pRGEB32-AtU6骨架中，构建得到pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述构建方法中，所用引物序列如下：

2x35sF：5’-TGCATGCCTGCAGGTCCGCATGCCTGCAGGTCAACATG-3’(SEQ ID NO.4)，

2x35sR：5’-TAGTCCATGGCTCGAGTATCGTTCGTAAATGGTGAAAATTTTCA-3’(SEQ IDNO.5)，

AtU6F：5’-CGCCAAGCTTTGATCAAAAGTCCCACATCGATCA-3’(SEQ ID NO.6)，

AtU6R：5’-GACCTGCAGGCATGCACGC-3’(SEQ ID NO.7)，

ClPSK1-gRNAF：5’-TAGGTCTCGAAAAGAAGAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG-3’(SEQ IDNO.8)，

ClPSK1-gRNAR：5’-ATGGTCTCGTTTTCCTCTGTCTGCACCAGCCGGGAA-3’(SEQ ID NO.9)。

进一步，步骤(3)中，获得转化植株的方法，包括如下步骤：

1)挑取成熟饱满的苏蜜1号西瓜种子，去壳获得籽粒，消毒并清洗后，转接到无激素的1/2MS培养基上，25℃暗培养至种子萌发，取籽粒萌发后3d的无菌苗，切去胚芽和下胚轴，将子叶切成0.5cm×0.5cm的小块，获得子叶节外植体；

2)将子叶节外植体浸入携带pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的农杆菌菌液中侵染10-20min；

3)将侵染后的子叶节外植体移至共培养培养基上25℃暗培养3d，共培养培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+200μMAS,pH 5.8；

4)将共培养3d后的子叶节外植体移至再生培养基上培养至形成再生幼苗，再生培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+400mg/L特美汀+10mg/L潮霉素,pH5.8；

5)再生幼苗长至1.5cm时，移至生根培养基上生根，生根培养基组成为1/2MS+1.0mg/L IBA,pH 5.8；

6)待再生植株根长到2cm长、植株长到5-6cm高时，打开组培瓶盖，进行练苗，练苗1周后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽于育苗基质中，放于温室培养，之后移栽得到转化植株。

进一步，步骤(4)中，Cas9基因的特异性引物为：cas9-F:5’-GTGCCCAGCAAGAAATTC-3’(SEQ ID NO.10)，cas9-R:5’-GATAGATCAGCCGCAGGTC-3’(SEQ ID NO.11)；潮霉素基因的特异性引物为：hyg-F:5’-CCATGTGTATCACTGGCAAACT-3’(SEQ ID NO.12),hyg-R:5’-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’(SEQ ID NO.13)；Clpsk1靶标序列侧翼引物为：Clpsk-F:5’-CACACGCATCTCTGATCTCC-3’(SEQ ID NO.14),Clpsk-R:5’-CATTTCATATCAGCCGACTGATAC-3’(SEQ ID NO.15)。

进一步，步骤(5)中，枯萎病菌孢子悬浮液浓度为1×10⁵个/mL。

进一步，步骤(5)中，侵染T1代植株的方法为伤根接种法，每棵植株接种5mL枯萎病菌孢子悬浮液。

本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明方法可以快速高效地获得西瓜抗病新种质，整个西瓜抗病种质创制过程约6个月左右，而采用传统的资源纯化、再杂交回交的方法至少需要3～6年，因此本发明方法极大地缩短了育种周期，提高了育种效率；本发明方法的基因编辑效率高达100％；本发明虽然借助了遗传转化，但是获得的材料不含有任何外源基因，除提高了西瓜抗枯萎病的能力，其他农艺性状不受影响。

附图说明

图1为sgRNA作用位点图；

图2为pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建示意图；

图3为pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的质粒图谱；

图4为实施例1中6株转化植株分别用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物扩增后的产物的电泳图；

图5为实施例1中6株转化植株的PCR产物测序峰图；

图6为实施例1获得的Clpsk1基因编辑植株接种枯萎病菌孢子悬浮液21天后的照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作进一步地详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

