CN113106120B

CN113106120B - 针叶树植物基因编辑载体、构建方法、及其应用

Info

Publication number: CN113106120B
Application number: CN202110457879.2A
Authority: CN
Inventors: 孔立生; 崔莹; 张金凤; 赵健; 范英明; 李珊珊; 赵辉
Original assignee: Shenzhou Lvpeng Agricultural Science & Technology Co ltd; Beijing Forestry University
Current assignee: Shenzhou Lvpeng Agricultural Science & Technology Co ltd; Beijing Forestry University
Priority date: 2021-04-27
Filing date: 2021-04-27
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2041-04-27
Also published as: CN113106120A

Abstract

本发明公开了一种针叶树植物基因编辑载体、构建方法及其应用，分析白云杉、挪威云杉序列，与拟南芥U6启动子上游USE元件同源的PaU6启动子，构建敲除DXS1基因的基因编辑载体(PgCas9‑PaU6(DXS1))，建立的基因编辑载体能对针叶树植物基因进行精确编辑，产生DXS1基因完除的双等位或纯合突变体，显示了较高的基因编辑效率；对基因编辑位点分析表明，可在多个靶位点基因编辑，且在2个靶点同时发生基因编辑的植株发生率高，说明本发明基因编辑载体可实现多靶点编本发明的在针叶树中能高效、多靶点基因编辑的基因编辑载体可广泛应用于针叶树基因编辑，极大地针叶树基因功能研究及性状改良。

Description

针叶树植物基因编辑载体、构建方法、及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物的基因遗传转化方法，特别涉及一种针叶树种植物的基因编辑载体、构建方法及其应用，属于植物基因工程技术领域。

背景技术

针叶树是构成森林生态系统的重要树种，也是最重要的木材来源。根据FAO统计(FAOSTAT,http://www.fao.org/faostat/en/#home)，2019年，针叶树在sawlogs andveneer logs以及pulpwood,round and spit类别中分别占64.8％和51.4％，因此研究针叶树具有重要的经济和生态意义。目前针叶树的性状改良主要通过优良父母本杂交，通过分子辅助育种手段在后代群体中进行筛选实现，通常耗费较长的时间。我们亟需一种更快捷地引入目标性状或者对原有性状进行修饰的方法。

针叶树基因组庞大，大小在20～40Gb之间。已经有多种针叶树基因组得到测序，例如白云杉，挪威云杉、火炬松、和落叶松。尽管目前已经积累了大量的针叶树基因组及转录组信息，但是针叶树基因功能研究相对缓慢，其原因主要有：针叶树生长周期长，缺乏高效再生体系及转基因体系、缺少有效的突变体库等。

由于裸子植物与被子植物在细胞内分子调控机制不完全相同，通过已有的被子植物模式研究针叶树基因功能存在局限性，因此，需要在针叶树中建立基因功能研究体系。

CRISPR/Cas基因编辑体系(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats/CRISPR associated proteins)被广泛用于动植物基因功能研究及性状改良等。CRISPR/Cas系统根据效应蛋白可以分为多种类型，其中CRISPR/Cas9系统是最早被用于植物基因组编辑的CRISPR/Cas系统。天然的CRISPR/Cas9系统识别以NGG为特征的PAM(protospacer adjacent motif)序列，在PAM位点上游3bp位置造成双链断裂(DSB)，植物在对DSB进行修复时可能造成不精确的修复，从而在修复位点突变。CRISPR/Cas9基因编辑体系已经成功应用于大量被子植物，其中包括多种木本植物，如杨树、柑橘、葡萄、苹果、猕猴桃、石榴等。在裸子植物中，尽管近期有报道证明一种PAM-less Cas9 variant，SpRY，可以在兴安落叶松(Dahurian larch)原生质体中进行基因编辑，但是至今还没通过稳定转化获得基因编辑再生植株的报道。

在植物基因编辑体系建立过程中，由于白化表型具有易于观察的特点，因此经常被作为基因编辑的靶标基因。CLA1(cloroplastos alterados)基因编码1-脱氧木酮糖5-磷酸合酶(1-Deoxylulose 5-Phosphate Synthase)，是2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate(MEP)pathway(2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径)第一个酶，是叶绿素(chlorophyll)和类胡萝卜素(carotenoids)合成的必须基因。在棉花中，利用CRISPR/Cas9系统敲除CLA1基因可以产生白化表型。

目前针叶树中还没有与白化体相关基因的报道，但是在挪威云杉中克隆到3个DXS基因，其中DXS1在光合作用组织中组成型表达，推测可能与叶绿素和胡萝卜素合成相关。

发明内容

本发明的目的是针对现有针叶树植物遗传转化，尤其是采用基因编辑，通过转化获得基因编辑再生植株的过程中存在的无法获得发生基因编辑的再生植株等技术问题，提供一种针叶树植物基因编辑载体、建立方法及其应用，本发明方法通过构建针叶树中表达的基础基因编辑载体，克隆DXS1基因，设计基因敲除靶点，农杆菌介导的遗传转化方法优化，并通过农杆菌介导的遗传转化方法转入WSP3胚性细胞系，抗性细胞系通过体细胞胚胎发生过程形成大量体胚植株，通过Sanger测序方法检测到在靶位点发生纯合突变，双等位突变及杂合突变的基因编辑植株，为针叶树植物多位点基因编辑提供高效的工具，通过该工具可以快速大量地获得靶位点完全敲除及多个位点同时发生编辑的植株，为针叶树基因功能研究及育种创制材料。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种针叶树植物基因编辑载体，包括用于针叶树植物基因编辑的骨架载体、针对目的基因片段的gRNA，根据不同基因设计不同的gRNA，并将gRNA连接到用于编辑针叶树植物基因的CRISPR/Cas9载体上。

其中，所述针叶树植物为白云杉(Picea glauca(Moench)Voss)、挪威云杉(Piceaabies(L.)Karst.)或落叶松(Larix.spp)，优选为白云杉。

特别是，所述用于针叶树植物的基因编辑骨架载体为PgCas9/PaU6，所述PgCas9/PaU6包括：PCAMBIA1300突变载体、编码针叶树表达Cas9蛋白基因PgCas9、针叶树植物U6启动子PaU6启动子、gRNA骨架序列、双35S启动子、NOS终止子。

特别是，所述PCAMBIA1300突变载体为对PCAMBIA1300载体定点突变，消除BsaⅠ酶切位点的载体。

尤其是，包含PaU6启动子、gRNA骨架序列、双35S启动子、PgCas9、NOS终止子的序列连接到PCAMBIA1300突变载体的EcoRⅠ和HindⅢ位点，获得所述的基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6。

特别是，所述PgCas9的5’端连接双35s启动子，3’端连接NOS终止子；双35s启动子5’端连接PaU6启动子和gRNA骨架序列。

尤其是，所述gRNA骨架序列为与文献Xie K,Minkenberg B,Yang Y(2015)Boosting CRISPR/Cas9multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system.PNAS,112:3570-3575中相同的序列。

特别是，所述PgCas9基因的序列如SEQ ID NO.1所示；所述针叶树植物U6启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

尤其是，针叶树植物U6基因与拟南芥U6基因同源，

本发明另一方面提供一种针叶树植物基因编辑载体的构建方法，包括如下步骤：

1)设计针叶树植物Cas9基因

在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9基因的5′端和3′端分别添加核定位信号肽，获得NLS-SpCas9序列；然后根据针叶树植物密码子的偏爱性，对NLS-SpCas9序列进行优化，获得针叶树植物Cas9基因，命名为PgCas9基因，序列为SEQ ID NO.1；

2)用拟南芥AtU6-26序列在Congenie网站进行BLAST比对，在挪威云杉和白云杉基因组中分别比对，搜索得到5’上游超过500bp，且与拟南芥上游因子USE元件序列高度同源的序列；然后根据搜索到的同源序列设计引物，进行PCR扩增，能得到扩增的序列为针叶树植物的U6启动子，命名为PaU6启动子，序列为SEQ ID NO.2；

3)对PCAMBIA1300载体进行定点突变，消除BsaⅠ酶切位点，获得PCAMBIA1300突变载体；

4)合成包含PaU6启动子、gRNA骨架序列、双35S启动子、PgCas9、NOS终止子的序列，并将合成的序列连接到PCAMBIA1300突变载体的EcoRⅠ和HindⅢ位点，获得基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6；

5)根据白云杉DXS1基因序列设计靶基因引物DXS-4F和DXS-5R，以提取的针叶树植物的胚性组织DNA为模板，进行第一PCR扩增，获得待编辑DXS1基因片段确切序列，序列SEQID NO.9；接着利用CRISPOR工具设计靶基因的靶位点序列gRNA 1、gRNA 2，序列为SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11；

6)以包含gRNA-tRNA序列的PUC57质粒为模板，分别以3个引物对，分别为U-F/gRNA1-R；gRNA1-F/gRNA2-R；gRNA2-F/U-R；进行第二PCR扩增，获得3个PCR反应产物；

7)将纯化后的3个第二PCR反应产物进行第一连接反应，获得第一连接反应产物即组装敲除DXS1基因的PTGs序列；

8)以第一连接反应产物为模板，以U-2F、U-2R为引物，进行第三PCR扩增；

9)对第三PCR反应产物纯化后，与步骤步骤4)获得的基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6进行第二连接反应，获得第二连接反应产物；

