CN118127073A - 水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑中的应用 - Google Patents

水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A‑to‑K单碱基编辑中的应用。本发明基于水稻烷基嘌呤糖基化酶OsMPG及其突变体开发了新型植物A‑to‑K的单碱基编辑器rAKBEs，利用rAKBEs可同时实现植物基因组中一个靶序列编辑窗口内腺嘌呤(A)的转换(G)和颠换(T)。通过原生质体及稳定转化株系鉴定结果表明，rAKBE04单碱基编辑器表现最好，可以在5个测试靶点上产生包含A‑to‑G、A‑to‑C、A‑to‑T以及indel在内的编辑事件。本发明开发的rAKBEs碱基编辑将极大地丰富植物单碱基编辑工具箱，为水稻和其它农作物重要基因功能分析和遗传改良提供了重要技术支撑。

Description

水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑 中的应用
技术领域
本发明属于分子育种领域，具体涉及水稻烷基嘌呤糖基化酶及其突变体在植物A-to-K单碱基编辑中的应用，特别涉及基于水稻烷基嘌呤糖基化酶OsMPG及其突变体mOsMPG开发的新型植物A-to-K的单碱基编辑器rAKBEs，以及利用rAKBEs同时实现植物基因组中靶序列编辑窗口内腺嘌呤(A)的转换(G)和颠换(T)的方法。
背景技术
遗传变异是作物性状遗传改良的基础，植物育种的目标是通过利用更多的遗传变异，提高农作物的产量、品质、抗病性等，从而创制农艺性状优良的农作物新种质。在农作物品种演化过程中，等位基因的差异是造成农作物产量和其他重要农艺性状差异的主要原因，而等位基因的差异通常是由一个或多个单核苷酸多态性(SNP)的差异或特定片段的插入/缺失引起的。利用常规育种方法将优异等位基因导入栽培品种往往需要经过多次杂交和回交，通常需要数年时间，耗时费力。此外，针对重要农艺性状关键基因创制新型等位变异，可以丰富农作物的遗传多样性，从而满足育种实践中的多样化需求。CRISPR/Cas介导的碱基编辑可在靶位点实现单个碱基的转换或颠换，利用单碱基编辑技术介导的内源靶标基因定向进化，可在短时间内创制数百个新的等位变异，极大促进了基因功能研究和农作物改良。目前，农作物中常用的单碱基编辑系统主要有两大类：胞嘧啶碱基编辑系统(CBE)和腺嘌呤碱基编辑系统(ABE)。CBE系统主要由nCas9(D10A)、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶-DNA糖基化酶抑制剂(UGI)融合而成，其在编辑窗口内可实现C-to-T的单碱基转换；ABE系统主要由nCas9(D10A)与腺嘌呤脱氨酶融合而成，其可在编辑窗口内实现A-to-G的碱基转换。近年来，随着CBE和ABE的不断优化，其在多种动、植物中已被广泛应用。在众多优化的ABE系统中，ABE8e在哺乳动物细胞和水稻中均表现出较高的A-to-G单碱基编辑效率。然而在农作物中一些优良农艺性状是由特定靶基因中A-C/T的颠换引起的，因此研发植物新型碱基编辑工具，实现A-to-T和/或A-to-C的碱基颠换，可极大地拓展碱基编辑在农作物基因功能研究和精准育种中的应用范围，为生物育种提供有力工具。
近期，Tong等人通过将腺嘌呤碱基编辑器与人源烷基嘌呤糖基化酶(hMPG)融合，开发了一种新型碱基编辑器AYBE，其可在动物细胞系中成功介导A-to-Y(Y＝C/T)的碱基颠换。Chen等人通过将TadA8e与小鼠来源的烷基嘌呤糖基化酶(mMPG或mAAG)融合，成功开发了两种新型腺嘌呤颠换编辑工具AXBEs和ACBEs，均可在动物细胞系中实现高效的A-to-C碱基颠换。以上结果表明，不同来源的MPG可能具有不同的碱基切除修复活性。同时，Li等人和Wu等人通过将水稻密码子优化的hMPG或其突变体mhMPG与ABE8e或ABE-TadA9融合，获得了植物单碱基编辑器pAKBEs。但是，在水稻植株中，AKBE仅可在编辑窗口内实现A-to-G/T的碱基编辑，很少或无法检测到A-to-C的碱基颠换。由此看来，利用不同的来源的MPG，对于针对不同的应用场景开发不同的腺嘌呤碱基编辑器具有重要意义。类似于人和小鼠来源的MPG，在水稻中同样存在着MPG同源蛋白，但水稻MPG(OsMPG)的功能未知，是否可用于开发植物碱基编辑器，进而实现植物中精准的A-to-G/C/T碱基编辑，需要进一步探究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何在植物中高效实现A-to-G/C/T碱基编辑。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了成套系统。
本发明提供的成套系统为如下M1)-M4)中任一种：
M1)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和gRNA；
M2)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和gRNA；
M3)所述成套系统包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和gRNA；
M4)所述成套系统包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和gRNA；
所述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG为将所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG氨基酸序列的第162位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第168位由天冬酰胺突变为丝氨酸后得到的蛋白质。
上述成套系统中，所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因为a1)或a2)：
a1)序列1第2591-3088位所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e的DNA分子。
所述Cas9(D10A)缺刻酶为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因为b1)或b2)：
b1)序列1第3185-7285位所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述Cas9(D10A)缺刻酶的DNA分子。
所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列8所示的蛋白质；
C2)将序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG的编码基因为c1)或c2)：
c1)序列7所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG的DNA分子。
所述反式激活因子Vp64为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
D2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述反式激活因子Vp64的编码基因为d1)或d2)：
d1)序列5第1-150位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述反式激活因子Vp64的DNA分子。
所述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG为G1)或G2)：
G1)氨基酸序列是序列10所示的蛋白质；
G2)将序列10所示的氨基酸序列经过除第162位、第168位氨基酸残基以外的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG的编码基因为g1)或g2)：
g1)序列9所示的DNA分子；
g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG的DNA分子。
所述gRNA靶向靶点序列；所述gRNA依次由所述靶点序列转录的RNA和gRNA骨架组成，所述gRNA骨架为将序列1第402-477位中的T替换为U后得到的RNA分子。
上述成套系统中，所述M1)的成套系统包括依次由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M2)中的成套系统包括依次由腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M3)中的成套系统包括依次由反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M4)中的成套系统包括依次由反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶和水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG融合而成的融合蛋白和gRNA。
进一步的，所述M1)的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M2)中的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M3)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA；
所述M4)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白和gRNA。
更进一步的，所述成套系统还包括筛选剂抗性蛋白。所述筛选剂抗性蛋白可为本技术领域中公知的各种抗性蛋白，如卡那霉素抗性蛋白、除草剂抗性蛋白、磷酸甘露糖异构酶等。
所述M1)的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M2)中的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M3)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白；
所述M4)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白、gRNA和筛选剂抗性蛋白。
在本发明的一个具体实施例中，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；所述潮霉素磷酸转移酶为E1)或E2)：
E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
E2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述潮霉素磷酸转移酶的编码基因为e1)或e2)：
e1)序列1第9018-10043位所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述潮霉素磷酸转移酶的DNA分子。
所述核定位信号为核定位信号NLS。所述核定位信号NLS为F1)或F2)：
F1)氨基酸序列是序列11所示的蛋白质；
F2)将序列11所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述核定位信号NLS的编码基因为f1)或f2)：
f1)序列1第2546-2566位所示的DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述核定位信号NLS的DNA分子。