下面以具体的实施例对本发明进行详细描述。

下述实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，包括如下步骤：

(1)针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列；

将西瓜Clpsk1基因序列(如SEQ ID NO.1所示)输入网站http://crispr.dbcls.jp设计gRNA，选取得分较高的gRNA编辑位点，该位点位于Clpsk1基因第1个外显子上，ATG下游35-55bp处，结果如图1所示，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-CTCTCTTCTTTTCCTCTGTC-3’(SEQ ID NO.2)；

(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；

1)pRGEB32-AtU6载体的构建

西瓜是双子叶植物，因此选用Bio-cubes(Wuhan,China)公司构建的tRNA-gRNA多靶点gRNA系统为载体骨架，针对双子叶植物的CRISPR载体pRGEB32-Mt，人工合成含有AtU6.3启动子序列、两个BsaI酶切位点以及一个gRNA重复区的片段，即为AtU6.3启动子片段，片段大小252bp；以质粒pBI121为模板，设计引物35sF，35sR，扩增2x35s启动子序列，得到35s启动子片段，片段大小930bp；通过融合PCR将AtU6.3和2x35s两个启动子片段进行融合，得到PCR融合产物；采用NcoI和HindIII对pRGEB32质粒、PCR融合产物进行双酶切和酶连，获得载体pRGEB32-AtU6；

2)pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建

以CRISPR-P软件对西瓜基因组进行分析，获得gRNA编辑位点，分别设计AtU6F、AtU6R、ClPSK1-gRNAR和ClPSK1-gRNAF引物，以质粒pGTR为模板进行PCR扩增，分别获得AtU6.3和ClPSK1-gRNA的目的片段，长度分别为127bp和210bp；以BsaI酶切pRGEB32-AtU6载体骨架，利用Gibson Mix进行载体骨架和目的片段的重组，将目的片段插入到载体pRGEB32-AtU6骨架中，构建得到pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，载体的构建示意图见图2，载体的质粒图谱见图3；

所述构建方法中，所用引物序列如下：

2x35sF：5’-TGCATGCCTGCAGGTCCGCATGCCTGCAGGTCAACATG-3’(SEQ ID NO.4)，

2x35sR：5’-TAGTCCATGGCTCGAGTATCGTTCGTAAATGGTGAAAATTTTCA-3’(SEQ IDNO.5)，

AtU6F：5’-CGCCAAGCTTTGATCAAAAGTCCCACATCGATCA-3’(SEQ ID NO.6)，

AtU6R：5’-GACCTGCAGGCATGCACGC-3’(SEQ ID NO.7)，

ClPSK1-gRNAF：TAGGTCTCGAAAAGAAGAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAG(SEQ ID NO.8)，

ClPSK1-gRNAR：ATGGTCTCGTTTTCCTCTGTCTGCACCAGCCGGGAA(SEQ ID NO.9)。

(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；

获得转化植株的方法，包括如下步骤：

1)挑取成熟饱满的苏蜜1号西瓜种子，去壳获得籽粒，消毒并清洗后，转接到无激素的1/2MS培养基上，25℃暗培养至种子萌发，取籽粒萌发后3d的无菌苗，切去胚芽和下胚轴，将子叶切成0.5cm×0.5cm的小块，获得子叶节外植体；

2)将子叶节外植体浸入携带pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的EHA105农杆菌菌液中侵染15min，每隔3～4min摇晃一次，使其充分接触；

农杆菌菌液制备方法：从-80℃冰箱中取出含有pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的EHA105农杆菌菌株，在无菌操作台中，用接种环挑取菌液，均匀的涂在加有利福平和卡那霉素的YEP平板上，封口膜封口后放入28℃培养箱培养，2d后挑取单菌落，28℃摇菌至菌液OD₆₀₀＝0.6～0.8，即得。

3)将侵染后的子叶节外植体移至共培养培养基上25℃暗培养3d，共培养培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+200μMAS,pH 5.8；

4)将共培养3d后的子叶节外植体移至再生培养基上培养至形成再生幼苗，再生培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+400mg/L特美汀+10mg/L潮霉素,pH 5.8；

5)再生幼苗长至1.5cm时，移至生根培养基上生根，生根培养基组成为1/2MS+1.0mg/L IBA,pH 5.8；

6)待再生植株根长到2cm长、植株长到5-6cm高时，打开组培瓶盖，进行练苗，练苗1周后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽于育苗基质中，放于温室培养，之后移栽，得到6株转化植株(编号：C-PSK-1-6)。