10)第二连接反应产物转化大肠杆菌E.coli TOP10，获得阳性菌落进行培养提取质粒，获得针叶树植物基因编辑载体PgCas9/PaU6(DXS1)。

其中，步骤1)中所述核定位信号肽的NCBI序列号为：Sequence ID AKE81011.1。

特别是，针叶树植物密码子的偏爱性为针叶树第三位密码子偏爱A或者T。

尤其是，采用OptimumGene软件设计，对NLS-SpCas9序列进行优化，获得所述PgCas9基因。

特别是，所述针叶树植物选择挪威云杉、白云杉、落叶松，优选为白云杉。

其中，步骤2)中搜索到2条挪威云杉U6启动子系列为MA_830248:1..713、MA_491136:94..680；2条白云杉U6启动子系列为Pg-01r141201s2064917:16506..17094、Pg-01r141201s2067362:7613..8201(四条U6启动子序列见Congenie网站)与拟南芥上游因子USE元件序列高度同源。

特别是，步骤2)中设计的引物为PaU6-F：AAGCTTCCGGGTTCAAGTCCCGGCAA CG；PaU6-R：GGATCCCGAAGAGACAACAACTTAAGC。

其中，步骤3)中PCAMBIA1300载体定点突变的引物为P1300MF、P1300MR，引物序列分别为：

P1300MF：GGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTGTTTCCTGTGGATAGC；

P1300MR：GCTATCCACAGGAAACAGACCTTTTCGACCTTTTTCCCC。

其中，步骤4)中所述基因编辑骨架载体中，PgCas9的5’端连接双35s启动子，3’端连接NOS终止子；双35s启动子5’端连接PaU6启动子和gRNA骨架序列。

其中，步骤5)中所述提取的针叶树植物的胚性组织DNA为提取的挪威云杉、白云杉、落叶松的胚性细胞组织的DNA，优选为白云杉。

特别是，步骤5)中引物DXS-4F和DXS-5R序列分别为：

DXS-4F(5’-CTGCAGGCTTATCCTCACAAG-3’)；(SEQ ID NO.7)

DXS-5R(5’-CAGCTTACTCAGTGCACTGC-3’)(SEQ ID NO.8)。

尤其是，选择获得待编辑DXS1基因片段确切序列的位于内含子4两侧的两个靶位点为基因编辑位点，设计gRNA 1序列和gRNA 2序列，构建双靶点基因编辑载体PgCas9-PaU6(DXS1)。

特别是，所述gRNA 1序列和gRNA 2序列分别为：

gRNA1序列：ACTAGTATATCTGCTGGGCT；(SEQ ID NO.10)

gRNA2序列：CAATGTGCAGGCATGGCTGT。(SEQ ID NO.11)

其中，步骤6)中所述包含gRNA-tRNA序列的PUC57质粒按照如下方法获得：首先合成gRNA-tRNA序列，接着将合成的gRNA-tRNA序列克隆至PUC57质粒。

所述包含gRNA-tRNA序列的PUC57质粒的制备方法参照文献：其中gRNA-tRNA序列与文献Xie K,Minkenberg B,Yang Y(2015)Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editingcapability with the endogenous tRNA-processing system.PNAS,112:3570-3575中相同。

特别是，3个引物对的序列分别为：

gRNA1-F：TAGGTCTCAATCTGCTGGGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；SEQ ID NO.12；

gRNA1-R：CGGGTCTCCAGATATACTAGTTGCACCAGCCGGGAATC；SEQ ID NO.13；

gRNA2-F：TAGGTCTCAAGGCATGGCTGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；SEQ ID NO.14；

gRNA2-R：CGGGTCTCCGCCTGCACATTGTGCACCAGCCGGGAATC；SEQ ID NO.15；

U-F：CGGGTCTCATTCGAACAAAGCACCAGTGGTC；SEQ ID NO.16；

U-R：TAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC。SEQ ID NO.17。

其中，步骤7)中所述第一、第二连接反应为采用golden gate方法进行的goldengate连接反应。

其中，步骤8)中所述U-2F、U-2R引物的序列如下：

U-2F：5’-CGGGTCTCATTCG AACAA-3’；SEQ ID NO.18

U-2R：5’-TAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCG-3’。SEQ ID NO.19

特别是，步骤10)中获得的基因编辑载体PgCas9/PaU6(DXS1)为用HindⅢ/BamHⅠ和HindⅢ/EcoRⅠ进行酶切后，产生1.3kb和6.6kb大小酶切条带的质粒。

本发明又一方面提供一种按照上述方法构建的针叶树植物基因编辑载体在针叶树植物中进行基因编辑中的应用，包括如下步骤：

A)将构建的PgCas9-PaU6(DXS1)载体转化到农杆菌；然后对针叶树植物的胚性组织进行浸染处理，获得浸染胚性组织；

B)将浸染胚性组织移入胚性组织恢复培养基中，进行恢复培养，获得恢复培养胚性组织；

C)将恢复培养胚性组织转移至胚性组织筛选培养基中，进行筛选培养，每2周更换一次培养基，筛选获得阳性抗性组织；

D)将抗性组织转移至成熟培养基中，进行成熟培养，获得成熟子叶体胚；然后移入萌发培养基中进行萌发培养，获得基因编辑抗性植株。

其中，步骤A)中所述针叶树植物的胚性组织为挪威云杉、白云杉或落叶松胚性组织，优选为白云杉WSP3胚性组织；所述农杆菌为农杆菌菌株EHA105。

特别是，采用化学法、电转化法将构建的PgCas9-PaU6(DXS1)载体转入农杆菌，优选为电转化法。

尤其是，所述的农杆菌为农杆菌菌株EHA105。

其中，步骤A)中所述针叶树植物的胚性组织按照如下方法进行处理后再进行所述浸染处理：将胚性组织在固体增殖培养基上进行增殖培养后，从固体增殖培养基上移入到液体增殖培养基中进行培养，直至胚性组织充分分散；然后在去除液体增殖培养基后加入前处理培养基，对分散的胚性组织进行前处理培养6-8d。

特别是，所述前处理培养为暗培养，培养温度23±1℃；100±10rpm。

其中，步骤A)中所述浸染处理包括如下步骤：

A-1)将农杆菌菌液加入到前处理胚性组织中，于室温下进行浸染处理；侵染处理5-30min后进行抽滤，弃掉菌液；然后将胚性组织移到用液体共培养培养基润湿的滤纸上，于20-25℃，黑暗条件下，进行浸染-共培养；浸染-共培养2-4d后用胚性组织液体增殖培养基清洗浸染-共培养后的胚性组织1-2次；

A-2)用胚性组织浸泡培养基浸泡浸染-共培养处理后的胚性组织25-35min，获得浸染胚性组织。

特别是，胚性组织浸泡培养基为含有350-450mg/L(优选为400mg/L)头孢霉素的胚性组织液体增殖培养基。

其中，步骤B)中所述恢复培养的条件为23±1℃，暗培养；恢复培养时间为6-8d，优选为7d。

特别是，所述胚性组织恢复培养基为含有350-450mg/L头孢霉素(Cef)的固体增殖培养基。

其中，步骤C)中所述筛选培养的培养条件为于23±1℃，暗培养；筛选培养时间为28-42d。

特别是，所述胚性组织筛选培养基为含有350-450mg/L头孢霉素和10-15mg/L潮霉素的固体增殖培养基。

其中，步骤D)中所述成熟培养基条件为(23±1)℃，暗培养；成熟培养时间27-35d。

特别是，还包括对成熟子叶体胚进行驯化处理后，再进行萌发培养，其中所述驯化处理条件为4±0.2℃下恒温培养至少10d，优选为10-28d。

尤其是，所述萌发培养包括如下步骤：

D-1)驯化处理后的成熟子叶体胚在光照强度为500-1000Lux；光照周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下，进行第一萌发培养6-8d(优选为7d)；

D-2)然后在光照强度为2000-3000Lux；光照周期为16小时光照/8小时黑暗的条件下，进行第二萌发培养50-75d(优选为60d)，获得抗性植株。

特别是，还包括步骤E)：对获得的基因编辑抗性植株进行基因编辑位点分析。

本发明的针叶树植物基因编辑体系的建立方法，包括：根据针叶树密码子偏爱性对Cas9基因进行优化；从针叶树中克隆U6启动子并且进行功能验证；对pCAMBIA1300载体进行定点突变；农杆菌介导的遗传转化方法优化；靶基因克隆及测序；gRNA设计及基因编辑载体构建；农杆菌介导的遗传转化；抗性组织筛选、成熟、萌发；抗性植株中靶基因PCR扩增；PCR扩增产物Sanger测序分析基因编辑等过程。

与现有技术相比，本发明方法具有如下优点：

本发明方法中对基因编辑基础载体中的Cas9基因根据针叶树密码子偏爱性进行优化，提高了Cas9在针叶树中的表达效率；U6启动子来源于针叶树，保证其驱动的gRNA在针叶树中的表达效率；遗传转化体系经过优化，遗传转化效率具有稳定可重复的特点；

本发明构建的CRISPR/Cas9基因编辑体系可以在白云杉中有效的进行基因编辑；

本发明方法构建合成的基因编辑基础载体可以用于快速便捷的基因编辑载体构建，构建的基因编辑载体结合本发明中优化的遗传转化方法可以快速大量地获得靶位点完全敲除及多个位点同时发生编辑的植株。

附图说明

图1为PaU6:GUS在针叶树胚性组织中的表达，其中a为PaU6:GUS在白云杉胚性组织中的表达；b为在落叶松胚性组织中的表达；

图1A为基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6图；

图2a为DXS1基因编辑位点，其中PAM位点用斜体字母标示；

图2为白云杉遗传转化抗性组织、体胚、萌发植株，其中：b为农杆菌介导遗传转化获得的抗性组织；c为抗性组织成熟培养获得体细胞胚胎；d为体细胞胚胎萌发成的绿色植株；f为体细胞胚胎萌发成的白色植株；g为体细胞胚胎萌发成的绿色和白色嵌合体植株，白色、绿色和嵌合体体细胞胚胎植株分别用A,G和M标注；