上述任一所述蛋白质中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述任一所述编码基因中的同一性是指与天然核酸序列的序列相似性。所述同一性包括与本发明的编码序列2、序列3、序列4、序列6、序列8、序列10所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或91％或更高，或92％或更高，或93％或更高，或94％或更高，或95％或更高，或96％或更高，或97％或更高，或98％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述成套系统中，所述M1)的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M2)中的成套系统包括依次由核定位信号、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M3)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒；
所述M4)中的成套系统包括依次由核定位信号、反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和核定位信号融合而成的融合蛋白表达盒、gRNA表达盒和筛选剂抗性蛋白表达盒。
进一步的，在所述成套系统的融合蛋白表达盒中，所述融合蛋白由Ubi启动子驱动表达。所述Ubi启动子的核苷酸序列如序列1第530-2521位所示。
在所述成套系统的gRNA表达盒中，所述gRNA由OsU3启动子驱动表达。所述OsU3启动子的核苷酸序列如序列1第1-380位所示。
在所述成套系统的筛选标记蛋白表达盒中，所述筛选标记蛋白由35S启动子驱动表达。所述35S启动子的核苷酸序列如序列1第8296-8973位所示。
再进一步的，在所述成套系统的融合蛋白表达盒中，所述融合蛋白由E9R终止子终止表达。所述E9R终止子的核苷酸序列如序列1第7337-7971位所示。
在所述成套系统的gRNA表达盒中，所述gRNA由OsU3终止子终止表达。所述OsU3终止子的核苷酸序列如序列1第478-497位所示。
在所述成套系统的筛选标记蛋白表达盒中，所述筛选标记蛋白由Nos终止子终止表达。所述Nos终止子的核苷酸序列如序列1第10090-10264位所示。
更进一步的，所述成套系统通过重组载体进行表达。所述成套系统包括的各个元件或各个表达盒可通过同一个载体进行表达，也可以通过多个载体进行表达。
在本发明的一个具体实施例中，所述M1)的成套系统通过下文中的重组载体rAKBE01-OsDEP1、重组载体rAKBE01-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE01-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE01-OsWaxy-T2或重组载体rAKBE01-OsWaxy-T3进行表达。
所述M2)的成套系统通过下文中的重组载体rAKBE02-OsDEP1、重组载体rAKBE02-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE02-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE02-OsWaxy-T2或重组载体rAKBE02-OsWaxy-T3进行表达。
所述M3)的成套系统通过下文中的重组载体rAKBE03-OsDEP1、重组载体rAKBE03-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE03-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE03-OsWaxy-T2或重组载体rAKBE03-OsWaxy-T3进行表达。
所述M4)的成套系统通过下文中的重组载体rAKBE04-OsDEP1、重组载体rAKBE04-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE04-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE04-OsWaxy-T2或重组载体rAKBE04-OsWaxy-T3进行表达。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了上述成套系统的新用途。
本发明提供了上述成套系统在如下S1)-S9)任一种中的应用：
S1)植物基因组序列的编辑；
S2)制备植物基因组序列的编辑的产品；
S3)提高植物基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高植物基因组序列的编辑效率的产品；
S5)拓展植物基因组序列的编辑窗口；
S6)制备拓展植物基因组序列的编辑窗口的产品；
S7)制备植物突变体；
S8)植物育种；
S9)制备植物育种的产品。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了如下T1)-T4)任一所述的方法：
T1)植物基因组序列的编辑方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套系统，以实现植物基因组序列的编辑；
T2)提高植物基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套系统，以实现提高植物基因组序列的编辑效率；
T3)拓展植物基因组序列的编辑窗口的方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套系统，以实现拓展植物基因组序列的编辑窗口；
T4)植物突变体的制备方法，包括如下步骤：使植物表达上述成套系统，以获得植物突变体。
上述任一所述方法中，所述使植物表达上述成套系统的方法为将上述成套系统包括的各个元件或各个表达盒导入植物中。
进一步的，所述成套系统包括的各个元件或各个表达盒可通过同一个载体导入植物中，也可以通过多个载体导入植物中。
更进一步的，所述成套系统通过同一个重组载体导入植物中。
在本发明的具体实施例中，所述成套系统通过下文中的重组载体rAKBE01-OsDEP1、重组载体rAKBE01-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE01-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE01-OsWaxy-T2、重组载体rAKBE01-OsWaxy-T3、重组载体rAKBE02-OsDEP1、重组载体rAKBE02-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE02-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE02-OsWaxy-T2、重组载体rAKBE02-OsWaxy-T3、重组载体rAKBE03-OsDEP1、重组载体rAKBE03-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE03-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE03-OsWaxy-T2、重组载体rAKBE03-OsWaxy-T3、重组载体rAKBE04-OsDEP1、重组载体rAKBE04-OsNRT1.1B、重组载体rAKBE04-OsWaxy-T1、重组载体rAKBE04-OsWaxy-T2或重组载体rAKBE04-OsWaxy-T3导入植物中。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述植物基因组序列的编辑包括植物基因组序列的碱基替换(如单碱基替换和小片段替换)和/或碱基插入(如单碱基插入和小片段插入)和/或碱基缺失(如单碱基缺失和小片段缺失)。所述单碱基替换包括碱基A突变为碱基G和/或碱基A突变为碱基C和/或碱基A突变为碱基T。
上述任一所述成套系统或应用或方法中，所述植物为X1)或X2)或X3)：
X1)单子叶植物或双子叶植物；
X2)禾本科植物；
X3)水稻(如中花11)。
本发明首先鉴定获得了一个水稻内源的烷基腺嘌呤糖基化酶OsMPG，其与人源的hMPG同源性较低，在氨基酸水平上只有27.36％的同源性(图1)。然后通过将OsMPG或其突变体与TadA8e和nCas9(D10A)融合，获得了碱基编辑器rAKBE01和rAKBE02(图2)。在此基础上，又分别将碱基编辑器rAKBE01和rAKBE02与反式激活因子VP64融合，获得了碱基编辑器rAKBE03和rAKBE04(图2)。随后，本发明利用水稻5个不同的内源靶点通过在水稻原生质体和稳定植株中测试了4个不同版本的植物rAKBEs编辑器的A-to-Y编辑效率。原生质体及稳定转化株系鉴定结果表明，rAKBE04编辑器表现最好，可以在5个测试靶点上产生包含A-to-G、A-to-C、A-to-T以及indel在内的编辑事件。
其中，原生质体测试结果表明，除了rAKBE01只在OsNRT1.1B一个靶点发生了A-to-T外，rAKBE02、rAKBE03、rAKBE04等三个版本的载体在5个靶点处均实现了A-to-Y碱基颠换。与rAKBE01相比，rAKBE02、rAKBE03、rAKBE04编辑效率分别得到显著提高，其中，rAKBE04载体介导的植物A-to-Y碱基编辑效率最高，表现最好，与rAKBE01、rAKBE02、rAKBE03相比，rAKBE04介导的植物A-to-C碱基编辑效率可分别提高3.63、1.75-2.48、1.19-1.61倍，最高A-to-C编辑效率可达1.96％。与rAKBE02、rAKBE03相比，A-to-T碱基编辑效率分别提高1.45-4.03倍和1.32-1.94倍，最高A-to-T编辑效率可达2.95％。与rAKBE01、rAKBE02、rAKBE03相比，rAKBE04介导的植物A-to-Y碱基编辑效率可分别提高3.63、1.87-6.57、1.33-1.75倍，最高A-to-Y编辑效率可达4.62％。与ABE8e、ABE8e-VP64、rAKBE01、rAKBE-02和rAKBE03相比，rAKBE04分别可以提高A-to-G碱基编辑效率约2.46倍、1.67倍、2.11倍、1.89倍、1.18倍。此外，rAKBE01、rAKBE02编辑窗口主要发生在A5-A6位点，rAKBE03、rAKBE04编辑窗口除了主要发生在A5-A6外，在A1至A10位也发生了不同程度的A-to-B编辑，表明耦合VP64后，可扩展rAKBE的编辑窗口。另外，rAKBE03、rAKBE04均可在靶点处产生精准indel事件。以上结果表明，除了进行A-to-Y单碱基外，rAKBEs，尤其是rAKBE04，可用于农作物重要基因编码区或启动子区的定向进化。此外，偶联VP64转录激活元件确实可以促进CRISPR复合体对染色质内DNA的可及性，从而提高碱基编辑效率，并且mOsMPG和VP64的结合对提高腺嘌呤碱基编辑效率具有协同作用。
