CN112575014B - 一种碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1及其构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种碱基编辑器SpCas9‑LjCDAL1及其构建和应用。本发明设计合成了新的类胞嘧啶脱氨酶LjCDAL1基因，融合失活的nSpCas9基因及3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(uracil DNA glycosylase(UDG)inhibitor，eUGI)，成为SpCas9‑LjCDAL1基因。并且本发明还提供包含该SpCas9‑LjCDAL1基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的SpCas9‑LjCDAL1基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的单碱基替换，特别是实现由C/G碱基突变成T/A。

Description

一种碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1及其构建和应用
技术领域
本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1在水稻基因打靶方面的应用。
背景技术
目前的基因编辑技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)依赖于在靶位点诱导双链断裂，进而激活DNA修复机制，实现基因矫正的目的。因此，基于双链断裂的基因编辑技术不仅容易产生DNA片段插入和缺失，且可能会产生脱靶效应及不确定编辑的产生，最终影响靶基因的功能。而单碱基编辑技术的出现能够实现更精准的基因替换。
单碱基基因编辑技术(base editors，BEs)，指能在基因组上引起单个碱基改变的基因编辑技术。基本原理是将胞嘧啶脱氨酶(APOBEC)或腺苷脱氨酶与Cas9n(D10A)融合而形成，依赖于CRISPR原理使得靶点远离PAM端的4-7位的单个碱基发生修改的基因编辑技术。目前的单碱基基因编辑包括两种，一种是CBEs(Cytidine base editors)——嘧啶碱基转换技术(C/G到T/A)，另一种是ABEs(Adenine base editors)——嘌呤碱基转换技术(A/T到G/C)。
基于CRISPR/Cas9基因编辑系统，2016年4月，哈佛大学生物化学家David Liu组率先在《自然》杂志上报告了一种新的基因编辑工具——单碱基编辑系统。单碱基编辑系统主要由sgRNA和融合蛋白两部分组成，其中融合蛋白一般由改造的Cas9蛋白、胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制子三者构成，而常兴组的融合蛋白仅包含Cas9和胞嘧啶脱氨酶两部分。sgRNA通过与靶位点互补配对，引导融合蛋白结合到靶位点发挥作用。融合蛋白中的胞嘧啶脱氨酶能够使非互补链中相应的胞嘧啶C经脱氨基作用转变为尿嘧啶U，而DNA复制进一步使得U被T代替，而互补链上原来与C的互补碱基鸟嘌呤G将会变成腺嘌呤A，而尿嘧啶糖基化酶抑制子则能够抑制U的切除，最终实现非互补链上的C替换为T和互补链上G替换为A的精确编辑。
转基因技术在改良作物性状方面已经做了大量的工作，但由于外源基因的导入和公众科普的缺乏，使得转基因作物的推广和应用存在较大的难度。作物在漫长的人工选育过程中，人类通过人工选择的方式定向选育具有优良性状的基因突变株，但该过程耗时、耗力且不可控。利用同源重组技术，可以获得定点修饰的优良植物株，但由于同源重组的效率太低，因此可行性不高。单碱基编辑技术在人细胞中高效编辑单个碱基的结果，提示可以通过该系统在农作物中的进行定点可控的基因编辑，进而快速、高效地获得优良性状的植株。但目前使用的单碱基编辑系统仍然存在一定的缺陷，如在植物中的编辑效率不稳定，编辑窗口有限等。为了优化编辑效率和扩展编辑窗口，挖掘和利用其它类型的胞嘧啶脱氨酶和类胞嘧啶脱氨酶实现更高效和更宽窗口的碱基编辑。因此，本发明希望提供一种新型的高编辑效率的工具，在实现更高编辑效率和更宽编辑窗口的同时，仍然保持了其基因编辑精准性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种碱基编辑工具SpCas9-LjCDAL1，实现由C/G到T/A的精准高效和宽窗口的碱基替换。
本发明设计了大量的七鳃鳗的类胞嘧啶脱氨酶(like cytidine deaminase，CDAL1)基因CDA，并通过实现反复筛选，从中找到了一条极为有效并且稳定的基因序列，命名为OsLjCDAL1。此外，本发明还在常用的SpCas9-BE编辑器上3’端融合了1个尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(uracil DNA glycosylase(UDG)inhibitor，UGI)。因此，OsLjCDAL1融合SpCas9基因，及一个UGI基因，成为OsSpCas9-LjCDAL1编辑器。本发明为了进一步提高OsSpCas9-LjCDAL1系统的单碱基编辑效率，在OsSpCas9-LjCDAL1基因3’端又融合了2个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因，最终成为OsSpCas9-eLjCDAL1基因，序列见序列表。将OsSpCas9-eLjCDAL1基因整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。
具体而言，在第一个方面，本发明提供了一种单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1，其特征在于，SpCas9-LjCDAL1器的基因序列至少包含：
(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者
(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且并且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者
(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列。
优选地，所述编辑器SpCas9-LjCDAL1的基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。
另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1的基因序列。
另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含所述的单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1或所述的表达盒。
另一方面，本发明提供一种所述的基因、所述表达盒或所述载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1实现对水稻基因组的单碱基编辑，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。
