CN113493803A

CN113493803A - 紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑系统及其应用

Info

Publication number: CN113493803A
Application number: CN202110884895.XA
Authority: CN
Inventors: 王涛; 董江丽; 叶沁怡
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-08-03
Filing date: 2021-08-03
Publication date: 2021-10-12
Anticipated expiration: 2041-08-03
Also published as: CN113493803B

Abstract

本发明公开了CRISPR/Cas9基因组编辑系统在紫花苜蓿基因编辑中的应用，所述CRISPR/Cas9基因组编辑系统包括表达载体，所述表达载体可包括Cas9表达盒、sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，所述Cas9表达盒表达Cas9。所述sgRNA1表达盒表达名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA2表达盒表达名称为sgRNA2的sgRNA；所述sgRNA1表达盒含有名称为MtU6‑6promoter的启动子和由所述MtU6‑6promoter驱动的sgRNA1基因，所述sgRNA2表达盒含有名称为MtU6‑5promoter的启动子和由所述MtU6‑5promoter驱动的sgRNA2基因；所述sgRNA1和所述sgRNA2可针对紫花苜蓿的同一靶标基因或不同靶标基因。本发明根据紫花苜蓿同源四倍体的特点对靶标基因设计双靶点，构建基因编辑双元载体p6401‑Target，由农杆菌介导转化紫花苜蓿获得再生植株。这种优化的基因组编辑系统大大提高了紫花苜蓿基因编辑效率，植株基因编辑效率可高达100％，单个靶点编辑效率可高达96.9％。

Description

紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑系统及其应用。

背景技术

紫花苜蓿(Medicago sativa)是重要的豆科牧草作物，具有丰富的营养价值，尤其是蛋白含量高，且含有优质膳食纤维和多种维生素，素有“牧草之王”的美誉。紫花苜蓿在我国分布广泛，除了优异的饲用价值，对于草地生态的保护和维持也具有重要功能。因此，紫花苜蓿的生理生态研究和遗传育种工作具有重要的现实意义。但是，紫花苜蓿栽培种多为同源四倍体，基因组庞大；并且是异交植物，具有半自交不亲和的生理特点；其基因组杂合度高，遗传操作困难，给基础研究和育种工作带来很大的难度。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是一项功能强大的遗传操作工具，主要由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白组成。融合靶点序列的sgRNA能够与基因组序列互补配对，从而将基因编辑机器定向地引导到靶点区域，由核酸酶Cas9切割DNA造成双链断裂，从而引起机体的DNA修复，在修复过程中引入随机突变，从而实现靶标基因的编辑。紫花苜蓿基因编辑技术虽然已有报道，但其编辑效率尚不能满足实际应用的需要。具体来说，此前由蒺藜苜蓿MtU6-1启动子驱动的sgRNA所介导的紫花苜蓿基因编辑系统，单个靶点编辑效率达到52％，纯合突变率为12％，其编辑效率尚有很大的提升空间。另一则文献报道，利用tRNA结构串联4个gRNA对紫花苜蓿单个靶标基因进行多靶点编辑，编辑效率最高能达到75％；该系统的不足在于仍然采用拟南芥U6启动子序列驱动串联的sgRNA表达，单个靶点工作效率仍然较低，只有串联4个sgRNA才能实现紫花苜蓿单基因4个拷贝的全部编辑。因此，提高CRISPR/Cas9系统在紫花苜蓿中的工作效率是紫花苜蓿基因编辑系统亟待解决的关键问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何快速高效的实现四倍体紫花苜蓿的基因编辑。

为解决上述技术问题，本发明提供CRISPR/Cas9基因组编辑系统在紫花苜蓿基因编辑中的应用，所述CRISPR/Cas9基因组编辑系统可包括表达载体，所述表达载体可包括Cas9表达盒、sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，所述Cas9表达盒可表达Cas9，sgRNA1表达盒可表达名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA2表达盒可表达名称为sgRNA2的sgRNA；所述sgRNA1表达盒可含有名称为MtU6-6 promoter的启动子和由所述MtU6-6 promoter驱动的sgRNA1基因，所述sgRNA2表达盒可含有名称为MtU6-5 promoter的启动子和由所述MtU6-5promoter驱动的sgRNA2基因；所述sgRNA1和所述sgRNA2可针对紫花苜蓿的同一靶标基因或不同靶标基因。

所述MtU6-6promoter和所述MtU6-5 promoter均来源于蒺藜苜蓿。

进一步地，所述的应用中，所述MtU6-6promoter可以是A1)或A2)的DNA分子：

A1)核苷酸序列是序列表中序列1第1-500位的DNA分子；

A2)与A1)的DNA分子具有80％以上的同一性且具有启动子功能的DNA分子；

所述MtU6-5 promoter可以是A3)或A4)的DNA分子，

A3)核苷酸序列是序列表中序列1第789-1288位的DNA分子；

A4)与A3)的DNA分子具有80％以上的同一性且具有启动子功能的DNA分子。

进一步地，所述的应用中，所述sgRNA1表达盒和所述sgRNA2表达盒均含有名称为AtU6-26t的终止子，所述AtU6-26t可以是B1)或B2)的DNA分子：

B1)核苷酸序列是序列表中序列1第605-788位的DNA分子；

B2)与B1)的DNA分子具有80％以上的同一性且具有终止子功能的DNA分子。

上述DNA分子中，所述DNA的“同一性”或是“序列同一性的百分比”是通过在比较窗口比较两个最优比对的序列来确定的，其中最优比对提供最高级别的配对并且能够在检验或参照的序列当中引入核苷酸添加。同一性百分比是通过计算测试序列和参考序列在整条序列中的每一个位置上一致的核苷酸的百分比来确定的。最佳的序列比对和百分比同一性可以手工测定，或是更优选的通过计算机的运算法则，其包括但不限于TBLASTN，FASTA，GAP，BESTFIT，和CLUSTALW(Altschul et al.,1990,J.Mol.Biol.215(3):403-10；Pearsonand Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8):2444-8；Thompson et al.,1994,Nucleic Acids Res.22(22):4673-80；Devereux et al.,1984,Nucleic Acids Res.12:387-395；Higgins et al.,1996,Methods Enzymol.266:383-402)。优选的，设置在默认的参数的NCBI Blast Server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)用于搜索多个数据库来寻找同源的序列。

上述DNA分子中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。

进一步地，所述的应用中，所述sgRNA1表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第1-788位，其中，序列表中序列1的第502-520位核苷酸与所述sgRNA1的靶标序列相同；所述sgRNA2表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第789-1576位，序列表中序列1的第1290-1308位核苷酸与所述sgRNA2的靶标序列相同。

具体地，所述sgRNA1表达盒的核苷酸序列如序列表中序列1的第1-788位中，序列表中序列1的第1-500位是MtU6-6 promoter，第501位是转录起始位点核苷酸G，第502-520位核苷酸与所述sgRNA1的靶标序列相同，第521-604位核苷酸是sgRNA1 scaffold，第605-788位核苷酸序列是AtU6-26 terminator。

具体地，所述sgRNA2表达盒的核苷酸序列如序列表中序列1的第789-1576位中，序列表中序列1的第789-1288位是MtU6-5 promoter，第1289位是转录起始位点核苷酸G，第1290-1308位核苷酸与所述sgRNA2的靶标序列相同，第1309-1392位核苷酸是sgRNA2scaffold，第1393-1576位核苷酸序列是AtU6-26 terminator。