(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；

Clpsk1突变株的Cas9基因和潮霉素基因的PCR鉴定：

对获得的6株T₀代转化植株进行取样，用NuClean Plant Genomic DNAKit(康为世纪)提取西瓜基因组DNA，分别用Cas9基因的特异性引物为：cas9-F:5’-GTGCCCAGCAAGAAATTC-3’(SEQ ID NO.10)，cas9-R:5’-GATAGATCAGCCGCAGGTC-3’(SEQ IDNO.11)；潮霉素基因的特异性引物为：hyg-F:5’-CCATGTGTATCACTGGCAAACT-3’(SEQ IDNO.12)，hyg-R:5’-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3’(SEQ ID NO.13)进行PCR扩增，PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃15s，58℃20s，72℃1min，共35个循环；72℃延伸10min；12℃保存。扩增产物用1％的琼脂糖胶进行电泳检测，Cas9基因扩增片段长度为380bp，潮霉素基因的扩增片段长度为420bp，6株转化植株分别用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物扩增后的产物的电泳图见图4(图中，M：DL2,000分子量Marker；1-6：Clpsk1突变体植株；P：阳性质粒)，可以看出，6个转化植株均同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因，将6个转化植株进行Clpsk1基因编辑效果检测。

Clpsk1基因编辑效果检测：选取靶标序列上下游各200bp的侧翼序列，设计Clpsk1靶标序列侧翼引物：Clpsk-F:5’-CACACGCATCTCTGATCTCC-3’(SEQ ID NO.14),Clpsk-R:5’-CATTTCATATCAGCCGACTGATAC-3’(SEQ ID NO.15)进行PCR扩增，扩增片段送测序，通过峰图判断靶标序列是否发生突变，6株转化植株的PCR产物测序峰图见图5，由图5可以看出，6株转化植株(编号：C-PSK-1-6)均为突变体植株，共有3种编辑类型：一种是连续删除2个碱基(-CT)(转化植株C-PSK-1、C-PSK-2、C-PSK-3)；一种是随机删除6个碱基(-CTCTT…T)(转化植株C-PSK-2、C-PSK-4、C-PSK-5)；一种是插入1个碱基(+A)(转化植株C-PSK-6)，由于碱基删除或插入，造成PAM位点附近开始翻译错位，翻译提前终止。

6株转化植株中，C-PSK-1、C-PSK-3含有1种突变类型，即连续删除2个碱基(-CT)，为纯合突变；C-PSK-2、C-PSK-4、C-PSK-5含有2种突变类型，即连续删除2个碱基(-CT)和随机删除6个碱基(-CTCTT…T)，为杂合突变；C-PSK-6同时含有3种突变类型，即连续删除2个碱基(-CT)、随机删除6个碱基(-CTCTT…T)和插入1个碱基(+A)，为嵌合体突变。

(5)将已成功实现Clpsk1基因编辑的T₀代再生植株种植于大棚，自交授粉收获T₁代种子，每个株系取25粒种子，播种于50孔穴盘，待子叶展平后，采用灌根接种，用小刀在距幼苗根茎约1cm处扎一孔，并用注射器注入5ml的枯萎病菌孢子悬浮液(枯萎病菌孢子悬浮液浓度为1×10⁵个/mL)，植株出现萎蔫症状时开始调查并记录发病情况，直至接种后21天结束调查(Clpsk1基因编辑植株接种枯萎病菌孢子悬浮液21天后的照片见图6)。

抗性分级标准：参考Martyn和Bruton(1989)的标准，以病株率进行评价：高抗病株率≤20％；中抗病株率21％-50％；轻抗病株率51％-80％；感病病株率>80％。

结果见表1：

表1 Clpsk1基因编辑植株枯萎病抗性鉴定结果

由表1可以看出，对照植株的病株率为84％，属于感病，Clpsk1基因编辑的株系C-PSK-2、C-PSK-5、C-PSK-6、C-PSK-4、C-PSK-3植株病株率为33～48％，抗性表现为中抗。C-PSK-1植株病株率为68％，抗性表现为轻抗。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 386

