CN109486840B - 密码子植物化改造的NmeCas9基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域，公开了密码子植物化改造的NmeCas9基因及其应用。所述密码子植物化改造的NmeCas9基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。本发明提供的密码子植物化改造的NmeCas9基因是以模式作物水稻密码子为基础改造获得的，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，利用发明人从与水稻基因相关密码子中所筛选出的密码子替换原有密码子，得到植物化改造的NmeCas9基因，再经过化学合成而来。采用本发明的基因可以明显提高剪切效率。

Description

密码子植物化改造的NmeCas9基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体的，本发明涉及一种密码子植物化改造的NmeCas9基因，含有该密码子植物化改造的NmeCas9基因的表达盒、表达载体、打靶载体、转基因细胞以及它们的应用。

背景技术

基因组编辑技术是植物基因功能研究和进行作物改良的有力工具，其主要依赖人工内切核酸酶(SSNs)在目标基因组位置产生双链断裂(DSBs)，DSBs可以通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HDR)进行修复。通过NHEJ的修复容易发生错误，使断裂位置产生小片段的缺失或插入，从而导致基因突变；在有供体DNA存在的情况下，有可能通过HDR进行断裂位置的修复，产生精准的基因插入或替换。在基因工程中多使用的基因组编辑系统是CRISPR-SpCas9系统。该系统识别靶点时需要特定的NGG序列，因此在一定程度上限定了基因编辑系统的应用范围。

通过使用NmeCas9可以一定程度降低SpCas9的局限性。NmeCas9可以识别NNNGMTT特征的PAM序列。但现在使用的NmeCas9是从原核生物大肠杆菌中分离出来的，而原核生物和真核生物存在不同的密码子偏好和碱基组成。例如以水稻为代表的单子叶植物，其GC含量高，较细菌及双子叶植物等物种，密码子偏好性强。因此直接使用未经人工优化设计的NmeCas9，会影响其在真核细胞中的表达效率，从而影响其对DNA双链的切割效率。此外，由于NmeCas9来自于细菌，可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种密码子植物化改造的NmeCas9基因及其在植物基因组编辑中的应用，

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种密码子植物化改造的NmeCas9基因，所述密码子植物化改造的NmeCas9基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

本发明第二方面提供一种表达盒，所述表达盒含有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因。

本发明第三方面提供一种表达载体，所述表达载体插入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或如上所述的表达盒。

本发明第四方面提供一种打靶载体，该打靶载体插入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或如上所述的表达盒以及靶位点序列。

本发明第五方面提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体或如上所述的打靶载体。

本发明第六方面提供如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体、如上所述的打靶载体或如上所述的转基因细胞在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

本发明提供的密码子植物化改造的NmeCas9基因是以模式作物水稻密码子为基础改造获得的，即在维持编码氨基酸序列不变的前提下，利用发明人从与水稻基因相关密码子中所筛选出的密码子替换原有密码子，得到植物化改造的NmeCas9基因，再经过化学合成而来。采用本发明的基因可以明显提高剪切效率。

附图说明

图1-1至图1-6为经过密码子植物化改造的NmeCas9与原始NmeCas9核苷酸序列比对。其中Optimized为密码子植物化改造的NmeCas9的核苷酸序列，Original为原始NmeCas9的核苷酸序列。

图2为实施例1构建的PHUN711载体质粒示意图。

图3为实施例2构建的转基因植株中密码子植物化改造的NmeCas9产生的靶向突变。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供一种密码子植物化改造的NmeCas9基因，所述密码子植物化改造的NmeCas9基因具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。

需要说明的是，在没有特别说明的情况下，在本发明的上下文中，本发明提供的密码子植物化改造的NmeCas9基因与plant NmeCas9基因可以互换使用，而原始的NmeCas9基因，也即，大肠杆菌的NmeCas9基因，简称为NmeCas9基因。