进一步地，所述的应用，所述sgRNA1和所述sgRNA2可以针对紫花苜蓿的同一靶标基因为MsGA3ox1基因，所述MsGA3ox1基因的编码序列如序列表中序列2所示。

进一步地，所述的应用，所述sgRNA1的靶标序列可以是序列表中序列2的第347-365位核苷酸的反向互补序列(即5′-ACACCATCCGGGGAACGAA-3′)，所述sgRNA2的靶标序列可以是序列表中序列2的第341-359位核苷酸(即5′-AAGCCATTCGTTCCCCGGA-3′)。

进一步地，所述的应用，所述sgRNA1和所述sgRNA2可以针对紫花苜蓿的同一靶标基因为MsNP1基因，所述MsNP1基因的编码序列如序列表中序列3所示。

进一步地，所述的应用，所述sgRNA1的靶标序列可以是序列表中序列3的第1052-1070位核苷酸(即5′-GCTACATTGAAGCCGCTAG-3′)，所述sgRNA2的靶标序列可以是序列表中序列3的第1082-1100位核苷酸的反向互补序列(即5′-TCTCTTTGAGAACCTGTGA-3′)。

本发明提供上述应用所述的表达载体。

本发明提供上述表达载体在制备匍匐型紫花苜蓿中的应用或在雄性不育紫花苜蓿或所述雄性不育保持系紫花苜蓿的应用。

本发明的目的是提供一种优化的紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑方法，以高效地获得等位基因全部发生突变的紫花苜蓿突变体材料。采用由蒺藜苜蓿中克隆到的2个U6启动子驱动sgRNA的表达，根据紫花苜蓿同源四倍体的特点对靶标基因设计双靶点，构建基因编辑双元载体p6401-Target，由农杆菌介导转化紫花苜蓿获得再生植株。这种优化的基因组编辑系统大大提高了紫花苜蓿基因编辑效率，植株基因编辑效率达100％，单个靶点编辑效率可高达96.9％。

附图说明

图1为sgRNA模块载体结构图和带有双靶点的sgRNA模块Target-5CBC构建方法示意图。

图2为基因编辑双元载体p6401-Target载体结构示意图。

图3为紫花苜蓿p6401-MsGA3ox1载体结构图。

图4为紫花苜蓿转入p6401-MsGA3ox1载体获得再生植株的转基因鉴定结果。

图5为基因编辑植株Msga3ox1的突变方式分析。

图6为Msga3ox1突变体与野生型植株表型及相关统计分析。

图7为紫花苜蓿p6401-MsNP1载体结构图。

图8为紫花苜蓿转入p6401-MsNP1载体获得再生植株的转基因鉴定结果。

图9为紫花苜蓿转入p6401-MsNP1载体获得再生植株的靶点片段克隆结果。

图10为紫花苜蓿转入p6401-MsNP1载体阳性植株靶点片段Sanger测序结果。

图11为Msnp1突变体突变方式示例。

图12为Msnp1突变体和对照材料(Control)的花序特写。

图13为Msnp1突变体和对照材料(Control)的雌雄蕊特写。

图14为Msnp1突变体和对照材料(Control)亚历山大染色实验结果。

图15为Msnp1突变体和对照材料(Control)I2-KI染色实验结果。

图16为紫花苜蓿雄性不育系的应用方式。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

p6401载体和p5CBC：记载于“ZHU,F.,YE,Q.,CHEN,H.,DONG,J.&WANG,T.2021.Multigene editing reveals that MtCEP1/2/12 redundantly regulatelateral root and nodule number in Medicago truncatula.J.Exp.Bot.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

10×N6大量母液(1L)：MgSO₄·7H₂O 1.85g，KNO₃ 28.3g，(NH4)₂SO₄ 4.63g，CaCl₂·2H₂O 1.66g，KH₂PO₄ 4g。

1000×SH微量母液(100mL)：MnSO₄·H₂O 1g，H₃BO₃ 500mg，ZnSO₄·7H₂O 100mg，KI100mg，Na₂MoO₄·2H₂O 10mg，CuSO₄·5H₂O 20mg，CoCl₂·6H₂O 10mg。

1000×SH有机母液(100mL)：烟酸500mg，盐酸吡哆醇500mg，盐酸硫胺素500mg。

50×EDFS铁盐母液(500mL)：NaFe·EDTA 3.487g。

SH9培养基(1L)的配方为：10×N6大量母液100mL，1000×SH微量母液1mL，1000×SH有机母液1mL，50×EDFS铁盐母液20mL，肌醇100mg，蔗糖20g，pH调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。

SM4培养基(1L)的配方为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)4.43g，2，4-D储存液(10mg/mL)0.4mL，6-BAP储存液(1mg/mL)0.2mL，蔗糖30g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。

MSBK培养基(1L)的配方为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)4.43g，激动素(1mg/mL)1mL，6-BAP储存液(1mg/mL)0.5mL，蔗糖30g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2g植物凝胶。

1/2MS培养基(1L)的配方为：MURASHIGE&SKOOG(MS)BASAL MEDIUM(M519)(PhytoTechnology Laboratories^TM)2.22g，蔗糖12g，pH调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。

下述实施例中采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用Kruskal-Wallis，nonparametric test检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异，P＜0.01(**)表示具有极显著性差异，P＜0.001(***)表示具有极显著性差异。

发明概述

本发明利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统编辑紫花苜蓿基因组，主要包括以下步骤：

步骤(1)紫花苜蓿基因编辑载体p6401-Target的构建；

步骤(2)根癌农杆菌介导的紫花苜蓿叶盘遗传转化；

步骤(3)紫花苜蓿再生苗的基因型和表型鉴定。

步骤(1)紫花苜蓿基因编辑载体p6401-Target的构建，包括以下几个方面：

1、基因编辑靶点设计：根据紫花苜蓿靶标基因的基因组序列，设计两个特异性靶点1和2以确保能够对靶标基因实现高效编辑。

2、sgRNA模块的构建：合成分别带有靶点1和靶点2的引物包括

Target1-BsF：5′-ATATATGGTCTCGCTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTT-3′，其中第18位至第36位核苷酸为设计的靶点1序列；

Target1-F0：5′-GNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，其中第2位至第20位核苷酸为设计的靶点1序列；

Target2-R0：5′-AACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAATTTAATGGTTCGCTTGTA-3′，其中第4位至第22位核苷酸为设计的靶点2的反向互补序列；

Target2-BsR：5′-ATTATTGGTCTCGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNC-3′，其中第18位至第36位为设计的靶点2的反向互补序列；

通过搭桥PCR扩增得到带有靶点序列的sgRNA模块Target-5CBC(如图1)，反应体系如下：10×KOD plus Buffer 5μL、MgSO4(25mM)3μL、dNTPs(2mM,Toyobo)4μL、KOD plus(Toyobo)1μL、p5CBC(5ng/μL)1μL、Target1-BsF(20μM)1μL、Target1-F0(1μM)1μL、Target2-R0(1μM)1μL、Target2-BsR(20μM)1μL、ddH2O 32μL、反应总体积50μL。

