CN109576300B - 玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用 - Google Patents

玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种玉米转化事件HiII‑AtAAP1‑1及其特异性鉴定方法与应用。所述转化事件以SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为外源基因的左侧翼序列，以SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为外源基因的右侧翼序列。本发明提供的玉米转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米氮素高效利用以及耐除草剂草铵膦的能力。外源基因在受体玉米中能够稳定遗传；外源基因的表达对受体玉米的生理形态及氮素利用效率均有提高。本发明检测方法可以为利用转化事件进行分子标记检测，提高育种工作效率。

Description

玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用。
背景技术
随着畜牧业和玉米深加工业的发展，以及玉米乙醇燃料技术的应用和推广，玉米已成为世界上重要的粮食作物、饲料作物和经济作物，在农业生产和国民经济发展中占有举足轻重的地位。玉米产量的高低、经济效益的好坏直接影响着我国粮食安全以及农业生产的发展。
玉米需肥量大，对氮肥敏感。氮是玉米生长发育必需的营养元素之一，对其生长发育和产量至关重要。在农业生产中，化学氮肥发挥着越来越重要的作用。随着氮肥用量的增加，氮肥利用率普遍降低，损失提高，因而增加了农业生产成本，也直接或间接的产生一系列不良的环境反应。因此，在保证玉米产量的前提下，提高氮肥的利用效率，减少氮肥施用量是当前农业生产亟待解决的问题之一。而通过转基因的方法培育高效吸收氮肥的玉米品种无疑是解决这一问题的有效途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种转基因玉米的培育方法。
本发明提供的转基因玉米的培育方法包括如下步骤：将目的玉米基因组第10号染色体的第92016364-92016366位之间的碱基替换为外源DNA片段，得到转基因玉米；
所述外源DNA片段含有氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒和耐草铵膦基因bar表达盒；
所述转基因玉米的氮肥利用效率高于所述目的玉米和/或所述转基因玉米的耐草铵膦的能力高于所述目的玉米。
上述方法中，所述氨基酸通透酶基因AtAAP1如SEQ ID NO.3所示，基因全长1458bp，编码SEQ ID NO.8所示的氨基酸通透酶(485个氨基酸组成，蛋白分子量约52kDa)，AtAAP1可促进根系吸收氨基酸并在氨基酸从根到茎的运输过程中起重要作用。该基因在玉米中过量表达，可使玉米在相同氮素水平下株高、叶绿素、植株全氮含量方面有良好表现。
所述耐草铵膦基因bar为来自吸水链霉菌的耐草铵膦基因，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示，基因全长552bp，编码SEQ ID NO.11所示的草铵膦乙酰转移酶PAT(183个氨基酸组成，蛋白分子量约23kDa)，它可使除草剂草铵膦乙酰化，抑制草铵膦的活性，最终达到耐草铵膦的效果。
进一步的，所述外源DNA片段依次由所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒和所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒组成。
所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒依次由玉米ZmUbi启动子、氨基酸通透酶基因AtAAP1和nos终止子构成。其中玉米ZmUbi启动子大小为1995bp，核苷酸序列为SEQ IDNO.6，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。nos终止子大小为270bp，来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止AtAAP1基因转录，核苷酸序列为SEQ ID NO.7。
所述耐草铵膦基因bar表达盒依次由CaMV35S启动子、耐草铵膦基因bar和CaMVpolyA终止子构成。其中CaMV35S启动子大小为482bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因bar的表达，核苷酸序列为SEQ ID NO.9。CaMV polyA终止子大小为148bp，终止bar基因转录，核苷酸序列为SEQ ID NO.10。
更进一步的，所述外源DNA片段的核苷酸序列具体如SEQ ID NO.5所示。