进一步稳定遗传转化结果表明，rAKBE01仅在OsNRT1.1B、OsWaxy-T3等靶点处实现了A-to-T碱基颠换，效率分别为1.30％、1.47％(图6、表8、表9)。rAKBE04在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点处均实现了碱基A-to-T的编辑，碱基编辑效率依次是3.85％(3/78)、2.33％(1/43)、1.67％(1/60)、2.60％(2/77)、4.84％(3/62)(图7、表8、表9)。相比rAKBE01，rAKBE04在OsDEP1、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2等靶点处首次实现A-to-T碱基编辑，在OsNRT1.1B靶点A-to-T效率提高了1.79倍(2.33％/1.30％)，在OsWaxy-T3靶点A-to-T效率提高了3.29倍(4.84％/1.47％)。根据幼苗基因型A-to-T的结果，确认A-to-T碱基编辑主要发生在A5、A6位。与先前报道的基于hMPG的pAKBEs碱基编辑器相比，rAKBE04可以诱导更高的A-to-G碱基编辑效率。上述rAKBEs碱基编辑器均能在水稻中成功介导A-to-K的碱基编辑，rAKBE04碱基编辑器表现最好，可以在5个测试靶点上产生包含A-to-G、A-to-C、A-to-T以及indel在内的编辑事件。此外，与现有技术中的基于hMPG的植物A-to-K碱基编辑器pAKBEs相比，rAKBE04不仅在编辑窗口内实现更高效的A-to-G碱基转换，而且还扩展了碱基编辑窗口，同时伴随着更少的A-to-T碱基颠换和小片段插入和缺失(indel)。
综上所述，本发明基于水稻烷基腺嘌呤糖基化酶及其突变体成功地设计了用于水稻A-to-Y碱基编辑的rAKBEs编辑器，在水稻原生质体中对rAKBE01、rAKBE02、rAKBE03、rAKBE04的编辑活性进行了测试，结果表明，带有OsMPG的rAKBE01具有极低的A-to-Y碱基编辑活性，与mOsMPG结合的rAKBE02或与VP64偶联的rAKBE03均能显著提高A-to-Y碱基颠换编辑效率；带有反式激活因子VP64的rAKBE03诱导A-to-Y碱基颠换的效果优于带有mOsMPG的rAKBE02。此外，mOsMPG和VP64在增强A-to-Y编辑活性方面表现出协同效应，含有mOsMPG和VP64的rAKBE04在A-to-Y碱基颠换方面优于其他版本的rAKBEs，且A-to-B碱基编辑的窗口扩展为A1至A10位。同时根据原生质体测试的结果在水稻稳定转化株系中测试了rAKBE01与rAKBE04两个策略，测序结果表明，rAKBE04实现了一些不可编辑的目标位点的A-to-T碱基颠换，A-to-T编辑效率最高达到4.84％。水稻稳定转化结果同样也表明，含有mOsMPG和VP64耦合的rAKBE04在A-to-Y碱基颠换方面优于rAKBE01，不仅提高了碱基A-to-T颠换的效率，而且在OsDEP1、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2等靶点处首次实现了碱基A-to-T的颠换。通过与ABEs、CBEs和CGBEs的结合，具有更高的A-to-T颠换效率的rAKBE04将允许所有类型的碱基转换，从而大大扩大了植物碱基编辑工具箱，并可能扩展到其他作物的基础研究和遗传改良。本发明开发的rAKBEs碱基编辑将极大地丰富植物单碱基编辑工具箱，为水稻和其它农作物重要基因功能分析和遗传改良提供了重要技术支撑，不仅对作物改良中重要农业基因的定向进化创造新的等位基因具有重要的研究意义，同时也将进一步推动水稻等其他作物的分子精准设计育种。
附图说明
图1为hMPG、mhMPG、OsMPG与mOsMPG突变体氨基酸序列对比。
图2为植物rAKBEs载体结构示意图。其中，TadA8：腺嘌呤脱氨酶；nCas9(D10A)：Cas9(D10A)缺刻酶；NLS：核定位信号；VP64：反式激活因子；OsMPG：水稻烷基腺嘌呤DNA糖基化酶；mOsMPG：水稻烷基腺嘌呤DNA糖基化酶二突突变体。
图3为水稻原生质体中测试rAKBE单碱基编辑器效率统计图。图A表示ABE8e在水稻原生质体中测试A-to-G编辑效率统计图；图B表示ABE8e-VP64在水稻原生质体中测试A-to-G编辑效率统计图；图C表示rAKBE01在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率统计图；图D表示rAKBE02在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率统计图；图E表示rAKBE03在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率统计图；图F表示rAKBE04在水稻原生质体中测试A-to-C、A-to-T、A-to-G以及靶点处indel编辑效率统计图。以上所有载体在测试时，每个靶点均在原生质体中进行了三次独立重复实验。
图4为在水稻原生质体中测试rAKBEs靶点编辑窗口偏好性，靶点序列以1-20位置排列，21-23位为PAM序列；箱式图跨越25％-75％四分位数，其中水平线表示中位数，误差线延伸至最小值与最大值。图A表示ABE8e靶点编辑窗口偏好性统计图；图B表示rAKBE01靶点编辑窗口偏好性统计图；图C表示rAKBE02靶点编辑窗口偏好性统计图；图D表示rAKBE03靶点编辑窗口偏好性统计图；图E表示rAKBE04靶点编辑窗口偏好性统计图。
图5为在水稻原生质体中rAKBE04测试indel基因型，黄色标注为PAM位点，PAM位点下方比值表示indel基因型在所有基因型事件的占比，黑色部分代表删除核酸片段。图A表示rAKBE04在OsDEP1靶点编辑后深度测序indel基因型；图B表示rAKBE04在OsNRT1.1B靶点编辑后深度测序indel基因型；图C表示rAKBE04在OsWaxy-T1靶点编辑后深度测序indel基因型；图D表示rAKBE04在OsWaxy-T2靶点编辑后深度测序indel基因型。图E表示rAKBE04在OsWaxy-T3靶点编辑后深度测序indel基因型。
图6为rAKBE01介导稳定转化幼苗A-to-Y编辑的Sanger测序结果，箭头表示碱基编辑发生位点。
图7为rAKBE04介导稳定转化幼苗A-to-T编辑的Sanger测序结果，箭头表示碱基编辑发生位点。
图8为rAKBE04稳定转化幼苗indel基因型统计，黄色标注为PAM位点，PAM位点下方表示indel编辑基因型，黑色部分代表删除核酸片段，深灰色表示A-to-G编辑事件。
图9为rAKBE01与rAKBE04介导编辑水稻植株的基因表达量分析。图A表示对照株系、rAKBE01与rAKBE04介导编辑株系OsDEP1基因表达量分析统计图；图B表示对照株系、rAKBE01与rAKBE04介导编辑株系OsNRT1.1B基因表达量分析统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的1/2MS培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在1/2MS培养基中的浓度分别为：2.15g/L MS&Vitamins盐、15g/L蔗糖、2g/L植物凝胶。
下述实施例中的0.6M Mannitol溶液(pH 5.8)是将Mannitol和水混匀得到的溶液，其中Mannitol浓度为：2.186g/20ml。
下述实施例中的酶解液(pH 5.8)是将Cellulase RS、Macerozyme R-10、Mannitol、pH 5.7的MES、CaCl2、BSA和水混匀得到的溶液，其中各溶质在酶解液中的浓度分别为：1.5％Cellulase RS、0.75％ Macerozyme R-10、0.6M Mannitol、pH 5.7的MES、10mMCaCl2、0.1％BSA。
下述实施例中的W5溶液(pH 5.8)是将NaCl、CaCl2、KCl、pH 5.7的MES和水混匀得到的溶液，其中各溶质在W5溶液中的浓度分别为：0.9％ NaCl、125mM CaCl2、5mM KCl、2mMMES。
下述实施例中的MMG溶液(pH 5.8)是将Mannitol、MgCl2、MES和水混匀得到的溶液，其中各溶质在MMG溶液中的浓度分别为：0.6M Mannitol、15mM MgCl2、4mM MES。
下述实施例中的PEG-4000溶液(pH 5.8)是将PEG4000、Mannitol、CaCl2和水混匀得到的溶液，其中各溶质在PEG-4000溶液中的浓度分别为：40％(W/V)PEG4000、0.6MMannitol、0.1M CaCl2。
下述实施例中的LB液体培养基是将酵母粉、胰蛋白胨、NaCl和水混匀得到的溶液，其中各溶质在LB液体培养基中的浓度分别为：0.5％(W/V)酵母粉、1％(W/V)胰蛋白胨、1％(W/V)NaCl。
下述实施例中的AAM培养基(pH 5.2)是将MS salts&vitamins盐、蔗糖、MES、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、乙酰丁香酮和100mL 10x AA amino acids混匀得到的培养基，其中各溶质在AAM培养基中的浓度分别为4.3g/L MS salts&vitamins盐、68.5g/L蔗糖、0.5g/L MES、36g/L葡萄糖、500mg/L酪蛋白氨基酸、40mg/L乙酰丁香酮。上述10x AA amino acids溶液为将L-谷氨酰胺、L-天(门)冬氨酸、L-精氨酸、甘氨酸和水混匀得到的溶液，其中各溶质在10xAA amino acids溶液中的浓度为：8.76g/L L-谷氨酰胺、2.66g/L L-天(门)冬氨酸、1.74g/L L-精氨酸和75mg/L甘氨酸。
下述实施例中的R1培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、L-脯氨酸、2，4-D、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R1培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2.8g/L L-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R2培养基(pH 5.2)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、2，4-D、植物凝胶、乙酰丁香酮和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R2培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶、20mg/mL乙酰丁香酮。
下述实施例中的R1筛选培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、L-脯氨酸、2，4-D、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R1筛选培养基中的浓度为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、300mg/L酪蛋白氨基酸、2.8g/LL-脯氨酸、2mg/L 2，4-D、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R4分化培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、酪蛋白氨基酸、山梨醇、激动素、NAA、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R4分化培养基中的浓度分别为：4.3g/L MS&Vitamins盐、30g/L蔗糖、0.5g/L MES、2g/L酪蛋白氨基酸、30g/L山梨醇、2mg/L激动素、1mg/L NAA、4g/L植物凝胶。
下述实施例中的R5生根培养基(pH 5.8)是将MS&Vitamins盐、蔗糖、MES、植物凝胶和水混匀得到的培养基，其中各溶质在R5培养基中的浓度分别为：2.15g/L MS&Vitamins盐、15g/L蔗糖、0.5g/L MES、2g/L植物凝胶。
下述实施例中的A-to-K中的K表示G/T。
下述实施例中的A-to-Y中的Y表示C/T。
