CN109929857B - 一种高编辑效率SaCas9基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高编辑效率的SaCas9基因及其应用。本发明通过优化密码子设计合成了一种在水稻转基因过程中高编辑效率的SaCas9基因。并且本发明还提供包含该SaCas9基因的表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用设计的SaCas9基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切。本发明实现了水稻基因打靶，并且更加适合用于水稻基因打靶，尤其是水稻的基因组剪切。

Description

一种高编辑效率SaCas9基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高编辑效率的SaCas9基因的应用，尤其是在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

基因组编辑技术是植物基因功能研究和进行作物改良的有力工具，其主要依赖人工内切核酸酶(SSNs)在目标基因组位置产生双链断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。通过NHEJ的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变；在有供体DNA存在的情况下，有可能通过HDR进行断裂位置的修复，产生精准的基因插入或替换。在基因工程中多使用的基因编辑系统是CRISPR-SpCas9系统。该系统识别靶点时需要特定的NGG序列，因此在一定程度上限定了基因编辑系统的应用范围。同时SpCas9基因较大(4kb)，可能对细胞导入效率带来一定影响。

通过使用SaCas9可以一定程度降低SpCas9的局限性。SaCas9可以识别NNGRRT特征的PAM序列，同时大小较SpCas9也有显著降低。但现在使用的SaCas9是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，其不仅表达效率有限还会带来安全性的风险和担忧。具体而言，由于SaCas9来自于大肠杆菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

而且现有的SaCas9若直接使用，其在真核细胞中的表达效率也偏低，从而影响其对DNA双链的切割效率。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种高编辑效率的、非提取自大肠杆菌的SaCas9基因。

本发明的申请人经过大量实验获得了一种能够在水稻转基因打靶过程中，实现高编辑和剪切效率的SaCas9基因，并整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种高编辑效率的SaCas9基因，其特征在于，所述高编辑效率的SaCas9基因，SaCas9基因至少包含：

(a)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列；或者

(b)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的核苷酸序列；或者

(c)在SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的；或者

(d)SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列缺失一个或多个核苷酸且能够进行水稻基因组剪切的。

优选地，所述高编辑效率的SaCas9基因由序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含所述的SaCas9基因。

另一方面，本发明提供一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含所述的SaCas9基因或所述的表达盒。

另一方面，本发明提供一种所述的基因、所述表达盒或所述载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述高编辑效率的SaCas9基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

所述应用包括利用所述SaCas9基因识别带有NNGRRT特征的PAM序列，完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

本发明的高编辑效率的SaCas9基因，命名为plant SaCas9。

本发明的含有plant SaCas9基因的植物表达载体的构建方法是：利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN900载体并回收，由于合成的plant SaCas9序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将plantSaCas9连接到pHUN600载体，得到植物表达载体pHUN-plant SaCas9(pHUN 911)，在载体图谱中，plant SaCas9标为Os-SaCas9。

另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUN-plantSaCas9(pHUN 911)表达载体(其含有所述高编辑效率SaCas9基因及其应用)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN 911-PDS)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带plantSaCas9的打靶载体(pHUN 611-BEL)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述plant SaCas9标记基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：