反应程序为：第一轮：94℃变性2min；第二轮：94℃变性15sec，60℃退火30sec，68℃延伸1min，30个循环；第三轮：68℃延伸5min。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，切取目的片段所在胶块，通过胶回收试剂盒进行片段回收。

3、基因编辑双元载体构建：利用Golden Gate反应将带有靶点序列的Target-5CBC片段和p6401载体通过限制性内切酶BsaI进行酶切，同时通过T4 DNA连接酶进行连接，构成p6401-Tatget(如图2)。具体反应体系如下：Target-5CBC片段(～100ng/μL)8μL、p6401(～400ng/μL)2μL、10×T4 Ligase Buffer(NEB)1.5μL、10×BSA 1.5μL、BsaI(NEB)1μL、T4 DNALigase(NEB)1μL，反应总体积共计15μL。反应程序为：第一步：37℃，5h；第二步：50℃，5min；第三步：80℃，10min。

反应完成后将产物加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μL含有Kanamycin(50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇培6～8h，随后进行菌液PCR鉴定，以上述Target1-BsF和Target2-BsR为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序确定构建的转化载体p6401-Target序列，其中测序引物为上述Target1-BsF和Target2-BsR。

测序结果表明：紫花苜蓿基因编辑载体p6401-Target含有sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，核苷酸序列是序列1，其中，n为a、t、c或g。

sgRNA1表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第1-788位，其中，序列表中序列1的第1-500位是MtU6-6 promoter，第501位是转录起始位点核苷酸G，第502-520位与所述sgRNA1的靶标序列相同，第521-604位核苷酸是sgRNA1 scaffold，第605-788位核苷酸序列是AtU6-26 terminator。

sgRNA2表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第789-1576位，其中，序列表中序列1的第789-1288位是MtU6-5 promoter，第1289位是转录起始位点核苷酸G，第1290-1308位与所述sgRNA2的靶标序列相同，第1309-1392位核苷酸是sgRNA2scaffold，第1393-1288位核苷酸序列是AtU6-26 terminator。

步骤(2)根癌农杆菌介导的紫花苜蓿叶盘遗传转化，包括以下几个方面：

1、将基因编辑双元载体p6401-Target转入根癌农杆菌EHA105：将50ng质粒加入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴5min；将混合物加入预冷的电击杯中，1600V高压电击，随后加入500μL不加抗生素的YEP液体培养基吹打混匀，将菌液转移至离心管中，28℃200rpm摇培1h，取30μL菌液涂布在含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP固体筛选培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24～48h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，以上述步骤(1)中的Target1-BsF和Target2-BsR为引物进行扩增反应，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带，选取阳性克隆进行下一步侵染。

2、外植体制备：取受体材料紫花苜蓿枝条从顶芽往下数第5～8片完全展开的复叶作为外植体，采集后用0.1％Triton X100水溶液浸没5min，去离子水洗涤3～5遍；随后转移至灭菌的密封瓶中，加入30％漂白水(有效成分为0.5％NaClO)消毒10min，在超净工作台中用灭菌水清洗3～5遍后备用。

3、农杆菌侵染液制备：将转入p6401-Target的根癌农杆菌EHA105阳性菌落转接至200mL含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP液体培养基中，28℃230rpm摇培至OD_600nm为0.2～0.4。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000rpm离心10min，去上清，用200mL的SM4液体培养基(含乙酰丁香酮0.1mM)重悬，即制备成侵染液。

4、农杆菌介导的遗传转化和共培养：将外植体投入上述制备好的侵染液中，抽真空至-0.09MPa维持5min，然后缓慢放气；在超声清洗器中20℃条件下超声处理3min；再次抽真空至-0.09MPa维持5min，缓慢放气；随后在超净工作台中去除侵染液，将外植体表面多余的液体用滤纸吸干；用小刀将复叶切开，去除叶柄，然后平铺在SM4固体培养基(含乙酰丁香酮0.1mM)上，22℃避光共培养3天。

5、愈伤诱导和分化：将外植体转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的SM4固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导抗性愈伤，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每2周继代一次，共持续6周；随后将愈伤转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的MSBK固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，持续3周；将胚性愈伤转移至含有筛选抗生素潮霉素B(5mg/L)的SH9固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上继续诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2MS固体培养基上生根，每3～4周继代一次，22℃、16h光照、8h黑暗培养；生根后移至营养土中，用保鲜膜覆盖保湿培养5天，然后揭膜，温室条件为22℃、16h光照、8h黑暗、湿度70％～80％培养。

步骤(3)紫花苜蓿再生苗的基因型鉴定，包括以下几个方面：

1、转基因鉴定：取再生苗的一片单叶提取基因组DNA，然后进行PCR检测。以质粒p6401-Target为阳性对照，受体材料基因组DNA为阴性对照，引物为Target1-BsF和Target2-BsR进行扩增，反应体系如下：2×Taq mix 10μL、Target1-BsF 1μL、Target2-BsR1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O 7μL，反应总体积为20μL。

反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，若存在相应大小的特异性条带，则该样品为转基因阳性。

2、突变方式鉴定：在靶标基因靶点1和2附近的基因组序列中设计特异性引物进行扩增和Sanger测序，以受体材料为对照，根据测序峰图进行初步的突变预测；将可能发生编辑的样品靶点片段连入pMD18T载体中，挑取多个单克隆进行测序验证。

实施例1、利用优化的CRISPR/Cas9系统编辑紫花苜蓿MsGA3ox1基因获得矮化株型材料

一、基因编辑载体p6401-MsGA3ox1的构建

1.基因编辑靶点设计

紫花苜蓿MsGA3ox1含有编码序列(CDS)是序列表中序列2所示的MsGA3ox1编码基因。根据紫花苜蓿MsGA3ox1的基因组序列，通过在线靶点预测网站(http:// crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5′-ACACCATCCGGGGAACGAA-3，靶点2为5′-AAGCCATTCGTTCCCCGGA-3′。

2.sgRNA模块的构建

由北京六合华大基因科技有限公司合成引物

MsGA3ox1-Target1-BsF：5′-ATATATGGTCTCGCTTGACACCATCCGGGGAACGAAGTT-3′，其中第18位至第36位核苷酸为设计的MsGA3ox1靶点1序列；

MsGA3ox1-Target1-F0：

5′-GACACCATCCGGGGAACGAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，其中第2位至第20位核苷酸为设计的MsGA3ox1靶点1序列；

MsGA3ox1-Target2-R0：

5′-AACTCCGGGGAACGAATGGCTTCAATTTAATGGTTCGCTTGTA-3′，其中第4位至第22位核苷酸为设计的MsGA3ox1靶点2的反向互补序列；

MsGA3ox1-Target2-BsR：5′-ATTATTGGTCTCGAAACTCCGGGGAACGAATGGCTTC-3′，其中第18位至第36位为设计的MsGA3ox1靶点2的反向互补序列；

通过搭桥PCR扩增得到带有靶点序列的sgRNA模块MsGA3ox1-5CBC。

将胶回收片段送样测序MsGA3ox1-p5CBC的序列如序列表中序列4所示。序列4的第18-36位为MsGA3ox1的靶点1序列，第806-824位为MsGA3ox1的靶点2序列。

