CN107142271A - 在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在基因打靶中具有高突变效率的PL‑LbCpf1‑RR基因及其应用。本发明在水稻基因打靶实验过程中，意外获得了一种新的PL‑LbCpf1‑RR基因，发现利用该PL‑LbCpf1‑RR基因进行水稻剪切，能够识别更多基因组位点并且具有高突变效率。此外，并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用所获得的PL‑LbCpf1‑RR构建植物表达载体，构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切，实现了水稻基因打靶，并且获得了高突变效率。

Description

在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因及其在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

作物分子育种的关键是高效定向的创制基因突变材料。Cpf1是最近发现的一种位点特异性核酸酶，CRSIPR/Cpf1系统是存在于细菌中的一种先天性免疫系统。Cpf1能够独自地对crRNA前体进行加工，然后利用成熟的crRNA特异性的识别和剪切DNA。利用这一原理，在真核生物细胞中，通过人工合成带有与Cpf1结合和特异识别靶位点的crRNA，同样可以引导 Cpf1切割基因组中的靶点序列，在细胞启动DNA修复机制后，切割位点会出现随机的碱基插入或缺失，从而实现了位点特异性的基因打靶。在水稻，拟南芥，烟草等植物中，通过工程化改造Cpf1，同样可以实现植物基因组特定位点的高效突变。例如，利用工程化的FrancisellanovicidaCpf1可在水稻叶型决定基因Drooping leaf编码区引入靶向突变，造成目标水稻叶片斜披。而利用来源于Lachnospiraceae bacterium菌的Cpf1(LbCpf1)则可高效编辑水稻叶绿素合成相关基因Phytoenedesaturase编码区引入靶向突变，造成目标水稻叶色改变。

目前植物中有三种Cpf1，FnCpf1，LbCpf1和来源于Acidaminococcus sp. BV3L6的AsCpf1在经工程化改造后可有效作用，而其中效率最高的是LbCpf1。LbCpf1可有效识别基因组中的TTTV(V＝A/C/G)序列作为PAM，从而靶向其下游序列。相对于Cas9识别的NGG PAM，基因组中TTTV的数量明显偏少，造成LbCpf1可编辑数量受限。

但是，目前还没有一种通用可行的提高LbCpf1可编辑位点数量并且能够提高LbCpf1基因在作物基因打靶中的突变效率的方法，而且现有的高突变效率的LbCpf1基因数量有限。因此，能够提供更多的在作物基因打靶中提供更多编辑位点的LbCpf1基因是人们迫切希望的，但是这样的基因往往是可遇而不可求的，没有成形的理论或方法能够为人们找到这样的基因提供理论依据。

发明内容

针对上述问题，本发明希望提供一种在作物基因打靶中具有较多编辑位点并且具有较高突变效率的LbCpf1基因。

具体而言，在第一个方面，本发明提供一种新的高突变效率 PL-LbCpf1-RR基因，命名为PL-LbCpf1-RR，所述PL-LbCpf1-RR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

优选地，该基因由SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列构成。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述PL-LbCpf1-RR基因的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用NotI/SacI酶切位点，用 NotI/SacI酶切pHUN600载体并回收，由于合成的PL-LbCpf1-RR序列两端加有NotI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将PL-LbCpf1-RR连接到 pHUN600载体，得到植物表达载体pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN 6a11)。

另一方面，本发明在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的PL-LbCpf1-RR基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述在基因打靶中具有高突变效率的 PL-LbCpf1-RR基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUN-PL-LbCpf1-RR(pHUN 6a11)表达载体(其含有所述PL-LbCpf1-RR基因)，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUN 6a11-PDS)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带PL-LbCpf1-RR的打靶载体 (pHUN 6a11-PDS)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入 2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；以及

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所采用的优化的“N6 majors”指的是，该N6 majors中[NO3 -]/[NH4+]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述PL-LbCpf1--RR标记基因的核苷酸序列为 SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：