ATGGCCCCAAAGAAGAAGCGCAAGGTCAAGCGGAACTACATCCTCGGACTGGACATCGGTATTACAAGTGTTGGTTATGGTATTATTGACTATGAAACTCGGGACGTTATTGACGCCGGCGTCCGCCTGTTCAAGGAGGCGAACGTGGAGAACAATGAGGGAAGGAGGAGCAAGCGGGGCGCCCGGCGGCTGAAGAGGAGGAGGAGGCACCGCATTCAGAGGGTCAAGAAGCTCCTGTTCGATTACAACCTCCTGACCGACCATTCTGAGCTGTCCGGCATCAATCCATACGAGGCCCGCGTGAAGGGCCTGAGCCAGAAGCTCTCAGAGGAGGAGTTCTCTGCGGCCCTCCTGCACCTCGCCAAGAGGAGGGGCGTGCATAACGTCAATGAGGTGGAGGAGGATACCGGCAACGAGCTGTCCACAAAGGAGCAGATTAGCAGGAACTCCAAGGCCCTGGAGGAGAAGTATGTGGCGGAGCTGCAGCTGGAGCGCCTCAAGAAGGATGGCGAGGTGCGGGGCTCTATCAATAGGTTCAAGACCTCCGACTACGTCAAGGAGGCCAAGCAGCTCCTGAAGGTGCAGAAGGCGTACCACCAGCTCGATCAGAGCTTCATTGATACATACATCGACCTCCTGGAGACACGCCGGACATACTACGAGGGACCTGGAGAGGGCTCACCGTTCGGCTGGAAGGACATCAAGGAGTGGTACGAGATGCTGATGGGCCATTGCACCTACTTCCCGGAGGAGCTGCGGAGCGTCAAGTACGCCTACAACGCGGATCTGTACAACGCGCTCAATGACCTGAACAATCTCGTGATCACCAGGGATGAGAACGAGAAGCTCGAGTACTACGAGAAGTTCCAGATCATTGAGAATGTCTTCAAGCAGAAGAAGAAGCCAACACTGAAGCAGATTGCCAAGGAGATCCTCGTCAACGAGGAGGACATCAAGGGCTACCGCGTGACCTCAACAGGCAAGCCTGAGTTCACCAATCTCAAGGTGTACCACGATATTAAGGACATCACAGCGCGGAAGGAGATCATTGAGAACGCCGAGCTGCTGGATCAGATTGCGAAGATCCTCACCATCTACCAGTCCAGCGAGGACATCCAGGAGGAGCTGACCAACCTCAATTCTGAGCTGACACAGGAGGAGATCGAGCAGATTTCCAATCTGAAGGGCTACACCGGCACACACAACCTCTCCCTGAAGGCCATCAATCTCATTCTGGATGAGCTGTGGCATACAAACGACAATCAGATTGCGATCTTCAACAGGCTCAAGCTGGTCCCTAAGAAGGTGGACCTCTCTCAGCAGAAGGAGATTCCTACCACACTGGTCGACGATTTCATCCTCTCCCCGGTGGTCAAGCGCTCTTTCATCCAGTCCATCAAGGTCATCAACGCCATCATTAAGAAGTACGGCCTGCCGAATGATATCATTATCGAGCTGGCCAGGGAGAAGAACTCTAAGGACGCGCAGAAGATGATTAATGAGATGCAGAAGCGGAACAGGCAGACCAATGAGCGCATCGAGGAGATTATCCGGACCACAGGCAAGGAGAACGCCAAGTACCTGATTGAGAAGATCAAGCTCCACGATATGCAGGAGGGCAAGTGCCTGTACTCCCTCGAGGCGATCCCACTCGAGGACCTCCTGAACAATCCTTTCAACTACGAGGTCGATCATATTATCCCGAGGAGCGTGTCATTCGACAATAGCTTCAACAATAAGGTGCTGGTCAAGCAGGAGGAGAACTCAAAGAAGGGCAATCGCACCCCATTCCAGTACCTCTCATCTTCCGATTCTAAGATTTCCTACGAGACATTCAAGAAGCATATCCTCAATCTGGCCAAGGGCAAGGGCCGGATCAGCAAGACCAAGAAGGAGTACCTCCTGGAGGAGCGGGACATTAACAGGTTCTCAGTCCAGAAGGATTTCATCAACAGGAATCTGGTGGACACCAGGTACGCCACCAGGGGCCTCATGAATCTCCTGAGGTCTTACTTCCGCGTCAACAATCTGGATGTGAAGGTCAAGAGCATCAACGGCGGCTTCACATCATTCCTCAGGCGCAAGTGGAAGTTCAAGAAGGAGCGCAACAAGGGCTACAAGCACCATGCCGAGGATGCGCTGATTATCGCCAATGCGGACTTCATTTTCAAGGAGTGGAAGAAGCTCGACAAGGCCAAGAAGGTCATGGAGAACCAGATGTTCGAGGAGAAGCAGGCGGAGTCCATGCCGGAGATCGAGACAGAGCAGGAGTACAAGGAGATTTTCATCACACCACACCAGATTAAGCATATCAAGGATTTCAAGGACTACAAGTACTCTCACAGGGTCGATAAGAAGCCGAACCGCGAACTGATTAATGACACCCTCTACTCCACAAGGAAGGACGATAAGGGCAATACCCTCATCGTGAACAATCTGAACGGCCTCTACGACAAGGATAATGACAAGCTGAAGAAGCTCATTAACAAGAGCCCGGAGAAGCTCCTGATGTACCACCATGATCCACAGACATACCAGAAGCTCAAGCTGATCATGGAGCAGTACGGCGACGAGAAGAACCCTCTCTACAAGTACTACGAGGAGACAGGCAACTACCTGACAAAGTACTCAAAGAAGGATAATGGCCCAGTGATCAAGAAGATCAAGTACTACGGCAACAAGCTGAATGCCCATCTCGACATCACCGACGATTACCCAAACTCTCGGAATAAGGTGGTCAAGCTCTCCCTGAAGCCTTACAGGTTCGATGTCTACCTGGACAACGGCGTGTACAAGTTCGTGACAGTCAAGAATCTCGATGTCATCAAGAAGGAGAACTACTACGAAGTGAATAGCAAGTGCTACGAGGAGGCGAAGAAGCTCAAGAAGATTAGCAACCAGGCCGAGTTCATCGCGTCATTCTACAACAATGACCTGATTAAGATCAATGGCGAGCTGTACCGGGTCATTGGCGTGAACAATGATCTCCTGAACAGGATCGAAGTGAATATGATTGACATCACCTACCGCGAGTACCTCGAGAACATGAATGATAAGAGGCCGCCACGCATTATCAAGACCATTGCCAGCAAGACACAGTCAATCAAGAAGTACTCAACAGACATCCTCGGTAACCTCTACGAAGTCAAGTCCAAGAAGCATCCCCAGATTATCAAGAAGGGTTAA