下述实施例中的A-to-B中的B表示G/C/T。
实施例1、不同植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的主要元件设计及其表达载体设计
一、不同植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的主要元件设计
本发明中的植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs有如下六种：ABE8e、ABE8e-VP64、rAKBE01、rAKBE2、rAKBE03、rAKBE04。各个植物A-to-K单碱基编辑器的主要元件分别如下：
单碱基编辑器ABE8e的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器ABE8e-VP64的主要元件如下：反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器rAKBE01的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器rAKBE02的主要元件如下：腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器rAKBE03的主要元件如下：反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
单碱基编辑器rAKBE04的主要元件如下：反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG、gRNA和筛选标记蛋白(如HPT)。
上述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG为将水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG氨基酸序列的第162位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第168位由天冬酰胺突变为丝氨酸后得到的蛋白质。
水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG、人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶七突突变体mhMPG和人源烷基腺嘌呤DNA糖基化酶hMPG的氨基酸序列比对图的氨基酸序列比对图如图1所示。
二、不同植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的表达载体设计
上述各植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs表达载体的结构示意图如图2所示。
单碱基编辑器ABE8e的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
单碱基编辑器ABE8e-VP64的表达载体包括融合蛋白VP64&TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白VP64&TadA8e&Cas9(D10A)的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、反式激活因子Vp64的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
单碱基编辑器rAKBE01的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
单碱基编辑器rAKBE02的表达载体包括融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&mOsMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
单碱基编辑器rAKBE03的表达载体包括融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、反式激活因子Vp64的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
单碱基编辑器rAKBE04的表达载体包括融合蛋白Vp64&TadA8e&Cas9(D10A)&mOsMPG的表达盒、gRNA表达盒和筛选标记蛋白HPT表达盒。其中，融合蛋白TadA8e&Cas9(D10A)&OsMPG的表达盒依次包括Ubi启动子、核定位信号NLS的编码基因、反式激活因子Vp64的编码基因、腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因、Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG的编码基因、核定位信号NLS的编码基因和E9R终止子。
上述各单碱基编辑器中的gRNA表达盒均依次包括OsU3启动子、gRNA的编码基因和OsU3终止子。
上述各单碱基编辑器中的筛选标记蛋白HPT表达盒均依次包括35S启动子、筛选标记蛋白HPT的编码基因和Nos终止子。
实施例2、不同植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的表达载体的构建及其在水稻基因组碱基编辑中的应用
一、不同植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的表达载体的构建
人工构建如下重组载体，各载体均为环状质粒：
单碱基编辑器ABE8e的表达载体共计5个，分别是pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器ABE8e-VP64的表达载体共计5个，分别是pABE8e-VP64-OsDEP1、pABE8e-VP64-OsNRT1.1B、pABE8e-VP64-OsWaxy-T1、pABE8e-VP64-OsWaxy-T2、pABE8e-VP64-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器rAKBE01的表达载体共计5个，分别是rAKBE01-OsDEP1、rAKBE01-OsNRT1.1B、rAKBE01-OsWaxy-T1、rAKBE01-OsWaxy-T2、rAKBE01-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器rAKBE02的表达载体共计5个，分别是rAKBE02-OsDEP1、rAKBE02-OsNRT1.1B、rAKBE02-OsWaxy-T1、rAKBE02-OsWaxy-T2、rAKBE02-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器rAKBE03的表达载体共计5个，分别是rAKBE03-OsDEP1、rAKBE03-OsNRT1.1B、rAKBE03-OsWaxy-T1、rAKBE03-OsWaxy-T2、rAKBE03-OsWaxy-T3重组载体。
单碱基编辑器rAKBE04的表达载体共计5个，分别是rAKBE04-OsDEP1、rAKBE04-OsNRT1.1B、rAKBE04-OsWaxy-T1、rAKBE04-OsWaxy-T2、rAKBE04-OsWaxy-T3重组载体。
pABE8e-OsDEP1重组载体的核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中第1-380位为OsU3启动子序列、第381-401位为gRNA靶点序列，第402-477位为gRNA骨架的编码序列，第478-497位为OsU3终止子序列；第530-2521位为Ubi启动子序列，第2546-2566位为核定位信号NLS的编码序列，编码序列11所示的核定位信号NLS，第2591-3088位为腺嘌呤脱氨酶TadA8e的编码基因序列，编码序列2所示的腺嘌呤脱氨酶TadA8e，第3185-7285位为Cas9(D10A)缺刻酶的编码基因序列，编码序列3所示的Cas9(D10A)缺刻酶，第7286-7333位为核定位信号NLS的编码序列，第7337-7971位为E9R终止子序列；第8296-8973位为35S启动子序列，第9018-10043位为筛选标记蛋白HPT的编码基因序列，编码序列4所示的筛选标记蛋白HPT，第10090-10264位为Nos终止子序列。
pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列为将pABE8e-OsDEP1重组载体序列中的gRNA靶点序列分别替换为表1中OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3对应的靶点序列，且保持其它序列不变后得到的序列。
pABE8e-VP64-OsDEP1、pABE8e-VP64-OsNRT1.1B、pABE8e-VP64-OsWaxy-T1、pABE8e-VP64-OsWaxy-T2、pABE8e-VP64-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为在pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体核苷酸序列中的第2590位和第2591位之间插入序列5所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列5为反式激活因子Vp64的编码基因序列(编码序列6所示的反式激活因子Vp64)和柔性连接肽的编码序列。
rAKBE01-OsDEP1、rAKBE01-OsNRT1.1B、rAKBE01-OsWaxy-T1、rAKBE01-OsWaxy-T2、rAKBE01-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为在pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体核苷酸序列中的第7285位和第7286位之间插入序列7所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列7为水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG的编码基因序列，编码序列8所示的水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG。
rAKBE02-OsDEP1、rAKBE02-OsNRT1.1B、rAKBE02-OsWaxy-T1、rAKBE02-OsWaxy-T2、rAKBE02-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为在pABE8e-OsDEP1、pABE8e-OsNRT1.1B、pABE8e-OsWaxy-T1、pABE8e-OsWaxy-T2、pABE8e-OsWaxy-T3重组载体核苷酸序列中的第7285位和第7286位之间插入序列9所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。其中，序列9为水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG的编码基因序列，编码序列10所示的水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG。