ATGTCCAAGCTGGAGAAGTTTACAAACTGTTACAGCCTCTCCAAAACCCTCAGGTTTAAAGCGATCCCGGTGGGCAAGACCCAGGAGAACATCGACAACAAGAGGCTCCTGGTGGAAGACGAGAAGCGCGCCGAAGACTACAAGGGCGTGAAGAAGCTGCTCGATAGGTACTACCTCAGCTTTATTAACGACGTGCTGCACAGCATCAAACTCAAGAATCTCAACAACTACATCTCCCTCTTCCGCAAAAAGACCCGCACCGAGAAGGAGAACAAGGAGCTGGAGAACCTGGAGATCAACCTCCGCAAGGAAATCGCCAAAGCGTTCAAGGGCAATGAAGGGTACAAGAGCCTCTTCAAGAAAGACATCATCGAAACTATCCTCCCAGAGTTTCTCGATGACAAGGACGAGATCGCGCTGGTGAACTCCTTTAACGGGTTCACAACCGCGTTTACCGGCTTCTTTGATAACAGGGAAAATATGTTCTCCGAGGAGGCCAAGTCCACCAGCATCGCCTTCAGGTGTATCAACGAGAACCTCACCCGCTACATTTCCAATATGGACATTTTCGAGAAGGTGGATGCGATCTTCGATAAGCACGAGGTGCAGGAGATCAAAGAGAAGATTCTCAATTCCGATTATGACGTCGAGGATTTCTTCGAAGGGGAGTTCTTTAATTTTGTGCTCACACAAGAGGGCATTGACGTGTACAACGCGATTATCGGGGGCTTCGTCACAGAGTCCGGGGAGAAGATTAAGGGGCTGAATGAGTACATCAATCTGTACAATCAGAAGACCAAGCAGAAACTGCCGAAATTCAAGCCGCTCTACAAGCAAGTCCTGTCCGATAGGGAAAGCCTCTCCTTCTACGGCGAGGGCTATACCAGCGACGAGGAGGTGCTGGAAGTCTTCCGCAACACACTGAATAAGAATAGCGAGATTTTCTCCTCCATCAAGAAGCTCGAGAAGCTCTTTAAGAACTTTGACGAGTACAGCTCCGCCGGGATTTTCGTGAAGAACGGGCCGGCGATCAGCACCATCTCCAAGGACATCTTTGGCGAGTGGAACGTCATCAGGGACAAGTGGAACGCCGAGTACGACGACATCCACCTGAAGAAGAAGGCGGTGGTGACCGAGAAGTATGAGGACGATCGCAGGAAGTCCTTCAAAAAAATCGGCTCCTTCAGCCTCGAACAGCTCCAGGAGTATGCCGATGCGGATCTGTCCGTCGTCGAGAAGCTGAAGGAAATCATCATTCAGAAGGTCGACGAGATCTATAAAGTGTACGGGTCCAGCGAGAAGCTGTTCGACGCCGACTTTGTGCTCGAGAAGTCCCTCAAAAAGAATGACGCCGTGGTGGCCATTATGAAAGACCTGCTCGACTCCGTGAAGTCCTTCGAAAATTACATTAAAGCGTTCTTTGGGGAGGGGAAGGAAACTAACAGGGATGAGTCCTTCTATGGCGACTTTGTCCTCGCGTACGACATCCTGCTGAAGGTCGACCACATTTACGACGCGATCCGCAACTACGTGACACAGAAGCCGTACTCCAAAGACAAGTTCAAGCTGTACTTCCAGAACCCGCAATTTATGCGCGGCTGGGACAAGGATAAAGAGACAGACTACCGCGCGACAATTCTCCGCTATGGCTCCAAATACTATCTGGCCATCATGGACAAGAAGTACGCGAAGTGCCTGCAGAAGATCGACAAAGACGACGTCAATGGCAACTATGAAAAGATCAACTACAAGCTGCTGCCGGGCCCGAACAAGATGCTCCCGAGGGTGTTCTTCAGCAAGAAGTGGATGGCCTACTACAATCCAAGCGAGGATATTCAGAAAATCTATAAAAACGGGACCTTCAAGAAGGGGGACATGTTTAACCTCAACGACTGCCACAAGCTCATTGATTTCTTCAAGGATAGCATTTCCCGCTACCCGAAATGGTCCAATGCGTACGATTTTAACTTCTCCGAGACAGAAAAGTACAAAGACATCGCGGGCTTTTACAGGGAGGTGGAGGAGCAAGGGTATAAAGTTTCTTTTGAATCCGCGAGCAAGAAGGAAGTCGACAAGCTCGTCGAGGAGGGCAAGCTCTACATGTTCCAAATTTATAACAAGGACTTTTCCGACAAGAGCCATGGGACCCCAAACCTCCACACCATGTACTTCAAACTGCTCTTTGACGAGAACAACCACGGGCAAATCAGGCTGAGCGGCGGCGCCGAATTATTCATGCGCAGGGCCTCCCTCAAGAAGGAAGAGCTGGTCGTCCATCCAGCCAATTCCCCGATCGCGAACAAGAACCCGGACAATCCGAAAAAGACCACCACCCTGTCCTACGACGTCTACAAGGACAAACGCTTCAGCGAAGACCAGTACGAATTACACATCCCAATTGCGATTAATAAGTGCCCAAAGAATATCTTCAAAATTAATACAGAGGTCAGGGTGCTGCTCAAACACGACGACAATCCGTATGTCATCGGCATTGACAGGGGCGAGCGCAATCTGCTCTATATCGTGGTCGTGGATGGGAAGGGCAATATTGTGGAGCAGTACTCCCTGAACGAGATTATCAACAACTTCAATGGGATTAGGATTAAGACCGACTATCACAGCCTGCTCGACAAGAAAGAAAAAGAGAGGTTTGAGGCCCGCCAAAACTGGACCTCCATTGAGAATATCAAAGAATTAAAGGCCGGCTATATTTCCCAAGTCGTCCACAAGATCTGCGAGCTGGTGGAGAAATATGACGCCGTGATTGCGCTCGAAGACTTAAATTCTGGGTTCAAGAACTCCCGCGTGAAGGTGGAAAAACAGGTGTATCAGAAATTCGAGAAAATGCTGATCGACAAACTCAATTATATGGTGGATAAGAAGTCCAACCCGTGTGCCACAGGGGGCGCGCTGAAGGGCTATCAGATCACCAACAAGTTCGAGAGCTTCAAGAGCATGAGCACCCAGAACGGGTTTATTTTCTACATCCCGGCGTGGCTCACCTCCAAGATTGACCCGAGCACCGGCTTCGTGAACCTCCTGAAGACAAAGTATACCTCCATTGCCGACAGCAAGAAGTTTATCTCCTCCTTCGACCGCATTATGTATGTGCCGGAGGAGGACCTCTTCGAGTTCGCCCTCGACTACAAAAACTTCAGCCGCACAGATGCGGATTACATCAAGAAGTGGAAGCTGTACTCCTACGGGAACAGGATCCGCATCTTCAGGAATCCAAAAAAAAATAACGTCTTTGACTGGGAGGAAGTGTGCCTGACATCCGCCTACAAGGAACTGTTCAATAAATACGGCATCAATTACCAGCAGGGCGACATTCGCGCCCTCCTCTGTGAGCAGTCCGACAAAGCGTTTTACTCCAGCTTCATGGCCCTCATGTCCCTGATGCTCCAAATGAGGAATAGCATCACAGGGCGCACCGACGTCGACTTCCTCATCAGCCCGGTGAAGAACTCCGACGGGATCTTTTACGACTCCCGCAACTATGAGGCGCAAGAGAATGCGATCCTCCCGAAGAACGCCGATGCGAACGGGGCCTATAATATCGCCAGGAAAGTGCTCTGGGCCATCGGGCAGTTCAAAAAGGCGGAGGATGAGAAGCTCGACAAGGTGAAAATTGCCATTTCCAACAAGGAGTGGCTGGAGTACGCGCAGACCTCCGTGAAGCACAAAAGGCCGGCGGCCACGAAAAAGGCCGGCCAGGCAAAAAAGAAAAAGGGATCCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTATCCCTACGACGTGCCTGATTATGCATACCCATATGATGTCCCCGACTATGCCTAA

