CN112430612A - 一种高效切割的SpRY基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种SpRY基因及其应用。本发明在OsSpCas9的基础上突变11个氨基酸获得SpRY基因。并且本发明提供一种表达盒和一种表达载体，以及该表达盒和表达载体在水稻基因编辑方面的应用。本发明利用突变的SpRY基因构建植物表达载体，进而构建水稻打靶载体，导入水稻细胞后造成水稻特异基因位点的DNA双链剪切。本发明实现了水稻基因打靶，这是因为经突变后的SpRY适用于水稻的基因组剪切。

Description

一种高效切割的SpRY基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种高效切割的SpRY基因在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

CRISPR-核酸酶技术是近几年发展出的一种真核生物特异位点基因编辑技术。该技术所涉及的核酸酶目前发现的主要有两种：Cas9核酸酶和Cpf1核酸酶。CRISPR-Cas9技术自2012年发现以来，由于其操作简单、高效，已经被广泛应用于斑马鱼、小鼠、大鼠等动物和拟南芥、烟草、甜橙、玉米、水稻等植物的基因编辑中。而常用的CRISPR/SpCas9由于其特异识别序列为NGG的PAM而限制了其在全基因组的应用范围。因此围绕着如何扩展基因组靶向编辑范围这一问题，衍生出了许多基于SpCas9的变体。但这些变体或多或少的存在一些问题，比如靶向效率不足，脱靶等。因此挖掘新的更广适的基因编辑突变体很有必要。

发明内容

针对上述问题，本发明希望通过对SpCas9进行各种突变尝试，然后获取新基因。实验中，发明人发现对SpCas9的11个特定氨基酸突变后可以获得一种新的具有高剪切效率、宽范围的新的SpRY蛋白。本发明旨在使用植物密码子优化后的OsSpCas9作为基础，将该突变后获得的OsSpRY基因整合到表达载体中，在此基础上构建相应的打靶载体，而后通过水稻遗传转化实现对水稻特异基因编辑。

具体而言，在第一个方面，本发明在OsSpCas9基础上突变11个氨基酸位点，获得新的基因，命名为OsSpRY，所述OsSpRY基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

在第二个方面，本发明提供一种含有所述OsSpRY基因的植物表达载体。该植物表达载体的构建方法是利用PstII/SacI酶切位点，用PstII/SacI酶切pHUC载体并回收，由于突变的OsSpRY序列两端加有PstI/SacI酶切位点，可以利用T4连接酶将OsSpRY连接到pHUC载体，得到植物表达载体pHUC411-SpRY。

另一方面，在表达载体的基础上，根据实验的实际需要，构建相应的基因打靶载体。

另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的OsSpRY基因。

另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述OsSpRY基因完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

在另一个方面，本发明提供一种利用pHUC411-SpRY表达载体，在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得特异基因的打靶载体(pHUC411-SpRY-PDS)，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带OsSpRY的打靶载体(pHUC411-SpRY-PDS)的农杆菌接触15分钟；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根。

其中所述步骤(1)中的种子是成熟种子；所述步骤(1)、(2)中的诱导培养基是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤(3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述农杆菌悬浮液中；所述步骤(4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基；所述步骤(5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤(6)中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基；所述步骤(7)中的分化再生培养基是说明书表1所列出的分化再生培养基；所述步骤(8)中的生根培养基是说明书表1所列出的生根培养基。

