CN111154764A - 一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的sgRNA - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的sgRNA。本发明提供了一种通过基因编辑技术提高水稻抗病性的方法，为降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量。“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”具体可通过对OsVQ25基因进行基因编辑实现。本发明的发明人利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑OsVQ25基因，通过造成移码突变，敲除了水稻OsVQ25基因，获得了稻瘟病和白叶枯病抗性明显提高的水稻新种质。本发明对于水稻育种具有重大的应用推广价值。

Description

一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的 sgRNA

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的sgRNA，尤其涉及一种通过基因组编辑提高水稻稻瘟病和/或白叶枯病抗性的方法及其使用的sgRNA。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)是一种二倍体单子叶植物，是世界上最重要的粮食作物之一。水稻稻瘟病和白叶枯病是全球范围内严重影响稻米品质及产量的主要病害，给粮食生产带来重大损失，严重威胁世界粮食安全。

稻瘟病由丝状子囊真菌稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起，常常发生在各个稻区，具有流行速度极快等特点，是世界各稻区最严重和最具危害性的水稻病害之一，严重影响水稻的高产、优质和抗病适应性。在稻瘟病流行发病年份，重病区稻瘟病所造成的产量损失一般为10％～20％，严重发病时可达到40％～50％，较严重的局部稻田甚至颗粒无收。

白叶枯病是由革兰氏阴性菌黄单胞杆菌水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.Oryzae，Xoo)引起的细菌性病害。白叶枯病突发、突变性强，传播侵染的速度非常快，一旦暴发很难控制水稻的受害程度。白叶枯病发生时一般减产10％～20％，严重时达到50％，甚至颗粒无收。白叶枯病严重制约着水稻的产量。

稻瘟病和白叶枯病在导致水稻减产的同时也会造成稻米品质下降，一直是阻碍水稻优质、高产、稳产和保收的最主要因素。目前，稻瘟病的防治措施主要有喷施化学药剂，但是使用化学药剂进行防治存在危害环境、增加农业成本等问题。而白叶枯病是维管束病害，使用一般化学药剂的防治效果很差，花费成本很高。实践证明，培育和种植抗病品种是控制稻瘟病和白叶枯病的最经济有效的方法之一，而培育抗病品种的关键在于挖掘并利用优良的抗病基因资源。

传统杂交育种耗时长、工作量大，且难以做到状定向改良；物理、化学、生物等诱变手段很难做到精确定点突变。近年来，以CRISPR/Cas9技术为代表的基因组定点编辑技术成为植物育种和直接研究基因功能的新手段。它的基本原理是，利用设计的一段sgRNA(single-guide RNA)介导Cas9核酸酶对靶标位点进行特异性识别和靶向切割，并利用胞内易错修复机制引入突变。操作简单，实验周期短，费用低，后期还可以甩掉载体序列得到不含标记基因的种质资源，已经发展成为了高效、便捷的获得特定基因突变体的技术，对种质资源创新和基因功能研究有重大意义。

VQ蛋白是一类植物特异性蛋白。2002年，VQ蛋白在拟南芥中被首次发现；随后，该类蛋白在水稻、棉花、玉米、葡萄、大豆等植物中也被发现并鉴定。

发明内容

本发明的目的是提高水稻的抗病性，具体可为稻瘟病抗性和/或白叶枯病抗性。

本发明首先保护提高水稻抗病性的方法。

本发明所保护的提高水稻抗病性的方法，具体可为方法一，可包括如下步骤：降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量。

上述方法一中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量的目的。

上述方法一中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”具体可通过抑制OsVQ25基因表达实现。所述“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”具体可通过敲除OsVQ25基因实现。所述敲除包括敲除整个基因，也包括敲除基因的部分区段。

上述方法一中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”具体可通过沉默OsVQ25基因实现。

上述方法一中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量”具体可通过对OsVQ25基因进行基因编辑实现。

本发明所保护的提高水稻抗病性的方法，具体可为方法二，可包括如下步骤：降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度。

上述方法二中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度”可通过RNA干扰、同源重组、基因定点编辑等本领域熟知的方法，达到降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度的目的。

上述方法二中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度”具体可通过抑制OsVQ25基因表达实现。所述“降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度”具体可通过敲除OsVQ25基因实现。所述敲除包括敲除整个基因，也包括敲除基因的部分区段。

上述方法二中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度”具体可通过沉默OsVQ25基因实现。

上述方法二中，所述“降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度”具体可通过对OsVQ25基因进行基因编辑实现。

本发明所保护的提高水稻抗病性的方法，具体可为方法三，可包括如下步骤：对编码OsVQ25蛋白的基因(即OsVQ25基因)进行基因编辑。

上述任一所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。

所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列可如SEQ ID NO：5所示。

所述基因编辑是通过在水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因和sgRNA的编码基因的特异DNA分子实现的。所述基因编辑是通过在水稻中导入含有所述特异DNA分子的重组质粒实现的。

所述基因编辑是通过在水稻中导入分别含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA的编码基因的DNA分子实现的。

本发明还保护特异sgRNA；所述特异sgRNA的靶标序列可如SEQ ID NO：5所示。

本发明还保护特异重组质粒；所述特异重组质粒可含有Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码基因。

本发明还保护一种制备转基因水稻的方法，可包括如下步骤：将上述任一所述特异sgRNA的编码基因和上述任一所述Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的抗病性提高。

上述方法中，上述任一所述特异sgRNA的编码基因和上述任一所述Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入出发水稻。

本发明还保护制备基因编辑水稻的方法。

本发明所保护的制备基因编辑水稻的方法，具体可为方法J，可包括如下步骤：

(j1)将上述任一所述特异sgRNA的编码基因和上述任一所述Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；

(j2)从所述转基因水稻中筛选基因编辑水稻；

所述基因编辑水稻的抗病性高于所述出发水稻。

所述步骤(j2)中，从所述转基因水稻中筛选基因编辑水稻具体可为从所述转基因水稻中筛选发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻。

本发明所保护的制备基因编辑水稻的方法，具体可为方法K，可包括如下步骤：

(k1)将上述任一所述特异sgRNA的编码基因和上述任一所述Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；

(k2)将所述转基因水稻自交，获得自交后代；

(k3)从自交后代中筛选基因编辑水稻；

所述基因编辑水稻的抗病性高于所述出发水稻。

上述方法K中，完成步骤(k1)后、进行步骤(k2)之前，还包括步骤(A)：筛选发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻。

所述步骤(k2)中，“将所述转基因水稻自交”具体可为将发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻进行自交。

所述步骤(k3)中，从自交后代中筛选基因编辑水稻具体可为从自交后代中筛选发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻。

上述任一所述基因编辑水稻可为不携带Cas9基因且不携带所述sgRNA的编码基因的转基因水稻。

上述任一所述基因编辑水稻可为携带Cas9基因和/或所述sgRNA的编码基因的转基因水稻。

上述任一所述基因编辑水稻具体可为不携带Cas9基因、不携带所述sgRNA的编码基因、发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻。

上述任一所述基因编辑水稻具体可为携带Cas9基因和/或所述sgRNA的编码基因、发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻。