3.基因编辑双元载体构建：利用Golden Gate反应将带有靶点序列的MsGA3ox1-5CBC片段和p6401载体通过限制性内切酶BsaI进行酶切，同时通过T4 DNA连接酶进行连接，构成p6401-MsGA3ox1(如图3)。反应完成后将产物加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μL含有Kanamycin(50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇培6～8h，随后进行菌液PCR鉴定，以上述MsGA3ox1-Target1-BsF和MsGA3ox1-Target2-BsR为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序确定构建的转化载体p6401-MsGA3ox1序列，其中测序引物为上述引物MsGA3ox1-Target1-BsF和MsGA3ox1-Target2-BsR。

测序结果表明p6401-MsGA3ox1是用片段序列4第14-824位所示的碱基序列替换载体p6401的BsaI限制性内切酶切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变，得到的重组表达载体。p6401-MsGA3ox1表达靶向于MsGA3ox1基因的sgRNA1(靶标为靶点1)和sgRNA2(靶标为靶点2)的两个sgRNA。

二、根癌农杆菌介导的紫花苜蓿叶盘遗传转化

1.将基因编辑双元载体p6401-MsGA3ox1转入根癌农杆菌EHA105：将50ng质粒加入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴5min；将混合物加入预冷的电击杯中，1600V高压电击，随后加入500μL不加抗生素的YEP液体培养基吹打混匀，将菌液转移至离心管中，28℃200rpm摇培1h，取30μL菌液涂布在含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP固体筛选培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24～48h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，以上述步骤(1)中的MsGA3ox1-Target1-BsF和MsGA3ox1-Target2-BsR为引物进行扩增反应，阳性克隆(命名为EHA105/p6401-MsGA3ox1)具有大小为841bp的特异条带，选取阳性克隆进行下一步侵染。

2.外植体制备：取受体材料紫花苜蓿枝条从顶芽往下数第5～8片完全展开的复叶作为外植体，采集后用0.1％Triton X100水溶液浸没5min，去离子水洗涤3～5遍；随后转移至灭菌的密封瓶中，加入30％漂白水(有效成分为0.5％NaClO)消毒10min，在超净工作台中用灭菌水清洗3～5遍后备用。

3.农杆菌侵染液制备：将EHA105/p6401-MsGA3ox1转接至200mL含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP液体培养基中，28℃230rpm摇培至OD600为0.2～0.4。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000rpm离心10min，去上清，用200mL的SM4液体培养基(含乙酰丁香酮0.1mM)重悬，即制备成侵染液。

4.农杆菌介导的遗传转化和共培养：将外植体投入上述制备好的侵染液中，抽真空至-0.09MPa维持5min，然后缓慢放气；在超声清洗器中20℃条件下超声处理3min；再次抽真空至-0.09MPa维持5min，缓慢放气；随后在超净工作台中去除侵染液，将外植体表面多余的液体用滤纸吸干；用小刀将复叶切开，去除叶柄，然后平铺在SM4固体培养基(含乙酰丁香酮0.1mM)上，22℃避光共培养3天。

5.愈伤组织诱导和分化：将外植体转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的SM4固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导抗性愈伤，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每2周继代一次，共持续6周；随后将愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的MSBK固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，持续3周；将胚性愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素B(5mg/L)的SH9固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上继续诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2MS固体培养基上生根，每3～4周继代一次，22℃、16h光照、8h黑暗培养；生根后移至营养土中，用保鲜膜覆盖保湿培养5天，然后揭膜，温室条件为22℃、16h光照、8h黑暗、湿度70％～80％培养。

三、紫花苜蓿再生苗的基因型鉴定

在上述紫花苜蓿遗传转化的生根培养过程中发现存在植株明显矮化的再生苗，该表型与近缘种二倍体蒺藜苜蓿中Mtga3ox1突变体的表型相似，根据此表型指针推测可能成功发生基因编辑。因此选取部分矮化苗与正常苗进行基因型鉴定。

1.转基因鉴定：取再生苗的一片单叶提取基因组DNA，将提取的基因组DNA作为模板DNA进行PCR检测。以质粒p6401-MsGA3ox1为阳性对照，野生型基因组DNA为阴性对照，引物为MsGA3ox1-Target1-BsF和MsGA3ox1-Target2-BsR进行扩增，反应体系如下：2×Taqmix 10μL、MsGA3ox1-Target1-BsF 1μL、MsGA3ox1-Target2-BsR 1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O7μL，反应总体积20μL。

反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，若存在相应大小的特异性条带，则该样品为转基因阳性(如图4中a)。

2.突变方式鉴定：在靶标基因MsGA3ox1靶点1和2附近的基因组序列中设计特异性引物MsGA3ox1-TF和MsGA3ox1-TR进行扩增，反应体系如下：2×Taq mix 15μL、MsGA3ox1-TF1μL、MsGA3ox1-TR 1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O 12μL，总体积30μL。

MsGA3ox1-TF：5′-TCACTACAAGAACTTCCTGAATC-3′；

MsGA3ox1-TR：5′-ATCAAATTGGGCTTTTGAGCCAG-3′。

反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。反应结束后，取5μL产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小约为1119bp(如图4中b)。

图4为紫花苜蓿转入p6401-MsGA3ox1载体获得再生植株的转基因鉴定结果，如图4中a图为转基因鉴定结果，1至7为再生植株，WT为受体材料，阴性对照“-”为ddH₂O，M表示DNA标准分子量，结果表明3，4，5，6，7为转基因阳性苗，1，2为转基因假阳性苗；b图为靶点附近片段扩增结果，其中1至7为再生植株，WT为受体材料，阴性对照“-”为ddH₂O，M表示DNA标准分子量，结果表明1-7均有扩增条带且与野生型大小基本一致，需进一步通过Sanger测序分析其序列。

将剩余产物回收，连入pMD18T载体中，挑取多个单克隆进行测序验证。突变方式分析如图5，其中方框内为靶点区域，下划线标记字母为PAM序列，“.”示缺失碱基，小写字母示插入碱基。突变后的基因序列如下：

基因型为Msga3ox1/-8bp/-8bp/-8bp/-36bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，有三条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-8bp基因，Msga3ox1/-8bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第350-357位共计8个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为Msga3ox1/-8bp-L3，该突变导致翻译提前终止；Msga3ox1/-8bp-L3基因的编码序列是将序列表中序列2的第350-357位共计8个核苷酸缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由147个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-8bp-L3；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-36bp基因，Msga3ox1/-36bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第320-355位共计36个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该突变导致翻译提前终止；Msga3ox1/-36bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第320-355位共计36个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由265个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-36bp【图5中Msga3ox1-3】。

基因型为Msga3ox1/-9bp/+1bp/+1bp/+1bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，一条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-9bp基因，Msga3ox1/-9bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第351-359位共计9个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该突变导致编码蛋白缺失3个氨基酸；Msga3ox1/-9bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第351-359位共计9个核苷酸缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由374个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-9bp；三条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/+1bp基因，Msga3ox1/+1bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第350-351位之间插入一个核苷酸G、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该突变导致翻译终止；Msga3ox1/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第350-351位之间插入一个核苷酸G、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由150个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/+1bp【图5中Msga3ox1-12】。