rAKBE03-OsDEP1、rAKBE03-OsNRT1.1B、rAKBE03-OsWaxy-T1、rAKBE03-OsWaxy-T2、rAKBE03-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为在rAKBE01-OsDEP1、rAKBE01-OsNRT1.1B、rAKBE01-OsWaxy-T1、rAKBE01-OsWaxy-T2、rAKBE01-OsWaxy-T3重组载体核苷酸序列中的第2590位和第2591位之间插入序列5所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。
rAKBE04-OsDEP1、rAKBE04-OsNRT1.1B、rAKBE04-OsWaxy-T1、rAKBE04-OsWaxy-T2、rAKBE04-OsWaxy-T3重组载体的核苷酸序列分别为在rAKBE02-OsDEP1、rAKBE02-OsNRT1.1B、rAKBE02-OsWaxy-T1、rAKBE02-OsWaxy-T2、rAKBE02-OsWaxy-T3重组载体核苷酸序列中的第2590位和第2591位之间插入序列5所示的DNA分子，且保持其它序列不变后得到的序列。
表1、靶点序列
二、水稻原生质体的分离、转化以及rAKBEs介导碱基编辑的编辑效果分析
将步骤一中构建的各个植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的重组表达载体(所有载体在测试时，每个靶点均在原生质体中进行了三次独立重复实验)分别按照如下步骤进行操作：
1、水稻原生质体的分离
将脱壳的水稻品种中花11种子先用75％的乙醇漂洗10分钟，再用20％的次氯酸钠处理20分钟，无菌水洗涤5次以上，得到消毒后种子。然后将消毒后种子放在1/2MS培养基上培养2周左右，在26℃，12h光照(150μmol·m-2·s-1)条件下培养，得到水稻幼苗。每个组培瓶可放30粒种子，60～90株幼苗可以做一次实验，分离出的原生质体量可以转化大约6个载体，每个质粒的转化设置3个重复。
选取水稻幼苗的茎干和叶鞘部分分离原生质体，具体步骤如下：用锋利的刀片切成大约0.5mm宽的细丝，可以20～30个放在一起切。将细丝放入0.6M Mannitol溶液中，锡箔纸包裹避光处理10分钟。用75μm尼龙布过滤，将细丝放入50mL酶解液中，避光，真空泵抽真空30min，压强约50kpa，取出后放在室温摇床上消化5～6小时，转速10～20rpm。加等体积W5溶液稀释酶解产物，终止酶解反应后用尼龙布过滤酶解液于50mL离心管收集原生质体，28℃，150g水平离心，升降速调至3，离心5min，弃上清；用10mL W5溶液轻轻悬起，28℃，150g水平离心，升降速为3，离心5min，弃上清；加适量MMG溶液重悬，调整原生质体浓度为2×106/mL，血球细胞计数器计数后备用。
2、水稻原生质体的转化
加入约20μg无内毒素的高浓度AKBE测试质粒(步骤一中构建的各个植物A-to-K单碱基编辑器rAKBEs的重组表达载体)于2mL离心管，用剪刀剪去枪尖的枪头吸取200μL步骤1获得的原生质体沿管壁缓慢加入离心管中，轻轻吸打混匀，再加入约220μL PEG-4000溶液，轻轻颠倒混匀，避光诱导转化10～20min；加入800μL W5溶液(室温)颠倒混匀，28℃，150g水平离心，升降速为3，离心5min，弃上清；加入1mL W5溶液，颠倒混匀，置28℃暗处培养。
转化后48h后，收集原生质体，弃上清。用枪吸打悬起原生质体于2mL离心管中，12000rpm离心1min后弃上清；提取原生质体基因组，具体方法同植物基因组提取方法，PCR扩增所选靶基因的目的片段进行Hi-tom高通量测序，Hi-tom测序使用引物如表2所示。
PCR扩增体系：10μL 2×Taq酶，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL基因组DNA模板(60ng/μL)，7μL ddH2O。
PCR扩增程序：98℃，3min；98℃，15s；60℃，15s；72℃，15s；35个循环；72℃，5min；16℃保持。
表2、深度测序所用引物列表
3、rAKBEs在原生质体中编辑效率的统计分析结果
本发明在水稻基因组中选定了5个内源靶点，深度测序后根据测序结果比较编辑载体的效率，以快速测试各个单碱基编辑器表达载体(下文简称载体)在水稻原生质体中的有效性。具体检测结果如图3、表3-表7所示。
ABE8e对照载体在5个靶点处没有检测到有A-to-Y碱基编辑事件，只检测到A-to-G碱基转换。其中，在OsDEP1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为8.91％，最低为5.01％；在OsNRT1.1B靶点处，A-to-G碱基编辑最为有效，效率最高为10.60％，最低为8.63％；在OsWaxy-T1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为8.65％，最低为6.82％；在OsWaxy-T2靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为9.67％，最低为7.71％；在OsWaxy-T3靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为6.33％，最低为4.41％。
ABE8e-VP64载体在5个靶点处没有检测到有A-to-Y碱基编辑事件，只检测到A-to-G碱基转换事件。其中，在OsDEP1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为10.81％，最低为9.45％，平均效率为10.11％；在OsNRT1.1B靶点处，A-to-G碱基编辑同样最为有效，效率最高为14.84％，最低为11.53％，平均效率为12.83％；在OsWaxy-T1靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为10.14％，最低为6.87％，平均效率为8.68％；在OsWaxy-T2靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为13.65％，最低为9.07％，平均效率为11.13％；在OsWaxy-T3靶点处，A-to-G碱基编辑效率最高为9.33％，最低为4.23％，平均效率为6.89％，相比ABE8e，在OsWaxy-T3靶点ABE8e-VP64可提高A-to-G碱基编辑效率1.47倍(9.33％/6.33％)。综上，ABE8e-VP64相比ABE8e，在5个靶点处，实现了A-to-G碱基转换效率的提高。
rAKBE01载体在OsDEP1靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为8.99％，最低为6.65％，平均效率为7.51％；在OsNRT1.1B靶点处深度测序首次在原生质体中检测到了A-to-C编辑事件，平均效率为0.47％，编辑效率最高为0.54％，最低为0.35％；A-to-G碱基编辑效率最高为8.37％，最低为7.18％，平均效率为7.84％；在OsWaxy-T1靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为7.87％，最低为6.29％，平均效率为7.00％；在OsWaxy-T2靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为8.73％，最低为7.40％，平均效率为8.15％；在OsWaxy-T3靶点处没有检测到A-to-Y碱基编辑事件的发生，A-to-G碱基编辑效率最高为8.23％，最低为6.68％，平均效率为7.50％。综上，植物A-to-Y单碱基编辑载体rAKBE01在5个靶点处深度测序的结果显示，在OsNRT1.1B靶点处检测到了A-to-C编辑事件，在其他靶点处没有检测到有A-to-Y碱基编辑事件的出现；同时，相比ABE8e载体，rAKBE01载体在5个靶点处，A-to-G碱基转换效率相当。
rAKBE02载体在5个内源靶点处均检测到了不同程度的A-to-Y/A-to-G事件。其中，在OsDEP1靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为0.64％，最低为0.41％，平均效率为0.53％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.22％，最低为0.72％，平均效率为0.97％，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为1.86％，最低为0.41％，平均效率为0.99％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为10.20％，最低为6.47％；在OsNRT1.1B靶点，A-to-C碱基编辑效率最高为1.12％，最低为0.70％，平均效率为0.91％，相比rAKBE01载体，rAKBE02载体的A-to-C碱基编辑效率约提高约2.07倍(1.12％/0.54％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.97％，最低为0.71％，平均效率为0.85％，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.09％，最低为1.57％，平均效率为1.76％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为10.99％，最低为10.40％；在OsWaxy-T1靶点处未检测到A-to-C碱基编辑事件，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.81％，最低为0.64％，平均效率为0.72％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为11.08％，最低为8.55％，平均效率为9.91％，相比rAKBE01，在OsWaxy-T1靶点rAKBE02提高A-to-G编辑效率1.41倍(11.08％/7.87％)；在OsWaxy-T2靶点处未检测到A-to-C碱基编辑事件，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.68％，最低为0.43％，平均效率为1.21％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为10.66％，最低为7.28％，平均效率为9.37％；在OsWaxy-T3靶点处未检测到A-to-C碱基编辑事件，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为0.60％，最低为0.48％，平均效率为0.54％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为8.21％，最低为7.45％。综上，相比rAKBE01载体，rAKBE02载体在5个靶点处，实现了A-to-Y碱基颠换效率的提高，尤其是OsNRT1.1B靶点处，A-to-C碱基编辑效率提高约2.07倍，同时，在OsWaxy-T1靶点A-to-G编辑效率提高约1.41倍。