上述任一所述“发生基因编辑且OsVQ25基因表达被抑制的转基因水稻”具体可为靶区域发生突变且均为纯合突变型的转基因水稻。

上述方法中，上述任一所述特异sgRNA的编码基因和上述任一所述Cas9蛋白的编码基因具体通过所述重组质粒导入出发水稻。

本发明还保护上述任一所述特异sgRNA或上述任一所述特异重组质粒在水稻育种中的应用；所述水稻育种的目的可为提高水稻的抗病性。

上述任一所述抗病性可为a1)-a4)中的至少一种：

a1)抗稻瘟病；

a2)抗白叶枯病；

a3)抗稻瘟病菌引起的病害；

a4)抗白叶枯病菌引起的病害。

所述稻瘟病菌具体可为稻瘟病菌RB22。

所述白叶枯病菌具体可为白叶枯病菌PXO99。

上述任一所述Cas9蛋白的编码基因具体可为SEQ ID NO：1自5’末端起第386-4516位核苷酸反向互补的DNA分子。

上述任一所述特异sgRNA的编码基因具体可为SEQ ID NO：1自5’末端起第7155-7257位核苷酸的DNA分子。

上述任一所述特异重组质粒具体可为重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA的核苷酸序列可如SEQ ID NO：1所示。

上述任一所述OsVQ25蛋白可为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将(a1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质；

(a3)来源于水稻且与(a1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。

所述OsVQ25基因可为编码所述OsVQ25蛋白的核酸分子。

所述OsVQ25基因可为如下1)或2)或3)或4)或5)：

1)编码区如SEQ ID NO：4所示的DNA分子；

2)核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的DNA分子；

3)核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)至3)中任一限定的DNA序列杂交且编码所述OsVQ25蛋白的DNA分子；

5)来源于水稻且与1)至3)中任一限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同源性且编码所述OsVQ25蛋白的DNA分子。

所述水稻具体可为水稻品种日本晴。

本发明的发明人利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑OsVQ25基因，通过造成移码突变，敲除了水稻OsVQ25基因，获得了稻瘟病和白叶枯病抗性明显提高的水稻新种质。水稻稻瘟病和白叶枯病是水稻的主要病害，不仅造成水稻减产，还导致其品质下降。本发明提高了水稻抗稻瘟病和白叶枯病的能力，创新了水稻抗病种质资源，对新品种培育、环境卫生和粮食安全具有重要意义。本发明具有重大的应用推广价值。

附图说明

图1为实施例2的步骤二中6株再生植株进行T7E1酶切后的电泳图。

图2为实施例2的步骤二中6株再生植株进行测序后的结果。

图3为实施例2的步骤二中部分T₁植株Cas9基因和sgRNA的编码基因的鉴定结果。

图4为稻瘟病抗性分析结果。

图5为白叶枯病抗性分析结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

水稻品种日本晴又称Oryza sativa L.japonica.cv.Nipponbare，其记载于如下文献中：Kawahara Y，de la Bastide M，Hamilton J P，et al.Improvement of the Oryzasativa Nipponbare reference genome using next generation sequence and opticalmap data[J].Rice，2013，6(1):4.在下文中，水稻品种日本晴简称日本晴。

农杆菌EHA105为普如汀生物技术(北京)有限公司的产品，货号为Biovector610134。

实施例1、制备重组质粒

人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA为环形质粒。

重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。SEQ ID NO：1自5’末端起，第109-361位核苷酸与NOS终止子反向互补，第386-4516位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4537-6527位核苷酸与Ubi启动子反向互补，第6751-7154位核苷酸为U3启动子，第7155-7257位核苷酸为sgRNA的编码基因(其中第7155-7174位核苷酸为靶序列识别区)。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA表达sgRNA，sgRNA的靶序列位于水稻OsVQ25基因中。

水稻OsVQ25基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示(基因组DNA)或SEQ ID NO：4所示(编码区)。SEQ ID NO：2自5’末端起，第48-689位核苷酸为外显子(OsVQ25基因没有内含子)，第59-78位核苷酸为sgRNA的靶序列。

实施例2、基因编辑水稻的获得及其性状的检测

一、T₀代再生植株的获得

1、将重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、采用农杆菌介导的遗传转化方法，将重组农杆菌导入日本晴，得到T₀代再生植株。具体步骤如下：

(1)用AAM培养基重悬重组农杆菌，得到OD_600nm值为0.3-0.5的菌悬液。

AAM培养基：将4.3g MS salts&vitamins盐(PhytoTechnology公司的产品)、68.5g蔗糖、0.5g MES、36g葡萄糖、500mg酪蛋白氨基酸、100mL 10×AA amino acids溶液和40mg乙酰丁香酮溶于去离子水，然后调节pH值至5.2，用去离子水定容至1L；121℃灭菌30min。

10×AA amino acids溶液：将8.76g L-谷氨酰胺、2.66g L-天(门)冬氨酸、1.74gL-精氨酸和75mg甘氨酸溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L。

(2)取日本晴种子，剥去种皮，灭菌洗涤后均匀点入R1固体培养基，28℃暗培养2-3周，得到愈伤组织。

R1固体培养基：将4.3g MS&Vitamins盐、30g蔗糖、0.5g MES、300mg酪蛋白氨基酸、2.8g L-脯氨酸、2mg 2，4-D和4g植物凝胶溶于去离子水，然后调节pH值至5.8，用去离子水定容至1L；121℃灭菌30min。

(3)完成步骤(2)后，取所述愈伤组织，转移至新的R1固体培养基上，28℃暗培养3-5天。

(4)完成步骤(3)后，将所述愈伤组织，浸泡于步骤(1)得到的菌悬液中，侵染5min，然后取出并用滤纸吸干表面的菌液。

(5)完成步骤(4)后，取所述愈伤组织，转移至R2固体培养基上，25℃暗培养3天。

R2固体培养基：将4.3g MS&Vitamins盐、30g蔗糖、0.5g MES、300mg酪蛋白氨基酸、2mg 2，4-D和4g植物凝胶溶于去离子水，然后调节pH值至5.2，用去离子水定容至1L，121℃灭菌30min；待冷却至55℃左右，加入乙酰丁香酮(无菌)并使乙酰丁香酮在培养基中的浓度为20mg/mL。

(6)完成步骤(5)后，取所述愈伤组织，转移至筛选培养基甲上，28℃暗培养2周。

筛选培养基甲：含50mg/L潮霉素的R1固体培养基。

(7)完成步骤(6)后，取所述愈伤组织，转移到新的筛选培养基甲上，28℃暗培养2周，生长良好呈嫩黄色的愈伤组织即为阳性愈伤组织。

(8)完成步骤(7)后，取所述阳性愈伤组织，转移至筛选培养基乙上，28℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)至幼苗株高为2-5cm。

筛选培养基乙：含50mg/L潮霉素的R4固体培养基。

R4固体培养基：将4.3g MS&Vitamins盐、30g蔗糖、0.5g MES、2g酪蛋白氨基酸、30g山梨醇、2mg激动素、1mg NAA和4g植物凝胶溶于去离子水，然后调节pH值至5.8，用去离子水定容至1L；121℃灭菌30min。