在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻日本晴。

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。

在优选的实施方案中，所述OsSpRY基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，具体如：

GCCACCATGgacaagaagtactccatcggcctcgCTatcggcaccaattctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccgtccaagaagttcaaggtcctcggcaacaccgaccgccactccatcaagaagaatctcatcggcgccctgctgttcgactctggcgagacagccgagCGTacaaggctcaagaggaccgctagacgcaggtacaccaggcgcaagaaccgcatctgctacctccaagagatcttctccaacgagatggccaaggtggacgacagcttcttccacaggctcgaggagagcttcctcgtcgaggaggacaagaagcacgagcgccatccgatcttcggcaacatcgtggatgaggtggcctaccacgagaagtacccgaccatctaccacctccgcaagaagctcgtcgactccaccgataaggccgacctcaggctcatctacctcgccctcgcccacatgatcaagttcaggggccacttcctcatcgagggcgacctcaacccggacaactccgatgtggacaagctgttcatccagctcgtgcagacctacaaccagctgttcgaggagaacccgatcaacgcctctggcgttgacgccaaggctattctctctgccaggctctctaagtcccgcaggctcgagaatctgatcgcccaacttccgggcgagaagaagaatggcctcttcggcaacctgatcgccctctctcttggcctcaccccgaacttcaagtccaacttcgacctcgccgaggacgccaagctccagctttccaaggacacctacgacgacgacctcgacaatctcctcgcccagattggcgatcagtacgccgatctgttcctcgccgccaagaatctctccgacgccatcctcctcagcgacatcctcagggtgaacaccgagatcaccaaggccccactctccgcctccatgatcaagaggtacgacgagcaccaccaggacctcacactcctcaaggccctcgtgagacagcagctcccagagaagtacaaggagatcttcttcgaccagtccaagaacggctacgccggctacatcgatggcggcgcttctcaagaggagttctacaagttcatcaagccgatcctcgagaagatggacggcaccgaggagctgctcgtgaagctcaatagagaggacctcctccgcaagcagcgcaccttcgataatggctccatcccgcaccagatccacctcggcgagcttcatgctatcctccgcaggcaagaggacttctacccgttcctcaaggacaaccgcgagaagattgagaagatcctcaccttccgcatcccgtactacgtgggcccgctcgccaggggcaactccaggttcgcctggatgaccagaaagtccgaggagacaatcaccccctggaacttcgaggaggtggtggataagggcgcctctgcccagtctttcatcgagcgcatgaccaacttcgacaagaacctcccgaacgagaaggtgctcccgaagcactcactcctctacgagtacttcaccgtgtacaacgagctgaccaaggtgaagtacgtgaccgaggggatgaggaagccagctttccttagcggcgagcaaaagaaggccatcgtcgacctgctgttcaagaccaaccgcaaggtgaccgtgaagcagctcaaggaggactacttcaagaaaatcgagtgcttcgactccgtcgagatctccggcgtcgaggataggttcaatgcctccctcgggacctaccacgacctcctcaagattatcaaggacaaggacttcctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtgctcaccctcaccctcttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctcaagacatacgcccacctcttcgacgacaaggtgatgaagcagctgaagcgcaggcgctataccggctggggcaggctctctaggaagctcatcaacggcatccgcgacaagcagtccggcaagacgatcctcgacttcctcaagtccgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctcatccacgacgactccctcaccttcaaggaggacatccaaaaggcccaggtgtccggccaaggcgattccctccatgagcatatcgccaatctcgccggctccccggctatcaagaagggcattctccagaccgtgaaggtggtggacgagctggtgaaggtgatgggcaggcacaagccagagaacatcgtgatcgagatggcccgcgagaaccagaccacacagaagggccaaaagaactcccgcgagcgcatgaagaggatcgaggagggcattaaggagctgggctcccagatcctcaaggagcacccagtcgagaacacccagctccagaacgagaagctctacctctactacctccagaacggccgcgacatgtacgtggaccaagagctggacatcaaccgcctctccgactacgacgtggaccatattgtgccgcagtccttcctgaaggacgactccatcgacaacaaggtgctcacccgctccgacaagaacaggggcaagtccgataacgtgccgtccgaagaggtcgtcaagaagatgaagaactactggcgccagctcctcaacgccaagctcatcacccagaggaagttcgacaacctcaccaaggccgagagaggcggcctttccgagcttgataaggccggcttcatcaagcgccagctcgtcgagacacgccagatcacaaagcacgtggcccagatcctcgactcccgcatgaacaccaagtacgacgagaacgacaagctcatccgcgaggtgaaggtcatcaccctcaagtccaagctcgtgtccgacttccgcaaggacttccagttctacaaggtgcgcgagatcaacaactaccaccacgcccacgacgcctacctcaatgccgtggtgggcacagccctcatcaagaagtacccaaagctcgagtccgagttcgtgtacggcgactacaaggtgtacgacgtgcgcaagatgatcgccaagtccgagcaagagatcggcaaggcgaccgccaagtacttcttctactccaacatcatgaatttcttcaagaccgagatcacgctcgccaacggcgagattaggaagaggccgctcatcgagacaaacggcgagacaggcgagatcgtgtgggacaagggcagggatttcgccacagtgcgcaaggtgctctccatgccgcaagtgaacatcgtgaagaagaccgaggttcagaccggcggcttctccaaggagtccatccGcccaaagcgcaactccgacaagctgatcgcccgcaagaaggactgggacccgaagaagtatggcggcttcCTCTGGccgaccgtggcctactctgtgctcgtggttgccaaggtcgagaagggcaagagcaagaagctcaagtccgtcaaggagctgctgggcatcacgatcatggagcgcagcagcttcgagaagaacccaatcgacttcctcgaggccaagggctacaaggaggtgaagaaggacctcatcatcaagctcccgaagtacagcctcttcgagcttgagaacggccgcaagagaatgctcgcctctgctAAGCagcttcagaagggcaacgagcttgctctcccgtccaagtacgtgaacttcctctacctcgcctcccactacgagaagctcaagggctccccagaggacaacgagcaaaagcagctgttcgtcgagcagcacaagcactacctcgacgagatcatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtgatcctcgccgatgccaacctcgataaggtgctcagcgcctacaacaagcaccgcgataagccaattcgcgagcaggccgagaacatcatccacctcttcaccctcaccCGCctcggcgctccaCGCgccttcaagtacttcgacaccaccatcgacCCCaagCAGtacCGCtctaccaaggaggttctcgacgccaccctcatccaccagtctatcacaggcctctacgagacacgcatcgacctctcacaactcggcggcgatTGA