本发明的PL-LbCpf1-RR基因不仅能有有效地应用在水稻的转基因培育中实现剪切，并且相对于现有的LbCpf1基因而言，本发明所获得的 PL-LbCpf1-RR基因的编辑范围更宽，至少多出两部以上的编辑范围，就是可以编辑的位点比Lbcpf1多两倍，Lbcpf1在水稻基因组上能识别150万个位点，PL-Lbcpf1-RR能识别310万位点。

附图说明

图1至图3为本发明所获得的PL-LbCpf1-RR基因与原始LbCpf1-RR 核苷酸序列比对。其中Optimized为本发明所获得的PL-LbCpf1-RR的核苷酸序列，Original为原始LbCpf1-RR的核苷酸序列。

图4为本发明所获得的PL-LbCpf1-RR与原始LbCpf1-RR基因编码蛋白的氨基酸序列比对。Optimized为本发明所获得的PL-LbCpf1-RR基因编码的氨基酸序列，Original为原始LbCpf1-RR编码的氨基酸序列。

图5为PHUN6a11(LbCpf1-RR)载体质粒示意图。

图6为转基因植株的T0代PDS基因位点的突变形式示例。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——PL-LbCpf1-RR基因的获得

本申请的发明人通过尝试利用各种不同的方式对来自大肠杆菌的 LbCpf1-RR基因进行改造，意外获得一条新的DNA序列，并给这个DNA 序列末端加上水稻偏好的终止密码子TGA，形成一个新基因，该基因被命名为PL-LbCpf1-RR，序列如SEQ ID NO:1所示，与LbCpf1-RR序列比对见图1。

进一步分析其碱基组成，结果见表2。由表2知：PL-LbCpf1的GC含量高达53.06％，明显高于LbCpf1的50.09％。这样基因结构更加稳定，因为GC间可形成3个氢键，而AT间2个。

表2PL-LbCpf1-RR和LbCpf1-RR的基因碱基组成分析。

分析-RR LbCpf1-RR和LbCpf1-RR基因所编码的蛋白氨基酸序列，比对结果见图4。从图4可看出，二者氨基酸序列完全一致。

将设计好的PL-LbCpf1-RR基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-PL-LbCpf1-RR载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

实施例2——含有PL-LbCpf1-RR基因植物打靶载体的构建

从上面含有PUC57-AMP-PL-LbCpf1-RR载体的大肠杆菌XL-blue，用 Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收PL-LbCpf1-RR 片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN600进行线性化处理，回收pHUN600，将上述的PL-LbCpf1-RR片段和pHUN600片段用T4连接酶(购于TaKaRa 公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN600-PL-LbCpf1-RR(图3)，命名为 pHUN 6a11。

选择水稻PDS基因(LOC_Os03g0184000)中第3647-3675位的核苷酸序列TTCAGGTTTGATAGAAAACTGAAGAACACATAT，(下划线部分为所述5’TYCV-(N)X-3’结构中TTCA部分)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUN6a11融合形成pHUN6a11-PDS。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例3——以pHUN6a11-PDS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含 Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴 Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5 天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUN6a11-PDS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置 30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在 100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3 周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为 16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增PL-LbCpf1-RR的PCR引物为5’-TTCACAACCGCGTTTACC-3’及5’-TCACCACCGCCTTCTTCT-3’，产生长度为492bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、 72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。随机挑选8棵转基因植株，经鉴定，均为阳性，阳性率达到100％。

对转基因所得的34棵植株全部进行叶片DNA提取，将所得基因组 DNA样品用于PCR分析。用于扩增PDS基因片段的PCR引物为5’- TCGGAAATTACTCATCATCG-3’及5’-AAATCAGGATAGAATGTGCCCA -3’，产生长度为253bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对。在所测的48株转基因植株中有20株发生了点突变；突变效率为41.7％。说明经改造的Lbcpf1-RR可以对水稻基因组进行剪切，并且具有很高的突变效率，部分突变形式见图6。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 在基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因及其应用