本发明还需要说明的是，本发明所述的“具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列”而并非是指任意的含有除SEQ ID No：1所示的核苷酸序列以外的核苷酸或核苷酸序列，而是指根据本领域技术人员的常规手段，为了便于或有利于对SEQ ID No：1所示的核苷酸序列进行操作或实现SEQ ID No：1所示的核苷酸序列的复制等而含有的不影响其功能发挥的核苷酸或核苷酸序列，例如，酶切位点、标记基因、筛选基因等。因此，本发明所述的“具有SEQID No：1所示的核苷酸序列”是指具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，但仍然能够实现SEQID No：1所示的核苷酸序列功能的序列。

根据本发明一种具体的实施方式，所述plant NmeCas9基因的核苷酸序列如SEQID No：1所示。

第二方面，本发明还提供了一种表达盒，所述表达盒含有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因。

第三方面，本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体插入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或如上所述的表达盒。

根据本发明，所述表达载体的构建方法可以按照本领域常规的方法进行，例如，使用相同的限制性内切酶对plant NmeCas9基因和待插入的载体进行酶切，然后再使用连接酶将plant NmeCas9基因连接到载体中，得到本发明的表达载体。

其中，所述限制性内切酶可以根据引入到plant NmeCas9基因中的酶切位点进行具体的选择，例如，可以为NotI/SacI限制性内切酶。

其中，所述连接酶可以本领域常规使用的各种能够将两种核酸片段进行连接的连接酶，例如，可以为T4连接酶。

其中，所述载体可以为本领域常规使用的各种载体，优选的，所述载体可以为PUC57-AMP、pHUN400或pHUN900，这些载体均可以通过商购获得。根据本发明一种优选的实施方式，所述载体为pHUN900，进一步的，可以利用NotI/SacI酶切位点，用NotI/SacI酶切pHUN900载体和plant NmeCas9基因并回收，之后利用T4连接酶将plant NmeCas9基因连接到pHUN900载体，得到植物表达载体pHUN-plant NmeCas9(简称pHUN 711)。

第四方面，提供一种打靶载体，该打靶载体插入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或如上所述的表达盒以及靶位点序列。

根据本发明，所述靶位点序列可以根据实际需要进行基因组编辑的序列而定，但是所述靶位点序列需要包括NNNGMTT特征的PAM序列。根据本发明一种具体的实施方式，所述靶位点序列为SEQ ID No：2所示的核苷酸序列(水稻OsPDS基因(Os03g0184000)中第1400-1431位的核苷酸序列，序列为AACAAGCCAGGAGAATTCAGCCGGTTTGATT，下划线部分为NNNNGMTT结构的PAM序列，其中，M为A或C)。

根据本发明，所述打靶载体在表达载体的基础上只需进行简单的退火、酶切连接作用即可获得。

第五方面，本发明还提供了一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体或如上所述的打靶载体。

根据本发明，所述细胞的选择可以根据基因打靶所处的阶段来定，具体的，例如，当进行打靶载体构建之前，需要实现plant NmeCas9基因的扩增时，可以采用大肠杆菌作为宿主细胞，当需要将打靶载体转化到植物细胞中时，可以采用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)作为宿主细胞，此外，所述专转基因细胞还包括转入有所述打靶载体的植物细胞，所述植物细胞，例如可以为植物的愈伤组织细胞。

第六方面，本发明还提供了如上所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因、如上所述的表达盒、如上所述的表达载体、如上所述的打靶载体或如上所述的转基因细胞在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

根据本发明，所述植物优选为单子叶植物，更优选为水稻，进一步优选为粳稻，再进一步优选为粳稻日本晴。

根据本发明，利用所述密码子植物化改造的NmeCas9基因识别带有NNNGMTT特征的PAM序列，完成水稻体内DNA双链的剪切，并在自身修复系统的作用下，获得带有突变位点的转基因植物或植物部分。

根据本发明，所述基因组编辑的培养条件可以为本领域常规的条件，优选的，所述培养条件包括，35-39℃和28-32℃以10-14小时的间隔交替培养，培养时间为40-50天。