附图说明

图1为pHUC411-SpRY载体质粒示意图。

图2为pHUC411-SpRY介导PDS基因的突变示例，PAM序列均为NNN。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,Vitaly Citovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——OsSpRY的获得

本发明进行各种突变尝试，获取新基因。实验中，发明人发现对SpCas9的11个特定氨基酸突变后可以获得一种新的具有高剪切效率、宽范围的新的SpRY蛋白。

具体而言，本实施例中，在植物密码子优化的OsSpCas9基因基础上，设计点突变引物，利用全式金公司的多点突变试剂盒连续突变A61R/L1111R/D1135L/S1136W/G1218K/E1219Q/N1317R/A1322R/R1333P/R1335Q/T1337R，得到OsSpRY。设计含有PstI/SacI酶切位点的引物进行TA克隆，获得T-OsSpRY的中间载体。

本发明的OsSpRY基因5’端添加GCCACC的kozrk序列，有利于基因高效表达，同时在5’和3’端分别添加1×和3×的核定位信号NLS，有利于基因入核。

实施例2——含有OsSpRY基因植物靶向载体的构建

从上面含有T-OsSpRY载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用PstI/SacI酶切，回收OsSpRY片段。同时利用PstI/SacI酶对pHUC(现有片段)进行线性化处理，回收pHUC，将上述的OsSpRY片段和pHUC片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUC411-OsSpRY(图1)。

选择水稻PDS基因(LOC_Os03g0184000)中的TGCTAACTTGGCCAGAGAAGGTG、GTAATCCTCCTGAAAGGTTATGC、TATTTGCCATGCCAAACAAGCCA、ACTCCATGATATTTGCCATGCCA

(下划线部分为所述NNN PAM的部分)，作为打靶位点。将靶位点序列与pHUC411-OsSpRY融合分别形成pHUC411-OsSpRY-PDS-1/2/3/4。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例3——分别以pHUC411-OsSpRY-PDS-1/2/3/4为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴(安徽省农业科学院水稻研究所保存)的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUC411-OsSpRY-PDS-1/2/3/4载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

对转基因分别所得的48棵植株全部进行叶片DNA提取，将所得基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增OsPDS基因各片段的PCR引物分别为5’-TTGGTATTAATGATCGGTTGCA-3’及5’-TACTTCTGGGAATCTTGGTTTA-3’，长度为172bp；5’-AGATCATGCCATGGAGCTTTTA-3’及5’-CAGTAAAACCATCTTGAGCTTC-3’，长度为204bp的片段；5’-ATGCAAATGTGTAGGAGAAGCA-3’及5’-CCAGTTATTTGAGTTCCATCAG-3’，长度为202bp。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃30秒、60℃30秒、72℃20秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物回收后TA克隆，对TA克隆的阳性单克隆进行测序。所测结果与野生型序列进行比对。在所测的48株转基因植株中分别有8株、14株、40株0株发生突变，突变效率分别为16.7％、29.2％、0和83.3％。由此可得，突变后的OsSpRY基因能够介导水稻基因组大多位点任一位点切割，从而获得突变体植株。具体突变类型部分见图2。野生型的SpCas9识别水稻基因组的NGG PAM，而突变后的SpRY可以编辑水稻更多位点，尤其是non-G的位点。因此基于SpRY的CRISPR编辑系统扩展了水稻基因组的可编辑位点。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种高效切割的SpRY 基因及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4113