所述应用包括利用所述单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1识别带有NGG特征的PAM序列，完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有由C/G到T/A的单碱基突变突变位点的转基因植物或植物部分。
本发明的含有SpCas9-LjCDAL1基因的植物表达载体的构建方法是：利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUC411载体并回收，由于SpCas9-LjCDAL1序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将SpCas9-LjCDAL1连接到pHUC411载体，得到植物表达载体pHUC-SpCas9-LjCDAL1，命名为pHUC411-eLjCDAL1。
另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。在另一个方面，本发明提供一种利用pHUC411-LjCDAL1表达载体(其含有所述高编辑效率SpCas9-LjCDAL1基因及其应用)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUC411-LjCDAL1-ALS)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：
(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；
(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带SpCas9-LjCDAL1的打靶载体(pHUC411-LjCDAL1ALS)的农杆菌接触15分钟；
(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；
(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；
(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；并且
(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。
其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。
在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。
表1培养基的示例性配方
Figure GDA0003499079880000041
Figure GDA0003499079880000051
表1
表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。
在优选的实施方案中，所述SpCas9-LjCDAL1标记基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：
附图说明
图1为PHUC411-eLjCDAL1载体质粒示意图。
图2为pHUC411-eLjCDAL1编辑ALS基因突变示例。
图3为pHUC411-CDA编辑ALS基因突变示例。
具体实施方式
以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。
在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1——SpCas9-LjCDAL1基因的拼接
本申请的基因被命名为SpCas9-LjCDAL1，序列如SEQ ID NO:1所示。
本申请的发明人对现有的七鳃鳗的类胞嘧啶脱氨酶(cytidine deaminase，LjCDAL1)进行大量不同方式的优化调整，然后分别按照下述方式进行实验，最终找到了一个最有效的单碱基编辑器，并将该编辑器中与七鳃鳗的类胞嘧啶脱氨酶对应的同类基因序列命名为Os-LjCDAL1。
具体而言，将所设计的Os-LjCDAL1基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-LjCDAL1载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
其次，人工合成3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(uracil DNAglycosylase(UDG)inhibitor，UGI)，命名为eUGI，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-eUGI载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。
根据Gibson拼接原理，SpCas9基因，Os-LjCDAL1基因，3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因(UGI)连接在一起，并连接于PUC57-AMP载体上。具体操作如下：
根据LjCDAL1基因，SpCas9基因，eUGI基因的拼接顺序及PUC57-AMP载体序列，分别合成引物：
SpCas9 HR FP：5’-TTACGCCAAGCTGCCCTTGGCGGCCGCGCCACCATGgacaagaagtactccatcgg-3’
SpCas9 HR RP:5’-TCTTCGGGTCGGCCCGGCTGGAGCCGCCGGAatcgccgc-3’
LjCDAL1-SpCas9 HR FP:5’-ggcgatTCCGGCGGCTCCAGCCGGGCCGACCCGAAGAAG-3’
LjCDAL1-SpCas9 HR RP:5’-caccttccgcttcttctttggGGTGAACAGATGGAGTGG-3’
Sp-eUGI HR FP:5’-CACTCCATCTGTTCACCccaaagaagaagcggaaggtgTt-3’
eUGI HR RP:5’-GCGAATTGAAGCTGCCCTTGGAGCTCTCAGACCTTTCTCTTCTTCTT-3’
以SpCas9基因为模板，用引物SpCas9 HR FP及SpCas9 HR RP进行PCR扩增，回收PCR产物。以OsLjCDAL1基因为模板，用引物LjCDAL1-SpCas9 HR FP及LjCDAL1-SpCas9 HRRP进行PCR扩增，回收PCR产物。以eUGI基因为模板，用引物Sp-eUGI HR FP及eUGI HR RP进行PCR扩增，回收PCR产物。将上述的三个回收片段，及经EcoRI酶切之后的PUC57-AMP载体片段，根据Gibson拼接原理，按照NEB Golden Gate Assembly Kit说明书，构成SpCas9基因，OsLjCDAL1，eUGI基因融合在一起的基因，命名为OsSpCas9-LjCDAL1基因。