图2e为抗性体细胞胚胎植株hpt基因PCR检测结果，图中M为DNA marker，P为阳性对照(质粒PgCas9/PaU6)，WT为野生型体细胞胚胎植株，1-20为抗性体细胞胚胎植株；

图3a为白化植株中纯合突变体和双等位突变体编辑位点峰图；其中编辑位点用箭头标注，PAM位点用矩形框标注；

图3b为纯合突变体植株基因编辑位点序列分析图；

图3c为双等位突变体植株基因编辑位点序列分析图；

图3d为双靶点突变体植株基因编辑位点序列分析图；

图3e为杂合突变体植株基因编辑位点序列分析图；其中图3b-3e中靶位点序列用下划线标注，PAM位点用矩形框标注，序列左侧为基因编辑植株编号，序列右侧+n bp和-nbp分别表示插入和缺失碱基数。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

1、植物材料

(1)稳定的白云杉(Picea glauca(Moench)Voss)WSP3胚性细胞系

白云杉成熟种子依次用75％酒精消毒30s；0.1％升汞消毒10min；1：1稀释的84消毒液消毒8min；每次消毒后用灭菌蒸馏水清洗2-3次；在无菌条件下将成熟胚接入胚性组织诱导培养基，23±1℃，黑暗条件诱导45d(通常为30-60d)，获得白云杉WSP3胚性组织；将诱导出的WSP3胚性组织接种至胚性组织固体增殖培养基上，23±1℃、黑暗条件培养，每2周继代一次，获得白云杉WSP3胚性组织，备用。

(2)挪威云杉(Picea abies(L.)Karst.)NP1胚性细胞系

挪威云杉未成熟种子依次用75％酒精消毒30s；0.1％升汞消毒10min；1：1稀释的84消毒液消毒8min；每次消毒后用灭菌蒸馏水清洗2-3次；在无菌条件下将未成熟胚接入胚性组织诱导培养基，23±1℃，黑暗条件诱导45d(通常为30-60d)，诱导出挪威云杉NP1胚性组织；将NP1胚性组织接种至胚性组织固体增殖培养基上，23±1℃、黑暗条件培养，每2周继代一次，获得挪威云杉NP1胚性组织，备用。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、脱落酸(ABA)、头孢霉素(Cef)、卡那霉素(Kan)；诱导转化物选用乙酰丁香酮(AS)。

3、培养基

(1)1/2mLV培养基

表1 1/2mLV培养基配方

1/2mLV基本培养基(Kong et al.,2007.Journal of Experimental Botany 58:1525–1531)是根据LV基本培养基配方(Litvay et al.,1985.Plant Cell Reports 4:325–328)优化而成。

上述三种(I,II，III)培养基母液配制好后，分别进行标记，储存于温度为4℃的冰箱中，待用。根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液和称量好的植物凝胶、蔗糖或/和麦芽糖、水解酪蛋白，每加入一种都充分搅拌，最后加水定容至培养基最终体积，用1mol的NaOH或1mol的HCl将pH调整至5.8。在121℃下恒温灭菌15分钟。在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，待培养基冷却到50℃左右，加入到培养基中混合摇匀。

(1A)胚性组织诱导培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 2mg/L+6-BA 1.0mg/L+酸水解酪蛋白0.8g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L，pH 5.8；

(2)胚性组织固体增殖培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L，pH 5.8；

(3)胚性组织液体增殖培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L，pH 5.8；

(4)胚性组织前处理培养基：1/2mLV基本成份+ABA 30μM+酸水解酪蛋白0.4g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L，pH 5.8；

(5)成熟培养基：1/2mLV基本成份+ABA 45μM+酸水解酪蛋白0.2g/L+谷氨酰胺0.4g/L+蔗糖30g/L+麦芽糖10g/L+植物凝胶6g/L，pH 5.8；

(6)LB培养基：酵母抽提物5g/L+胰蛋白10g/L+NaCl 10g/L+琼脂16g/L+卡那霉素50mg/L；

(7)液体共培养培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+AS 50μM，pH 5.8；

(8)胚性组织浸泡培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+头孢霉素350-450mg/L，pH 5.8；

(9)胚性组织恢复培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L+头孢霉素350-450mg/L，pH5.8；

(10)胚性组织筛选培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L+潮霉素10-15mg/L+头孢霉素350-450mg/L，pH 5.8；

(11)萌发培养基：1/2mLV基本成份+NH₄NO₃ 0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+植物凝胶3.2g/L，pH 5.8)。

4、培养条件

胚性组织诱导、胚性组织固体培养基上增殖、胚性组织液体培养基中增殖、胚性组织前处理、胚性组织成熟、遗传转化共培养、恢复培养、筛选培养过程均避光(即暗培养)，23±1℃；

体细胞胚胎萌发培养过程为光培养：光强500-3000Lux，16小时光照/8小时暗培养，23±1℃。

实施例1设计PgCas9基因

1、在酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9(SpCas9)基因的5′端和3′端分别添加核定位信号肽(nuclear localization signal,NLS)(NCBI，Sequence IDAKE81011.1)，获得NLS-SpCas9序列；

2、根据白云杉密码子偏爱性，采用OptimumGene软件(金斯瑞(GenScript)公司)设计，对添加了核定位信号肽的SpCas9序列(NLS-SpCas9)进行优化，获得白云杉Cas9基因(命名为PgCas9基因，SEQ ID NO.1)。

针叶树第三位密码子偏爱A或者T，这与其它植物明显不同，根据白云杉密码子偏爱性，采用OptimumGene软件对SpCas9基因进行序列优化。

3、OptimumGene软件分析PgCas9基因显示：PgCas9基因的GC含量为36.94％，在白云杉中Codon Adaptation Index(CAI)为0.93，意味着本发明的PgCas9基因能在白云杉中高效表达。

实施例2克隆PaU6启动子

根据拟南芥AtU6-26基因序列(GenBank:X52528.1)，从挪威云杉及白云杉基因组数据库(https://congenie.org/)中查找同源序列，分析其上游启动子序列，从挪威云杉胚性细胞系NP1和白云杉胚性细胞系WSP3中克隆U6启动子序列(PaU6启动子)。

1、拟南芥AtU6-26启动子序列含有两个保守的上游因子(upstream elements),分别是USE元件和TATA元件，其中USE元件以5’-RTCCCACATCG-3’为特征(Waibel F,Filipowicz W(1990)U6 snRNA genes of Arabidopsis are transcribed by RNApolymeraseⅢbut contain the same two promoter elements as RNA polymeraseⅡ-transcribed U-snRNA genes.Nucleic Acids Research,18:3451-3458.)序列；

用拟南芥AtU6-26序列在Congenie网站进行BLAST比对，在挪威云杉和白云杉基因组中分别比对到有6个同源性>96％的DNA片段。对6个DNA片段的5’端序列进行分析，搜索到有9条序列的5’上游超过500bp，其中有2条来自挪威云杉、2条来自白云杉的序列可以搜索到保守序列TCCCACATGC。该保守序列与拟南芥上游因子(USE元件)RTCCCACATCG序列高度同源，因此这4条序列很可能是挪威云杉或者白云杉U6 SnRNA启动子序列，2条挪威云杉U6启动子系列为MA_830248:1..713、MA_491136:94..680；2条白云杉U6启动子系列为Pg-01r141201s2064917:16506..17094、Pg-01r141201s2067362:7613..8201(四条U6启动子序列见Congenie网站)。

2、用DNA抽提试剂盒从白云杉的WSP3、挪威云杉的NP1胚性细胞系中分别提取DNA，提取方法参照试剂盒(DP360，TIANGEN Biotech(Beijing)CO.,Ltd.)说明，分别以提取的DNA为模板进行PCR扩增。

根据上述4条可能为挪威云杉或者白云杉U6启动子序列设计引物，其中1条来自挪威云杉的U6启动子序列(MA_491136:94..680)得到PCR扩增产物，命名为PaU6启动子(PaU6promoter，SEQ ID NO.2)，其中：PaU6启动子扩增引物：

PaU6-F(AAGCTTCCGGGTTCAAGTCCCGGCAACG)；SEQ ID NO.3

PaU6-R(GGATCCCGAAGAGACAACAACTTAAGC)。SEQ ID NO.4

PCR扩增体系按照KOD-Plus-Neo(KOD-401，TOYOBO)试剂盒说明进行。

PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性15s，56℃退火30s，68℃延伸40s；重复30个循环；68℃终延伸5min。

PCR扩增产物PaU6启动子，利用克隆试剂盒(CB101-01，北京全式金生物技术有限公司)进行克隆并测序(北京擎科生物技术有限公司)，克隆得序列为SEQ ID NO.2。

扩增产物与参考基因序列(挪威云杉的U6启动子序列(MA_491136:94..680)相比，转录起始位点上游225bp序列相对保守，在该保守序列上游有超过120bp核苷酸插入，这种差异可能是由针叶树基因组高度杂合的缘故。

本发明具体实施方式部分，均委托北京擎科生物技术有限公司进行核苷酸测序。

将PaU6启动子与GUS基因连接，克隆到PCAMBIA1300载体，然后转化农杆菌EHA105，获得菌株EHA105(PaU6:GUS)。用EHA105(PaU6:GUS)侵染白云杉和落叶松胚性组织，最后侵染过的材料用GUS染液(G3060,Solarbio)进行检测，检测步骤按照试剂盒说明进行，结果显示被侵染过的白云杉和落叶松胚性组织上有蓝色斑点(如图1)，GUS基因可以在这些组织中表达，说明本发明扩增产物PaU6启动子具有活性，可用于针叶树基因编辑载体的构建。