基因型为Msga3ox1/+1bp/+1bp/-8bp/-7bp的四等位杂合突变体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，两条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/+1bp基因，Msga3ox1/+1bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第350-351位之间插入一个核苷酸G、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该突变导致翻译提前终止；Msga3ox1/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第350-351位之间插入一个核苷酸G、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由150个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/+1bp；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-8bp基因，Msga3ox1/-8bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第350-357位共计8个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，命名为Msga3ox1/-8bp-L12，该突变导致翻译提前终止；Msga3ox1/-8bp-L12基因的编码序列是将序列表中序列2的第350-357位共计8个核苷酸缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由147个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-8bp-L12；一条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-7bp基因，Msga3ox1/-7bp基因是将MsGA3ox1编码序列(序列表中序列2)的第351-357位共计7个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，该突变导致翻译提前终止；Msga3ox1/-7bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第351-357位共计7个核苷酸缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由172个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-7bp【图5中Msga3ox1-15】。

基因型为Msga3ox1/-72bp/-72bp/WT/WT的杂合体植株与野生型紫花苜蓿相比，对于MsGA3ox1编码基因，有两条染色体中MsGA3ox1基因突变为Msga3ox1/-72bp基因，Msga3ox1/-72bp基因是将MsGA3ox1编码序列的第351-422位共计72个核苷酸缺失、保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子；Msga3ox1/-72bp基因的编码序列是将序列表中序列2的第351-422位共计72个核苷酸缺失，保持序列2的其他核苷酸序列不变得到的DNA分子，编码由353个氨基酸组成的蛋白质Msga3ox1/-72bp；其它两条染色体在紫花苜蓿基因组中MsGA3ox1编码序列未发生变化。需要说明的是，杂合突变体的表型与野生型没有明显差异，说明紫花苜蓿中MsGA3ox1的四等位突变对于其矮化表型是必须的。

3.表型鉴定：

对上述鉴定为T₀代阳性植株进行全营养条件下表型观测。与对照组植株相比，Msga3ox1突变体植株分支增多，株高降低(如图6)。

野生型和Msga3ox1-3，Msga3ox1-12和Msga3ox1-15T₀代阳性植株(图6)扦插后获得的15株突变体植株进行全营养条件下表型检测。紫花苜蓿WT，Msga3ox1突变体材料在1/2MS培养条件下生长六周，统计植株株高和节间长度。与对照组植株相比，Msga3ox1突变体植株(图6中a和图6中b)株高降低(图6中c)，节间长度降低(图6中d)。野生型平均株高为28.9cm，突变株平均株高为3.0cm，平均株高降低了89.6％；野生型第一节间平均长度为0.9cm，突变体第一节间平均长度为0.4cm，降低了55.5％；野生型第二节间平均长度为2.6cm，突变体第二节间平均长度为0.7cm，降低了73.1％；野生型第三节间平均长度为4.6cm，突变体第三节间平均长度为0.8cm，降低了82.6％；野生型第四节间平均长度为5.6cm，突变体第四节间平均长度为0.5cm，降低了91.1％；野生型第五节间平均长度为6.1cm，突变体第五节间平均长度为0.4cm，降低了93.4％；野生型第六节间平均长度为5.6cm；野生型第七节间平均长度为3.6cm；野生型第八节间平均长度为1.7cm。突变体植株由于株高及节间长度较野生型降低，无第六、第七及第八节间。

外源施加0.1mM植物赤霉素(GA₄)可使Msga3ox1突变体植株平均株高及平均节间长度恢复至野生型植株水平(图6中e)。

实施例2、利用优化的CRISPR/Cas9系统编辑紫花苜蓿MsNP1基因获得雄性不育材料

一、基因编辑载体p6401-MsNP1的构建

1.基因编辑靶点设计

紫花苜蓿MsNP1含有编码序列(CDS)是序列表中序列3所示的MsNP1编码基因。根据紫花苜蓿MsNP1基因组序列，通过在线靶点预测网站(http://crispor.tefor.net/)生成靶点列表，选择靶点1为5′-GCTACATTGAAGCCGCTAG-3′，靶点2为5′-TCTCTTTGAGAACCTGTGA-3′。

2.sgRNA模块的构建：由北京六合华大基因科技有限公司合成引物

MsNP1-Target1-BsF：5′-ATATATGGTCTCGCTTGGCTACATTGAAGCCGCTAGGTT-3′，其中第18位至第36位核苷酸为设计的MsNP1靶点1序列；

MsNP1-Target1-F0：5′-GGCTACATTGAAGCCGCTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3′，其中第2位至第20位核苷酸为设计的MsNP1靶点1序列；

MsNP1-Target1-R0：

5′-AACTCACAGGTTCTCAAAGAGACAATTTAATGGTTCGCTTGTA-3′，其中第4位至第22位核苷酸为设计的MsNP1靶点2的反向互补序列；

MsNP1-Target-BsR：5′-ATTATTGGTCTCGAAACTCACAGGTTCTCAAAGAGAC-3′，其中第18位至第36位为设计的MsNP1靶点2的反向互补序列；

通过搭桥PCR扩增得到带有靶点序列的sgRNA模块MsNP1-5CBC。

测序结果表明，MsNP1-5CBC如序列表中序列5所示。序列表中序列5的第18-36位为sgRNA1的编码序列，第806-824位为sgRNA2的编码序列。

3.基因编辑双元载体构建：利用Golden Gate反应将带有靶点序列的MsNP1-5CBC片段和p6401载体通过限制性内切酶BsaI进行酶切，同时通过T4 DNA连接酶进行连接，构成p6401-MsNP1(如图7)。反应完成后将产物加入大肠杆菌TOP10感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，加入不添加抗生素的LB液体培养基，37℃150rpm摇培45min，随后将菌液涂布于含有Kanamycin(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃黑暗倒置筛选培养12h。挑取单克隆至400μL含有Kanamycin(50mg/L)的LB液体培养基中37℃230rpm摇培6～8h，随后进行菌液PCR鉴定，以上述MsNP1-Target1-BsF和MsNP1-Target2-BsR为引物进行扩增，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带。提取阳性克隆质粒，并通过测序确定构建的转化载体p6401-MsNP1序列，其中测序引物为上述引物MsNP1-Target1-BsF和MsNP1-Target2-BsR。

测序结果表明p6401-MsNP1是用片段序列5第14-824位所示的碱基序列替换载体p6401的BsaI限制性内切酶切割位点之间的片段，保持载体p6401的其他序列不变得到的重组表达载体。p6401-MsNP1表达靶向于MsNP1基因的sgRNA1(靶标为为靶点1)和sgRNA2(靶标为靶点2)的两个sgRNA。

二、根癌农杆菌介导的紫花苜蓿叶盘遗传转化

1.将基因编辑双元载体p6401-MsNP1转入根癌农杆菌EHA105：将50ng质粒加入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴5min；将混合物加入预冷的电击杯中，1600V高压电击，随后加入500μL不加抗生素的YEP液体培养基吹打混匀，将菌液转移至离心管中，28℃200rpm摇培1h，取30μL菌液涂布在含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP固体筛选培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24～48h，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，以上述步骤(1)中的MsNP1-Target1-BsF和MsNP1-Target2-BsR为引物进行扩增反应，阳性克隆具有大小为841bp的特异条带，选取阳性克隆(将p6401-MsNP1导入根癌农杆菌EHA105得到的根癌农杆菌，命名为EHA105/p6401-MsNP1)进行下一步侵染。