(9)完成步骤(8)后，取幼苗，转移至R5固体培养基上，28℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)2-3周。

R5固体培养基：将2.15g MS&Vitamins盐、15g蔗糖、0.5g MES和2g植物凝胶溶于去离子水，然后调节pH值至5.8，用去离子水定容至1L；121℃灭菌30min。

(10)完成步骤(9)后，将所述幼苗移栽至培养土中，28-30℃光暗交替培养(16h光照/8h黑暗)，得到55株T₀代再生植株，分别命名为T₀ OsVQ25-1至T₀ OsVQ25-55。

二、定点编辑的检测

1、对T₀代再生植株的鉴定

(1)分别以55株T₀代再生植株的叶片的基因组DNA为模板，采用RC11-F和RC11-R组成的引物对进行PCR扩增，得到相应的PCR扩增产物1。以日本晴植株的叶片的基因组DNA为模板，采用RC11-F和RC11-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。将PCR扩增产物2分别与PCR扩增产物1进行退火杂交，得到杂交产物。

RC11-F：5’-TACCGTTTCGTTTCCACCGT-3’。

RC11-R：5’-AAGTTGGTGGTGTCCGTGTT-3’。

(2)取步骤(1)得到的杂交产物，用T7E1内切酶进行酶切(如果发生突变，则杂交产物会被T7E1酶切开)，得到酶切产物。

(3)取步骤(2)得到的酶切产物，进行电泳。将显示三条带的酶切产物对应的PCR扩增产物1进行测序。

如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与日本晴的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与日本晴的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与日本晴的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为杂合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与日本晴的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为双等位突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与日本晴的PCR扩增产物的核苷酸序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换)，该再生植株为纯合突变型。野生型的再生植株的T7E1酶切产物电泳显示一条带，杂合型的再生植株的T7E1酶切产物电泳显示三条带，双等位突变型的再生植株和纯合突变型的再生植株显示三条带。

55株再生植株中，20株为野生型(36％)，0株为杂合型(0％)，17株为双等位突变型(31％)，18株为纯合突变型(33％)。即35株为编辑植株(64％)。

6株再生植株进行T7E1酶切后的电泳图见图1。图1中，M为DL100 Marker，WT为日本晴，1为T₀ OsVQ25-1，10为T₀ OsVQ25-10，24为T₀ OsVQ25-24，28为T₀ OsVQ25-28，29为T₀OsVQ25-29，42为T₀ OsVQ25-42。

6株再生植株的测序结果见图2。图2中，Wild type为日本晴，方框中TGG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，“-”表示碱基删除，标红色的序列表示碱基插入。

(4)以T₀ OsVQ25-1、T₀ OsVQ25-10、T₀ OsVQ25-24、T₀ OsVQ25-28、T₀ OsVQ25-29或T₀ OsVQ25-42的叶片基因组DNA为模板，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9蛋白的编码基因(即Cas9基因)；采用U3F和U3R组成的引物对鉴定sgRNA的编码基因。

Cas9-F：5’-TCGACAAGAAGTACTCCATCGGC-3’；Cas9-R：5’-CAAGAGAGAGGGCGATCAGGTTG-3’。

U3F：5’-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATC-3’；U3R：5’-ACTTTTTCAAGTTGATAACGG-3’。

T₀ OsVQ25-1、T₀ OsVQ25-10、T₀ OsVQ25-24、T₀ OsVQ25-28、T₀ OsVQ25-29和T₀OsVQ25-42基于靶序列的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9基因的情况和携带sgRNA的编码基因的情况见表1。

表1

	基于靶序列的基因型	基于靶序列的突变类型	Cas9/gRNA
				T<sub>0</sub> OsVQ25-1	i1/d6	双等位突变型	Y/Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-10	i1/d2	双等位突变型	Y/Y
				T<sub>0</sub> OsVQ25-24	i1/d1	双等位突变型	Y/Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-28	i1	纯合突变型	Y/Y
				T<sub>0</sub> OsVQ25-29	i1	纯合突变型	Y/Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-42	i1	纯合突变型	Y/Y

注：i代表插入，i1代表插入1个核苷酸，依次类推；d代表缺失，d1代表缺失1个核苷酸，依次类推；“/”的前和后分别代表两条染色体；当基于靶序列的突变类型为“双等位突变型”时，基于靶序列的基因型“i1/i1”代表的是两个染色体上的靶序列发生了不同的突变，但均为一个核苷酸的插入；当基于靶序列的突变类型为“纯合突变型”时，基于靶序列的基因型“i1”代表的是两个染色体上的靶序列发生了完全相同的突变，一个核苷酸的插入；依次类推；Y代表鉴定结果为阳性，N代表鉴定结果为阴性。

2、对T₁代植株的鉴定

取T₀ OsVQ25-1、T₀ OsVQ25-10、T₀ OsVQ25-24、T₀ OsVQ25-28、T₀ OsVQ25-29和T₀OsVQ25-42，分别进行自交并收获T₁代种子，培育T₁代种子，获得T₁代植株。

按照步骤1的方法，对各个T₁代植株进行鉴定。

T₀ OsVQ25-10的50个T₁代植株的Cas9基因和sgRNA的编码基因的鉴定结果见图3。

各项鉴定的结果见表2。

表2

	株数	基于靶序列的基因型	Cas9/gRNA
				T<sub>0</sub> OsVQ25-1的T<sub>1</sub>代植株	50株	13i1；25i1/d6；12d6	47Y/47Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-10的T<sub>1</sub>代植	50株	14i1；24i1/d2；12d2	39Y/39Y
				T<sub>0</sub> OsVQ25-24的T<sub>1</sub>代植	50株	11i1；25i1/d1；14d1	50Y/50Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-28的T<sub>1</sub>代植	50株	50i1	46Y/46Y
				T<sub>0</sub> OsVQ25-29的T<sub>1</sub>代植	50株	50i1	50Y/50Y
T<sub>0</sub> OsVQ25-42的T<sub>1</sub>代植	50株	50i1	50Y/50Y

注：相关符号的含义同表1；13i1表示13株为i1纯合突变；25i1/d6表示25株为i1/d6双等位突变；47Y代表47株携带，以此类推。

结果表明，T₀代OsVQ25被定点突变的纯合株系可以稳定遗传T₁代，对于定点编辑的OsVQ25的双等位突变株系通过严格的自交，T₁分离情况符合孟德尔遗传规律，在T₁代株系中没有发现新的变异类型。在T₁代可获得没有Cas9和gRNA的编辑株系。

将T₀ OsVQ25-28的T₁代植株命名为T₁ OsVQ25-28，将T₀ OsVQ25-29的T₁代植株命名为T₁ OsVQ25-29，将T₀ OsVQ25-42的T₁代植株命名为T₁ OsVQ25-42。