在本发明的具体实施例中，利用上述方法获得玉米转化事件HiII-AtAAP1-1为将SEQ ID NO.5所示的外源DNA片段插入目的玉米基因组第10号染色体的第92016364-92016366位间，替换掉第10号染色体的第92016364-92016366位间1bp的碱基序列后得到的转基因玉米。且自第92016364位上游且紧邻第92016364位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列(左侧翼序列)如SEQ ID NO.1所示，自第92016366位下游且紧邻第92016366位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列(右侧翼序列)如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述玉米转化事件HiII-AtAAP1-1是利用农杆菌介导法，将来自于拟南芥的目的基因AtAAP1和来自于吸水链霉素菌的耐草铵膦基因bar构建到pCAM-UPN载体上，通过农杆菌介导法，将目的基因AtAAP1和bar导入受体玉米的幼胚中，利用分子生物学和生物测定的方法筛选得到表现最佳的转化事件。所述筛选方法具体如下：经除草剂筛选及PCR检测，筛选出带有目的基因的转基因植株，然后根据转基因植株氮肥利用效率水平，从218个转化事件中筛选出10个氮素利用效率较高且耐草铵膦除草剂的转化株系，其中转基因玉米HiII-AtAAP1-1的养分利用效率和综合性状最佳。
上述方法中，所述转基因玉米的氮肥利用效率高于所述目的玉米体现在如下B1)-B4)中任一种：
B1)所述转基因玉米的株高高于所述目的玉米；
B2)所述转基因玉米的叶绿素含量高于所述目的玉米；
B3)所述转基因玉米的全氮含量和/或总氮量高于所述目的玉米；
B4)所述转基因玉米的产量和/或百粒重高于所述目的玉米。
上述方法中，所述目的玉米可为玉米HiII。
本发明的另一个目的是提供用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法。
本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，所述DNA片段A依次由左侧翼序列、上述外源DNA片段和右侧翼序列组成；
若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；
若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述左侧翼序列如SEQ ID NO.1所示；
所述右侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。
上述用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的方法为如下1)或2)或3)：
1)直接测序；
2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为673bp的条带和/或引物对乙扩增得到大小为631bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述引物对甲由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对乙由SEQ ID NO.15所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成；
3)用探针甲和/或探针乙对所述待测植物样品的基因组DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述探针甲为以玉米基因组DNA为模板，采用由SEQ ID NO.17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.18所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段；
所述探针乙为以玉米基因组DNA为模板，采用由SEQ ID NO.19所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.20所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
本发明又有一个目的是提供用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的试剂盒。
本发明提供的用于检测或辅助检测待测植物样品是否为上述方法获得的转基因玉米或其后代的试剂盒其包括由上述引物对甲和引物对乙组成的成套引物对和/或由上述探针甲和探针乙组成的成套探针。
本发明还有一个目的是提供上述方法获得的转基因玉米的新用途。
本发明提供了上述方法获得的转基因玉米在培育氮肥利用效率高和/或耐草铵膦的玉米中的应用。
本发明还提供了上述方法获得的转基因玉米在玉米育种中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种培育氮肥利用效率高和/或耐草铵膦的玉米的方法。