实施例3 PCAMBIA1300载体定点突变

利用定点突变试剂盒(D0206,Beyotime Biotechnology)对PCAMBIA1300载体进行定点突变，消除BsaⅠ酶切位点，获得PCAMBIA1300突变载体，具体突变方法如下：

定点突变引物如下：

P1300MF(GGGGAAAAAGGTCGAAAAGGTCTGTTTCCTGTGGATAGC)，SEQ ID NO.5；

P1300MR(GCTATCCACAGGAAACAGACCTTTTCGACCTTTTTCCCC)，SEQ ID NO.6。

具体操作过程按照试剂盒说明进行。对定点突变后的PCAMBIA1300载体序列进行测序，PCAMBIA1300载体中BsaⅠ位点被去除。

实施例4构建基因编辑骨架载体

1、在最终的基因编辑骨架载体中的PgCas9的5’端连接双35s启动子(double 35Spromoter)，3’端连接NOS终止子；双35s启动子5’端连接PaU6启动子和gRNA骨架序列；

合成包含PaU6启动子、gRNA骨架序列、双35S启动子(double CaMV 35S启动子)、PgCas9、NOS终止子的序列(SEQ ID NO.22，委托北京金斯瑞公司完成)，并将合成的序列连接到PCAMBIA1300突变载体的EcoRⅠ和HindⅢ位点，获得基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6(又称PgCas9/PaU6 plasmid，PgCas9/PaU6质粒，如图1A所示)。

gRNA骨架序列为与文献Xie K,Minkenberg B,Yang Y(2015)Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processingsystem.PNAS,112:3570-3575(简称文献Xie et al.(2015))中相同的序列。

实施例5构建DXS1基因编辑载体(PgCas9-paU6(DXS1))

5-1)用DNA抽提试剂盒提取白云杉胚性细胞系WSP3胚性组织DNA，提取方法参照试剂盒(DP360，TIANGEN Biotech(Beijing)CO.,Ltd.)说明。

5-2)第一PCR扩增

将已经报道的DXS1基因序列(Phillips MA,Walter MH,Ralph SG,Dabrowska P,Luck K,Urós EM,Boland W,Strack D,Rodríguez-Concepción M,Bohlmann J,GershenzonJ(2007)Functional identification and differential expression of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase in induced terpenoid resin formation of Norwayspruce(Picea abies).Plant Molecular Biology,65:243-257.)在Congenie网站(https://congenie.org/)进行BLAST比对，从Congenie网站获得白云杉DXS1基因序列，并且根据白云杉DXS1基因序列设计靶基因引物DXS-4F和DXS-5R，

DXS-4F(5’-CTGCAGGCTTATCCTCACAAG-3’)；(SEQ ID NO.7)

DXS-5R(5’-CAGCTTACTCAGTGCACTGC-3’)(SEQ ID NO.8)

以提取的WSP3的DNA为模板，用引物DXS-4F和DXS-5R进行第一PCR扩增，获得第一PCR扩增产物(SEQ ID NO.9，即待编辑DXS1基因片段确切序列)，其中第一PCR扩增体系按照KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)试剂盒说明进行。

PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸30s；重复30个循环；68℃终延伸5min。

5-3)设计基因编辑位点序列

对第一PCR扩增产物进行测序(委托北京擎科生物科技有限公司进行)，获得白云杉WSP3胚性细胞系DXS1基因第4和第5外显子之间的准确DNA序列，利用CRISPOR(crispor.tefor.net)查找基因编辑位点，最终选择位于内含子4两侧的两个靶位点(target 1、target 2)为基因编辑位点，设计gRNA 1序列和gRNA2序列，构建双靶点基因编辑载体PgCas9/PaU6(DXS1)(如图2a)。

gRNA1序列：ACTAGTATATCTGCTGGGCT；(SEQ ID NO.10)

gRNA2序列：CAATGTGCAGGCATGGCTGT；(SEQ ID NO.11)

5-4)第二PCR扩增

按照文献Xie et al.,(2015)的原理及方法构建Polycistronic tRNA-gRNA(PTG)。以包含gRNA-tRNA序列(参见Xie et al.,2015)的PUC57质粒为模板，以按照gRNA 1序列和gRNA 2序列设计引物gRNA1-F、gRNA1-R；gRNA2-F、gRNA2-R(如表1)；按照gRNA-tRNA序列设计引物U-RF、U-R(如表1)进行第二PCR扩增；其中，gRNA-tRNA序列与文献Xie etal.,(2015)中相同，由金斯瑞公司合成；将gRNA-tRNA序列与质粒PUC57相连接。

分别用如表1所示的3个引物对U-F/gRNA1-R；gRNA1-F/gRNA2-R；gRNA2-F/U-R，按照表2、3体系、程序进行3个PCR反应，获得3个PCR反应产物(即第二PCR产物)。

表1第二PCR扩增设计合成引物

gRNA1-F	TAGGTCTCAATCTGCTGGGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；SEQ ID NO.12
		gRNA1-R	CGGGTCTCCAGATATACTAGTTGCACCAGCCGGGAATC；SEQ ID NO.13
gRNA2-F	TAGGTCTCAAGGCATGGCTGTGTTTTAGAGCTAGAAATAG；SEQ ID NO.14
		gRNA2-R	CGGGTCTCCGCCTGCACATTGTGCACCAGCCGGGAATC；SEQ ID NO.15
U-F	CGGGTCTCATTCGAACAAAGCACCAGTGGTC；SEQ ID NO.16
		U-R	TAGGTCTCCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC；SEQ ID NO.17

表2第二PCR扩增体系

PUC57(gRNA-tRNA)质粒	0.1ng
		10×KOD buffer	2μL
dNTPs(8mM)	2μL
		MgSO<sub>4</sub>(25mM)	0.8μL
Forward primer(10μM)(F正向引物)	0.6μL
		Reverse primer(10μM)(R反向引物)	0.6μL
KOD(1U/μL)KOD-401,TOYOBO	0.4μL
		ddH<sub>2</sub>O	XμL
总体积至	20μL

表3第二PCR扩增程序

5-5)第一连接反应

第二PCR扩增过程中的3个PCR反应产物分别用通用DNA纯化试剂盒(UniversalDNA Purification Kit,(DP214,TIANGEN BIOTECH CO.,LTD,Beijing,China))进行纯化；纯化后的产物利用golden gate方法按如表4所示体系进行第一连接反应(golden gate连接反应)，获得第一连接反应产物(即组装敲除DXS1基因的PTGs)：

表4第一golden gate连接体系

Each of the three PCR products(每一个PCR扩增产物)	20ng
		10×T<sub>4</sub> DNA ligase Buffer	2μL
BsaI(10U/μL)(R0535V,NEB)	0.5μL
		T<sub>4</sub>DNA ligase(400U/μL)(M0202V,NEB)	0.1μL
ddH<sub>2</sub>O	XμL
		总体积至	20μL

第一Golden gate反应程序：37℃,5min；20℃,5min共15个循环；

5-6)第三PCR扩增

第一连接反应产物稀释10倍后作为第三PCR扩增反应模板，以U-2F(5’-CGGGTCTCATTCGAACAA-3’，SEQ ID NO.18)、U-2R(5’-TAGGTCTCCAAACAAA AAAAAAA GCACCG-3’，SEQ ID NO.19)为引物，在50μL PCR体系中进行第三PCR扩增，第三PCR反应体系及程序如表5、6所示，获得第三PCR扩增产物：

表5第三PCR反应体系：

Ligation product(1:10dilution)(Golden gate连接反应产物)	3μL
		10×KOD buffer	3μL
dNTPs(8mM)	3μL
		MgSO<sub>4</sub>(25mM)	1.2μL
U-2F(10μM)	0.9μL
		U-2R(10μM)	0.9μL
KOD(1U/μL)(KOD-401,TOYOBO)	0.6μL
		H<sub>2</sub>O	XμL
总体积至	30μL

表6第三PCR反应程序

5-7)第二连接反应

第三PCR产物用通用DNA纯化试剂盒进行纯化后，与实施例4构建的基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6，利用golden gate方法按如表7所示体系和程序进行第二连接反应，获得第二连接产物。

表7第二golden gate连接反应体系

PgCas9/PaU6 plasmid	100ng
		第三PCR产物	50ng
10×BsaI buffer	1.5μL
		ATP(10mM)(P0756S,NEB)	1.5μL
BsaI(10U/μL)(R0535V,NEB)	1μL
		T<sub>4</sub>DNA ligase(400U/μL)(M0202V,NEB)	0.1μL
ddH<sub>2</sub>O	XμL
		总体积至	15μL

第二golden gate连接反应程序：37℃孵育2min，然后进行15个循环的10℃,3min,20℃,5min,最后于37℃孵育2min。

5-8)将第二产物转化进入E.coli TOP10(DL1010，上海唯地生万物技术有限公司)，转化方法参见本感受态使用说明，获得阳性菌落，通过PCR方法及测序方法筛选阳性克隆，阳性克隆进一步用酶切方法验证，挑选用HindⅢ/BamHⅠ和HindⅢ/EcoRⅠ进行酶切后，可以分别产生1.3kb和6.6kb大小酶切条带的质粒，命名为PgCas9/PaU6(DXS1)(即DXS1基因编辑载体)。

实施例5A电转化农杆菌

将DXS1基因编辑载体(PgCas9/PaU6(DXS1))电转化到农杆菌菌株EHA105(AE1010,上海唯地生物技术有限公司)，转化方法参见说明，用于后续的遗传转化。