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 1

atgccttcta aattcatctc ctttctcttc atcctctctc ttcttttcct ctgtcacagc 60

ccccctgctt acgctgcccg ctcccttccc cctttttcat ccgaaacagc ccccaccaaa 120

atccccactc aggtttgtta aacaacacca ataagttatt atatttatcg tactctattt 180

gctttgatta ttaattcttc tttttttttt cttttttttt ttcttttttt ttttttgggg 240

ttttgtaggg gttggaatca aaacaaagtg atactgatga aatgatggat gataactgca 300

atggagtggg agaagaagag tgtttgatga gacgaactct agccgcgcac ttagattatg 360

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<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 2

ctctcttctt ttcctctgtc 20

<210> 3

<211> 15460

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 3

cttgtacaaa gtggttgata acagcgacta caaggatgac gatgacaagg cttagagctc 60

gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 120

cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 180

catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 240

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tttcttgtcg cgtgttttag tcgcataaag tagaatactt gcgactagaa ccggagacat 900

tacgccatga acaagagcgc cgccgctggc ctgctgggct atgcccgcgt cagcaccgac 960

gaccaggact tgaccaacca acgggccgaa ctgcacgcgg ccggctgcac caagctgttt 1020

tccgagaaga tcaccggcac caggcgcgac cgcccggagc tggccaggat gcttgaccac 1080

ctacgccctg gcgacgttgt gacagtgacc aggctagacc gcctggcccg cagcacccgc 1140

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gccgagaatg aacgccaaga ggaacaagca tgaaaccgca ccaggacggc caggacgaac 1620

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cgcccgcgca cgtctcaacc gtgcggctgc atgaaatcct ggccggtttg tctgatgcca 1740

agctggcggc ctggccggcc agcttggccg ctgaagaaac cgagcgccgc cgtctaaaaa 1800

ggtgatgtgt atttgagtaa aacagcttgc gtcatgcggt cgctgcgtat atgatgcgat 1860

gagtaaataa acaaatacgc aaggggaacg catgaaggtt atcgctgtac ttaaccagaa 1920

aggcgggtca ggcaagacga ccatcgcaac ccatctagcc cgcgccctgc aactcgccgg 1980

ggccgatgtt ctgttagtcg attccgatcc ccagggcagt gcccgcgatt gggcggccgt 2040

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tggaaggcta caagcggcct ttgtcgtgtc gcgggcgatc aaaggcacgc gcatcggcgg 2340

tgaggttgcc gaggcgctgg ccgggtacga gctgcccatt cttgagtccc gtatcacgca 2400

gcgcgtgagc tacccaggca ctgccgccgc cggcacaacc gttcttgaat cagaacccga 2460

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agcgcacgca gcagcaaggc tgcaacgttg gccagcctgg cagacacgcc agccatgaag 2640

cgggtcaact ttcagttgcc ggcggaggat cacaccaagc tgaagatgta cgcggtacgc 2700

caaggcaaga ccattaccga gctgctatct gaatacatcg cgcagctacc agagtaaatg 2760

agcaaatgaa taaatgagta gatgaatttt agcggctaaa ggaggcggca tggaaaatca 2820

agaacaacca ggcaccgacg ccgtggaatg ccccatgtgt ggaggaacgg gcggttggcc 2880

aggcgtaagc ggctgggttg tctgccggcc ctgcaatggc actggaaccc ccaagcccga 2940

ggaatcggcg tgacggtcgc aaaccatccg gcccggtaca aatcggcgcg gcgctgggtg 3000

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aaccgccggc agccggtgcg ccgtcgatta ggaagccgcc caagggcgac gagcaaccag 3180

attttttcgt tccgatgctc tatgacgtgg gcacccgcga tagtcgcagc atcatggacg 3240

tggccgtttt ccgtctgtcg aagcgtgacc gacgagctgg cgaggtgatc cgctacgagc 3300

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<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 12

ccatgtgtat cactggcaaa ct 22

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 13

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<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

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<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)Mansfeld.et Nakai)

<400> 15

catttcatat cagccgactg atac 24

Claims (7)

1.一种创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)针对西瓜的Clpsk1基因的第一个外显子，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，所述sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)构建含有编码所述sgRNA序列的DNA片段的pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体；

(3)利用农杆菌介导法将pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1基因编辑载体导入受体西瓜品种苏蜜1号，获得转化植株；