本发明提供的培育氮肥利用效率高和/或耐草铵膦的玉米的方法包括如下步骤：
(1)按照上述培育方法获得转基因玉米；
(2)将所述转基因玉米自交或杂交，得到繁育后代，按照上述方法鉴定所述繁育后代，得到目标植株。
如下a)-c)中任一所述的生物材料也属于本发明的保护范围：
a)上述左侧翼序列和上述右侧翼序列；
b)上述外源DNA片段；
c)与上述外源DNA片段相关的生物材料；
所述生物材料为下述A1)至A11)中的任一种：
A1)含有所述外源DNA片段的表达盒；
A2)含有所述外源DNA片段的重组载体；
A3)含有A1)所述表达盒的重组载体；
A4)含有所述外源DNA片段的重组微生物；
A5)含有A1)所述表达盒的重组微生物；
A6)含有A2)所述重组载体的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有所述外源DNA片段的转基因植物细胞系；
A9)含有A1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系。
所述生物材料在调控植物氮肥利用效率和/或株高和/或叶绿素含量和/或全氮含量和/或产量和/或百粒重和/或耐草铵膦的能力中的应用也属于本发明的保护范围。
上述生物材料中，所述重组载体为含有氮高效利用基因AtAAP1表达盒和耐草铵膦基因bar表达盒的重组载体。在本发明的一个实施方案中，所述重组载体为重组载体pCAM-UPN-AAP1，其图谱如图1所示，载体序列为SEQ ID NO.12。
所述重组细胞为含有所述重组载体的重组农杆菌细胞。在本发明的一个实验方案中，所述重组细胞为含有所述重组载体pCAM-UPN-AAP1的重组农杆菌细胞。
与现有技术相比，本发明的优异效果主要体现在：本发明提供了优良的转化事件HiII-AtAAP1-1，所述转化事件可实现将外源基因特异性引入到玉米品系中，赋予受体玉米具有高效利用氮肥以及耐除草剂草铵膦的能力；氮高效基因及耐草铵膦基因在受体玉米中能够稳定遗传；氮高效基因的表达可改良玉米受体的农艺性状。
试验结果表明：不同世代(T4、T5、T6)转基因玉米HiII-AtAAP1-1在目的基因整合稳定性、目的基因表达稳定性和目标农艺性状方面表现突出，且遗传稳定；转基因玉米HiII-AtAAP1-1在低氮条件下的大田长势较好，氮素吸收水平高于对照材料，株高、产量等证据表明其具有较好的节肥增产潜力。
附图说明
图1为载体图谱。
图2为不同氮素条件下转基因玉米HiII-AtAAP1-1各世代植株的株高。
图3为不同氮素条件下转基因玉米HiII-AtAAP1-1各世代植株的叶绿素SPAD值。
图4为不同氮素水平下T4代转基因玉米HiII-AtAAP1-1的全氮含量。
图5为不同氮素水平下BC2代转基因玉米HiII-AtAAP1-1的产量测定。
图6为不同氮素水平下BC2代转基因玉米HiII-AtAAP1-1的百粒重测定。
图7为bar基因的田间性状表现。
图8为目的基因AtAAP1的Southern blot杂交结果。图8A：Hind III酶切，M1：DNAMolecular-Weight Marker II DIG-labeled；1：阳性质粒(pCAM-UPN-AAP1质粒)；2：阴性对照HiII；3：T4代HiII-AtAAP1-1；4：T5代HiII-AtAAP1-1；5：T6代HiII-AtAAP1-1。图8B：Sac I酶切，6：T6代HiII-AtAAP1-1；7：T5代HiII-AtAAP1-1；8：T4代HiII-AtAAP1-1；9：阴性对照HiII；10：阳性质粒(pCAM-UPN-AAP1质粒)；M2：DNA Molecular-Weight Marker II DIG-labeled。图8C：Kpn I酶切，M3：Trans15K DNA Marker；11：阳性质粒(pCAM-UPN-AAP1质粒)；12：阴性对照HiII；13：T4代HiII-AtAAP1-1；14：T5代HiII-AtAAP1-1；15：T6代HiII-AtAAP1-1。
图9为目的基因bar的Southern blot杂交结果。图9A：Hind III酶切；图9B：Sac I酶切。M：Trans15K DNA Marker；1：阳性质粒(pCAM-UPN-AAP1质粒)；2：阴性对照HiII；3：T4代HiII-AtAAP1-1；4：T5代HiII-AtAAP1-1；5：T6代HiII-AtAAP1-1。
图10为探针、酶切位点在插入片段上的酶切示意图。PUBI：ZmUbi启动子；Nos：nos终止子；P35S：CaMV35S启动子；T35S：CaMV Poly A；LB：左边界识别序列；RB：右边界识别序列。
图11为转基因玉米HiII-AtAAP1-1的T-DNA区插入位点示意图。
图12为转基因玉米HiII-AtAAP1-1连续三代的PCR检测。图12A：Fragment-AtAAP1；图12B：Fragment-bar。M：DL2000Marker；1：水；2：阴性对照(HiII)；3：阳性对照(pCAM-UPN-AAP1质粒)；4：T4代HiII-AtAAP1-1；5：T5代HiII-AtAAP1-1；6：T6代HiII-AtAAP1-1。