实施例6农杆菌介导的遗传转化

6-1、WSP3胚性组织增殖培养

将0.8g WSP3胚性组织从固体增殖培养基上移入到50mL液体增殖培养基中，100rpm(通常为100±10rpm)，23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件进行液体增殖培养，每周更换1次液体增殖培养基；待胚性组织充分分散以后，去除液体增殖培养基；

然后再加入前处理培养基，于(23±1)℃，100±10rpm，黑暗条件下，进行前处理培养，培养7d(通常为6-8d)，获得前处理WSP3胚性组织，其中：

6-2、制备浸染菌液

将实施例5A制备的用于遗传转化的、电转化的农杆菌菌株EHA105接种在LB培养基上，于28℃(通常为28±0.5℃)下暗培养2d(通常为1-3d)；收集农杆菌菌体，加入50mL液体共培养培养基中，于28℃(通常为28±0.5℃)下培养2h(通常为1-3h)后用液体共培养基培养调节农杆菌菌液的浓度OD₆₀₀值为0.5(通常为0.5-1.0)，制得浸染菌液；

6-3、浸染处理

将浸染菌液(农杆菌菌液)加入到前处理WSP3胚性组织(1g)中，于室温下，进行浸染处理；侵染处理15min(通常为5-30min)后进行抽滤，弃掉菌液；然后将WSP3胚性组织移到用1mL液体共培养培养基润湿的滤纸上，于25℃(通常为20-25℃)，黑暗条件下，进行浸染-共培养；浸染-共培养3d(通常为2-4d)后用胚性组织液体增殖培养基清洗浸染-共培养后的WSP3胚性组织1次(通常1-2次)；

再用胚性组织浸泡培养基浸泡浸染-共培养处理后的WSP3胚性组织30min(通常为25-35min)，获得浸染胚性组织；其中胚性组织浸泡培养基为含有400mg/L(通常为350-450mg/L)头孢霉素的胚性组织液体增殖培养基；

胚性组织浸泡培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+头孢霉素400mg/L，pH 5.8；

使用含有400mg/L(通常为350-450mg/L)头孢霉素的液体增殖培养基浸泡浸染处理的WSP3胚性组织可以使浸染-共培养后的胚性组织中的农杆菌有效清除。

6-4、恢复培养

抽滤，弃掉胚性组织浸泡培养基，将浸染胚性组织移入胚性组织恢复培养基中，于23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件下，进行恢复培养，恢复培养7d(通常为6-8d)，获得恢复培养胚性组织，其中：胚性组织恢复培养基为含有400mg/L(通常为350-450mg/L)头孢霉素(Cef)的固体增殖培养基；

胚性组织恢复培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L+Cef 400mg/L，pH 5.8；

6-5、筛选培养

将恢复培养胚性组织转移至胚性组织筛选培养基中，于23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件下，进行筛选培养，每2周更换一次培养基，筛选培养28-42d，待有抗性组织长出后，将抗性组织进行继代培养，其中在继代培养过程中，每14d更换一次筛选培养基；其中：胚性组织筛选培养基为含有400mg/L(通常为350-450mg/L)头孢霉素和10mg/L(通常为10-15mg/L)潮霉素的固体增殖培养基；

胚性组织筛选培养基：1/2mLV基本成份+2,4-D 1mg/L+6-BA 0.5mg/L+酸水解酪蛋白0.5g/L+谷氨酰胺0.5g/L+蔗糖10g/L+植物凝胶3g/L+潮霉素10mg/L+Cef 400mg/L，pH5.8；

6-6、抗性组织前处理

然后将继代培养(通常选择继代培养至质量大于0.8g的抗性组织)的抗性组织转移至胚性组织液体增殖培养基中，100rpm(通常为100±10rpm)，23℃(通常为23±1℃)，黑暗条件进行液体增殖培养，每周更换1次液体增殖培养基；待抗性组织充分分散后，加入前处理培养基，于(23±1)℃，100±10rpm，黑暗条件下，进行抗性组织的前处理培养，培养7d(通常为6-8d)，获得前处理WPS3抗性组织；

6-7、成熟培养

将前处理WPS3抗性组织移至成熟培养基中，(23±1)℃，黑暗条件下，进行成熟培养，成熟培养30d(通常为27-35d)，获得成熟子叶体胚，胚性组织发育成子叶胚：

6-8、萌发培养

将成熟子叶胚组织置于4℃(通常为4±0.2℃)培养箱至少10d(通常为10-28d)，进行驯化处理；

针叶树体胚要经过4℃驯化才能萌发，其中驯化处理时间≥10天(通常为-10-28d)。

将驯化处理后的成熟子叶体胚移入萌发培养基，弱光下进行第一萌发培养，其中第一萌发培养过程中，光照强度为500-1000Lux；光照周期为16小时光照/8小时黑暗；第一萌发培养7d(通常为6-8d)后，再转移至强光下进行第二萌发培养，其中第二萌发培养过程中，光照强度为2000-3000Lux；光照周期为16小时光照/8小时黑暗；第二萌发培养60d(通常为50-75d)，获得抗性植株，其中：

2次独立的遗传转化实验(即农杆菌介导遗传转化重复2次)获得3个抗性组织(转基因事件，R1、R2、R3)，抗性组织如图2b。3个抗性组织经过增殖和成熟发育成体细胞胚胎(图2c)，经过萌发培养，获得体细胞胚胎植株(图2d、2f、2g)。

由3个抗性组织发育成的体细胞胚胎植株均出现3种表型，包括绿色、白化以及绿色和白色嵌合体植株(图2d、2f、2g)，其数量如表8所示。由于白云杉体细胞胚胎在萌发过程中极少出现白化现象，因此推测白化植株是由于DXS1基因发生编辑导致的。

表8遗传转化的抗性植株表型统计表

转基因事件	总的体胚植株	白化体胚植株	嵌合体植株
				R1	1139	2(0.18％)	1(0.09％)
R 2	532	12(2.26％)	1(0.19％)
				R 3	503	11(2.19％)	1(0.20％)

R1、R2和R3分别代表2次重复遗传转化实验获得的3个抗性组织。

实施例6A农杆菌介导的遗传转化

除了步骤6-1)中液体增殖培养至胚性组织充分分散后，不进行前处理，在步骤6-3)中直接加入步骤6-2)制备的浸染菌液之外，其余与实施例6相同。

统计每克被侵染的胚性组织最后形成的抗性组织块数。不经过前处理，每克被侵染材料获得的抗性组织块数为0，遗传转化效率为0；

而步骤6-1)中WSP3胚性组织在侵染处理前进行前处理，可以增加农杆菌介导的遗传转化效率。实施例6中每克被遗传转化的、电转化的农杆菌菌株EHA105侵染的WSP3胚性组织平均可以形成2±1个抗性组织，因此前处理可以增加农杆菌介导的遗传转化效率。

实施例7DXS1基因编辑位点分析

7-1)对实施例6中的3个转基因事件获得的绿色植株中分别随机挑取50-60个绿色体细胞胚胎植株；18个白色体细胞胚胎植株，用DNA抽提试剂盒(CW0556S,Beijing ComWinBiotech Co.,Ltd.)分别提取整株体细胞胚胎植株基因组DNA；

7-2)以步骤7-1)提取的基因组DNA为模板，用筛选标记基因引物hpt-F(5′-ACACTACATGGCGTGATTTCAT-3′，SEQ ID NO.20)和hpt-R(5′-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3′，SEQ ID NO.21)进行PCR扩增，检测实施例6萌发培养获得的抗性植株是否为转基因植株；

PCR扩增体系参见KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)试剂盒说明进行，PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸30s；重复35个循环；68℃终延伸5min。根据PCR扩增产物的凝胶电泳检测结果统计转基因再生植株阳性率，PCR结果统计如下：

从实施例6中的3个转基因事件中分别随机挑取50个体细胞胚胎植株，进行PCR检测，hpt基因阳性率100％，说明再生的体细胞胚胎植株均为转基因阳性植株，PCR检测的部分结果如图2e。

7-3)以步骤7-1)提取的基因组DNA为模板，再用引物DXS-4F和DXS-5R进行PCR扩增，PCR扩增体系参见KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)试剂盒说明进行。

PCR反应程序：94℃预变性2min，94℃变性15s，58℃退火30s，68℃延伸30s；重复35个循环；68℃终延伸5min。

对PCR扩增片段进行测序，测序结果用dsdecode工具(http://skl.scau.edu.cn/dsdecode/)进行分析，分析结果如下：

共检测到44个突变体植株，其中18个白化体植株全部为基因编辑植株；其中：18个白化植株中，有4个植株DXS1发生纯合突变(图3a和3b)，有4个植株DXS1发生双等位基因突变(图3a和3c)，10个植株在靶位点1(target 1)和靶位点2(target 2)同时发生突变(图3d)；

来自3个转基因事件的绿色植株，分别有7.9％、28％和13.5％的植株DXS1基因发生突变(表9)，这26株DXS1基因突变植株均为杂合突变植株，在靶位点的突变情况见图3e；

表9绿色体细胞胚胎植株DXS1基因编辑频率

在44个突变植株中，有26个突变体植株在靶位点1(target 1sites)发生编辑；8个突变体植株在靶位点2(target 2位点)发生编辑；有10个突变体植株在两个靶位点(target1和target 2)均发生编辑，说明本研究中的针叶树基因编辑载体可以实现多靶点基因编辑(图3b-3e)；

对基因编辑造成的突变类型进行分析，绝大多数基因编辑发生在PAM位点上游3bp，造成的突变类型包括1bp碱基的插入、1-15bp大小不等的碱基缺失(图3b-3e)。

在植物中成功利用CRISPR/Cas9体系进行基因编辑的首要条件是可以进行遗传转化并且具有成熟的再生体系。多数针叶树再生困难并且难于遗传转化，这是限制基因编辑技术在针叶树中应用的重要原因。