根据本发明，将打靶载体导入到植物细胞中的方法可以按照本领域常规的方法进行。

根据本发明一种具体的实施方式，将打靶载体导入水稻细胞的方法，包括下述步骤：

(1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈伤组织；其中，所述种子可以为成熟种子；

(2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；

(3)将步骤(2)中获得的愈伤组织与携带plant NmeCas9基因的打靶载体的农杆菌接触15分钟，具体的是将愈伤组织浸泡在农杆菌的悬浮液中；

(4)将步骤(3)的愈伤组织转移到垫上三张无菌滤纸(加入2.5-3.5mL农杆菌悬浮培养基)的培养皿中，21-23℃培养48小时；

(5)将步骤(4)的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；其中，前筛选培养基可以为表1中所列的前筛选培养基；

(6)将步骤(5)的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织；培养条件为12小时37℃培养，12小时30℃培养，在此温度下周期连续培养45天；

(7)将抗性愈伤组织转移到分化再生培养基中分化成苗；

(8)将步骤(7)的苗转移到生根培养基中生根；其中，生根培养基可以为表1中所列的生根培养基。

根据本发明，如上所使用的各种培养基均可以为本领域常规使用的培养基，优选的，可以使用表1中所列出的培养基，其中，所用到的培养基的配置可以参考文献：YongboDuan,Chenguang Zhai,Hao Li,Juan Li,Wenqian Mei et al.An efficient and high-throughput protocol for Agrobacterium mediated transformation based onphosphomannose isomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativaL.).Plant cell reports,2012,31:1611-1624进行。

表1

注：“N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO₃ ^-]/[NH₄ ⁺]＝40mM/10mM。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecμlar Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——含有plant NmeCas9基因植物打靶载体的构建1、委托苏州金唯智生物科技有限公司合成SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，其与原始NmeCas9的核苷酸序列(Neisseria meningitidis 053442中的402733～405931)对比图如图1-1至图1-6所示，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-plant NmeCas9载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

2、从上述含有PUC57-AMP-plant NmeCas9载体的大肠杆菌XL-blue中用Axygen质粒提取试剂盒提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收plant NmeCas9片段。同时利用NotI/SacI酶对pHUN900进行线性化处理，回收pHUN900，将上述的plant NmeCas9片段和pHUN900片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN900-plant NmeCas9(图2)，命名为pHUN 711。

3、选择水稻OsPDS基因(Os03g0184000)中第1400-1431位的核苷酸序列作为打靶位点序列，如SEQ ID No：2所示(AACAAGCCAGGAGAATTCAGCCGGTTTGATT，下划线部分为所述NNNNGMTT结构的PAM序列)。将靶位点序列与pHUN 711融合形成pHUN711-PDS。利用冻融法将植物表达载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化。

实施例2——以pHUN711-PDS为打靶载体的水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，其中，50％次氯酸钠是将原液稀释1倍后的溶液，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在愈伤组织诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUN711-PDS载体的农杆菌菌株EHA105在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线(参见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density 660nm，660nm吸光值)至约0.10-0.25，室温静置30min以上。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min，其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，培养条件为两种，一种为：30℃黑暗培养，45天；另一种为12小时37℃黑暗培养，12小时30℃黑暗培养，在此温度下周期连续培养45天；培养结束后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

在移栽之前，对两种培养条件分别取30个独立转化事件，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增密码子植物化改造的plant NmeCas9的PCR引物为：5’-AGTTGGAGCTTATCCCAACATA-3’(SEQ ID No：3)及5’-TAAAACAAAAGTAACCACCAAT-3’(SEQ ID No：4)，产生长度为241bp的片段。PCR扩增程序为首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对(图3)。在30℃黑暗培养产生30个转基因植株中仅获得1个编辑阳性植株，而37℃-30℃循环培养的30个转基因植株中获得7个编辑阳性植株。同样地，我们以原始的NmeCas9基因同样构建了打靶载体，进行水稻遗传转化，但并未得到阳性编辑植株。表明密码子优化后的NmeCas9在优化的培养条件下可在植物中实现有效的基因编辑。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业科学院水稻研究所