图13为转基因玉米HiII-AtAAP1-1的特异性PCR检测。图13A：PR1；图13B：PR2。M：DL2000Marker；1：阴性对照(HiII)；2：HiII-AtAAP1-2(pCAM-UPN-AAP1载体的其他转化事件)；3：T4代HiII-AtAAP1-1；4：T5代HiII-AtAAP1-1；5：T6代HiII-AtAAP1-1。
图14为转基因玉米HiII-AtAAP1-1连续三代不同组织器官中AtAAP1基因的RT-PCR分析。图14A：T4；图14B：T5；图14C：T6。M：DL2000Marker；1：水；2：阴性对照(HiII)；3：阳性对照(pCAM-UPN-AAP1质粒)；4：HiII-AtAAP1-1根；5：HiII-AtAAP1-1茎；6：HiII-AtAAP1-1叶；7：HiII-AtAAP1-1花丝；8：HiII-AtAAP1-1雄穗；9：HiII-AtAAP1-1籽粒。
图15为转基因玉米HiII-AtAAP1-1连续三代不同组织器官中bar基因的RT-PCR分析。图15A：T4；图15B：T5；图15C：T6。M：DL2000Marker；1：水；2：阴性对照(HiII)；3：阳性对照(pCAM-UPN-AAP1质粒)；4：HiII-AtAAP1-1根；5：HiII-AtAAP1-1茎；6：HiII-AtAAP1-1叶；7：HiII-AtAAP1-1花丝；8：HiII-AtAAP1-1雄穗；9：HiII-AtAAP1-1籽粒。
图16为转基因玉米HiII-AtAAP1-1中AtAAP1基因的表达分析。
图17为转基因玉米HiII-AtAAP1-1中bar基因的表达分析。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的pCAM-UPN载体是在pCAMBIA3300质粒基础上进行改造后得到的载体。pCAM-UPN载体含有一个目的基因插盒(Pubi－多克隆酶切位点－Tnos)和一个来自吸水链霉菌的耐除草剂草铵膦基因bar表达盒(CaMV35S启动子-bar基因-TCaMV)。pCAMBIA3300质粒为澳大利亚CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology toInternational Agriculture)的产品，详细资料见如下网址：http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html。
下述实施例中的玉米HiII记载于如下文献：刘洋，刘相国等.抗虫抗除草剂转基因玉米HiII-NGc-1的遗传稳定性分析[J].生物技术进展,2016,6(6):428-434，公众可从申请人处获得。
下述实施例中的YEP固体培养基配方如下：NaCl 10g/L、酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L。
下述实施例中的选择培养基S1配方如下：N6 1L、头孢250mg/L、脯氨酸700mg/L、双丙氨膦1.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L。
下述实施例中的筛选培养基S2配方如下：N6 1L、头孢250mg/L、脯氨酸700mg/L、双丙氨膦3.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂8g/L。
实施例1、转pCAM-UPN-AA P1玉米的获得及农艺性状分析
一、转pCAM-UPN-AAP1玉米的获得
1、含有外源基因的质粒载体的获得
将SEQ ID NO.3所示的养分高效利用基因AtAAP1插入pCAM-UPN载体的Sma I和SacI酶切位点间，得到本发明用于玉米转化的载体pCAM-UPN-AAP1。pCAM-UPN-AAP1载体图谱如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
本发明用于玉米转化的质粒载体pCAM-UPN-AAP1的具体组成元件名称、位置如表1所示。其中T-DNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。SEQ ID NO.5包含完整的氮高效利用基因AtAAP1表达框和耐除草剂草铵膦基因bar表达框。
氮高效基因AtAAP1表达框具体由以下部分组成：玉米ZmUbi启动子、氮高效基因AtAAP1和nos终止子。其中，ZmUbi启动子大小为1995bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，是组成型启动子，可驱动目的基因在玉米所有组织中表达。氮高效基因AtAAP1全长1458bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示。nos终止子大小为270bp，来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区胭脂碱合成酶基因终止子，终止AtAAP1基因转录，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