3、CRISPR/Cas9的脱靶分析

根据网上预测软件(http://crispr.dbcls.jp/)，对gRNA的20bp的靶序列进行了相似性序列查找，选取含有0-3个碱基差异的序列作为脱靶分析的目标序列，对OsVQ25靶点可能存在的脱靶位点进行预测。根据该位点的侧翼序列设计引物：OFRC-1F和OFRC-1R组成的引物对，OFRC-2F和OFRC-2R组成的引物对，OFRC-3F和OFRC-3R组成的引物对。

OFRC-1F：5’-TACGAGGGGAGAAATTAAAACG-3’；OFRC-1R：5’-CCAACTACATCCAGAAGACGCT-3’。

OFRC-2F：5’-GCCTTGCTCTGCTGCTGG-3’；OFRC-2R：5’-GCCGTGGTTCATCTCCCTCT-3’。

OFRC-3F：5’-CGTAGATGCGGAGGGAGC-3’；OFRC-3R：5’-CGGTGGGTGGTAAGGAGAA-3’。

(1)取35株步骤一得到的编辑植株，提取基因组DNA。

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，分别采用OFRC-1F和OFRC-1R组成的引物对、OFRC-2F和OFRC-2R组成的引物对、OFRC-3F和OFRC-3R组成的引物对进行PCR扩增。

(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。

脱靶位点的信息见表3。

表3

结果表明，对于上述3个脱靶位点，35株植株均未存在脱靶现象，即gRNA并不存在脱靶情况。

三、性状的检测

(一)T₂ OsVQ25-28、T₂ OsVQ25-29和T₂ OsVQ25-42的获得

1、取T₁ OsVQ25-28、T₁ OsVQ25-29和T₁ OsVQ25-42，分别进行自交并收获T₂代种子，培育T₂代种子，获得T₂代植株。

2、按照步骤二中步骤1的方法，对各个T₂代植株进行鉴定。

将不携带Cas9基因且不携带sgRNA的编码基因的T₁ OsVQ25-28的T₂代植株命名为T₂OsVQ25-28，将不携带Cas9基因且不携带sgRNA的编码基因的T₁ OsVQ25-29的T₂代植株命名为T₂ OsVQ25-29，将不携带Cas9基因且不携带sgRNA的编码基因的T₁ OsVQ25-42的T₂代植株命名为T₂ OsVQ25-42。

(二)性状的检测

供试植株为T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株、T₂OsVQ25-42植株或日本晴植株。

1、水稻稻瘟病抗性分析

(1)在温室条件下，正常培育10株供试植株。

(2)待供试植株生长至6周，采用打孔法接种法(史学涛.稻瘟菌干扰水稻钾离子通道抑制免疫反应的分子机理研究[D].)接种稻瘟病菌RB22，接菌浓度为3—5×10⁵孢子/mL。

(3)完成步骤(2)后14天，观察叶片表型。

部分结果见图4中A(WT为日本晴植株，osvq25-28为T₂OsVQ25-28植株，osvq25-29为T₂OsVQ25-29植株，osvq25-42为T₂OsVQ25-42植株)。结果表明，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株的病斑面积显著减少。

(4)完成步骤(3)后，检测各株植株病斑中的真菌生物量，结果取平均值。

结果见图4中B(WT为日本晴植株，osvq25-28为T₂OsVQ25-28植株，osvq25-29为T₂OsVQ25-29植株，osvq25-42为T₂OsVQ25-42植株，***表示显著性P<0.001)。结果表明，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株病斑中的真菌生物量极显著降低。

由此可见，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株的抗稻瘟病能力显著提高。

2、水稻白叶枯病抗性分析

(1)在温室条件下，正常培育10株供试植株。

(2)待供试植株生长至6周，采用人工剪叶接种法(KAUFFMAN H E，REDDY A P K，HSIEH S P Y，1973.Improved technique for evaluating resistance of ricevarieties to Xanthomonasoryzae.Plant Disease Reporter，57：537–541.)接种白叶枯病菌PXO99，接菌浓度OD_600nm值为0.6—0.8。

(3)完成步骤(2)后14天，观察叶片表型。

部分结果见图5中A(WT为日本晴植株，osvq25-28为T₂OsVQ25-28植株，osvq25-29为T₂OsVQ25-29植株，osvq25-42为T₂OsVQ25-42植株)。

(4)完成步骤(3)后，测量各株植株病斑长度，结果取平均值。

结果见图5中B(WT为日本晴植株，osvq25-28为T₂OsVQ25-28植株，osvq25-29为T₂OsVQ25-29植株，osvq25-42为T₂OsVQ25-42植株，**表示显著性0.001<P<0.01，*表示显著性0.01<P<0.05)。结果表明，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株的病斑长度均显著变短。

由此可见，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株的抗白叶枯病能力显著提高。

3、其它农艺性状分析

(1)在大田条件下，正常培育供试植株。

(2)随机选取10株，统计各个供试植株的有效分蘖数、株高、主穗小穗数等农艺性状，结果取平均值。

部分统计结果见表4(WT为日本晴植株)。结果表明，与日本晴植株相比，T₂OsVQ25-28植株、T₂OsVQ25-29植株和T₂OsVQ25-42植株的有效分蘖数、株高、主穗小穗数均无显著差异。

表4

	有效分蘖数(个)	株高(cm)	主穗小穗数(个)
				T<sub>2</sub> OsVQ25-28植株	12±1.45	104±1.72	11±0.55
T<sub>2</sub> OsVQ25-29植株	12±1.81	103±2.00	11±0.65
				T<sub>2</sub> OsVQ25-42植株	12±1.46	103±1.64	10±0.55
WT	12±1.72	105±1.33	11±0.60

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种通过基因组编辑提高水稻抗病性的方法及其使用的sgRNA

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15970

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gaattcgagc tccctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 60