<120> 密码子植物化改造的NmeCas9基因及其应用

<130> HFI00862-NYSD

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 3324

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggccgcgt tcaagccaaa ttccatcaat tatatcctgg gcctggatat cgggattgcg 60

agcgtggggt gggccatggt cgagattgat gaggaggaga atccgatcag gctcattgat 120

ctcggcgtga gggtgttcga gagggccgag gtcccaaaaa ccggcgactc cctggccatg 180

gcgaggaggc tggcgaggtc cgtgaggagg ctgaccagga ggcgcgcgca tcgcctgctc 240

aggacaagga ggctcctcaa gagggagggc gtgctccagg ccgccaactt cgatgagaat 300

gggctcatca agagcctccc gaacaccccg tggcaactcc gcgctgctgc tctcgacagg 360

aagctgacac cgctcgagtg gtccgccgtg ctcctccatc tgatcaaaca ccgcggctac 420

ctctcccaac gcaaaaacga gggggaaact gcggacaagg aactgggggc cctcctgaaa 480

ggcgtcgccg gcaatgcgca cgcgctccag accggggact tcaggacacc agccgagctg 540

gcgctcaaca agttcgaaaa ggaatccggc catattagga accagcgcag cgactacagc 600

cacaccttta gcaggaagga cctgcaggcg gagctgatcc tcctcttcga gaaacagaag 660

gagttcggca acccacatgt cagcggcggc ctcaaggaag gcatcgaaac actcctcatg 720

acccaacgcc cagccctgag cggcgatgcg gtccagaaga tgctcggcca ttgtaccttt 780

gaaccagcgg agccgaaggc cgcgaaaaat acctataccg ccgagcgctt catttggctg 840

accaagctca acaacctcag gatcctcgaa cagggcagcg agaggccgct gacagacacc 900

gaacgcgcca ccctgatgga tgagccgtac aggaagtcca agctcaccta cgcccaggcc 960

cgcaaactcc tcggcctgga ggataccgcc ttcttcaagg ggctccgcta tggcaaggat 1020

aatgccgaag cgtccaccct catggaaatg aaggcgtacc atgccatcag ccgcgccctg 1080

gagaaggaag ggctcaagga caagaagagc ccgctgaatc tcagcccgga actgcaggat 1140

gagatcggca cagccttctc cctgttcaaa accgatgagg acattaccgg ccgcctgaaa 1200

gaccgcatcc aaccagaaat cctcgaggcc ctcctgaagc acatctcctt tgataaattc 1260

gtgcagatta gcctcaaggc cctcaggagg atcgtgccgc tcatggagca agggaaaagg 1320

tacgacgagg cgtgcgccga gatttacggc gatcactacg ggaagaagaa taccgaagag 1380

aagatttacc tgccgccgat tccagccgac gaaatcagga atccggtcgt cctcagggcc 1440

ctgtcccagg cgcgcaaggt gattaacggc gtggtgaggc gctacggcag cccggccagg 1500

atccacatcg aaacagcgcg cgaagtcggc aagtccttca aggacaggaa ggagatcgag 1560

aagaggcagg aagagaatcg caaggacagg gagaaggcgg cggcgaagtt tagggaatac 1620

ttcccgaact ttgtggggga gccaaagagc aaggacatcc tgaagctcag gctgtatgaa 1680

caacagcacg gcaagtgcct gtattccggc aaggagatca acctggggag gctgaacgag 1740

aagggctatg tggagatcga ccatgcgctc ccgttctccc gcacctggga cgactccttc 1800

aacaacaagg tgctcgtgct cgggagcgaa aatcagaata aagggaacca aacaccgtac 1860

gagtacttca acggcaagga caacagccgc gagtggcagg agtttaaggc gagggtcgag 1920

acatcccgct ttccgcgcag caagaagcag cgcattctcc tccagaaatt cgacgaggat 1980

gggttcaaag agcgcaacct caacgatacc aggtacgtga acaggttcct ctgccaattt 2040

gtcgcggata ggatgcgcct caccggcaag ggcaagaagc gcgtctttgc gtccaatggg 2100