白云杉的再生主要通过体细胞胚胎发生实现，本发明在进行基因编辑前首先建立适用性广、遗传转化效率稳定的针叶树农杆菌介导的遗传转化体系，该遗传转化体系平均每克白云杉胚性组织可以获得1-2个转基因事件；在此基础上利用构建的适用于针叶树的CRIPSR/Cas9体系对白云杉DXS1基因进行编辑，获得发生基因编辑的白化体植株。

由于针叶树密码子偏爱性与多数植物不同，并且SnRNA启动子具有种属特异性，目前常用的植物CRISPR/Cas9基因编辑载体不适用于针叶树。挪威云杉和白云杉U6 SnRNA启动子保守序列与拟南芥At U6-26启动子不相同，因此我们从云杉中克隆U6 SnRNA启动子用于构建CRISPR/Cas9基因编辑载体。

本发明采用的U6 SnRNA启动子来源于挪威云杉，但根据基因编辑结果显示其在白云杉中也发挥作用，瞬时转化结果显示该启动子在落叶松中也可驱动GUS基因表达，因此构建的CRISPR/Cas9载体不仅在白云杉中而且在其它针叶树中也能发挥作用。

多顺反子tRNA-gRNA(Polycistronic tRNA-gRNA，PTG)结构经常被用于多靶点基因编辑，本发明采用PTG结构对DXS1进行双靶点基因编辑，结果显示基因编辑在靶位点1和2都可以发生，证明PTG结构在白云杉中同样适用。

本发明中CRISPR/Cas9基因编辑体系在白云杉中造成的突变类型包括在PAM位点附近小片段插入和缺失。在基因编辑过程中，嵌合体现象几乎是无法避免的一种现象。本发明中从相同抗性组织发育的体细胞胚胎植株发生了不同类型的基因突变，因此本发明中对DXS1的基因编辑应该发生在抗性组织形成以后，可能发生在抗性组织的增殖阶段或者是成熟阶段。

除了相同抗性组织来源的体细胞胚胎植株可以发生不同类型突变，同一株体细胞胚胎植株也出现绿色和白色嵌合的表型，说明本发明中利用针叶树体细胞胚胎发生体系进行基因编辑存在嵌合体现象。但是由于在检测基因编辑时，抽提的是整个植株的基因组DNA，测序结果显示一些白化体植株在靶位点发生了纯合突变，说明本发明方法处理过程中在T₀代也可以获得靶位点完全敲除的非嵌合体植株。尽管基因编辑发生在抗性组织形成以后，导致筛选基因编辑植株的工作量增大，但是获得不同类型基因编辑植株的概率也增大，这对遗传转化相对困难的物种尤为重要。

由于白云杉的胚性组织可以通过相对简单的处理实现长期超低温保存，因此可以将抗性组织突变体库长期保存，在需要的阶段取出抗性组织，发育成体细胞胚胎植株，从中筛选出所需的突变体材料用于后续研究。本发明通过构建适用于针叶树的CRISPR/cas9体系，成功地对白云杉DXS1基因进行了编辑，且编辑效率高，该体系将促进针叶树基因功能研究及性状改良的发展。

序列表

<110> 北京林业大学

神舟绿鹏农业科技有限公司

<120> 针叶树植物基因编辑载体、构建方法、及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctccta agaagaagag aaaggttggt attcatggtg ttccagctgc agataagaag 60

tattctatcg gtcttgatat cggtacaaat tcagttggtt gggcagttat tactgatgag 120

tataaggttc cttctaagaa gtttaaggtt ttgggtaaca cagatcgtca ttcaattaag 180

aagaatctta tcggtgctct tttgtttgat tctggagaga ctgctgaagc aacaaggctt 240

aagagaactg caagacgtag gtatacaaga cgtaagaata ggatctgtta tcttcaggag 300

atttttagca atgagatggc taaggttgat gattctttct ttcatagatt ggaggaatca 360

tttcttgttg aggaagataa gaagcatgag cgtcatccta tcttcggtaa catcgttgat 420

gaggttgctt atcatgaaaa gtatccaaca atctatcatt tgagaaagaa gttggttgat 480

tctactgata aggcagatct taggttgatc tatcttgctt tggcacatat gatcaagttt 540

agaggtcatt ttcttattga gggagatctt aaccctgata actcagatgt tgataagttg 600

tttattcagc ttgttcagac atataaccag cttttcgagg aaaacccaat taatgcttct 660

ggtgttgatg ctaaggcaat tttgtcagca cgtctttcta agtcaaggag acttgagaat 720

ttgattgctc agcttcctgg tgaaaagaag aatggtttgt tcggtaatct tatcgcactt 780

tctttgggtc ttacaccaaa cttcaagtca aacttcgatc ttgctgagga tgcaaagttg 840

cagctttcta aggatactta tgatgatgat cttgataatc ttttggctca gattggagat 900

cagtatgcag atttgtttct tgctgcaaag aatttgtctg atgctatcct tttgtcagat 960

atccttagag ttaacactga gatcacaaag gctcctcttt ctgcatcaat gattaagaga 1020

tatgatgaac atcatcagga tttgactctt ttgaaggcat tggttagaca gcagcttcca 1080

gagaagtata aggaaatttt ctttgatcag tcaaagaatg gttatgctgg ttatattgat 1140

ggtggtgcat ctcaggaaga gttttataag tttattaagc ctatcttgga gaagatggat 1200

ggtacagagg aacttttggt taagttgaat cgtgaagatc ttttgcgtaa gcagaggact 1260

tttgataatg gttctattcc tcatcagatt catcttggag agttgcatgc tattttgcgt 1320

aggcaggaag atttctatcc atttcttaag gataacagag agaagatcga aaagatcttg 1380

acatttcgta ttccttatta tgttggtcca cttgctaggg gtaattctag atttgcatgg 1440

atgactagga agtcagagga aactattaca ccttggaatt ttgaggaagt tgttgataag 1500

ggtgcttctg cacagtcttt tattgagaga atgacaaact tcgataagaa tttgcctaat 1560

gagaaggttc ttccaaagca ttctcttttg tatgagtatt tcactgttta taatgagctt 1620

acaaaggtta agtatgttac tgagggtatg agaaagccag cttttctttc aggtgaacag 1680

aagaaggcaa tcgttgatct tttgtttaag actaaccgta aggttacagt taagcagctt 1740

aaggaagatt atttcaagaa gattgaatgc tttgattctg ttgagatttc aggtgttgaa 1800

gatcgtttta atgcatctct tggtacttat catgatcttt tgaagattat taaggataag 1860

gattttcttg ataatgagga aaatgaggat atccttgaag atatcgtttt gactcttaca 1920

ttgtttgagg atagggaaat gattgaggaa agattgaaga catatgctca tcttttcgat 1980

gataaggtta tgaagcagct taagagacgt aggtatactg gttggggtag attgtctaga 2040

aagttgatta atggtattag agataagcag tctggaaaga ctatccttga ttttcttaag 2100

tcagatggtt tcgcaaacag gaacttcatg cagttgatcc atgatgattc tcttactttt 2160

aaggaagata tccagaaggc tcaggtttct ggtcagggag attcattgca tgaacatatt 2220

gctaatcttg caggttcacc tgcaattaag aagggtattt tgcagacagt taaggttgtt 2280

gatgagcttg ttaaggttat gggtagacat aagccagaaa acatcgttat cgagatggct 2340

cgtgaaaatc agactacaca gaagggtcag aagaatagca gagagcgtat gaagaggatt 2400

gaggaaggta ttaaggaatt gggttcacag attcttaagg agcatcctgt tgaaaataca 2460

cagttgcaga atgagaagtt gtatttgtat tatcttcaga atggtaggga tatgtatgtt 2520

gatcaggagt tggatattaa tagactttct gattatgatg ttgatcatat cgttcctcag 2580

tcttttctta aggatgattc aatcgataat aaggttctta ctcgttcaga taagaatagg 2640

ggaaagtctg ataatgttcc atcagaggaa gttgttaaga agatgaagaa ctattggaga 2700

cagcttttga atgctaagtt gattacacag aggaagtttg ataatcttac taaggctgag 2760

agaggtggtc tttctgaatt ggataaggca ggttttatta agcgtcagtt ggttgagact 2820

aggcagatta caaagcatgt tgcacagatc cttgattcac gtatgaatac aaagtatgat 2880

gagaacgata agttgatcag agaagttaag gttattactt tgaagtctaa gttggtttct 2940

gatttccgta aggatttcca gttctataag gttagggaga ttaataacta tcatcatgct 3000

catgatgcat atcttaatgc tgttgttggt acagcattga ttaagaagta tcctaagttg 3060

gagtctgaat ttgtttatgg agattataag gtttatgatg ttagaaagat gatcgctaag 3120

tctgagcagg aaattggaaa ggctactgca aagtatttct tttattcaaa cattatgaat 3180

ttctttaaga ctgagattac attggctaat ggtgaaattc gcaagcgacc tcttattgag 3240

actaatggtg agacaggtga aattgtttgg gataagggta gagattttgc aactgttcgt 3300

aaggttcttt ctatgcctca ggttaatatt gttaagaaga ctgaggttca gacaggtggt 3360

ttttctaagg aatcaatctt gccaaagaga aattctgata agttgatcgc tagaaagaag 3420

gattgggacc ctaagaagta tggtggtttt gattctccaa cagttgctta ttcagttttg 3480

gttgttgcaa aggttgagaa gggaaagtct aagaagttga agtcagttaa ggaacttttg 3540

ggtatcacta ttatggagcg ttcttcattt gaaaagaatc ctatcgattt tcttgaggca 3600

aagggttata aggaagttaa gaaggatctt attattaagt tgccaaagta ttcacttttt 3660

gagttggaaa atggtcgtaa gaggatgttg gcttctgcag gagagcttca gaagggtaat 3720

gagcttgctt tgccttcaaa gtatgttaat tttctttatt tggcatctca ttatgagaag 3780

ttgaagggtt caccagagga taatgagcag aagcagttgt ttgttgagca gcataagcat 3840

tatcttgatg agattattga acagatctct gaattttcaa agagggttat tcttgctgat 3900

gcaaatttgg ataaggttct ttctgcttat aataagcata gagataagcc tattcgtgag 3960

caggcagaaa acatcatcca tctttttact ttgacaaatc ttggtgctcc agctgctttt 4020

aagtatttcg atactacaat cgatagaaag cgttatactt ctacaaagga agttttggat 4080

gcaacactta ttcatcagtc tattactggt ctttatgaaa cacgtattga tttgtcacag 4140

cttggtggag ataagaggcc tgctgcaact aagaaggctg gtcaggctaa gaagaagaag 4200

tga 4203

<210> 2

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgggttcaa gtcccggcaa cggaaattaa attgttttat aggattttaa acaacattgc 60