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattcccga tctagtaaca 120

tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg 180

cgtattaaat gtataattgc gggactctaa tcataaaaac ccatctcata aataacgtca 240

tgcattacat gttaattatt acatgcttaa cgtaattcaa cagaaattat atgataatca 300

tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat 360

cggggaaatt cggatcccca atacttcaat cgccgccgag ttgtgagagg tcgatgcgtg 420

tctcgtagag gcctgtgata gactggtgga tgagggtggc gtcgagaacc tccttggtag 480

aggtgtagcg cttgcggtcg atggtggtgt cgaagtactt gaaggcggct ggagcgccga 540

ggttggtgag ggtgaagagg tggatgatgt tctcggcctg ctcgcgaatt ggcttatcgc 600

ggtgcttgtt gtaggcgctg agcaccttat cgaggttggc atcggcgagg atcacgcgct 660

tggagaactc ggagatctgc tcgatgatct cgtcgaggta gtgcttgtgc tgctcgacga 720

acagctgctt ttgctcgttg tcctctgggg agcccttgag cttctcgtag tgggaggcga 780

ggtagaggaa gttcacgtac ttggacggga gagcaagctc gttgcccttc tgaagctcgc 840

cagcagaggc gagcattctc ttgcggccgt tctcaagctc gaagaggctg tacttcggga 900

gcttgatgat gaggtccttc ttcacctcct tgtagccctt ggcctcgagg aagtcgattg 960

ggttcttctc gaagctgctg cgctccatga tcgtgatgcc cagcagctcc ttgacggact 1020

tgagcttctt gctcttgccc ttctcgacct tggcaaccac gagcacagag taggccacgg 1080

tcggagaatc gaagccgcca tacttcttcg ggtcccagtc cttcttgcgg gcgatcagct 1140

tgtcggagtt gcgctttggg aggatggact ccttggagaa gccgccggtc tgaacctcgg 1200

tcttcttcac gatgttcact tgcggcatgg agagcacctt gcgcactgtg gcgaaatccc 1260

tgcccttgtc ccacacgatc tcgcctgtct cgccgtttgt ctcgatgagc ggcctcttcc 1320

taatctcgcc gttggcgagc gtgatctcgg tcttgaagaa attcatgatg ttggagtaga 1380

agaagtactt ggcggtcgcc ttgccgatct cttgctcgga cttggcgatc atcttgcgca 1440

cgtcgtacac cttgtagtcg ccgtacacga actcggactc gagctttggg tacttcttga 1500

tgagggctgt gcccaccacg gcattgaggt aggcgtcgtg ggcgtggtgg tagttgttga 1560

tctcgcgcac cttgtagaac tggaagtcct tgcggaagtc ggacacgagc ttggacttga 1620

gggtgatgac cttcacctcg cggatgagct tgtcgttctc gtcgtacttg gtgttcatgc 1680

gggagtcgag gatctgggcc acgtgctttg tgatctggcg tgtctcgacg agctggcgct 1740

tgatgaagcc ggccttatca agctcggaaa ggccgcctct ctcggccttg gtgaggttgt 1800

cgaacttcct ctgggtgatg agcttggcgt tgaggagctg gcgccagtag ttcttcatct 1860

tcttgacgac ctcttcggac ggcacgttat cggacttgcc cctgttcttg tcggagcggg 1920

tgagcacctt gttgtcgatg gagtcgtcct tcaggaagga ctgcggcaca atatggtcca 1980

cgtcgtagtc ggagaggcgg ttgatgtcca gctcttggtc cacgtacatg tcgcggccgt 2040

tctggaggta gtagaggtag agcttctcgt tctggagctg ggtgttctcg actgggtgct 2100

ccttgaggat ctgggagccc agctccttaa tgccctcctc gatcctcttc atgcgctcgc 2160

gggagttctt ttggcccttc tgtgtggtct ggttctcgcg ggccatctcg atcacgatgt 2220

tctctggctt gtgcctgccc atcaccttca ccagctcgtc caccaccttc acggtctgga 2280

gaatgccctt cttgatagcc ggggagccgg cgagattggc gatatgctca tggagggaat 2340

cgccttggcc ggacacctgg gccttttgga tgtcctcctt gaaggtgagg gagtcgtcgt 2400

ggatgagctg catgaagttg cggttggcga agccgtcgga cttgaggaag tcgaggatcg 2460

tcttgccgga ctgcttgtcg cggatgccgt tgatgagctt cctagagagc ctgccccagc 2520

cggtatagcg cctgcgcttc agctgcttca tcaccttgtc gtcgaagagg tgggcgtatg 2580

tcttgaggcg ctcctcgatc atctcgcggt cctcgaagag ggtgagggtg agcacgatgt 2640

cctcgaggat gtcctcgttc tcctcgttgt cgaggaagtc cttgtccttg ataatcttga 2700

ggaggtcgtg gtaggtcccg agggaggcat tgaacctatc ctcgacgccg gagatctcga 2760

cggagtcgaa gcactcgatt ttcttgaagt agtcctcctt gagctgcttc acggtcacct 2820

tgcggttggt cttgaacagc aggtcgacga tggccttctt ttgctcgccg ctaaggaaag 2880

ctggcttcct catcccctcg gtcacgtact tcaccttggt cagctcgttg tacacggtga 2940

agtactcgta gaggagtgag tgcttcggga gcaccttctc gttcgggagg ttcttgtcga 3000

agttggtcat gcgctcgatg aaagactggg cagaggcgcc cttatccacc acctcctcga 3060

agttccaggg ggtgattgtc tcctcggact ttctggtcat ccaggcgaac ctggagttgc 3120

ccctggcgag cgggcccacg tagtacggga tgcggaaggt gaggatcttc tcaatcttct 3180

cgcggttgtc cttgaggaac gggtagaagt cctcttgcct gcggaggata gcatgaagct 3240

cgccgaggtg gatctggtgc gggatggagc cattatcgaa ggtgcgctgc ttgcggagga 3300

ggtcctctct attgagcttc acgagcagct cctcggtgcc gtccatcttc tcgaggatcg 3360

gcttgatgaa cttgtagaac tcctcttgag aagcgccgcc atcgatgtag ccggcgtagc 3420

cgttcttgga ctggtcgaag aagatctcct tgtacttctc tgggagctgc tgtctcacga 3480

gggccttgag gagtgtgagg tcctggtggt gctcgtcgta cctcttgatc atggaggcgg 3540

agagtggggc cttggtgatc tcggtgttca ccctgaggat gtcgctgagg aggatggcgt 3600

cggagagatt cttggcggcg aggaacagat cggcgtactg atcgccaatc tgggcgagga 3660

gattgtcgag gtcgtcgtcg taggtgtcct tggaaagctg gagcttggcg tcctcggcga 3720

ggtcgaagtt ggacttgaag ttcggggtga ggccaagaga gagggcgatc aggttgccga 3780

agaggccatt cttcttctcg cccggaagtt gggcgatcag attctcgagc ctgcgggact 3840

tagagagcct ggcagagaga atagccttgg cgtcaacgcc agaggcgttg atcgggttct 3900

cctcgaacag ctggttgtag gtctgcacga gctggatgaa cagcttgtcc acatcggagt 3960

tgtccgggtt gaggtcgccc tcgatgagga agtggcccct gaacttgatc atgtgggcga 4020

gggcgaggta gatgagcctg aggtcggcct tatcggtgga gtcgacgagc ttcttgcgga 4080

ggtggtagat ggtcgggtac ttctcgtggt aggccacctc atccacgatg ttgccgaaga 4140

tcggatggcg ctcgtgcttc ttgtcctcct cgacgaggaa gctctcctcg agcctgtgga 4200

agaagctgtc gtccaccttg gccatctcgt tggagaagat ctcttggagg tagcagatgc 4260

ggttcttgcg cctggtgtac ctgcgtctag cggtcctctt gagccttgta gcctcggctg 4320

tctcgccaga gtcgaacagc agggcgccga tgagattctt cttgatggag tggcggtcgg 4380

tgttgccgag gaccttgaac ttcttggacg gcaccttgta ctcgtcggtg atcacggccc 4440

agccaacaga attggtgccg atgtcgaggc cgatggagta cttcttgtcg accttgcgct 4500

tcttctttgg ggccatagta ttggggatcc cccgggctgc agaagtaaca ccaaacaaca 4560

gggtgagcat cgacaaaaga aacagtacca agcaaataaa tagcgtatga aggcagggct 4620

aaaaaaatcc acatatagct gctgcatatg ccatcatcca agtatatcaa gatcaaaata 4680

attataaaac atacttgttt attataatag ataggtactc aaggttagag catatgaata 4740