<130> HCI20170169

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3822

<212> DNA

<213> PL-LbCpf1--RR

<400> 1:

atgtccaagc tggagaagtt tacaaactgt tacagcctct ccaaaaccct caggtttaaa 60

gcgatcccgg tgggcaagac ccaggagaac atcgacaaca agaggctcct ggtggaagac 120

gagaagcgcg ccgaagacta caagggcgtg aagaagctgc tcgataggta ctacctcagc 180

tttattaacg acgtgctgca cagcatcaaa ctcaagaatc tcaacaacta catctccctc 240

ttccgcaaaa agacccgcac cgagaaggag aacaaggagc tggagaacct ggagatcaac 300

ctccgcaagg aaatcgccaa agcgttcaag ggcaatgaag ggtacaagag cctcttcaag 360

aaagacatca tcgaaactat cctcccagag tttctcgatg acaaggacga gatcgcgctg 420

gtgaactcct ttaacgggtt cacaaccgcg tttaccggct tctttgataa cagggaaaat 480

atgttctccg aggaggccaa gtccaccagc atcgccttca ggtgtatcaa cgagaacctc 540

acccgctaca tttccaatat ggacattttc gagaaggtgg atgcgatctt cgataagcac 600

gaggtgcagg agatcaaaga gaagattctc aattccgatt atgacgtcga ggatttcttc 660

gaaggggagt tctttaattt tgtgctcaca caagagggca ttgacgtgta caacgcgatt 720

atcgggggct tcgtcacaga gtccggggag aagattaagg ggctgaatga gtacatcaat 780

ctgtacaatc agaagaccaa gcagaaactg ccgaaattca agccgctcta caagcaagtc 840

ctgtccgata gggaaagcct ctccttctac ggcgagggct ataccagcga cgaggaggtg 900

ctggaagtct tccgcaacac actgaataag aatagcgaga ttttctcctc catcaagaag 960

ctcgagaagc tctttaagaa ctttgacgag tacagctccg ccgggatttt cgtgaagaac 1020

gggccggcga tcagcaccat ctccaaggac atctttggcg agtggaacgt catcagggac 1080

aagtggaacg ccgagtacga cgacatccac ctgaagaaga aggcggtggt gaccgagaag 1140

tatgaggacg atcgcaggaa gtccttcaaa aaaatcggct ccttcagcct cgaacagctc 1200

caggagtatg ccgatgcgga tctgtccgtc gtcgagaagc tgaaggaaat catcattcag 1260

aaggtcgacg agatctataa agtgtacggg tccagcgaga agctgttcga cgccgacttt 1320

gtgctcgaga agtccctcaa aaagaatgac gccgtggtgg ccattatgaa agacctgctc 1380

gactccgtga agtccttcga aaattacatt aaagcgttct ttggggaggg gaaggaaact 1440

aacagggatg agtccttcta tggcgacttt gtcctcgcgt acgacatcct gctgaaggtc 1500

gaccacattt acgacgcgat ccgcaactac gtgacacaga agccgtactc caaagacaag 1560

ttcaagctgt acttccagaa cccgcaattt atgcgcggct gggacaagga taaagagaca 1620

gactaccgcg cgacaattct ccgctatggc tccaaatact atctggccat catggacaag 1680

aagtacgcga agtgcctgca gaagatcgac aaagacgacg tcaatggcaa ctatgaaaag 1740

atcaactaca agctgctgcc gggcccgaac aagatgctcc cgagggtgtt cttcagcaag 1800

aagtggatgg cctactacaa tccaagcgag gatattcaga aaatctataa aaacgggacc 1860

ttcaagaagg gggacatgtt taacctcaac gactgccaca agctcattga tttcttcaag 1920

gatagcattt cccgctaccc gaaatggtcc aatgcgtacg attttaactt ctccgagaca 1980

gaaaagtaca aagacatcgc gggcttttac agggaggtgg aggagcaagg gtataaagtt 2040

tcttttgaat ccgcgagcaa gaaggaagtc gacaagctcg tcgaggaggg caagctctac 2100

atgttccaaa tttataacaa ggacttttcc gacaagagcc atgggacccc aaacctccac 2160

accatgtact tcaaactgct ctttgacgag aacaaccacg ggcaaatcag gctgagcggc 2220

ggcgccgaat tattcatgcg cagggcctcc ctcaagaagg aagagctggt cgtccatcca 2280

gccaattccc cgatcgcgaa caagaacccg gacaatccga aaaagaccac caccctgtcc 2340

tacgacgtct acaaggacaa acgcttcagc gaagaccagt acgaattaca catcccaatt 2400