<212> DNA

<213> OsSpRY

<400> 1

gccaccatgg acaagaagta ctccatcggc ctcgctatcg gcaccaattc tgttggctgg 60

gccgtgatca ccgacgagta caaggtgccg tccaagaagt tcaaggtcct cggcaacacc 120

gaccgccact ccatcaagaa gaatctcatc ggcgccctgc tgttcgactc tggcgagaca 180

gccgagcgta caaggctcaa gaggaccgct agacgcaggt acaccaggcg caagaaccgc 240

atctgctacc tccaagagat cttctccaac gagatggcca aggtggacga cagcttcttc 300

cacaggctcg aggagagctt cctcgtcgag gaggacaaga agcacgagcg ccatccgatc 360

ttcggcaaca tcgtggatga ggtggcctac cacgagaagt acccgaccat ctaccacctc 420

cgcaagaagc tcgtcgactc caccgataag gccgacctca ggctcatcta cctcgccctc 480

gcccacatga tcaagttcag gggccacttc ctcatcgagg gcgacctcaa cccggacaac 540

tccgatgtgg acaagctgtt catccagctc gtgcagacct acaaccagct gttcgaggag 600

aacccgatca acgcctctgg cgttgacgcc aaggctattc tctctgccag gctctctaag 660

tcccgcaggc tcgagaatct gatcgcccaa cttccgggcg agaagaagaa tggcctcttc 720

ggcaacctga tcgccctctc tcttggcctc accccgaact tcaagtccaa cttcgacctc 780

gccgaggacg ccaagctcca gctttccaag gacacctacg acgacgacct cgacaatctc 840

ctcgcccaga ttggcgatca gtacgccgat ctgttcctcg ccgccaagaa tctctccgac 900

gccatcctcc tcagcgacat cctcagggtg aacaccgaga tcaccaaggc cccactctcc 960

gcctccatga tcaagaggta cgacgagcac caccaggacc tcacactcct caaggccctc 1020

gtgagacagc agctcccaga gaagtacaag gagatcttct tcgaccagtc caagaacggc 1080

tacgccggct acatcgatgg cggcgcttct caagaggagt tctacaagtt catcaagccg 1140

atcctcgaga agatggacgg caccgaggag ctgctcgtga agctcaatag agaggacctc 1200

ctccgcaagc agcgcacctt cgataatggc tccatcccgc accagatcca cctcggcgag 1260

cttcatgcta tcctccgcag gcaagaggac ttctacccgt tcctcaagga caaccgcgag 1320

aagattgaga agatcctcac cttccgcatc ccgtactacg tgggcccgct cgccaggggc 1380

aactccaggt tcgcctggat gaccagaaag tccgaggaga caatcacccc ctggaacttc 1440

gaggaggtgg tggataaggg cgcctctgcc cagtctttca tcgagcgcat gaccaacttc 1500

gacaagaacc tcccgaacga gaaggtgctc ccgaagcact cactcctcta cgagtacttc 1560

accgtgtaca acgagctgac caaggtgaag tacgtgaccg aggggatgag gaagccagct 1620

ttccttagcg gcgagcaaaa gaaggccatc gtcgacctgc tgttcaagac caaccgcaag 1680

gtgaccgtga agcagctcaa ggaggactac ttcaagaaaa tcgagtgctt cgactccgtc 1740

gagatctccg gcgtcgagga taggttcaat gcctccctcg ggacctacca cgacctcctc 1800

aagattatca aggacaagga cttcctcgac aacgaggaga acgaggacat cctcgaggac 1860

atcgtgctca ccctcaccct cttcgaggac cgcgagatga tcgaggagcg cctcaagaca 1920

tacgcccacc tcttcgacga caaggtgatg aagcagctga agcgcaggcg ctataccggc 1980

tggggcaggc tctctaggaa gctcatcaac ggcatccgcg acaagcagtc cggcaagacg 2040

atcctcgact tcctcaagtc cgacggcttc gccaaccgca acttcatgca gctcatccac 2100

gacgactccc tcaccttcaa ggaggacatc caaaaggccc aggtgtccgg ccaaggcgat 2160

tccctccatg agcatatcgc caatctcgcc ggctccccgg ctatcaagaa gggcattctc 2220

cagaccgtga aggtggtgga cgagctggtg aaggtgatgg gcaggcacaa gccagagaac 2280

atcgtgatcg agatggcccg cgagaaccag accacacaga agggccaaaa gaactcccgc 2340

gagcgcatga agaggatcga ggagggcatt aaggagctgg gctcccagat cctcaaggag 2400

cacccagtcg agaacaccca gctccagaac gagaagctct acctctacta cctccagaac 2460