(4)转化植株用Cas9基因和潮霉素基因的特异性引物进行第一轮扩增，同时扩增出Cas9基因和潮霉素基因的植株，再用Clpsk1基因靶标序列侧翼引物进行第二轮扩增，将PCR产物进行测序，通过峰图筛选出sgRNA作用位点发生突变的植株，即为突变体植株；

(5)将步骤(4)中鉴定出的突变体植株的T0代株系，自交收获T1代种子，用枯萎病菌孢子悬浮液侵染T1代植株，表现为抗病的植株即为具有枯萎病抗性的西瓜种质材料。

2.如权利要求1所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(2)中，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建方法，包括以下步骤：

1)pRGEB32-AtU6载体的构建

人工合成含有AtU6.3启动子序列、两个BsaI酶切位点以及一个gRNA重复区的片段，即为AtU6.3启动子片段，片段大小252bp；以质粒pBI121为模板，设计引物35sF，35sR，扩增2x35s启动子序列，得到35s启动子片段，片段大小930bp；通过融合PCR将AtU6.3和2x35s两个启动子片段进行融合，得到PCR融合产物；采用NcoI和HindIII对pRGEB32质粒、PCR融合产物进行双酶切和酶连，获得载体pRGEB32-AtU6；

2)pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的构建

以CRISPR-P软件对西瓜基因组进行分析，获得gRNA编辑位点，分别设计AtU6F、AtU6R、ClPSK1-gRNAR和ClPSK1-gRNAF引物，以质粒pGTR为模板进行PCR扩增，分别获得AtU6.3和ClPSK1-gRNA的目的片段，长度分别为127bp和210bp；以BsaI酶切pRGEB32-AtU6载体骨架，利用Gibson Mix进行载体骨架和目的片段的重组，将目的片段插入到载体pRGEB32-AtU6骨架中，构建得到pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体，pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.如权利要求2所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，所述构建方法中，所用引物序列如下：2x35sF的序列如SEQ ID NO.4所示，2x35sR的序列如SEQ ID NO.5所示，AtU6F的序列如SEQ ID NO.6所示，AtU6R的序列如SEQ ID NO.7所示，ClPSK1-gRNAF的序列如SEQ ID NO.8所示，ClPSK1-gRNAR的序列如SEQ ID NO.9所示。

4.如权利要求1所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(3)中，获得转化植株的方法，包括如下步骤：

1)挑取成熟饱满的苏蜜1号西瓜种子，去壳获得籽粒，消毒并清洗后，转接到无激素的1/2MS培养基上，25℃暗培养至种子萌发，取籽粒萌发后3d的无菌苗，切去胚芽和下胚轴，将子叶切成0.5cm×0.5cm的小块，获得子叶节外植体；

2)将子叶节外植体浸入携带pRGEB32-CAS9-gRNA-Clpsk1载体的农杆菌菌液中侵染10-20min；

3)将侵染后的子叶节外植体移至共培养培养基上25℃暗培养3d，共培养培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+200μM AS,pH 5.8；

4)将共培养3d后的子叶节外植体移至再生培养基上培养至形成再生幼苗，再生培养基组成为MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA+400mg/L特美汀+10mg/L潮霉素,pH 5.8；

5)再生幼苗长至1.5cm时，移至生根培养基上生根，生根培养基组成为1/2MS+1.0mg/LIBA,pH 5.8；

6)待再生植株根长到2cm长、植株长到5-6cm高时，打开组培瓶盖，进行练苗，练苗1周后，取出幼苗，洗去根部培养基，移栽于育苗基质中，放于温室培养，之后移栽得到转化植株。

5.如权利要求1所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(4)中，Cas9基因的特异性引物为cas9-F和cas9-R，序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；潮霉素基因的特异性引物为hyg-F和hyg-R，序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；Clpsk1靶标序列侧翼引物为Clpsk-F和Clpsk-R，序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ IDNO.15所示。

6.如权利要求1所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(5)中，枯萎病菌孢子悬浮液浓度为1×10⁵个/mL。

7.如权利要求1至6任一项所述创制枯萎病抗性西瓜种质材料的方法，其特征在于，步骤(5)中，侵染T1代植株的方法为伤根接种法，每棵植株接种5mL枯萎病菌孢子悬浮液。

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