3.农杆菌侵染液制备：将EHA105/p6401-MsNP1菌落转接至200mL含Rifampicin(75mg/L)和Kanamycin(50mg/L)的YEP液体培养基中，28℃230rpm摇培至OD_600nm为0.2-0.4。将EHA105/p6401-MsNP1菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000rpm离心10min，去上清，用200mL的SM4液体培养基(含乙酰丁香酮0.1mM)重悬，即制备成侵染液。

5.愈伤组织诱导和分化：将外植体转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的SM4固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导抗性愈伤组织，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每2周继代一次，共持续6周；随后将愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素B(10mg/L)的MSBK固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，持续3周；将胚性愈伤组织转移至含有筛选抗生素潮霉素B(5mg/L)的SH9固体培养基(同时含有特美汀200mg/L)上继续诱导芽分化，22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2MS固体培养基上生根，每3～4周继代一次，22℃、16h光照、8h黑暗培养；生根后移至营养土中，用保鲜膜覆盖保湿培养5天，然后揭膜，温室条件为22℃、16h光照、8h黑暗、湿度70％～80％培养。

三、紫花苜蓿再生苗的基因型鉴定

1.转基因鉴定：随机选取19棵再生苗进行基因型鉴定，取一片单叶提取基因组DNA，然后进行PCR检测。以质粒p6401-MsNP1为阳性对照，野生型基因组DNA为阴性对照，引物为MsNP1-Target1-BsF和MsNP1-Target2-BsR进行扩增，反应体系如下：2×Taq mix 10μL、MsNP1-Target1-BsF 1μL、MsNP1-Target2-BsR 1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O 7μL，反应总体积20μL。

反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为841bp，若存在相应大小的特异性条带，则该样品为转基因阳性，结果见图8，其中M示DNA标准分子量，阳性对照“+”为载体p6401-MsNP1质粒，阴性对照“-”为受体材料即野生型，序号1-19为遗传转化再生植株，结果表明2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19为转基因阳性植株，1，3，4为转基因假阳性植株；结果显示转基因阳性率为84.2％(16/19)。

2.突变方式鉴定：在靶标基因MsNP1靶点1和2附近的基因组序列中设计特异性引物MsNP1-TF和MsNP1-TR进行扩增，反应体系如下：2×Taq mix 15μL、MsNP1-TF 1μL、MsNP1-TR 1μL、模板DNA 1μL、ddH₂O 12μL、反应总体积30μL。

MsNP1-TF：5′-TTCAAGGATGCACGAGGGAC-3′；

MsNP1-TR：5′-AGGTCATGCCATGCCATACC-3′。

反应程序为：第一轮：95℃变性3min；第二轮：95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；第三轮：72℃延伸5min。反应结束后，取5μL产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小约为486bp，结果见图9。

图9为紫花苜蓿转入p6401-MsNP1载体获得再生植株的MsNP1基因型鉴定结果，其中M示DNA标准分子量，WT为受体材料，序号1-19为遗传转化再生植株，结果显示各样品均有扩增条带。

将剩余PCR产物一部分进行Sanger测序，测序引物为MsNP1-TF，分析靶点附近峰图情况，初步判断是否发生编辑，结果如图10，其中，WT为受体材料，2，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19均为转基因阳性植株。结果显示在16棵转基因阳性苗中靶点附近片段均呈现多重峰现象，说明16棵阳性苗均发生基因编辑，即获得基因编辑植株的效率为100％(16/16)；将剩余PCR产物直接回收，连入pMD18T载体中，挑取多个单克隆进行测序验证。具体突变方式如图11，其中方框内为靶点区域，下划线标记字母为PAM序列，“.”为缺失碱基，小写字母为插入碱基；结果表明单个靶点基因编辑效率96.9％。

植株基因编辑效率指发生基因编辑的植株数目/转基因阳性植株数目(16/16＝100％)，单个靶点基因编辑效率计算的是Target1处发生编辑的等位基因数目/所有转基因阳性植株中等位数目62/64＝96.875％(具体来说，分析这16棵转基因阳性苗突变方式，我们发现只有2棵中各保留了1个MsNP1野生型拷贝，其余的均发生了编辑，因此发生编辑的等位数目为4*16-2＝62，所有等位数目为4*16＝64)。

对突变获得的雄性不育系基因型鉴定，以突变体Msnp1/-2bp/(-2bp/+1bp)/(-6bp/+1bp)/(-9bp/-6bp)植株(图11中5号植株)为例。

基因型为Msnp1/-2bp/(-2bp/+1bp)/(-6bp/+1bp)/(-9bp/-6bp)的四等位突变体植株(图11中5号植株)与野生型紫花苜蓿相比，对于MsNP1基因，一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-2bp基因，Msnp1/-2bp基因是将序列表中序列3的第1066-1067位的核苷酸GC缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致翻译提前终止；Msnp1/-2bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1066-1067位的核苷酸GC缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由355个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-2bp。另一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-2bp/+1bp基因，Msnp1/-2bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1066-1067位的核苷酸GC缺失、并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸T、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致翻译提前终止；Msnp1/-2bp/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1066-1067位的核苷酸GC缺失、并在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸T、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由355个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-2bp/+1bp。另一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-6bp/+1bp基因，Msnp1/-6bp/+1bp基因是将序列表中序列3的第1062-1067位共计6个核苷酸缺失、同时在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸T、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致翻译提前终止；Msnp1/-6bp/+1bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1062-1067位共计6个核苷酸缺失、同时在第1084和第1085位核苷酸之间插入1个核苷酸T、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由430个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-6bp/+1bp。另一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-9bp/-6bp基因，Msnp1/-9bp/-6bp基因是将序列表中序列3的第1063-1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084和第1089位缺失了6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，该突变导致编码蛋白缺失5个氨基酸；Msnp1/-9bp/-6bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1063-1071位共计9个核苷酸缺失、同时在第1084和第1089位缺失了6个核苷酸、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码575个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-9bp/-6bp。

基因型为Msnp1/-23bp/-5bp/-21bp/wt的三等位突变体植株(图11中14号植株)与野生型紫花苜蓿相比，对于MsNP1基因，一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-23bp基因，Msnp1/-23bp基因是将序列表中序列3的第1046-1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致翻译提前终止；Msnp1/-23bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1046-1068位共计23个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由348个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-23bp。另一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-5bp基因，Msnp1/-23bp基因是将序列表中序列3的第1063-1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，导致翻译提前终止；Msnp1/-5bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1063-1067位共计5个核苷酸缺失、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由354个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-5bp。另一条染色体中MsNP1基因突变为Msnp1/-21bp基因，Msnp1/-21bp基因是将序列表中序列3的第1052-1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸TTACCAA、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，该突变导致编码蛋白缺失7个氨基酸；Msnp1/-21bp基因的编码序列是将序列表中序列3的第1052-1079位共计28个核苷酸缺失、同时在缺失段增加了7个核苷酸TTACCAA、保持序列3的其他核苷酸不变得到的DNA分子，编码由573个氨基酸组成的蛋白质Msnp1/-21bp。另一条染色体未发生突变；从而产生杂合形式的三等位突变体植株。需要说明的是，Msnp1三等位突变体的育性与野生型没有明显差异，说明紫花苜蓿中MsNP1的四等位突变对于其雄性不育表型是必须的。