gcgattaata agtgcccaaa gaatatcttc aaaattaata cagaggtcag ggtgctgctc 2460

aaacacgacg acaatccgta tgtcatcggc attgacaggg gcgagcgcaa tctgctctat 2520

atcgtggtcg tggatgggaa gggcaatatt gtggagcagt actccctgaa cgagattatc 2580

aacaacttca atgggattag gattaagacc gactatcaca gcctgctcga caagaaagaa 2640

aaagagaggt ttgaggcccg ccaaaactgg acctccattg agaatatcaa agaattaaag 2700

gccggctata tttcccaagt cgtccacaag atctgcgagc tggtggagaa atatgacgcc 2760

gtgattgcgc tcgaagactt aaattctggg ttcaagaact cccgcgtgaa ggtggaaaaa 2820

caggtgtatc agaaattcga gaaaatgctg atcgacaaac tcaattatat ggtggataag 2880

aagtccaacc cgtgtgccac agggggcgcg ctgaagggct atcagatcac caacaagttc 2940

gagagcttca agagcatgag cacccagaac gggtttattt tctacatccc ggcgtggctc 3000

acctccaaga ttgacccgag caccggcttc gtgaacctcc tgaagacaaa gtatacctcc 3060

attgccgaca gcaagaagtt tatctcctcc ttcgaccgca ttatgtatgt gccggaggag 3120

gacctcttcg agttcgccct cgactacaaa aacttcagcc gcacagatgc ggattacatc 3180

aagaagtgga agctgtactc ctacgggaac aggatccgca tcttcaggaa tccaaaaaaa 3240

aataacgtct ttgactggga ggaagtgtgc ctgacatccg cctacaagga actgttcaat 3300

aaatacggca tcaattacca gcagggcgac attcgcgccc tcctctgtga gcagtccgac 3360

aaagcgtttt actccagctt catggccctc atgtccctga tgctccaaat gaggaatagc 3420

atcacagggc gcaccgacgt cgacttcctc atcagcccgg tgaagaactc cgacgggatc 3480

ttttacgact cccgcaacta tgaggcgcaa gagaatgcga tcctcccgaa gaacgccgat 3540

gcgaacgggg cctataatat cgccaggaaa gtgctctggg ccatcgggca gttcaaaaag 3600

gcggaggatg agaagctcga caaggtgaaa attgccattt ccaacaagga gtggctggag 3660

tacgcgcaga cctccgtgaa gcacaaaagg ccggcggcca cgaaaaaggc cggccaggca 3720

aaaaagaaaa agggatccta cccatacgat gttccagatt acgcttatcc ctacgacgtg 3780

cctgattatg catacccata tgatgtcccc gactatgcct aa 3822

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 2:

ttcacaaccg cgtttacc 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 3:

tcaccaccgc cttcttct 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 4:

tcggaaatta ctcatcatcg 20

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 5:

aaatcaggat agaatgtgcc ca 22

Claims (9)

1.一种在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RR基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的一种在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因，其特征在于，所述PL-LbCpf1-RR基因由序列表中SEQID NO.1所示的核苷酸序列构成。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RR基因。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的PL-LbCpf1-RR基因或权利要求3所述的表达盒。

5.一种权利要求1所述的基因、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述PL-LbCpf1-RR基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

6.一种利用含有权利要求1中所述的PL-LbCpf1-RR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述打靶载体，所述打靶载体中携带所述在水稻基因打靶中具有高突变效率的PL-LbCpf1-RR基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。

7.根据权利要求6所述的PL-LbCpf1-RR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。

8.根据权利要求6所述的PL-LbCpf1-RR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述方法还包括对所获得水稻样品进行分子鉴定。

9.根据权利要求8所述的PL-LbCpf1-RR基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述分子鉴定采用的PCR引物为5’-TTCACAACCGCGTTTACC-3’及5’-TCACCACCGCCTTCTTCT-3’。