ggccgcgaca tgtacgtgga ccaagagctg gacatcaacc gcctctccga ctacgacgtg 2520

gaccatattg tgccgcagtc cttcctgaag gacgactcca tcgacaacaa ggtgctcacc 2580

cgctccgaca agaacagggg caagtccgat aacgtgccgt ccgaagaggt cgtcaagaag 2640

atgaagaact actggcgcca gctcctcaac gccaagctca tcacccagag gaagttcgac 2700

aacctcacca aggccgagag aggcggcctt tccgagcttg ataaggccgg cttcatcaag 2760

cgccagctcg tcgagacacg ccagatcaca aagcacgtgg cccagatcct cgactcccgc 2820

atgaacacca agtacgacga gaacgacaag ctcatccgcg aggtgaaggt catcaccctc 2880

aagtccaagc tcgtgtccga cttccgcaag gacttccagt tctacaaggt gcgcgagatc 2940

aacaactacc accacgccca cgacgcctac ctcaatgccg tggtgggcac agccctcatc 3000

aagaagtacc caaagctcga gtccgagttc gtgtacggcg actacaaggt gtacgacgtg 3060

cgcaagatga tcgccaagtc cgagcaagag atcggcaagg cgaccgccaa gtacttcttc 3120

tactccaaca tcatgaattt cttcaagacc gagatcacgc tcgccaacgg cgagattagg 3180

aagaggccgc tcatcgagac aaacggcgag acaggcgaga tcgtgtggga caagggcagg 3240

gatttcgcca cagtgcgcaa ggtgctctcc atgccgcaag tgaacatcgt gaagaagacc 3300

gaggttcaga ccggcggctt ctccaaggag tccatccgcc caaagcgcaa ctccgacaag 3360

ctgatcgccc gcaagaagga ctgggacccg aagaagtatg gcggcttcct ctggccgacc 3420

gtggcctact ctgtgctcgt ggttgccaag gtcgagaagg gcaagagcaa gaagctcaag 3480

tccgtcaagg agctgctggg catcacgatc atggagcgca gcagcttcga gaagaaccca 3540

atcgacttcc tcgaggccaa gggctacaag gaggtgaaga aggacctcat catcaagctc 3600

ccgaagtaca gcctcttcga gcttgagaac ggccgcaaga gaatgctcgc ctctgctaag 3660

cagcttcaga agggcaacga gcttgctctc ccgtccaagt acgtgaactt cctctacctc 3720

gcctcccact acgagaagct caagggctcc ccagaggaca acgagcaaaa gcagctgttc 3780

gtcgagcagc acaagcacta cctcgacgag atcatcgagc agatctccga gttctccaag 3840

cgcgtgatcc tcgccgatgc caacctcgat aaggtgctca gcgcctacaa caagcaccgc 3900

gataagccaa ttcgcgagca ggccgagaac atcatccacc tcttcaccct cacccgcctc 3960

ggcgctccac gcgccttcaa gtacttcgac accaccatcg accccaagca gtaccgctct 4020

accaaggagg ttctcgacgc caccctcatc caccagtcta tcacaggcct ctacgagaca 4080

cgcatcgacc tctcacaact cggcggcgat tga 4113

Claims (7)

1.一种SpRY基因，其特征在于，所述SpRY基因至少包含如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的SpRY基因，其特征在于，所述SpRY基因由序列表中SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列构成。

3.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的SpRY基因。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求1所述的SpRY基因或权利要求3所述的表达盒。

5.一种权利要求1所述的基因、权利要求3所述的表达盒或权利要求4所述的载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述SpRY基因实现对水稻基因组的剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

6.一种利用含有权利要求1中所述的SpRY基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；

(2)将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得愈伤组织；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所述打靶载体，所述打靶载体中携带所述SpRY基因；

(4)将步骤(3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；

(6)将步骤(5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；

(7)将所述抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；和

(8)将步骤(7)中所获得的苗转移到生根培养基中生根。

7.根据权利要求1所述的SpRY基因的表达载体构建特异基因打靶载体，将打靶载体导入水稻细胞的方法，其特征在于，所述水稻是粳稻。

Images