三等位突变体植株可以作为雄性不育保持系使用。其应用方式如图16所示，以三等位突变体(保持系)为父本与四等位突变体(雄性不育系)杂交，后代能够按照1：1的比例产生雄性不育系和保持系，从而稳定保持两种材料；以四等位突变体(雄性不育系)为母本，选择优良的花粉供体进行杂交，能够产生杂交种F1。

3.表型鉴定

对获得的突变体进行表型鉴定，以突变体Msnp1/-2bp/(-2bp/+1bp)/(-6bp/+1bp)/(-9bp/-6bp)植株(以下简称Msnp1突变体)为例进行说明。

Msnp1突变体和对照材料(Control，遗传转化获得的假阳性植株，靶标基因未发生突变，基因型与受体材料一致)的花序特写如图12，结果表明Msnp1突变体花序结构及花器官形态与野生型相比无明显差异；Msnp1突变体和对照材料(Control)的雌雄蕊特写如图13，结果表明Msnp1突变体雌蕊与对照无形态差异，但是对照材料花粉从花药中散出，Msnp1突变体雄蕊无花粉外露；Msnp1突变体和对照材料(Control)亚历山大染色实验如图14，结果显示对照材料花粉粒近球形，能够染成紫红色并从花药中散出，Msnp1突变体花药内容物不能被染成紫红色，无成熟花粉粒；Msnp1突变体和对照材料(Control)I2-KI染色实验如图15，结果显示对照材料花粉粒近球形，能被染成黄褐色，而Msnp1突变体花药无被染色的花粉粒；以上结果说明Msnp1四等位突变体雄性不育。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 紫花苜蓿CRISPR/Cas9基因组编辑系统及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1576

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgttagcta ttttaattga agtattatct tcctttacct cttatattga ttcagctaaa 60

cttgggttat ttgaagaagc aaatgagcta tcaatgagat ctacacttgc agagtcagtt 120

tacaatgatg ttgtttttgg aatatgccta tcttatatga tcaatgaggc atttaattgg 180

gtgcatatga tatgatggtg gaaaaaggtg ctgctcctgg cttgggaatg atgactcatg 240

tggaatttgg tcttaaattt atcacatcct tttgggatgt gatgattgta tcacttgttc 300

attttgcaaa gacaaggtgc actgctacaa actttggttt aatctgaaat aaaacaaaac 360

tcactgagag gaagatgcat cccagtaggt gaaagttgag aagtatttgc atgttactat 420

tacacttgct ttttagtccc acatcgactg aaacagaaaa tatttcagcg tttatatact 480

tcaagcgaac cagtaggctt gnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc 540

aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 600

ttttgcaaaa ttttccagat cgatttcttc ttcctctgtt cttcggcgtt caatttctgg 660

ggttttctct tcgttttctg taactgaaac ctaaaatttg acctaaaaaa aatctcaaat 720

aatatgattc agtggttttg tacttttcag ttagttgagt tttgcagttc cgatgagata 780

aaccaataga gtgtcgtttt agtaaaaaaa attattttaa aatgaatatc atcacttttc 840

aatatagaat tattatttta cttccaatta taccctctaa ttaatttcca aagcattata 900

ccaatagtaa ataaagttag tttagtaaaa ttgtcatatc ttttaacatt attattagat 960

ttcttaattt gtgtttaaaa gctttaaacg atgatcattt ttaaacagag agtataaagt 1020

agtaaaatag tactattaga aatgaattga cgtgacatgc tatgaaaagt ctggaagagt 1080

atcgataaaa ggctacacta gaggtagcta cttatatgcg caggaactga aatcaaaaat 1140

gaaataaagg agaaggaaga tgcatgttgt gttatataag tgaaggagaa ggacttgcat 1200

gttgtgttat atttgcttgt tttagtccca catcgactga aacagaaagt atctcggcgt 1260

ttatatacta caagcgaacc attaaattgn nnnnnnnnnn nnnnnnnngt tttagagcta 1320

gaaatagcaa gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg 1380

gtgctttttt ttgcaaaatt ttccagatcg atttcttctt cctctgttct tcggcgttca 1440

atttctgggg ttttctcttc gttttctgta actgaaacct aaaatttgac ctaaaaaaaa 1500

tctcaaataa tatgattcag tggttttgta cttttcagtt agttgagttt tgcagttccg 1560

atgagataaa ccaata 1576

<210> 2

<211> 1134

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 2

atgccttcac tctcagaagc ctatagagct catccggtgc atgttaacca caagcaccct 60

gatttcaact cactacaaga acttcctgaa tcatacactt ggacacacct tgatgatcac 120

acccttatta attccaataa tactatgaag gagagtgcta atagtagtag tgttcccata 180

attgatctca atgacccaaa tgcttcaaag ttaataggac atgcatgcaa aacatggggt 240

gtgtatcaag tggtgaacca tggcatccca ataagcctcc ttgatgaaat tcaatggctt 300

ggacaaactc tcttcaccct tccctctcac caaaaactca aagccattcg ttccccggat 360

ggtgtttcag gttatggcct cgctcgcatc tcctccttct tccccaaact catgtggtcc 420

gagggattta ccatcgttgg atcccctctt gatcattttc gacaactttg gcctcaagat 480

tatgccaaac actgtgatac tgtcttgcaa tatgatgaag ccatgaaaaa gttagcgggg 540

aaactaatgt ggctaatgtt ggactctctt ggtattacaa tggaagatat cgaatgggct 600

ggctcaaaag cccaatttga tgagaaagcc tgtgcagcca tgcaactcaa ctcctaccct 660

agttgtccgg atccggatca cgccatgggt ctcgccccgc acacggactc aacatttcta 720

acgatccttt cccaaaatga cataagcggg ttgcaagttc aacgagaagg ttccgggtgg 780

gtcaatgtac ccccactcca tggaggactc gtggtcaacg taggcgacct attccacatt 840

ttgtcgaacg gattgtacac aagtgtgctc catcgggttt tagtgaaccg aactcgtcag 900

aggttttcgg ttgcgtattt gtatgggccc ccatcaaatg tagagatttg tccacatgag 960

aaattagtag gcccaacaca acctcccctt tataggtcag tgacttggaa tgagtacctt 1020

ggcacaaaag caaagcattt caacaaagca ctctcatccg ttagtctttg tgcacctatt 1080

aacggtttgt ttgatgtaaa cgactctaac aaaagtagtg tgcaagtggg ttaa 1134

<210> 3

<211> 1743

<212> DNA

<213> 紫花苜蓿(Medicago sativa)