相比rAKBE01载体，rAKBE03载体在5个内源靶点处均检测到了不同程度的A-to-Y/A-to-G碱基编辑事件，相比rAKBE02载体，A-to-Y效率有不同程度的提升。其中，在OsDEP1靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为0.99％，最低为0.80％，平均效率为0.89％，相比rAKBE02载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.55倍(0.99％/0.64％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.56％，最低为1.41％，平均效率为1.48％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率略微有所提高(1.56％/1.22％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.40％，最低为2.33％，平均效率为2.36％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.29倍(2.40％/1.86％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为14.38％，最低为13.28％，平均效率为13.65％；在OsNRT1.1B靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.63％，最低为0.98％，平均效率为1.23％，相比rAKBE01载体，A-to-C碱基编辑效率提高约3.02倍(1.63％/0.54％)，相比rAKBE02载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.46倍(1.63％/1.12％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.46％，最低为1.38％，平均效率为1.41％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.51倍(1.46％/0.97％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.01％，最低为2.38％，平均效率为2.64％，相比rAKBE01载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约5.57倍(3.01％/0.54％)，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.44倍(3.01％/2.09％)，靶点处indel事件效率最高为0.92％，最低为0.52％，平均效率为0.72％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为14.18％，最低为12.42％，平均效率为13.48％；在OsWaxy-T1靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.24％，最低为0.93％，平均效率为1.08％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.52％，最低为1.36％，平均效率为1.45％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.88倍(1.52％/0.81％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.60％，最低为2.45％，平均效率为2.53％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约3.21倍(2.60％/0.81％)，靶点处indel事件效率最高为0.75％，最低为0.41％，平均效率为0.56％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为16.07％，最低为12.38％，平均效率为14.38％；在OsWaxy-T2靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.33％，最低为0.97％，平均效率为1.12％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.77％，最低为1.58％，平均效率为1.99％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.65倍(2.77％/1.68％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.82％，最低为2.55％，平均效率为3.11％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.27倍(3.82％/1.68％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为12.37％，最低为9.35％，平均效率为10.58％；在OsWaxy-T3靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.28％，最低为0.80％，平均效率为1.07％，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为1.83％，最低为1.23％，平均效率为1.54％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约3.05倍(1.83％/0.60％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为2.96％，最低为2.03％，平均效率为2.61％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约4.93倍(2.96％/0.60％)，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为13.18％，最低为10.27％，平均效率为11.72％，相比rAKBE02载体，在OsWaxy-T3靶点rAKBE03提高A-to-G编辑效率1.61倍(13.18％/8.21％)。综上，相比rAKBE01与rAKBE02载体，rAKBE03载体显著提高了A-to-Y碱基颠换与A-to-G碱基转换的效率，并且在靶点处开始出现了小片段的碱基插入和缺失。
相比rAKBE01、rAKBE02与rAKBE03载体，rAKBE04载体在5个内源靶点处均显著提高了A-to-Y的编辑效率。其中，在OsDEP1靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为1.59％，最低为1.04％，平均效率为1.30％，相比rAKBE02载体，A-to-C碱基编辑效率提高约2.48倍(1.59％/0.64％)，相比rAKBE03载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.61倍(1.59％/0.99％)，A-to-T碱基编辑效率最高为2.21％，最低为1.74％，平均效率为1.97％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.81倍(2.21％/1.22％)，相比rAKBE03载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.42倍(2.21％/1.56％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.48％，最低为2.99％，平均效率为3.27％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.87倍(3.48％/1.86％)，相比rAKBE03载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.45倍(3.48％/2.40％)，靶点处indel事件效率最高为1.39％，最低为0.74％，平均效率为1.03％，A-to-G碱基编辑效率最高为16.63％，最低为13.60％；在OsNRT1.1B靶点处A-to-C碱基编辑效率最高为1.96％，最低为1.04％，平均效率为1.65％，相比rAKBE01载体，A-to-C碱基编辑效率提高约3.63倍(1.96％/0.54％)，相比rAKBE02载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.75倍(1.96％/1.12％)，相比rAKBE03载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.20倍(1.96％/1.63％)，A-to-T碱基编辑效率最高为2.66％，最低为1.47％，平均效率为2.22％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约2.74倍(2.66％/0.97％)，相比rAKBE03载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.82倍(2.66％/1.46％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为4.62％，最低为2.51％，平均效率为3.86％，相比rAKBE01载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约8.56倍(4.62％/0.54％)，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.21倍(4.62％/2.09％)，相比rAKBE03载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.53倍(4.62％/3.01％)，靶点处indel事件效率最高为1.09％，最低为0.83％，平均效率为0.98％，A-to-G碱基编辑效率最高为17.87％，最低为14.35％，平均效率为16.52％；在OsWaxy-T1靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.60％，最低为1.13％，平均效率为1.33％，相比rAKBE03载体，A-to-C碱基编辑效率提高约1.29倍(1.60％/1.24％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.95％，最低为1.90％，平均效率为2.51％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约3.64倍(2.95％/0.81％)，相比rAKBE03载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.94倍(2.95％/1.52％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为4.55％，最低为3.16％，平均效率为3.84％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约5.62倍(4.55％/0.81％)，相比rAKBE03载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.75倍(4.55％/2.60％)，靶点处indel事件效率最高为1.05％，最低为0.58％，平均效率为0.77％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为16.58％，最低为14.30％，平均效率为16.52％；在OsWaxy-T2靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.36％，最低为1.16％，平均效率为1.24％，相比rAKBE03载体，A-to-C碱基编辑效率相当(1.36％/1.33％