agagatcttc cgggttttca atcgagaaat ctgaaattct ctaaacagaa aagagtaaac 120

acaggtgcgt ctgccgggag tcgaacccgg gtctattgct tggaaggcaa ttatcctaac 180

cgttggacta caaacgccta gatgtaagag gttaacaaga ggggcatacc aggctattaa 240

tctaacagtt ggacatgcaa accacaaaat gtgagagcgg atacatgctt ttcgttgata 300

atattactac aactggacta ttactttaac agttggacta caactgctct cggtgtaacc 360

gctggacaat aaacgctact tgcaaaccac aaaatgtgag agcgtttcgc tgataataat 420

actaaattcg ttgcactcct cgagtgttaa aattcaaacc ccaaatctca cgcaaacgca 480

aattcaaaca gaagagatac agatatacac ggaggggaca tccgtaacgc gaaatagata 540

tacatttttc gtataacact tgcagtttat tcccacatgc gtaaagaaaa atagatataa 600

acctttcata tacggagatg atagcttaag ttgttgtctc ttcg 644

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagcttccgg gttcaagtcc cggcaacg 28

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatcccgaa gagacaacaa cttaagc 27

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggaaaaag gtcgaaaagg tctgtttcct gtggatagc 39

<210> 6

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctatccaca ggaaacagac cttttcgacc tttttcccc 39

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgcaggctt atcctcacaa g 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcttactc agtgcactgc 20

<210> 9

<211> 432

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agacagacaa atggcctctc aggctttaca aaacgttcag agagtgaata tgactgcttt 60

ggtgccggtc acagctctac tagtatatct gctgggctag gtctggttct gggcatcttc 120

agatatttga atgttatgag ttttcctaca ggaattggta tagaagggga ctttaactct 180

gaccatttga caatgtgcag gcatggctgt tggtcgtgac ttgaaaggga gaaacaatca 240

tgtcattagt gtcattggag atggagccat gacagctggg caagcctttg aagctatgaa 300

caatgctgga tatttggatt ccaacatgat agttatcctg aatgacaaca aacaagtttc 360

tctgccaacg gcaaatcttg atgggcctat gccaccagtg ggtgctctca gcagtgcact 420

gaaggtaagc tg 432

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actagtatat ctgctgggct 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caatgtgcag gcatggctgt 20

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

taggtctcaa tctgctgggc tgttttagag ctagaaatag 40

<210> 13

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cgggtctcca gatatactag ttgcaccagc cgggaatc 38

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taggtctcaa ggcatggctg tgttttagag ctagaaatag 40

<210> 15

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgggtctccg cctgcacatt gtgcaccagc cgggaatc 38

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgggtctcat tcgaacaaag caccagtggt c 31

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

taggtctcca aacaaaaaaa aaagcaccga ctcggtgcca c 41

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cgggtctcat tcgaacaa 18

<210> 19

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taggtctcca aacaaaaaaa aaagcaccg 29

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

acactacatg gcgtgatttc at 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tccactatcg gcgagtactt ct 22

<210> 22

<211> 6129

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagcttccgg gttcaagtcc cggcaacgga aattaaattg ttttatagga ttttaaacaa 60

cattgcagag atcttccggg ttttcaatcg agaaatctga aattctctaa acagaaaaga 120

gtaaacacag gtgcgtctgc cgggagtcga acccgggtct attgcttgga aggcaattat 180

cctaaccgtt ggactacaaa cgcctagatg taagaggtta acaagagggg cataccaggc 240

tattaatcta acagttggac atgcaaacca caaaatgtga gagcggatac atgcttttcg 300

ttgataatat tactacaact ggactattac tttaacagtt ggactacaac tgctctcggt 360

gtaaccgctg gacaataaac gctacttgca aaccacaaaa tgtgagagcg tttcgctgat 420

aataatacta aattcgttgc actcctcgag tgttaaaatt caaaccccaa atctcacgca 480

aacgcaaatt caaacagaag agatacagat atacacggag gggacatccg taacgcgaaa 540

tagatataca tttttcgtat aacacttgca gtttattccc acatgcgtaa agaaaaatag 600

atataaacct ttcatatacg gagatgatag cttaagttgt tgtctcttcg ggagaccgag 660

gtctcggttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 720

aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt ttcaagagct tggagtggat ggaccgtcga 780

cctgcaggca tgcggtaccg gatccgtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat 840

caaagataca gtctcagaag accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 900

cggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga 960

aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga 1020

tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 1080

agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgataaca tggtggagca 1140

cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc aaagggcaat 1200

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 1260

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 1320

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 1380

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 1440

ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 1500

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacgtcga gagttctcaa 1560

cacaacatat acaaaacaaa cgaatctcaa gcaatcaagc attctacttc tattgcagca 1620

atttaaatca tttcttttaa agcaaaagca attttctgaa aattttcacc atttacgaac 1680

gatagccatg gctcctaaga agaagagaaa ggttggtatt catggtgttc cagctgcaga 1740

taagaagtat tctatcggtc ttgatatcgg tacaaattca gttggttggg cagttattac 1800

tgatgagtat aaggttcctt ctaagaagtt taaggttttg ggtaacacag atcgtcattc 1860

aattaagaag aatcttatcg gtgctctttt gtttgattct ggagagactg ctgaagcaac 1920

aaggcttaag agaactgcaa gacgtaggta tacaagacgt aagaatagga tctgttatct 1980

tcaggagatt tttagcaatg agatggctaa ggttgatgat tctttctttc atagattgga 2040

ggaatcattt cttgttgagg aagataagaa gcatgagcgt catcctatct tcggtaacat 2100

cgttgatgag gttgcttatc atgaaaagta tccaacaatc tatcatttga gaaagaagtt 2160

ggttgattct actgataagg cagatcttag gttgatctat cttgctttgg cacatatgat 2220

caagtttaga ggtcattttc ttattgaggg agatcttaac cctgataact cagatgttga 2280

taagttgttt attcagcttg ttcagacata taaccagctt ttcgaggaaa acccaattaa 2340

tgcttctggt gttgatgcta aggcaatttt gtcagcacgt ctttctaagt caaggagact 2400

tgagaatttg attgctcagc ttcctggtga aaagaagaat ggtttgttcg gtaatcttat 2460

cgcactttct ttgggtctta caccaaactt caagtcaaac ttcgatcttg ctgaggatgc 2520

aaagttgcag ctttctaagg atacttatga tgatgatctt gataatcttt tggctcagat 2580

tggagatcag tatgcagatt tgtttcttgc tgcaaagaat ttgtctgatg ctatcctttt 2640

gtcagatatc cttagagtta acactgagat cacaaaggct cctctttctg catcaatgat 2700

taagagatat gatgaacatc atcaggattt gactcttttg aaggcattgg ttagacagca 2760

gcttccagag aagtataagg aaattttctt tgatcagtca aagaatggtt atgctggtta 2820

tattgatggt ggtgcatctc aggaagagtt ttataagttt attaagccta tcttggagaa 2880

gatggatggt acagaggaac ttttggttaa gttgaatcgt gaagatcttt tgcgtaagca 2940

gaggactttt gataatggtt ctattcctca tcagattcat cttggagagt tgcatgctat 3000

tttgcgtagg caggaagatt tctatccatt tcttaaggat aacagagaga agatcgaaaa 3060

gatcttgaca tttcgtattc cttattatgt tggtccactt gctaggggta attctagatt 3120

tgcatggatg actaggaagt cagaggaaac tattacacct tggaattttg aggaagttgt 3180

tgataagggt gcttctgcac agtcttttat tgagagaatg acaaacttcg ataagaattt 3240

gcctaatgag aaggttcttc caaagcattc tcttttgtat gagtatttca ctgtttataa 3300

tgagcttaca aaggttaagt atgttactga gggtatgaga aagccagctt ttctttcagg 3360

tgaacagaag aaggcaatcg ttgatctttt gtttaagact aaccgtaagg ttacagttaa 3420

gcagcttaag gaagattatt tcaagaagat tgaatgcttt gattctgttg agatttcagg 3480

tgttgaagat cgttttaatg catctcttgg tacttatcat gatcttttga agattattaa 3540

ggataaggat tttcttgata atgaggaaaa tgaggatatc cttgaagata tcgttttgac 3600

tcttacattg tttgaggata gggaaatgat tgaggaaaga ttgaagacat atgctcatct 3660

tttcgatgat aaggttatga agcagcttaa gagacgtagg tatactggtt ggggtagatt 3720

gtctagaaag ttgattaatg gtattagaga taagcagtct ggaaagacta tccttgattt 3780

tcttaagtca gatggtttcg caaacaggaa cttcatgcag ttgatccatg atgattctct 3840

tacttttaag gaagatatcc agaaggctca ggtttctggt cagggagatt cattgcatga 3900

acatattgct aatcttgcag gttcacctgc aattaagaag ggtattttgc agacagttaa 3960

ggttgttgat gagcttgtta aggttatggg tagacataag ccagaaaaca tcgttatcga 4020

gatggctcgt gaaaatcaga ctacacagaa gggtcagaag aatagcagag agcgtatgaa 4080

gaggattgag gaaggtatta aggaattggg ttcacagatt cttaaggagc atcctgttga 4140

aaatacacag ttgcagaatg agaagttgta tttgtattat cttcagaatg gtagggatat 4200

gtatgttgat caggagttgg atattaatag actttctgat tatgatgttg atcatatcgt 4260

tcctcagtct tttcttaagg atgattcaat cgataataag gttcttactc gttcagataa 4320

gaatagggga aagtctgata atgttccatc agaggaagtt gttaagaaga tgaagaacta 4380

ttggagacag cttttgaatg ctaagttgat tacacagagg aagtttgata atcttactaa 4440

ggctgagaga ggtggtcttt ctgaattgga taaggcaggt tttattaagc gtcagttggt 4500

tgagactagg cagattacaa agcatgttgc acagatcctt gattcacgta tgaatacaaa 4560

gtatgatgag aacgataagt tgatcagaga agttaaggtt attactttga agtctaagtt 4620

ggtttctgat ttccgtaagg atttccagtt ctataaggtt agggagatta ataactatca 4680

tcatgctcat gatgcatatc ttaatgctgt tgttggtaca gcattgatta agaagtatcc 4740

taagttggag tctgaatttg tttatggaga ttataaggtt tatgatgtta gaaagatgat 4800

cgctaagtct gagcaggaaa ttggaaaggc tactgcaaag tatttctttt attcaaacat 4860

tatgaatttc tttaagactg agattacatt ggctaatggt gaaattcgca agcgacctct 4920

tattgagact aatggtgaga caggtgaaat tgtttgggat aagggtagag attttgcaac 4980

tgttcgtaag gttctttcta tgcctcaggt taatattgtt aagaagactg aggttcagac 5040

aggtggtttt tctaaggaat caatcttgcc aaagagaaat tctgataagt tgatcgctag 5100

aaagaaggat tgggacccta agaagtatgg tggttttgat tctccaacag ttgcttattc 5160

agttttggtt gttgcaaagg ttgagaaggg aaagtctaag aagttgaagt cagttaagga 5220

acttttgggt atcactatta tggagcgttc ttcatttgaa aagaatccta tcgattttct 5280

tgaggcaaag ggttataagg aagttaagaa ggatcttatt attaagttgc caaagtattc 5340

actttttgag ttggaaaatg gtcgtaagag gatgttggct tctgcaggag agcttcagaa 5400

gggtaatgag cttgctttgc cttcaaagta tgttaatttt ctttatttgg catctcatta 5460

tgagaagttg aagggttcac cagaggataa tgagcagaag cagttgtttg ttgagcagca 5520

taagcattat cttgatgaga ttattgaaca gatctctgaa ttttcaaaga gggttattct 5580

tgctgatgca aatttggata aggttctttc tgcttataat aagcatagag ataagcctat 5640

tcgtgagcag gcagaaaaca tcatccatct ttttactttg acaaatcttg gtgctccagc 5700

tgcttttaag tatttcgata ctacaatcga tagaaagcgt tatacttcta caaaggaagt 5760

tttggatgca acacttattc atcagtctat tactggtctt tatgaaacac gtattgattt 5820

gtcacagctt ggtggagata agaggcctgc tgcaactaag aaggctggtc aggctaagaa 5880

gaagaagtga taggagctcc acctgatcta gagtccgcaa aaatcaccag tctctctcta 5940

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attagggttc ttatagggtt tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta 6060

tttgtatttg taaaatactt ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt 6120

gacgaattc 6129

Claims

1.一种针叶树植物基因编辑载体，其特征是，包括用于针叶树植物基因编辑的骨架载体PgCas9/PaU6、针对目的基因片段的gRNA，根据不同基因设计不同的gRNA，并将gRNA连接到用于编辑针叶树植物基因的CRISPR/Cas9载体上，其中所述PgCas9/PaU6包括：PCAMBIA1300突变载体、编码针叶树表达Cas9蛋白基因PgCas9、针叶树植物U6启动子PaU6启动子、gRNA 骨架序列、双35S启动子、NOS终止子，其中，所述PgCas9序列如序列SEQ IDNO. 1所示；所述针叶树植物U6启动子序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.一种针叶树植物基因编辑载体的构建方法，其特征是，包括如下步骤：

1）在酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9基因的5′端和3′端分别添加核定位信号肽，获得NLS- SpCas9序列；然后根据针叶树植物密码子的偏爱性，对NLS- SpCas9序列进行优化，获得针叶树植物Cas9基因，命名为PgCas9基因，所述PgCas9基因序列如序列SEQ ID NO. 1所示；

2）用拟南芥AtU6-26序列在Congenie网站进行BLAST比对，在挪威云杉和白云杉基因组中分别比对，搜索得到5’上游超过500 bp，且与拟南芥上游因子USE元件序列高度同源的序列；然后根据搜索到的同源序列设计引物，进行PCR扩增，能得到扩增的序列为针叶树植物的U6启动子，命名为PaU6 启动子，其中所述针叶树植物U6启动子序列如SEQ ID NO. 2所示；

3）对PCAMBIA1300载体进行定点突变，消除BsaⅠ酶切位点，获得PCAMBIA1300突变载体；

4）合成包含PaU6启动子、gRNA 骨架序列、双35S启动子、PgCas9、NOS终止子的序列，并将合成的序列连接到PCAMBIA1300突变载体的EcoRⅠ和HindⅢ位点，获得基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6；

5）根据白云杉DXS1基因序列设计靶基因引物DXS-4F和DXS-5R，以提取的白云杉胚性细胞系WSP3胚性组织DNA为模板，进行第一PCR扩增，获得待编辑DXS1基因片段确切序列；接着利用CRISPOR工具设计靶基因的靶位点序列gRNA 1、gRNA 2，序列为SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11；

6）以包含gRNA-tRNA序列的PUC57质粒为模板，分别以3个引物对，分别为U-F/ gRNA1-R；gRNA1-F/ gRNA2-R ；gRNA2-F/U-R；进行第二PCR扩增，获得3个PCR反应产物；

7）将纯化后的3个第二PCR反应产物进行第一连接反应，获得第一连接反应产物即组装敲除DXS1基因的PTGs 序列；

8）以第一连接反应产物为模板，以 U-2F、U-2R为引物，进行第三PCR扩增；

9）对第三PCR反应产物纯化后，与步骤4）获得的基因编辑骨架载体PgCas9/PaU6进行第二连接反应，获得第二连接反应产物；

10）第二连接反应产物转化大肠杆菌E.coliTOP10，获得阳性菌落进行培养提取质粒，获得针叶树植物基因编辑载体PgCas9/PaU6(DXS1)。

3.如权利要求2所述的构建方法，其特征是，步骤5）中设计的靶位点序列为：gRNA 1:ACTAGTATATCTGCTGGGCT；gRNA2: CAATGTGCAGGCATGGCTGT。

4.如权利要求2或3所述的构建方法，其特征是，步骤10）中获得的基因编辑载体PgCas9/PaU6(DXS1)为用HindⅢ / BamHⅠ和 HindⅢ /EcoRⅠ进行酶切后，产生1.3kb和6.6kb大小酶切条带的质粒。

5.如权利要求2-4任一方法构建的针叶树植物基因编辑载体在针叶树植物中进行基因编辑中的应用，其特征是，包括如下步骤：

A）将构建的PgCas9-PaU6（DXS1）载体转化到农杆菌；然后对针叶树植物的胚性组织进行浸染处理，获得浸染胚性组织；

B）将浸染胚性组织移入胚性组织恢复培养基中，进行恢复培养，获得恢复培养胚性组织；

C）将恢复培养胚性组织转移至胚性组织筛选培养基中，进行筛选培养，每2周更换一次培养基，筛选获得阳性抗性组织；

D）将抗性组织转移至成熟培养基中，进行成熟培养，获得成熟子叶体胚；然后移入萌发培养基中进行萌发培养，获得基因编辑抗性植株。

6.如权利要求5所述的应用，其特征是，步骤A）中所述针叶树植物的胚性组织按照如下方法进行处理后再进行所述浸染处理：将胚性组织在固体增殖培养基上进行增殖培养后，从固体增殖培养基上移入到液体增殖培养基中进行培养，直至胚性组织充分分散；然后在去除液体增殖培养基后加入前处理培养基，对分散的胚性组织进行前处理培养6-8d。

7.如权利要求6所述的应用，其特征是，所述前处理培养为暗培养，培养温度23±1℃。

8.如权利要求5所述应用，其特征是，步骤A）中所述浸染处理包括如下步骤：

A-1）将农杆菌菌液加入到前处理胚性组织中，于室温下进行浸染处理；侵染处理5-30min后进行抽滤，弃掉菌液；然后将胚性组织移到用液体共培养培养基润湿的滤纸上，于20-25℃，黑暗条件下，进行浸染-共培养；浸染-共培养2-4d后用胚性组织液体增殖培养基清洗浸染-共培养后的胚性组织1-2次；

A-2）用胚性组织浸泡培养基浸泡浸染-共培养处理后的胚性组织25-35min，获得浸染胚性组织。