gatgctgcat atgccatcat gtatatgcat cagtaaaacc cacatcaaca tgtataccta 4800

tcctagatcg atatttccat ccatcttaaa ctcgtaacta tgaagatgta tgacacacac 4860

atacagttcc aaaattaata aatacaccag gtagtttgaa acagtattct actccgatct 4920

agaacgaatg aacgaccgcc caaccacacc acatcatcac aaccaagcga acaaaaagca 4980

tctctgtata tgcatcagta aaacccgcat caacatgtat acctatccta gatcgatatt 5040

tccatccatc atcttcaatt cgtaactatg aatatgtatg gcacacacat acagatccaa 5100

aattaataaa tccaccaggt agtttgaaac agaattctac tccgatctag aacgaccgcc 5160

caaccagacc acatcatcac aaccaagaca aaaaaaagca tgaaaagatg acccgacaaa 5220

caagtgcacg gcatatattg aaataaagga aaagggcaaa ccaaacccta tgcaacgaaa 5280

caaaaaaaat catgaaatcg atcccgtctg cggaacggct agagccatcc caggattccc 5340

caaagagaaa cactggcaag ttagcaatca gaacgtgtct gacgtacagg tcgcatccgt 5400

gtacgaacgc tagcagcacg gatctaacac aaacacggat ctaacacaaa catgaacaga 5460

agtagaacta ccgggcccta accatggacc ggaacgccga tctagagaag gtagagaggg 5520

gggggggggg aggacgagcg gcgtaccttg aagcggaggt gccgacgggt ggatttgggg 5580

gagatctggt tgtgtgtgtg tgcgctccga acaacacgag gttggggaaa gagggtgtgg 5640

agggggtgtc tatttattac ggcgggcgag gaagggaaag cgaaggagcg gtgggaaagg 5700

aatcccccgt agctgccgtg ccgtgagagg aggaggaggc cgcctgccgt gccggctcac 5760

gtctgccgct ccgccacgca tttctggatg ccgacagcgg agcaagtcca acggtggagc 5820

ggaactctcg agaggggtcc agaggcagcg acagagatgc cgtgccgtct gcttcgcttg 5880

gcccgacgcg acgctgctgg ttcgctggtt ggtgtccgtt agactcgtcg acggcgttta 5940

acaggctggc attatctact cgaaacaaga aaaatgtttc cttagttttt ttaatttctt 6000

aaagggtatt tgtttaattt ttagtcactt tattttattc tattttatat ctaaattatt 6060

aaataaaaaa actaaaatag agttttagtt ttcttaattt agaggctaaa atagaataaa 6120

atagatgtac taaaaaaatt agtctataaa aaccattaac cctaaaccct aaatggatgt 6180

actaataaaa tggatgaagt attatatagg tgaagctatt tgcaaaaaaa aaggagaaca 6240

catgcacact aaaaagataa aactgtagag tcctgttgtc aaaatactca attgtccttt 6300

agaccatgtc taactgttca tttatatgat tctctaaaac actgatatta ttgtagtact 6360

atagattata ttattcgtag agtaaagttt aaatatatgt ataaagatag ataaactgca 6420

cttcaaacaa gtgtgacaaa aaaaatatgt ggtaattttt tataacttag acatgcaatg 6480

ctcattatct ctagagaggg gcacgaccgg gtcacgctgc actgcaggaa ttcgatatca 6540

atggcactgg ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt 6600

aatcgccttg cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta atagcgaaga ggcccgcacc 6660

gatcgccctt cccaacagtt gcgcagcctg aatggcgaat gctagagcag cttgagcttg 6720

gatcagattg tcgtttcccg ccttcagttt tgcatgcctg caggtcgacg attaaggaat 6780

ctttaaacat acgaacagat cacttaaagt tcttctgaag caacttaaag ttatcaggca 6840

tgcatggatc ttggaggaat cagatgtgca gtcagggacc atagcacaag acaggcgtct 6900

tctactggtg ctaccagcaa atgctggaag ccgggaacac tgggtacgtt ggaaaccacg 6960

tgatgtgaag aagtaagata aactgtagga gaaaagcatt tcgtagtggg ccatgaagcc 7020

tttcaggaca tgtattgcag tatgggccgg cccattacgc aattggacga caacaaagac 7080

tagtattagt accacctcgg ctatccacat agatcaaagc tgatttaaaa gagttgtgca 7140

gatgatccgt ggcagagtga cactggctcg agctgtttta gagctagaaa tagcaagtta 7200

aaataaggct agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc tttttttcca 7260

cataatctct agaggatcca aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct 7320

aagagaaaag agcgtttatt agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc 7380

gttcgtccat ttgtatgtgc atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg 7440

atccaacccc tccgctgcta tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct 7500

gaaaacgaca tgtcgcacaa gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc 7560

tggcgttttc ttgtcgcgtg ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg 7620

agacattacg ccatgaacaa gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc 7680

accgacgacc aggacttgac caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag 7740

ctgttttccg agaagatcac cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt 7800

gaccacctag ccctggcgac gttgtgacag tgaccaggct agaccgcctg gcccgcagca 7860

cccgcgacct actggacatt gccgagcgca tccaggaggc cggcgcgggc ctgcgtagcc 7920

tggcagagcc gtgggccgac accaccacgc cggccggccg catggtgttg accgtgttcg 7980

ccggcattgc cgagttcgag cgttccctaa tcatcgaccg cacccggagc gggcgcgagg 8040

ccgccaaggc ccgaggcgtg aagtttggcc cccgccctac cctcaccccg gcacagatcg 8100

cgcacgcccg cgagctgatc gaccaggaag gccgcaccgt gaaagaggcg gctgcactgc 8160

ttggcgtgca tcgctcgacc ctgtaccgcg cacttgagcg cagcgaggaa gtgacgccca 8220

ccgaggccag gcggcgcggt gccttccgtg aggacgcatt gaccgaggcc gacgccctgg 8280

cggccgccga gaatgaacgc caagaggaac aagcatgaaa ccgcaccagg acggccagga 8340

cgaaccgttt ttcattaccg aagagatcga ggcggagatg atcgcggccg ggtacgtgtt 8400

cgagccgccc gcgcacgtct caaccgtgcg gctgcatgaa atcctggccg gtttgtctga 8460

tgccaagctg gcggcctggc cggccagctt ggccgctgaa gaaaccgagc gccgccgtct 8520

aaaaaggtga tgtgtatttg agtaaaacag cttgcgtcat gcggtcgctg cgtatatgat 8580

gcgatgagta aataaacaaa tacgcaaggg gaacgcatga aggttatcgc tgtacttaac 8640

cagaaaggcg ggtcaggcaa gacgaccatc gcaacccatc tagcccgcgc cctgcaactc 8700

gccggggccg atgttctgtt agtcgattcc gatccccagg gcagtgcccg cgattgggcg 8760

gccgtgcggg aagatcaacc gctaaccgtt gtcggcatcg accgcccgac gattgaccgc 8820

gacgtgaagg ccatcggccg gcgcgacttc gtagtgatcg acggagcgcc ccaggcggcg 8880

gacttggctg tgtccgcgat caaggcagcc gacttcgtgc tgattccggt gcagccaagc 8940

ccttacgaca tatgggcaac cgccgacctg gtggagctgg ttaagcagcg cattgaggtc 9000

acggatggaa ggctacaagc ggcctttgtc gtgtcgcggg cgatcaaagg cacgcgcatc 9060

ggcggtgagg ttgccgaggc gctggccggg tacgagctgc ccattcttga gtcccgtatc 9120

acgcagcgcg tgagctaccc aggcactgcc gccgccggca caaccgttct tgaatcagaa 9180

cccgagggcg acgctgcccg cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc 9240