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.43％，最低为1.41％，平均效率为1.85％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约1.45倍(2.43％/1.68％)，相比rAKBE03载体，A-to-T碱基编辑效率略微有所下降(2.43％/2.77％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.62％，最低为2.57％，平均效率为3.09％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约2.15倍(3.62％/1.68％)；相比rAKBE03载体，A-to-Y碱基编辑效率略微有所下降(3.62％/3.82％)，靶点处indel事件效率最高为0.60％，最低为0.50％，平均效率为0.56％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为14.24％，最低为11.50％，平均效率为13.19％；在OsWaxy-T3靶点处，A-to-C碱基编辑效率最高为1.52％，最低为1.26％，平均效率为1.41％，相比rAKBE03载体，A-to-C碱基编辑效率约提高1.19倍(1.52％/1.28％)，靶点处A-to-T碱基编辑效率最高为2.42％，最低为1.72％，平均效率为2.03％，相比rAKBE02载体，A-to-T碱基编辑效率提高约4.03倍(2.42％/0.60％)，相比rAKBE03载体，A-to-T碱基编辑效率约提高1.32倍(2.42％/1.83％)，靶点处A-to-Y碱基编辑效率最高为3.94％，最低为2.98％，平均效率为3.44％，相比rAKBE02载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约6.57倍(3.94％/0.60％)，相比rAKBE03载体，A-to-Y碱基编辑效率提高约1.33倍(3.94％/2.96％)，靶点处indel事件效率最高为0.95％，最低为0.39％，平均效率为0.58％，靶点处A-to-G碱基编辑效率最高为15.55％，最低为10.33％，平均效率为13.31％。综上，与rAKBE02载体相比，rAKBE04载体的A-to-C编辑效率提高约1.75-2.48倍，A-to-T编辑效率提高约1.45-4.03倍，A-to-Y编辑效率提高约1.87-6.57倍；相比rAKBE03载体，rAKBE04载体的A-to-C编辑效率提高约1.19-1.61倍，A-to-T编辑效率提高约1.32-1.94倍，A-to-Y编辑效率提高约1.33-1.75倍。相比ABE8e、ABE8e-VP64、rAKBE01、rAKBE-02和rAKBE03载体，rAKBE04载体分别可以提高A-to-G碱基编辑效率约2.46倍、1.67倍、2.11倍、1.89倍、1.18倍。
表3、水稻原生质体中rAKBEs在不同靶点A-to-C碱基编辑效率
注：A-to-C碱基编辑效率＝深度测序中A to C编辑reads/深度测序总reads。
表4、水稻原生质体中rAKBEs在不同靶点A-to-T碱基编辑效率
注：A-to-T碱基编辑效率＝深度测序中A to T编辑reads/深度测序总reads。
表5、水稻原生质体中rAKBEs在不同靶点A-to-Y碱基编辑效率
注：A-to-Y碱基编辑效率＝深度测序中A to Y编辑reads/深度测序总reads。
表6、水稻原生质体中ABE8e、ABE8e-VP64与rAKBEs在不同靶点A-to-G碱基编辑效率
注：A-to-G碱基编辑效率＝深度测序中A to G编辑reads/深度测序总reads。
4、rAKBEs在原生质体中编辑窗口的统计分析结果
在原生质体测试结中，ABE8e载体在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点均实现了碱基A-to-G的转换，编辑事件主要发生在A3至A8位之间。同时，rAKBEs碱基编辑器在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点处均实现了碱基A-to-B的替换。如图4所示，rAKBE01仅在OsNRT1.1B靶点处实现了第5位碱基A-to-T的颠换，在其他靶点处，未实现碱基A-to-K的颠换，且碱基A-to-G的转换，编辑事件主要发生在A3至A6位之间。rAKBE02介导碱基A-to-Y的颠换发生在A5、A6位；且碱基A-to-G的转换，编辑事件主要发生在A3至A9位之间。rAKBE03介导的碱基A-to-Y的颠换发生在A3至A9位，在A5与A6位编辑效率最高，碱基A-to-G的转换编辑事件主要发生在A1至A9位之间。相比ABE8e、ABE8e-VP64、rAKBEs载体，rAKBE04载体在A5与A6位碱基编辑效率最高，同时拓宽了碱基A-to-Y颠换与碱基A-to-G转换的窗口，编辑窗口拓宽至A1至A10位之间。
5、rAKBEs在原生质体中Indel事件基因型的统计分析结果
CRISPR/nCas9(D10A)在sgRNA引导下因Ruvc功能域的失活，因此该Nickase只切割靶标链，从而导致DNA在靶标链处造成缺口。植物pAYBE的腺嘌呤脱氨酶将腺嘌呤(A)催化脱氨产生次黄嘌呤(I)，MPG蛋白可以移除次黄嘌呤形成无碱基位点AP site(Apurinic site)并通过DNA聚合酶错配修复DNA双链，实现碱基A-to-Y的碱基颠换；同时，因nCas9(D10A)切割靶标链，同时与非靶标链上的AP site有机会形成交错的双链断裂(double strandbreak，DSB)，通过跨损伤修复与复制在靶标位点产生精准Indel编辑事件。
在原生质体测试结果中，在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点均检测到小片段精准缺失事件。以rAKBE04测试结果(图5)为例，在OsDEP1靶点中，缺失片段从2bp到13bp不等，其中A5至A6位点之间片段缺失效率为0.95％，A6位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.74％，A5位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为1.39％。在OsNRT1.1B靶点中，缺失片段从6bp到10bp，其中A5至A14位点之间片段缺失效率为1.09％，A8位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.83％，A13至T18位点之间片段缺失效率为1.03％。在OsWaxy-T1靶点中，缺失片段从9bp到11bp，其中A6至A15位点之间片段缺失效率为0.69％，A9位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为1.05％，T7至nCas9(D10A)切割位点之间片段缺失效率为0.58％。在OsWaxy-T2靶点中，缺失片段从9bp到12bp，其中A6至nCas9(D10A)切割位点之间片段缺失效率为0.59％，A9位点至nCas9(D10A)切割位点之间缺失片段事件出现效率为0.50％，G7至C18位点之间片段缺失效率为0.60％。在OsWaxy-T3靶点中，缺失片段从12bp到13bp，其中A6至nCas9(D10A)切割位点之间片段缺失效率为0.95％，A5至nCas9(D10A)切割位点之间片段缺失效率为0.41％，G7位点至G18位点之间缺失片段事件出现效率为0.39％。由此可见，应用这项技术，在靶点处产生具有确定长度的indel则可用于研究目标基因启动子区域的顺式作用元件和反式作用因子的相互作用机制。
三、农杆菌介导的水稻稳定遗传转化及rAKBE介导碱基编辑的编辑效果分析
为了探究rAKBEs介导的碱基编辑是否可以在稳定转化植株中实现，根据rAKBEs系列载体在水稻原生质体中的测试结果，选择rAKBE01载体与rAKBE04载体在水稻稳定转化中编辑与原生质体测试相同的5个内源靶点，经农杆菌介导的水稻稳定转化，对T0代转基因苗进行基因型鉴定，并对编辑效果进行分析，具体步骤如下：
1、农杆菌介导的水稻稳定遗传转化
选取饱满的水稻品种中花11种子，剥去种皮，灭菌洗涤浸泡后，均匀的点在灭菌R1固体培养基上，28℃黑暗处培养4～6周诱导愈伤形成；挑取状态较为紧实的愈伤颗粒至于新的R1继代培养基上，培养约1周后，用于农杆菌介导水稻愈伤遗传转化。
已制备好的含有rAKBE01载体或rAKBE04载体的农杆菌(EHA105感受态，购买于庄盟国际有限公司，货号为ZC142)的单克隆接种于10mL含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养12小时；当培养至对数期时，收集农杆菌菌体，并用AAM侵染液重悬农杆菌，将已培养好的水稻愈伤组织浸泡到此农杆菌重悬液中侵染30分钟；将侵染完的愈伤组织转入R2培养基上进行共培养3天；共培养结束后转至带有50mg/L潮霉素的R1筛选培养基上进行筛选培养，28℃培养4～6周；选取生长良好呈淡黄色的愈伤组织，用无菌镊子移至R4分化培养基，28℃持续光照培养；待分化出来的幼苗长至2-5厘米，转入R5生根培养基培养2～3周，获得抗性T0代植株(再生植株)，之后移入土中置于温室生长(温度28～30℃，16小时光照/8小时黑暗)。
2、再生植株的基因型检测
对步骤1中筛选获得的再生植株进行基因型检测及分析，使用CTAB提取方法，提取T0代植株的基因组DNA，以T0代植株基因组DNA为模板，进行PCR扩增获得靶标基因片段，对筛选获得的再生植株进行基因型检测及分析。基因型检测所用引物如表7所示。
表7、基因型检测所用引物
PCR扩增体系：15μL 2×Taq酶，1μL正向引物，1μL反向引物，1μL基因组DNA模板(100ng/μL)，12μL ddH2O。
PCR扩增程序：98℃，3min；98℃，15s；60℃，15s；72℃，30s；35个循环；72℃，5min；16℃保持。
对PCR扩增产物进行Sanger测序，与野生型基因组序列进行比对，鉴定编辑类型。
3、水稻稳定转化实现A-to-K单碱基编辑
rAKBE01介导的碱基编辑结果如图6、表8、表9所示，结果表明：在OsDEP1靶点共得到77簇转基因T0代苗，其中有1簇幼苗(#35)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.30％，76簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为98.70％。在OsNRT1.1B靶点共得到77簇转基因T0代苗，其中有1簇幼苗(#77)基因型在靶点处检测到了A-to-T事件的出现，基因型为双等位状态的A-to-T编辑事件，A-to-T事件发生效率为1.30％，其中，#77有4株单株。剩下的68簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为88.31％。在OsWaxy-T1靶点，共得到60簇转基因T0代苗，其中有2簇幼苗(#16、#47)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为3.33％，其中53簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为88.33％。在OsWaxy-T2靶点，共得到34簇转基因T0代苗，在靶点处未检测到A-to-T或indel的编辑事件，其中有32簇幼苗在靶点处检测到了A-to-G编辑事件的出现，A-to-G编辑效率为94.12％。在OsWaxy-T3靶点，共得到68簇转基因T0代苗，其中有1簇幼苗(#4)基因型在靶点处检测到了A-to-T事件的出现，基因型为双等位状态的A-to-T的编辑事件，A-to-T事件发生效率为1.47％，其中，#4株系有2株单株；在靶点处同时检测到了2簇幼苗(#31、#56)存在indel编辑事件，indel事件发生效率为2.94％；48簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为70.59％。同时由深度测序结果分析可知，精准删除与插入片段发生窗口集中在A4-A6至nCas9(D10A)切割位点，最多可以造成14bp的缺失与9bp的插入。这些结果表明，rAKBE01载体可以实现A-to-K的碱基编辑，同时也能够造成小片段的精准缺失。