实施例2——含有OsSpCas9-LjCDAL1基因植物打靶载体的构建
从上面获得的含有OsSpCas9-LjCDAL1载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收OsSpCas9-LjCDAL1片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUC411进行线性化处理，回收pHUC411，将上述的OsSpCas9-LjCDAL1片段和pHUC411片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUC411SpCas9-LjCDAL1(图1)，命名为pHUC411-eLjCDAL1。
选择水稻ALS基因(Os02g0510200)中第552-571位的核苷酸序列CAGGTCCCCCGCCGCATGATCGG，(下划线部分为所述5’NGG-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUC411-eLjCDAL1融合形成pHUC411-eLjCDAL1-ALS。利用冻融法将融合后的植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。
实施例3——以pHUC411-eLjCDAL1-ALS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。
1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养
将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。
两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。
2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备
将含有pHUC411-LjCDAL1-ALS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660至约0.10-0.25，室温静置30min以上。
3、侵染和共培养
向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。
4、前筛选和筛选培养
共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。
5、分化再生
每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。
6、生根与移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。
7、分子鉴定
在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。设计PCR引物5’-CCAACCTCGTGTCCGCGCTCGC-3’及5’-TAATTGTGCTTGGTGATGGAGC-3’，用于扩增ALS靶标附近的151bp序列。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行35个循环：94℃30秒、58℃30秒、72℃20秒，最后72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图2和图3)。在pHUC411-eLjCDAL1-ALS获得的植株中，在检测的48株植株中出现40株突变，都是在靶标序列的不同位置实现了C到T的替换，单碱基编辑效率达到83.3％(图2)。以实验室之前构建的普通编辑器pHUC411-CDA的表达载体为对照，连接ALS靶标，按照上述相同的方式进行培养，得到对照组质粒pHUC411-CDA-ALS(其序列参见SEQ ID No.2)，经相同的农杆菌介导稳定遗传转化获得植株，在检测的48株植株中有20株靶标序列出现单碱基变异，突变率为41.7％。但在其中的5株中检测到了非预期替换或插入等非预期突变(图3)。由此可见，pHUC411-eLjCDAL1不仅能获得更高的单碱基突变率，更宽的编辑窗口，还能获得更“干净”的突变类型。
序列表
<110> 安徽省农业科学院水稻研究所
合肥丰乐种业股份有限公司
<120> 一种新型的碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1及其构建和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6024
<212> DNA
<213> LjCDAL1
<400> 1
atggacaaga agtactccat cggcctcgct atcggcacca attctgttgg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gccgtccaag aagttcaagg tcctcggcaa caccgaccgc 120
cactccatca agaagaatct catcggcgcc ctgctgttcg actctggcga gacagccgag 180
gctacaaggc tcaagaggac cgctagacgc aggtacacca ggcgcaagaa ccgcatctgc 240
tacctccaag agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300
ctcgaggaga gcttcctcgt cgaggaggac aagaagcacg agcgccatcc gatcttcggc 360
aacatcgtgg atgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctccgcaag 420
aagctcgtcg actccaccga taaggccgac ctcaggctca tctacctcgc cctcgcccac 480
atgatcaagt tcaggggcca cttcctcatc gagggcgacc tcaacccgga caactccgat 540
gtggacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600
atcaacgcct ctggcgttga cgccaaggct attctctctg ccaggctctc taagtcccgc 660
aggctcgaga atctgatcgc ccaacttccg ggcgagaaga agaatggcct cttcggcaac 720
ctgatcgccc tctctcttgg cctcaccccg aacttcaagt ccaacttcga cctcgccgag 780
gacgccaagc tccagctttc caaggacacc tacgacgacg acctcgacaa tctcctcgcc 840
cagattggcg atcagtacgc cgatctgttc ctcgccgcca agaatctctc cgacgccatc 900
ctcctcagcg acatcctcag ggtgaacacc gagatcacca aggccccact ctccgcctcc 960
atgatcaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctcacac tcctcaaggc cctcgtgaga 1020
cagcagctcc cagagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080
ggctacatcg atggcggcgc ttctcaagag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctc 1140
gagaagatgg acggcaccga ggagctgctc gtgaagctca atagagagga cctcctccgc 1200
aagcagcgca ccttcgataa tggctccatc ccgcaccaga tccacctcgg cgagcttcat 1260
gctatcctcc gcaggcaaga ggacttctac ccgttcctca aggacaaccg cgagaagatt 1320
gagaagatcc tcaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctcgccag gggcaactcc 1380
aggttcgcct ggatgaccag aaagtccgag gagacaatca ccccctggaa cttcgaggag 1440
gtggtggata agggcgcctc tgcccagtct ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500
aacctcccga acgagaaggt gctcccgaag cactcactcc tctacgagta cttcaccgtg 1560
tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggga tgaggaagcc agctttcctt 1620
agcggcgagc aaaagaaggc catcgtcgac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680
gtgaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtcgagatc 1740
tccggcgtcg aggataggtt caatgcctcc ctcgggacct accacgacct cctcaagatt 1800
atcaaggaca aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg acatcctcga ggacatcgtg 1860
ctcaccctca ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctcaa gacatacgcc 1920
cacctcttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgca ggcgctatac cggctggggc 1980
aggctctcta ggaagctcat caacggcatc cgcgacaagc agtccggcaa gacgatcctc 2040
gacttcctca agtccgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctcat ccacgacgac 2100
tccctcacct tcaaggagga catccaaaag gcccaggtgt ccggccaagg cgattccctc 2160
catgaacata tcgccaatct cgccggctcc ccggctatca agaagggcat tctccagacc 2220
gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcaggc acaagccaga gaacatcgtg 2280
atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccaca cagaagggcc aaaagaactc ccgcgagcgc 2340
atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctgggctccc agatcctcaa ggagcaccca 2400
gtcgagaaca cccagctcca gaacgagaag ctctacctct actacctcca gaacggccgc 2460
gacatgtacg tggaccaaga gctggacatc aaccgcctct ccgactacga cgtggaccat 2520
attgtgccgc agtccttcct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct cacccgctcc 2580
gacaagaaca ggggcaagtc cgataacgtg ccgtccgaag aggtcgtcaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctcct caacgccaag ctcatcaccc agaggaagtt cgacaacctc 2700
accaaggccg agagaggcgg cctttccgag cttgataagg ccggcttcat caagcgccag 2760
ctcgtcgaga cacgccagat cacaaagcac gtggcccaga tcctcgactc ccgcatgaac 2820
accaagtacg acgagaacga caagctcatc cgcgaggtga aggtcatcac cctcaagtcc 2880
aagctcgtgt ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctcaat gccgtggtgg gcacagccct catcaagaag 3000
tacccaaagc tcgagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060
atgatcgcca agtccgagca agagatcggc aaggcgaccg ccaagtactt cttctactcc 3120
aacatcatga atttcttcaa gaccgagatc acgctcgcca acggcgagat taggaagagg 3180
ccgctcatcg agacaaacgg cgagacaggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240
gccacagtgc gcaaggtgct ctccatgccg caagtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtt 3300
cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctcccaaagc gcaactccga caagctgatc 3360
gcccgcaaga aggactggga cccgaagaag tatggcggct tcgattctcc gaccgtggcc 3420
tactctgtgc tcgtggttgc caaggtcgag aagggcaaga gcaagaagct caagtccgtc 3480
aaggagctgc tgggcatcac gatcatggag cgcagcagct tcgagaagaa cccaatcgac 3540
ttcctcgagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tcatcatcaa gctcccgaag 3600
tacagcctct tcgagcttga gaacggccgc aagagaatgc tcgcctctgc tggcgagctt 3660
cagaagggca acgagcttgc tctcccgtcc aagtacgtga acttcctcta cctcgcctcc 3720
cactacgaga agctcaaggg ctccccagag gacaacgagc aaaagcagct gttcgtcgag 3780
cagcacaagc actacctcga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtg 3840
atcctcgccg atgccaacct cgataaggtg ctcagcgcct acaacaagca ccgcgataag 3900
ccaattcgcg agcaggccga gaacatcatc cacctcttca ccctcaccaa cctcggcgct 3960
ccagccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac ctctaccaag 4020
gaggttctcg acgccaccct catccaccag tctatcacag gcctctacga gacacgcatc 4080
gacctctcac aactcggcgg cgatagccgg gccgacccga agaagaagag gaaagtgggc 4140
ggcggcggca ccggcggcgg cggctccgcc gagtatgtga gggccctctt cgatttcaac 4200
ggcaatgacg aggaggatct ccctttcaag aagggcgaca tcctgcgcat tcgggataag 4260
ccggaggagc agtggtggaa cgcggaggac tctgagggca agcgcggcat gatcctcgtg 4320
ccatacgtcg agaagtactc cggcgattac aaggaccacg atggcgacta caaggatcat 4380
gacattgatt acaaggacga tgacgataag gccggcgacg agaatgtgag ggtgtccgag 4440
aagctggatt tcaacacatt cgagttcgag ttcgagaatc tccattacgc cgagggaagg 4500
ggccgcacct acgtgatctt cgacgtcaag ccacagtcag agggcggccg gggcaagagg 4560
ctgtggggct acgtgaggaa caatcctctc gacgatcatg ccgaggtcat cctgatgtca 4620
aagattaacg atcacctcga gacacatcag ggcaattaca caatgacctg gtacatgtca 4680
tggtccccgt gcggaaactg ctcctcagag ctggtgccat ggctcaagaa tctggaggag 4740
cagcagcaca cactcaccat gcatttctct cgcatctacg acaaggatag ggccgtggac 4800
cacaggggcc tctgcgacct ccagcgcgtg gtgtccaact acttccagat gggcgtgatg 4860
cggaagaagg aggtcaagaa gtgcctggcg gagtatgtgg aggcgtccgg ccgcacactc 4920
aggtggctga ggaccacaac atcaaatgcg ggaaggagga ggaggaagct ctacagcatt 4980
ctggtcaggt gcgccggaat gagggagtca ggaatgccac tccatctgtt caccgagggc 5040
cgcggctctt tactcacttg tggcgacgtg gaggaaaatc cgggcccgac caatctgtcc 5100
gacatcatcg agaaagaaac cggcaaacaa ctcgtcatcc aagagagcat cctcatgctg 5160
ccggaagaag tggaggaagt gatcggcaat aagccggaga gcgatatcct cgtgcatacc 5220
gcgtacgatg agtccaccga tgagaacgtg atgctcctca ccagcgacgc cccggaatat 5280
aaaccgtggg ccctcgtcat ccaagacagc aatggcgaaa ataagatcaa aatgctcccg 5340
aaaaaaaaga ggaaggtcgc gaccaacttc tctttactca agcaagccgg cgatgtggaa 5400
gaaaaccccg gtccgacaaa cctctccgac atcattgaga aggaaactgg caagcaactc 5460
gtgatccaag aatccatttt aatgctccca gaggaagtgg aggaggtgat cggcaacaag 5520
ccagagtccg acatcctcgt gcacacagcg tacgacgaaa gcaccgacga gaacgtcatg 5580
ttattaacat ccgatgcccc ggagtataag ccgtgggcgc tcgtcatcca agatagcaat 5640
ggcgaaaaca agatcaaaat gctgccgaag aagaagagga aagtcgaggg gcgcggctcc 5700
ctcctcacat gcggggatgt ggaggagaac cccggtccaa ccaatttatc cgacatcatc 5760
gaaaaggaaa ctggtaagca gctggtgatc caagaaagca ttctcatgct cccagaagag 5820
gtggaagagg tcatcggcaa taagccggaa tccgatatcc tcgtccacac cgcctatgac 5880
gagagcaccg atgaaaatgt catgttatta accagcgatg cgccagagta caagccgtgg 5940