附图说明

图1至图5为本发明的plantSaCas9与原始SaCas9核苷酸序列比对。其中上方的一排为本发明的plantSaCas9的核苷酸序列，下方的一排为原始SaCas9的核苷酸序列。

图6为PHUN911(SaCas9)载体质粒示意图。

图7为转基因植株中SaCas9产生的靶向突变。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——SaCas9基因

本申请的基因被命名为plantSaCas9，序列如SEQ ID NO:1所示，与SaCas9序列比对见图1-5。

进一步分析其碱基组成，分析本发明的plant SaCas9和现有SaCas9基因所编码的蛋白氨基酸序列，二者氨基酸序列完全一致。

将设计好的plantSaCas9基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-plant SaCas9载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

实施例2——含有plant SaCas9基因植物打靶载体的构建

从上面含有PUC57-AMP-plant SaCas9载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收plantSaCas9片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN900进行线性化处理，回收pHUN600，将上述的plantSaCas9片段和pHUN900片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN900-plant SaCas9(图6)，命名为pHUN911。

选择水稻OsPDS基因(Os03g0184000)中第573-599位的核苷酸序列AAACCCATATTGCTTGAGGCAAGGGAT，(下划线部分为所述5’NNGRRT-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUN911融合形成pHUN911-PDS。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例3——以pHUN911-PDS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUN911-PDS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增密码子植物化改造的plantSaCas9的PCR引物为5’-GCAGTCACATCGTGGTCTTAGC-3’及5’-AATAATCCACAAATGCTACTAACA-3’，产生长度为260bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图7)，在检测的40株植株中出现33株突变。证明本发明的SaCas9基因在植物中编辑效率相当高。

类似地，采用上述相同的方法，参照图1-5，申请人也构建了原始的SaCas9打靶载体并进行水稻遗传转化和分子鉴定，但并未得到阳性突变植株。由于实验过程类似，这里不再重复描述。

序列表

<110> 合肥戬谷生物科技有限公司

<120> 一种高编辑效率SaCas9 基因及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3186

<212> DNA

<213> 人工序列(man made)