rAKBE04介导的碱基编辑结果如图7、表8、表9、图8所示，结果表明：在OsDEP1靶点共得到78簇转基因T0代苗，有3簇幼苗(#64、#32、#72)在靶点处检测到了A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为3.85％，相比rAKBE01，在OsDEP1靶点首次实现稳定株系A-to-T的编辑。其中，#64株系有1株单株，为含有A5>T5、A6>G6编辑事件的纯合编辑植株，#32株系有3株单株，为含有A5>T5编辑事件的嵌合编辑植株，#72株系含有3株单株，为含有A5>T5、A3>G3、A6>G6编辑事件的双等位编辑植株。此外，有4簇幼苗(#1、#16、#38、#61)在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为5.13％，其中缺失片段多是集中在A5位点至nCas9切口处，有72簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为92.31％。在OsNRT1.1B靶点共得到43簇转基因T0代苗，有1簇幼苗(#43)在靶点处检测到了基因型为嵌合体的A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为2.33％，其中，#43株系有2株单株，为含有A6>T6编辑事件的嵌合编辑植株。相比rAKBE01，在OsNRT1.1B靶点A-to-T编辑效率提高1.79倍(2.33％/1.30％)。此外，有1簇幼苗(#19)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为2.33％，有31簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为72.09％。在OsWaxy-T1靶点共得到60簇转基因T0代苗，有1簇幼苗(#20)在靶点处检测到了基因型为杂合体的A-to-T的编辑事件，其中，#20株系有3株单株，为含有T5>A5、T6>A6编辑事件的杂合编辑植株，A-to-T编辑效率为1.67％。相比rAKBE01，在OsWaxy-T1靶点首次实现稳定株系A-to-T的编辑。此外，有1簇幼苗(#42)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.67％，有54簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为90.00％。在OsWaxy-T2靶点共得到77簇转基因T0代苗，有2簇幼苗(#35、#77)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，A-to-T编辑效率为2.60％，相比rAKBE01，在OsWaxy-T2靶点首次实现稳定株系A-to-T的编辑。其中，#35、#77为含有A5>T5编辑事件的双等位编辑植株，分别含有3株、1株单株。此外，有1簇幼苗(#25)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为1.30％；有71簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为92.21％。在OsWaxy-T3靶点共得到62簇转基因T0代苗，有4簇幼苗(#6、#51、#56、#17)在靶点处检测到了基因型为A-to-T的编辑事件，其中#51、#56株系基因型一致，视为同一个转化事件，A-to-T编辑效率为4.84％，相比rAKBE01，在OsWaxy-T3靶点A-to-T编辑效率提高3.29倍(4.84％/1.47％)。其中，#6株系含有T5>A5编辑事件的双等位编辑植株，含有单株3株；#51、#56、#17等株系为含有T5>A5编辑事件的杂合编辑植株，分别含有2株、2株、3株单株；此外，有3簇幼苗(#16、#31、#43)基因型在靶点处检测到了indel事件的出现，indel事件发生效率为4.84％，有44簇幼苗均检测到了A-to-G编辑事件，A-to-G编辑效率为70.97％。重要的是，在这些编辑的稳定株系中，OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2和OsWaxy-T3靶点上的indel产生效率分别为5.13％、2.33％、1.67％、1.30％和4.84％，先前报道中，基于hMPG的pAKBEs在OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2和OsWaxy-T3靶点上的indel产生效率分别为34.15％、5.56％、14.08％、25.61％和10.34％，由此可知，rAKBEs介导的靶点处indel的产生频率远低于pAKBEs。因此，rAKBEs诱导靶点处产生相对较低的indel频率的这一优势，将促使这项技术有可能应用于在作物重要基因的定向进化中。
表8、水稻稳定转化株系rAKBEs效率统计
注：A-to-G碱基编辑效率＝A to G编辑株系数目/转基因株系数目；A-to-T碱基编辑效率＝A to T编辑株系数目/转基因株系数目；Indel事件发生效率＝插入与缺失编辑株系数目/转基因株系数目。
表9、A-to-K水稻稳定转化株系基因型列表
此外，为验证VP64转录激活因子的使用是否会对基因组基因的表达量产生影响，对上述rAKBE01与rAKBE04介导的碱基编辑株系进行了定量PCR实验验证。因OsWaxy基因在幼苗时期不能表达，本发明测试了OsDEP1、OsNRT1.1B基因编辑株系的表达量。定量结果如图9所示，结果显示：OsDEP1、OsNRT1.1B基因编辑株系与野生型对照株系的表达量无显著差异，这表明VP64对靶基因的表达没有附带影响，至少在测试的靶基因和编辑的稳定株系中没有明显表达量的变化。
4、植物单碱基编辑Ato Y脱靶检测
根据CRISPR-GE(http://skl.scau.edu.cn/)网站预测与OsDEP1、OsNRT1.1B、OsWaxy-T1、OsWaxy-T2、OsWaxy-T3等靶点相似的脱靶位点，寻找脱靶位点序列并设计相应的引物对A-to-K编辑株系进行扩增与Sanger测序鉴定。
脱靶位点序列信息如表10所示，结果显示：在预测的脱靶位点处并没有编辑事件的出现。
表10、脱靶位点分析
注：下划线处为PAM序列；标红斜体碱基为脱靶位点与靶点错配碱基。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.成套系统，所述成套系统为如下M1)-M4)中任一种：
M1)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和gRNA；
M2)所述成套系统包括腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和gRNA；
M3)所述成套系统包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG和gRNA；
M4)所述成套系统包括反式激活因子Vp64、腺嘌呤脱氨酶TadA8e、Cas9(D10A)缺刻酶、水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG和gRNA；
所述水稻烷基DNA糖基化酶突变体mOsMPG为将所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG氨基酸序列的第162位由甘氨酸突变为精氨酸，且将第168位由天冬酰胺突变为丝氨酸后得到的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述腺嘌呤脱氨酶TadA8e为A1)或A2)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述Cas9(D10A)缺刻酶为B1)或B2)：
B1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
B2)将序列3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
4.根据权利要求1-3任一所述的成套系统，其特征在于：所述水稻烷基DNA糖基化酶OsMPG为C1)或C2)：
C1)氨基酸序列是序列8所示的蛋白质；
C2)将序列8所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
5.根据权利要求1-4任一所述的成套系统，其特征在于：所述反式激活因子Vp64为D1)或D2)：
D1)氨基酸序列是序列6所示的蛋白质；
D2)将序列6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
6.根据权利要求1-5任一所述的成套系统，其特征在于：所述成套系统还包括筛选剂抗性蛋白；
或，所述筛选剂抗性蛋白为潮霉素磷酸转移酶；
或，所述潮霉素磷酸转移酶为E1)或E2)：
E1)氨基酸序列是序列4所示的蛋白质；
E2)将序列4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
7.权利要求1-6任一所述的成套系统在如下S1)-S9)任一种中的应用：
S1)植物基因组序列的编辑；
S2)制备植物基因组序列的编辑的产品；
S3)提高植物基因组序列的编辑效率；
S4)制备提高植物基因组序列的编辑效率的产品；
S5)拓展植物基因组序列的编辑窗口；
S6)制备拓展植物基因组序列的编辑窗口的产品；
S7)制备植物突变体；
S8)植物育种；
S9)制备植物育种的产品。
8.如下T1)-T4)任一所述的方法：
T1)植物基因组序列的编辑方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1-6任一所述的成套系统，以实现植物基因组序列的编辑；
T2)提高植物基因组序列的编辑效率的方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1-6任一所述的成套系统，以实现提高植物基因组序列的编辑效率；
T3)拓展植物基因组序列的编辑窗口的方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1-6任一所述的成套系统，以实现拓展植物基因组序列的编辑窗口；
T4)植物突变体的制备方法，包括如下步骤：使植物表达权利要求1-6任一所述的成套系统，以获得植物突变体。
9.根据权利要求1-6任一所述的成套系统或权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物基因组序列的编辑包括将植物基因组序列中的碱基A突变为碱基C和/或碱基A突变为碱基G和/或碱基A突变为碱基T。
10.根据权利要求1-6任一所述的成套系统或权利要求7所述的应用或权利要求8所述的方法，其特征在于：所述植物为X1)或X2)或X3)：
X1)单子叶植物或双子叶植物；
X2)禾本科植物；
X3)水稻。
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