atttgagtta atgaggtaaa gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc 9300

gtccgagcgc acgcagcagc aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca 9360

tgaagcgggt caactttcag ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg 9420

tacgccaagg caagaccatt accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt 9480

aaatgagcaa atgaataaat gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa 9540

aatcaagaac aaccaggcac cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt 9600

tggccaggcg taagcggctg ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag 9660

cccgaggaat cggcgtgacg gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct 9720

gggtgatgac ctggtggaga agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga 9780

ggcagaagca cgccccggtg aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc 9840

ccggcaaccg ccggcagccg gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca 9900

accagatttt ttcgttccga tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat 9960

ggacgtggcc gttttccgtc tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta 10020

cgagcttcca gacgggcacg tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg 10080

ggattacgac ctggtactga tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg 10140

ggaagggaag ggagacaagc ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa 10200

gttctgccgg cgagccgatg gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg 10260

gttaaacacc acgcacgttg ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt 10320

gacggtatcc gagggtgaag ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg 10380

gcggccggag tacatcgaga tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg 10440

caagaacccg gacgtgctga cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg 10500

ccgttttctc taccgcctgg cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt 10560

caagacgatc tacgaacgca gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt 10620

gcgcaagctg atcgggtcaa atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca 10680

ggctggcccg atcctagtca tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg 10740

ttcctaatgt acggagcaga tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa 10800

aggtctcttt cctgtggata gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg 10860

gaacccgtac attgggaacc caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac 10920

tgatataaaa gagaaaaaag gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac 10980

tcttaaaacc cgcctggcct gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca 11040

aaaagcgcct acccttcggt cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat 11100

cgcggccgct ggccgctcaa aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg 11160

acaagccgcg ccgtcgccac tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc 11220

gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 11280

gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 11340

ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa 11400

ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca 11460

cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc 11520

gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg 11580

gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 11640

ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 11700

cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 11760

ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 11820

taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg 11880

ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 11940

ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 12000

aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 12060

tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 12120

agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 12180

ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat 12240

tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 12300

tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa 12360

ttcatccagt aaaatataat attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc 12420

aaaaaatagc tcgacatact gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa 12480

ggcaatgtca taccacttgt ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac 12540

tttgccatct ttcacaaaga tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc 12600

ctcttcgggc ttttccgtct ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt 12660

gtcttcttcc cagttttcgc aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa 12720

ttcggctaag cggctgtcta agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg 12780

aaagagcctg atgcactccg catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc 12840

atactcttcc gagcaaagga cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc 12900

atgccgttca aagtgcagga cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat 12960

gtccttttcc cgttcaacat cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa 13020

atataggttt tcattttctc ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt 13080

atcttttacg cagcggtatt tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt 13140

agccatttat tatttccttc ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat 13200

tataacaaga cgaactccaa ttcactgttc cttgcattct aaaaccttaa ataccagaaa 13260

acagcttttt caaagttgtt ttcaaagttg gcgtataaca tagtatcgac ggagccgatt 13320

ttgaaaccgc ggtgatcaca ggcagcaacg ctctgtcatc gttacaatca acatgctacc 13380

ctccgcgaga tcatccgtgt ttcaaacccg gcagcttagt tgccgttctt ccgaatagca 13440

tcggtaacat gagcaaagtc tgccgcctta caacggctct cccgctgacg ccgtcccgga 13500

ctgatgggct gcctgtatcg agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt 13560

ggctggctgg tggcaggata tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata 13620

acacattgcg gacgttttta atgtactgaa ttaacgccga attaattcgg gggatctgga 13680

ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa 13740

atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac cctataggaa 13800

ccctaattcc cttatctggg aactactcac acattattat ggagaaactc gagcttgtcg 13860

atcgacagat ccggtcggca tctactctat ttctttgccc tcggacgagt gctggggcgt 13920

cggtttccac tatcggcgag tacttctaca cagccatcgg tccagacggc cgcgcttctg 13980

cgggcgattt gtgtacgccc gacagtcccg gctccggatc ggacgattgc gtcgcatcga 14040

ccctgcgccc aagctgcatc atcgaaattg ccgtcaacca agctctgata gagttggtca 14100

agaccaatgc ggagcatata cgcccggagt cgtggcgatc ctgcaagctc cggatgcctc 14160

cgctcgaagt agcgcgtctg ctgctccata caagccaacc acggcctcca gaagaagatg 14220

ttggcgacct cgtattggga atccccgaac atcgcctcgc tccagtcaat gaccgctgtt 14280

atgcggccat tgtccgtcag gacattgttg gagccgaaat ccgcgtgcac gaggtgccgg 14340

acttcggggc agtcctcggc ccaaagcatc agctcatcga gagcctgcgc gacggacgca 14400

ctgacggtgt cgtccatcac agtttgccag tgatacacat ggggatcagc aatcgcgcat 14460

atgaaatcac gccatgtagt gtattgaccg attccttgcg gtccgaatgg gccgaacccg 14520

ctcgtctggc taagatcggc cgcagcgatc gcatccatag cctccgcgac cggttgtaga 14580

acagcgggca gttcggtttc aggcaggtct tgcaacgtga caccctgtgc acggcgggag 14640

atgcaatagg tcaggctctc gctaaactcc ccaatgtcaa gcacttccgg aatcgggagc 14700

gcggccgatg caaagtgccg ataaacataa cgatctttgt agaaaccatc ggcgcagcta 14760

tttacccgca ggacatatcc acgccctcct acatcgaagc tgaaagcacg agattcttcg 14820

ccctccgaga gctgcatcag gtcggagacg ctgtcgaact tttcgatcag aaacttctcg 14880

acagacgtcg cggtgagttc aggctttttc atatctcatt gccccccgga tctgcgaaag 14940

ctcgagagag atagatttgt agagagagac tggtgatttc agcgtgtcct ctccaaatga 15000

aatgaacttc cttatataga ggaaggtctt gcgaaggata gtgggattgt gcgtcatccc 15060

ttacgtcagt ggagatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt 15120

ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg 15180

catcttgaac gatagccttt cctttatcgc aatgatggca tttgtaggtg ccaccttcct 15240

tttctactgt ccttttgatg aagtgacaga tagctgggca atggaatccg aggaggtttc 15300

ccgatattac cctttgttga aaagtctcaa tagccctttg gtcttctgag actgtatctt 15360

tgatattctt ggagtagacg agagtgtcgt gctccaccat gttatcacat caatccactt 15420

gctttgaaga cgtggttgga acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc 15480