<400> 1

atggccccaa agaagaagcg caaggtcaag cggaactaca tcctcggact ggacatcggt 60

attacaagtg ttggttatgg tattattgac tatgaaactc gggacgttat tgacgccggc 120

gtccgcctgt tcaaggaggc gaacgtggag aacaatgagg gaaggaggag caagcggggc 180

gcccggcggc tgaagaggag gaggaggcac cgcattcaga gggtcaagaa gctcctgttc 240

gattacaacc tcctgaccga ccattctgag ctgtccggca tcaatccata cgaggcccgc 300

gtgaagggcc tgagccagaa gctctcagag gaggagttct ctgcggccct cctgcacctc 360

gccaagagga ggggcgtgca taacgtcaat gaggtggagg aggataccgg caacgagctg 420

tccacaaagg agcagattag caggaactcc aaggccctgg aggagaagta tgtggcggag 480

ctgcagctgg agcgcctcaa gaaggatggc gaggtgcggg gctctatcaa taggttcaag 540

acctccgact acgtcaagga ggccaagcag ctcctgaagg tgcagaaggc gtaccaccag 600

ctcgatcaga gcttcattga tacatacatc gacctcctgg agacacgccg gacatactac 660

gagggacctg gagagggctc accgttcggc tggaaggaca tcaaggagtg gtacgagatg 720

ctgatgggcc attgcaccta cttcccggag gagctgcgga gcgtcaagta cgcctacaac 780

gcggatctgt acaacgcgct caatgacctg aacaatctcg tgatcaccag ggatgagaac 840

gagaagctcg agtactacga gaagttccag atcattgaga atgtcttcaa gcagaagaag 900

aagccaacac tgaagcagat tgccaaggag atcctcgtca acgaggagga catcaagggc 960

taccgcgtga cctcaacagg caagcctgag ttcaccaatc tcaaggtgta ccacgatatt 1020

aaggacatca cagcgcggaa ggagatcatt gagaacgccg agctgctgga tcagattgcg 1080

aagatcctca ccatctacca gtccagcgag gacatccagg aggagctgac caacctcaat 1140

tctgagctga cacaggagga gatcgagcag atttccaatc tgaagggcta caccggcaca 1200

cacaacctct ccctgaaggc catcaatctc attctggatg agctgtggca tacaaacgac 1260

aatcagattg cgatcttcaa caggctcaag ctggtcccta agaaggtgga cctctctcag 1320

cagaaggaga ttcctaccac actggtcgac gatttcatcc tctccccggt ggtcaagcgc 1380

tctttcatcc agtccatcaa ggtcatcaac gccatcatta agaagtacgg cctgccgaat 1440

gatatcatta tcgagctggc cagggagaag aactctaagg acgcgcagaa gatgattaat 1500

gagatgcaga agcggaacag gcagaccaat gagcgcatcg aggagattat ccggaccaca 1560

ggcaaggaga acgccaagta cctgattgag aagatcaagc tccacgatat gcaggagggc 1620

aagtgcctgt actccctcga ggcgatccca ctcgaggacc tcctgaacaa tcctttcaac 1680

tacgaggtcg atcatattat cccgaggagc gtgtcattcg acaatagctt caacaataag 1740

gtgctggtca agcaggagga gaactcaaag aagggcaatc gcaccccatt ccagtacctc 1800

tcatcttccg attctaagat ttcctacgag acattcaaga agcatatcct caatctggcc 1860

aagggcaagg gccggatcag caagaccaag aaggagtacc tcctggagga gcgggacatt 1920

aacaggttct cagtccagaa ggatttcatc aacaggaatc tggtggacac caggtacgcc 1980

accaggggcc tcatgaatct cctgaggtct tacttccgcg tcaacaatct ggatgtgaag 2040

gtcaagagca tcaacggcgg cttcacatca ttcctcaggc gcaagtggaa gttcaagaag 2100

gagcgcaaca agggctacaa gcaccatgcc gaggatgcgc tgattatcgc caatgcggac 2160

ttcattttca aggagtggaa gaagctcgac aaggccaaga aggtcatgga gaaccagatg 2220

ttcgaggaga agcaggcgga gtccatgccg gagatcgaga cagagcagga gtacaaggag 2280

attttcatca caccacacca gattaagcat atcaaggatt tcaaggacta caagtactct 2340

cacagggtcg ataagaagcc gaaccgcgaa ctgattaatg acaccctcta ctccacaagg 2400

aaggacgata agggcaatac cctcatcgtg aacaatctga acggcctcta cgacaaggat 2460

aatgacaagc tgaagaagct cattaacaag agcccggaga agctcctgat gtaccaccat 2520

gatccacaga cataccagaa gctcaagctg atcatggagc agtacggcga cgagaagaac 2580

cctctctaca agtactacga ggagacaggc aactacctga caaagtactc aaagaaggat 2640

aatggcccag tgatcaagaa gatcaagtac tacggcaaca agctgaatgc ccatctcgac 2700

atcaccgacg attacccaaa ctctcggaat aaggtggtca agctctccct gaagccttac 2760

aggttcgatg tctacctgga caacggcgtg tacaagttcg tgacagtcaa gaatctcgat 2820

gtcatcaaga aggagaacta ctacgaagtg aatagcaagt gctacgagga ggcgaagaag 2880

ctcaagaaga ttagcaacca ggccgagttc atcgcgtcat tctacaacaa tgacctgatt 2940

aagatcaatg gcgagctgta ccgggtcatt ggcgtgaaca atgatctcct gaacaggatc 3000

gaagtgaata tgattgacat cacctaccgc gagtacctcg agaacatgaa tgataagagg 3060

ccgccacgca ttatcaagac cattgccagc aagacacagt caatcaagaa gtactcaaca 3120

gacatcctcg gtaacctcta cgaagtcaag tccaagaagc atccccagat tatcaagaag 3180

ggttaa 3186

Claims (5)

1.一种高编辑效率的SaCas9基因，其特征在于，所述高编辑效率的SaCas9基因，SaCas9基因由SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列构成。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的SaCas9基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的高编辑效率的SaCas9基因或权利要求2 所述的表达盒。

4.一种权利要求1所述的高编辑效率的SaCas9基因、权利要求2所述的表达盒或权利要求3所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述高编辑效率的SaCas9基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

5.一种将权利要求1中所述的高编辑效率的SaCas9基因导入水稻细胞的方法。

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