gctttagtga tccaagatag caatggcgag aacaaaatca aaatgctcag cgggggcagc 6000
ccgaagaaga aaaggaaggt gtga 6024
<210> 2
<211> 6033
<212> DNA
<213> CDA
<400> 2
atggacaaga agtactccat cggcctcgct atcggcacca attctgttgg ctgggccgtg 60
atcaccgacg agtacaaggt gccgtccaag aagttcaagg tcctcggcaa caccgaccgc 120
cactccatca agaagaatct catcggcgcc ctgctgttcg actctggcga gacagccgag 180
gctacaaggc tcaagaggac cgctagacgc aggtacacca ggcgcaagaa ccgcatctgc 240
tacctccaag agatcttctc caacgagatg gccaaggtgg acgacagctt cttccacagg 300
ctcgaggaga gcttcctcgt cgaggaggac aagaagcacg agcgccatcc gatcttcggc 360
aacatcgtgg atgaggtggc ctaccacgag aagtacccga ccatctacca cctccgcaag 420
aagctcgtcg actccaccga taaggccgac ctcaggctca tctacctcgc cctcgcccac 480
atgatcaagt tcaggggcca cttcctcatc gagggcgacc tcaacccgga caactccgat 540
gtggacaagc tgttcatcca gctcgtgcag acctacaacc agctgttcga ggagaacccg 600
atcaacgcct ctggcgttga cgccaaggct attctctctg ccaggctctc taagtcccgc 660
aggctcgaga atctgatcgc ccaacttccg ggcgagaaga agaatggcct cttcggcaac 720
ctgatcgccc tctctcttgg cctcaccccg aacttcaagt ccaacttcga cctcgccgag 780
gacgccaagc tccagctttc caaggacacc tacgacgacg acctcgacaa tctcctcgcc 840
cagattggcg atcagtacgc cgatctgttc ctcgccgcca agaatctctc cgacgccatc 900
ctcctcagcg acatcctcag ggtgaacacc gagatcacca aggccccact ctccgcctcc 960
atgatcaaga ggtacgacga gcaccaccag gacctcacac tcctcaaggc cctcgtgaga 1020
cagcagctcc cagagaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa cggctacgcc 1080
ggctacatcg atggcggcgc ttctcaagag gagttctaca agttcatcaa gccgatcctc 1140
gagaagatgg acggcaccga ggagctgctc gtgaagctca atagagagga cctcctccgc 1200
aagcagcgca ccttcgataa tggctccatc ccgcaccaga tccacctcgg cgagcttcat 1260
gctatcctcc gcaggcaaga ggacttctac ccgttcctca aggacaaccg cgagaagatt 1320
gagaagatcc tcaccttccg catcccgtac tacgtgggcc cgctcgccag gggcaactcc 1380
aggttcgcct ggatgaccag aaagtccgag gagacaatca ccccctggaa cttcgaggag 1440
gtggtggata agggcgcctc tgcccagtct ttcatcgagc gcatgaccaa cttcgacaag 1500
aacctcccga acgagaaggt gctcccgaag cactcactcc tctacgagta cttcaccgtg 1560
tacaacgagc tgaccaaggt gaagtacgtg accgagggga tgaggaagcc agctttcctt 1620
agcggcgagc aaaagaaggc catcgtcgac ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680
gtgaagcagc tcaaggagga ctacttcaag aaaatcgagt gcttcgactc cgtcgagatc 1740
tccggcgtcg aggataggtt caatgcctcc ctcgggacct accacgacct cctcaagatt 1800
atcaaggaca aggacttcct cgacaacgag gagaacgagg acatcctcga ggacatcgtg 1860
ctcaccctca ccctcttcga ggaccgcgag atgatcgagg agcgcctcaa gacatacgcc 1920
cacctcttcg acgacaaggt gatgaagcag ctgaagcgca ggcgctatac cggctggggc 1980
aggctctcta ggaagctcat caacggcatc cgcgacaagc agtccggcaa gacgatcctc 2040
gacttcctca agtccgacgg cttcgccaac cgcaacttca tgcagctcat ccacgacgac 2100
tccctcacct tcaaggagga catccaaaag gcccaggtgt ccggccaagg cgattccctc 2160
catgaacata tcgccaatct cgccggctcc ccggctatca agaagggcat tctccagacc 2220
gtgaaggtgg tggacgagct ggtgaaggtg atgggcaggc acaagccaga gaacatcgtg 2280
atcgagatgg cccgcgagaa ccagaccaca cagaagggcc aaaagaactc ccgcgagcgc 2340
atgaagagga tcgaggaggg cattaaggag ctgggctccc agatcctcaa ggagcaccca 2400
gtcgagaaca cccagctcca gaacgagaag ctctacctct actacctcca gaacggccgc 2460
gacatgtacg tggaccaaga gctggacatc aaccgcctct ccgactacga cgtggaccat 2520