<400> 3

atgagtgctt tgctgtggag gttaattctt ctttttcttg ctgggattgt tttctctcct 60

aaacattgtg tatctttaaa agatacaggt agaaaataca gttttatgca agatgcaact 120

tcagcaccaa tcatatcctt ctatgattac atcataattg gtggtggcac tgcagggtgt 180

cctttggctg caacactatc ccaaaatcat agggttttgg tgcttgaacg tggtggatca 240

ccttatggca acccaaacat aacaaattta agtgcctttg gtgttgcact ttctgataca 300

tctccttcct ctcctgctca acgattcatt tctgaagatg gtgttatcaa ctcaagggct 360

cgtgttctag gtggtggaag ttgtttgaat gctggcttct atactcgtgc aagccctcgc 420

tacgtaagtg aagctggttg ggatgaaaaa ttagtgaagg aatcatataa atgggtggag 480

agagtggtgg cattttggcc tcctatgcgt caatggcaat cagcagttag ggatggatta 540

ttggaagtag gtgtattgcc tgacaatggc tttacttatg atcatattca tgggactaag 600

gttggaggta caatctttga ccaaaatggt caaagacaca ctgctgctga tcttttggaa 660

tatgctaaca ccaacacaat tactcttctt ttgcatgcca ccgttcatag aatcttgttt 720

acaaaaagca aaggtggatt aatttcaaag ccaattgcac atggagttgt attcaaggat 780

gcacgaggga cagaacatag ggcatacttg aaacaaggga ttaggaatga gatcatagta 840

tccgctggtg cactaggtag cccacaactt ctgatgttga gtggaattgg agcagcacat 900

caccttaggg aacacaacat cagtgtagtg ttacatcaac catttgtagg acaaggaatg 960

tcagacaacc caatgaactc tgtttatgtc ccatctcctt ccccggtaga ggtttccctc 1020

atttctgttg ttggcattac caactttggc agctacattg aagccgctag cggcacaacc 1080

ttcacaggtt ctcaaagaga cttcggaatg ttttctccca agattggtca attttcaaag 1140

ttgccaccaa agcaaaggac cccagaagcc atagcaaaag caatagagag gatggagagc 1200

ttggaccaag aagctttcag gggtggattc attctagaaa aaatcttggg gccaatttca 1260

acgggtcatt tggagctccg aaacaccgat ccaaatgaga accctttggt aacatttaac 1320

tacttccaag acccaagaga cttagaaaga tgcatacaag gcatgagcac aattgagaaa 1380

attatagatt caaatgcttt ttctccattt aaatacacaa acatgtcagt ttctatgcta 1440

cttaacatga cagcaaattc accagtgaat ttattgccta aacacacaaa tacttcaatg 1500

tctttggaac aattttgtag agacactgtg atgactatat ggcattatca tggtggttgt 1560

caagttggta gggttgttga taatgattat aaggttcttg gtgtccatgc attgcgcgta 1620

atcgacggtt ctacctttaa tcattctcct ggaacaaatc ctcaagccac tgttatgatg 1680

cttggaaggt atatgggagt caaaatattg agagagagat ttgctgctga tgaaaccact 1740

taa 1743

<210> 4

<211> 841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atatatggtc tcgcttgaca ccatccgggg aacgaagttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatagagtgt cgttttagta aaaaaaatta ttttaaaatg aatatcatca cttttcaata 360

tagaattatt attttacttc caattatacc ctctaattaa tttccaaagc attataccaa 420

tagtaaataa agttagttta gtaaaattgt catatctttt aacattatta ttagatttct 480

taatttgtgt ttaaaagctt taaacgatga tcatttttaa acagagagta taaagtagta 540

aaatagtact attagaaatg aattgacgtg acatgctatg aaaagtctgg aagagtatcg 600

ataaaaggct acactagagg tagctactta tatgcgcagg aactgaaatc aaaaatgaaa 660

taaaggagaa ggaagatgca tgttgtgtta tataagtgaa ggagaaggac ttgcatgttg 720

tgttatattt gcttgtttta gtcccacatc gactgaaaca gaaagtatct cggcgtttat 780

atactacaag cgaaccatta aattgaagcc attcgttccc cggagtttcg agaccaataa 840

t 841

<210> 5

<211> 841

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atatatggtc tcgcttggct acattgaagc cgctaggttt tagagctaga aatagcaagt 60

taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120

gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180

ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240

tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300

aatagagtgt cgttttagta aaaaaaatta ttttaaaatg aatatcatca cttttcaata 360

tagaattatt attttacttc caattatacc ctctaattaa tttccaaagc attataccaa 420

tagtaaataa agttagttta gtaaaattgt catatctttt aacattatta ttagatttct 480

taatttgtgt ttaaaagctt taaacgatga tcatttttaa acagagagta taaagtagta 540

aaatagtact attagaaatg aattgacgtg acatgctatg aaaagtctgg aagagtatcg 600

ataaaaggct acactagagg tagctactta tatgcgcagg aactgaaatc aaaaatgaaa 660

taaaggagaa ggaagatgca tgttgtgtta tataagtgaa ggagaaggac ttgcatgttg 720

tgttatattt gcttgtttta gtcccacatc gactgaaaca gaaagtatct cggcgtttat 780

atactacaag cgaaccatta aattgtctct ttgagaacct gtgagtttcg agaccaataa 840

t 841

Claims

1.CRISPR/Cas9基因组编辑系统在紫花苜蓿基因组编辑中的应用，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因组编辑系统包括表达载体，所述表达载体包括Cas9表达盒、sgRNA1表达盒和sgRNA2表达盒，所述Cas9表达盒表达Cas9、sgRNA1表达盒表达名称为sgRNA1的sgRNA，所述sgRNA2表达盒表达名称为sgRNA2的sgRNA；所述sgRNA1表达盒含有名称为MtU6-6promoter的启动子和由所述MtU6-6promoter驱动的sgRNA1基因，所述sgRNA2表达盒含有名称为MtU6-5 promoter的启动子和由所述MtU6-5 promoter驱动的sgRNA2基因；所述sgRNA1和所述sgRNA2针对紫花苜蓿的同一靶标基因或不同靶标基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MtU6-6promoter是A1)或A2)的DNA分子：

A1)核苷酸序列是序列表中序列1第1-500位的DNA分子；

所述MtU6-5 promoter是A3)或A4)的DNA分子，

A3)核苷酸序列是序列表中序列1第789-1288位的DNA分子；

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1表达盒和所述sgRNA2表达盒均含有名称为AtU6-26t的终止子，所述AtU6-26t是B1)或B2)的DNA分子：

B1)核苷酸序列是序列表中序列1第605-788位的DNA分子；

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第1-788位，其中，序列1的第502-520位核苷酸与所述sgRNA1的靶标序列相同；所述sgRNA2表达盒的核苷酸序列是序列表中序列1的第789-1576位，序列1的第1290-1308位核苷酸与所述sgRNA2的靶标序列相同。

5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1和所述sgRNA2针对紫花苜蓿的同一靶标基因为MsGA3ox1基因，所述MsGA3ox1基因的编码序列(CDS)如序列表中序列2所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1的靶标序列是序列表中序列2的第347-365位核苷酸的反向互补序列，所述sgRNA2的靶标序列是序列表中序列2的第341-359位核苷酸。

7.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1和所述sgRNA2针对紫花苜蓿的同一靶标基因为MsNP1基因，所述MsNP1基因的编码序列(CDS)如序列表中序列3所示。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述sgRNA1的靶标序列是序列表中序列3的第1052-1070位核苷酸，所述sgRNA2的靶标序列是序列表中序列3的第1082-1100位核苷酸的反向互补序列。

9.权利要求1-8任一项所述的表达载体。

10.权利要求9所述的表达载体在制备匍匐型紫花苜蓿中的应用或在制备雄性不育紫花苜蓿或所述雄性不育保持系紫花苜蓿中的应用。