catctttggg accactgtcg gcagaggcat cttgaacgat agcctttcct ttatcgcaat 15540

gatggcattt gtaggtgcca ccttcctttt ctactgtcct tttgatgaag tgacagatag 15600

ctgggcaatg gaatccgagg aggtttcccg atattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag 15660

ccctttggtc ttctgagact gtatctttga tattcttgga gtagacgaga gtgtcgtgct 15720

ccaccatgtt ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 15780

gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 15840

cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 15900

ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 15960

ccatgattac 15970

<210> 2

<211> 793

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

ccgatatttt gcaattcgcg acgcgatccg tctctcgctc gatcgccatg gcggccatga 60

gtgacactgg ctcgagcttg gcgcagtggg ccgagctgta ccacgacgcg tcggctgctc 120

acggcggcgt ggtggcgaac ggtgcggcgg cggcggcgac gagcccggcg tcgccggcgg 180

gatcgacagg cgggagcccg acgcgggcgc cgggggtgga ggggccgcgc gtggggaagc 240

cggcgaggag gcggtccagg gcgtcgcggc gcgcgcccgt gacgctgctc aacacggaca 300

ccaccaactt ccgcgccatg gtgcagcagt tcaccggcat cccggcgccg cccgcgggcg 360

cgttcgcggg gcccggcggc gttccggtca tcaacttcgg ctccgactac ggcttcaccg 420

gcgccgtcct tcccttctcc gaccacctcc aaccgcgccg gccgacgttc caggaccacc 480

aacagctcct ccgaccgcag cagcagtaca ccggcgcacc gttcggttac ggcaacctgc 540

agcaagccgg cggcgccggc accggcgccg gcgacatgtt cagccacgcg ctgagctcgg 600

ccgaggacag gttgctcctg cagagcctcc agtcagctca gatgcctact tccgccgcta 660

accacagcgc taatggttac ttcgcctaat taaccaacgg ttaatcgaag acacatcaca 720

agcaaagaag attcatggac cagttgtgtt taacccccta caagttaatt ttaccctctc 780

ctcgatcgtg tgc 793

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400>3

Met Ala Ala Met Ser Asp Thr Gly Ser Ser Leu Ala Gln Trp Ala Glu

1 5 10 15

Leu Tyr His Asp Ala Ser Ala Ala His Gly Gly Val Val Ala Asn Gly

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ser Pro Ala Ser Pro Ala Gly Ser Thr Gly

35 40 45

Gly Ser Pro Thr Arg Ala Pro Gly Val Glu Gly Pro Arg Val Gly Lys

50 55 60

Pro Ala Arg Arg Arg Ser Arg Ala Ser Arg Arg Ala Pro Val Thr Leu

65 70 75 80

Leu Asn Thr Asp Thr Thr Asn Phe Arg Ala Met Val Gln Gln Phe Thr

85 90 95

Gly Ile Pro Ala Pro Pro Ala Gly Ala Phe Ala Gly Pro Gly Gly Val

100 105 110

Pro Val Ile Asn Phe Gly Ser Asp Tyr Gly Phe Thr Gly Ala Val Leu

115 120 125

Pro Phe Ser Asp His Leu Gln Pro Arg Arg Pro Thr Phe Gln Asp His

130 135 140

Gln Gln Leu Leu Arg Pro Gln Gln Gln Tyr Thr Gly Ala Pro Phe Gly

145 150 155 160

Tyr Gly Asn Leu Gln Gln Ala Gly Gly Ala Gly Thr Gly Ala Gly Asp

165 170 175

Met Phe Ser His Ala Leu Ser Ser Ala Glu Asp Arg Leu Leu Leu Gln

180 185 190

Ser Leu Gln Ser Ala Gln Met Pro Thr Ser Ala Ala Asn His Ser Ala

195 200 205

Asn Gly Tyr Phe Ala

210

<210> 4

<211> 642

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 4

atggcggcca tgagtgacac tggctcgagc ttggcgcagt gggccgagct gtaccacgac 60

gcgtcggctg ctcacggcgg cgtggtggcg aacggtgcgg cggcggcggc gacgagcccg 120

gcgtcgccgg cgggatcgac aggcgggagc ccgacgcggg cgccgggggt ggaggggccg 180

cgcgtgggga agccggcgag gaggcggtcc agggcgtcgc ggcgcgcgcc cgtgacgctg 240

ctcaacacgg acaccaccaa cttccgcgcc atggtgcagc agttcaccgg catcccggcg 300

ccgcccgcgg gcgcgttcgc ggggcccggc ggcgttccgg tcatcaactt cggctccgac 360

tacggcttca ccggcgccgt ccttcccttc tccgaccacc tccaaccgcg ccggccgacg 420

ttccaggacc accaacagct cctccgaccg cagcagcagt acaccggcgc accgttcggt 480

tacggcaacc tgcagcaagc cggcggcgcc ggcaccggcg ccggcgacat gttcagccac 540

gcgctgagct cggccgagga caggttgctc ctgcagagcc tccagtcagc tcagatgcct 600

acttccgccg ctaaccacag cgctaatggt tacttcgcct aa 642

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

gagtgacact ggctcgagct 20

Claims (10)

1.一种提高水稻抗病性的方法，包括如下步骤：降低水稻中OsVQ25蛋白活性和/或表达量。

2.一种提高水稻抗病性的方法，包括如下步骤：降低水稻中OsVQ25蛋白的丰度。

3.一种提高水稻抗病性的方法，包括如下步骤：对编码OsVQ25蛋白的基因进行基因编辑。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如SEQ ID NO：5所示。

6.特异sgRNA或特异重组质粒；

所述特异sgRNA的靶标序列如SEQ ID NO：5所示；

所述特异重组质粒含有Cas9蛋白的编码基因和所述特异sgRNA的编码基因。

7.一种制备转基因水稻的方法，包括如下步骤：将权利要求6所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；与出发水稻相比，转基因水稻的抗病性提高。

8.制备基因编辑水稻的方法，为方法J或方法K：

所述方法J包括如下步骤：

(j1)将权利要求6所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；

(j2)从所述转基因水稻中筛选基因编辑水稻；

所述方法K包括如下步骤：

(k1)将权利要求6所述特异sgRNA的编码基因和Cas9蛋白的编码基因导入出发水稻，得到转基因水稻；

(k2)将所述转基因水稻自交，获得自交后代；

(k3)从自交后代中筛选基因编辑水稻；

所述基因编辑水稻的抗病性高于所述出发水稻。

9.权利要求6所述特异sgRNA或所述特异重组质粒在水稻育种中的应用；所述水稻育种的目的为提高水稻的抗病性。

10.如权利要求1、2、3、4、5、7或8所述的方法，或，权利要求9所述的应用，其特征在于：所述抗病性为a1)-a4)中的至少一种：

a1)抗稻瘟病；

a2)抗白叶枯病；

a3)抗稻瘟病菌引起的病害；

a4)抗白叶枯病菌引起的病害。

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