attgtgccgc agtccttcct gaaggacgac tccatcgaca acaaggtgct cacccgctcc 2580
gacaagaaca ggggcaagtc cgataacgtg ccgtccgaag aggtcgtcaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccagctcct caacgccaag ctcatcaccc agaggaagtt cgacaacctc 2700
accaaggccg agagaggcgg cctttccgag cttgataagg ccggcttcat caagcgccag 2760
ctcgtcgaga cacgccagat cacaaagcac gtggcccaga tcctcgactc ccgcatgaac 2820
accaagtacg acgagaacga caagctcatc cgcgaggtga aggtcatcac cctcaagtcc 2880
aagctcgtgt ccgacttccg caaggacttc cagttctaca aggtgcgcga gatcaacaac 2940
taccaccacg cccacgacgc ctacctcaat gccgtggtgg gcacagccct catcaagaag 3000
tacccaaagc tcgagtccga gttcgtgtac ggcgactaca aggtgtacga cgtgcgcaag 3060
atgatcgcca agtccgagca agagatcggc aaggcgaccg ccaagtactt cttctactcc 3120
aacatcatga atttcttcaa gaccgagatc acgctcgcca acggcgagat taggaagagg 3180
ccgctcatcg agacaaacgg cgagacaggc gagatcgtgt gggacaaggg cagggatttc 3240
gccacagtgc gcaaggtgct ctccatgccg caagtgaaca tcgtgaagaa gaccgaggtt 3300
cagaccggcg gcttctccaa ggagtccatc ctcccaaagc gcaactccga caagctgatc 3360
gcccgcaaga aggactggga cccgaagaag tatggcggct tcgattctcc gaccgtggcc 3420
tactctgtgc tcgtggttgc caaggtcgag aagggcaaga gcaagaagct caagtccgtc 3480
aaggagctgc tgggcatcac gatcatggag cgcagcagct tcgagaagaa cccaatcgac 3540
ttcctcgagg ccaagggcta caaggaggtg aagaaggacc tcatcatcaa gctcccgaag 3600
tacagcctct tcgagcttga gaacggccgc aagagaatgc tcgcctctgc tggcgagctt 3660
cagaagggca acgagcttgc tctcccgtcc aagtacgtga acttcctcta cctcgcctcc 3720
cactacgaga agctcaaggg ctccccagag gacaacgagc aaaagcagct gttcgtcgag 3780
cagcacaagc actacctcga cgagatcatc gagcagatct ccgagttctc caagcgcgtg 3840
atcctcgccg atgccaacct cgataaggtg ctcagcgcct acaacaagca ccgcgataag 3900
ccaattcgcg agcaggccga gaacatcatc cacctcttca ccctcaccaa cctcggcgct 3960
ccagccgcct tcaagtactt cgacaccacc atcgaccgca agcgctacac ctctaccaag 4020
gaggttctcg acgccaccct catccaccag tctatcacag gcctctacga gacacgcatc 4080
gacctctcac aactcggcgg cgatccaaag aagaaacgca aggtgggggg cggccccggt 4140
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gatagcaatg gcgaaaacaa gatcaaaatg ctgccgaaga agaagaggaa agtcgagggg 5700
cgcggctccc tcctcacatg cggggatgtg gaggagaacc ccggtccaac caatttatcc 5760
gacatcatcg aaaaggaaac tggtaagcag ctggtgatcc aagaaagcat tctcatgctc 5820
ccagaagagg tggaagaggt catcggcaat aagccggaat ccgatatcct cgtccacacc 5880
gcctatgacg agagcaccga tgaaaatgtc atgttattaa ccagcgatgc gccagagtac 5940
aagccgtggg ctttagtgat ccaagatagc aatggcgaga acaaaatcaa aatgctcagc 6000
gggggcagcc cgaagaagaa aaggaaggtg tga 6033

Claims (6)

1.一种单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1，其特征在于，SpCas9-LjCDAL1的基因序列为：
SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列。
2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求 1 所述的单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1或权利要求2所述的表达盒。
4.一种权利要求1所述的单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1、权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1实现对水稻基因组的单碱基编辑。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1用于将目标基因序列中特定或不特定位点的C/G碱基突变成A/T，获得含有单碱基突变的转基因植物或植物部分。
6.一种权利要求1中所述的单碱基编辑器SpCas9-LjCDAL1的构建方法，所述方法包括合成类胞嘧啶脱氨酶LjCDAL1基因并融合失活的nSpCas9基因及3个重复的尿嘧啶糖基化酶基因抑制剂基因。
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