cagatcacaa acctgctgag gggcttctgg ggcctgagga aagtgcgcgc ggagaatgat 2160

aggcatcacg cgctggacgc cgtggtcgtg gcgtgctcca cagtcgcgat gcagcaaaaa 2220

atcacacgct tcgtccgcta caaagagatg aacgcgttcg acggcaaaac catcgacaag 2280

gaaactgggg aggtcctgca ccagaagacc cacttcccac aaccgtggga gtttttcgcg 2340

caggaggtca tgatcagggt gttcggcaaa ccggacggca agccggagtt cgaagaggcg 2400

gataccctgg agaagctcag gaccctgctg gcggagaaac tgtccagcag gccggaagcg 2460

gtgcatgagt acgtcacccc gctcttcgtc tccagggcgc cgaacaggaa gatgagcggc 2520

caaggccaca tggaaacagt gaagtccgcg aaacgcctcg acgagggggt gagcgtcctc 2580

agggtgccac tcacccaact caaactcaag gacctggaga agatggtgaa tcgcgagagg 2640

gagccaaagc tctatgaggc cctgaaggcc cgcctggaag cccacaaaga cgacccagcg 2700

aaggccttcg cggagccgtt ttataagtac gacaaagccg ggaacaggac ccagcaggtc 2760

aaagccgtga gggtcgaaca ggtccagaaa accggggtgt gggtgcgcaa tcataacggg 2820

atcgccgata atgccacaat ggtcagggtg gatgtgttcg agaaaggcga taagtactac 2880

ctggtgccga tctacagctg gcaagtcgcc aaaggcattc tcccggatcg cgcggtggtg 2940

cagggcaagg atgaagagga ctggcagctg atcgacgatt cctttaattt caagttcagc 3000

ctgcacccga atgacctcgt ggaggtcatc accaagaaag cccgcatgtt tggctacttc 3060

gcctcctgtc acaggggcac cggcaatatc aatatccgca tccacgacct cgaccataag 3120

atcggcaaaa acggcatcct ggaggggatt ggcgtcaaaa cagcgctgag cttccagaag 3180

taccagattg acgaattagg caaagagatc aggccgtgca ggctcaagaa acgcccaccg 3240

gtcaggtacc catacgatgt tccagattac gctaagcggc cagcggcgac gaagaaggcg 3300

gggcaggcga agaagaagaa gtaa 3324

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列，gtttgatt为nnnngmtt结构的pam序列，其中，nnnngmtt序列中m为a或c

<400> 2

aacaagccag gagaattcag ccggtttgat t 31

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agttggagct tatcccaaca ta 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taaaacaaaa gtaaccacca at 22

Claims (10)

1.一种密码子植物化改造的NmeCas9基因，其特征在于，所述密码子植物化改造的NmeCas9基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。

2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求1所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体插入有权利要求1所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或权利要求2所述的表达盒。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其中，所述载体为PUC57-AMP、pHUN400或pHUN900。

5.一种打靶载体，其特征在于，该打靶载体插入有权利要求1所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因或权利要求2所述的表达盒以及靶位点序列。

6.权利要求1所述的密码子植物化改造的NmeCas9基因、权利要求2所述的表达盒、权利要求3或4所述的表达载体或权利要求5所述的打靶载体在植物基因组编辑中的应用，其中，所述植物基因组编辑包括对植物基因组进行剪切，获得含有突变位点的转基因植物或植物部分。

7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述植物为单子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其中，所述植物为水稻。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述植物为粳稻。

10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述植物为粳稻日本晴。

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