耐除草剂草铵膦基因bar表达框具体由以下部分组成：CaMV35S启动子、耐除草剂草铵膦基因bar和CaMV polyA终止子。其中，CaMV35S启动子大小为482bp，来自花椰菜花叶病毒CaMV，负责启动植物耐草铵膦基因bar的表达，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。耐除草剂草铵膦基因bar全长552bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示。CaMV polyA终止子大小为148bp，终止bar基因转录，核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
表1、pCAM-UPN-AAP1载体各元件信息表
Figure BDA0001902202450000061
2、重组菌的获得
将步骤1获得的重组载体pCAM-UPN-AAP1导入农杆菌EHA105中，得到重组菌。
3、转pCAM-UPN-AAP1玉米的获得
采用农杆菌介导的方法将步骤2获得的重组菌转化玉米HiII幼穗，得到T0代转pCAM-UPN-AAP1玉米，具体步骤如下：
(1)将步骤2获得的重组菌(含有pCAM-UPN-AAP1的农杆菌EHA105)在YEP固体培养基上涂布，28℃下暗培养1～3天。将培养好的农杆菌从平板上刮下重悬，调OD550至0.3，制成侵染液备用；
(2)取授粉后9～12天的玉米HiII幼穗，剥去苞叶，75％酒精消毒10min，剥取幼胚于装有2mL重悬液的离心管中，每管100个幼胚，备用；
(3)侵染时弃尽重悬液，加入2mL侵染液，温和颠倒离心管数次混匀，室温暗处静止5min。侵染结束后，幼胚盾片朝上接种于共培养基中，20℃暗培养3天。转至静息培养基中，28℃暗培养7天。再转至含有1.5mg/L双丙氨膦的选择培养基S1中，28℃暗培养2周。如已得到初始愈伤组织，将其转至含有3mg/L双丙氨膦的筛选培养基S2中，以后每两周更换一次S2培养基；
(4)当筛选得到的抗性愈伤组织增殖至直径为2cm左右时，将其转至暗分化培养基上，25℃暗培养2～3周。将分化得到的胚芽鞘转至光分化培养基上，25℃光下培养2周。待胚芽鞘形成完整的幼苗和根，将幼苗转入培养瓶中促根壮苗。10天后将幼苗移栽入营养钵，室内温室中培养。待幼苗长出1～2片新叶后移入大花盆，转移至大型温室，以后按照常规方法进行日常管理即可。待雄穗散粉后，自交授粉。
通过农杆菌介导法获得了218个T0代转pCAM-UPN-AAP1玉米株系，经过PCR鉴定，筛选阳性植株，将PCR鉴定阳性的T1代转pCAM-UPN-AAP1玉米收种子，并按照上述方法在筛选培养基上进行筛选，得到T1代转pCAM-UPN-AAP1玉米株系。如此重复，直至得到阳性T2、T3、T4、T5、T6代转pCAM-UPN-AAP1玉米株系。
将T6代转pCAM-UPN-AAP1玉米株系与郑58杂交，得到F1代pCAM-UPN-AAP1玉米株系。随后，经过2代与郑58的回交，最终得到pCAM-UPN-AAP1玉米株系的BC2代回交群体。
二、转pCAM-UPN-AAP1玉米的农艺性状分析及转化事件HiII-AtAAP1-1的获得
分别在不同氮素水平下(HN水平为正常施氮水平，即38kg/亩；MN水平为HN的50％；LN水平为不施氮肥)培育T4、T5、T6代阳性转pCAM-UPN-AAP1玉米株系，并测定其形态及生理指标，同时以野生型玉米HiII为对照，最终筛选得到一个农艺性状最优的T6代转pCAM-UPN-AAP1玉米株系，将其命名为转化事件HiII-AtAAP1-1。
指标测定方法具体如下：
1、株高
植株处于抽雄开花期时，每小区选取3株长势大致相同的玉米，用尺测量从地面到植株最高点的距离。
结果如图2所示。结果表明：从连续三代(T4、T5、T6)来看，随着土壤氮素水平的降低，对照植株的株高也呈现随之降低的趋势，但转基因玉米HiII-AtAAP1-1的株高下降幅度相对较小。在回交群体BC2中，阳性植株的株高在三种氮肥梯度下均显著高于阴性植株。
2、叶绿素SPAD值
中间试验阶段检测了连续3代(T4、T5、T6)和BC2的抽雄期植株棒三叶的叶绿素SPAD值，具体检测步骤如下：使用KONICA MINOLTA生产的SPAD-502Plus叶绿素仪检测植株苗期、拔节期、抽雄开花期及成熟期的叶绿素SPAD值。每小区选取3株长势相同的植株，苗期和拔节期测量最后一片全展叶的SPAD值，抽雄开花期和成熟期测量穗位叶的SPAD值，每个叶片取3个点测量，最终计算平均值。
结果如图3所示。结果表明：T4代HiII-AtAAP1-1的叶绿素SPAD低于对照植株，但无显著差异；T5代HiII-AtAAP1-1在不同氮素条件下的叶绿素含量和对照相比均处于较高水平，尤其在低氮条件下，HiII-AtAAP1-1植株的叶绿素SPAD值较对照材料高10.08％；T6代HiII-AtAAP1-1植株的叶绿素SPAD值的趋势与T5代基本相同，不同氮素水平下HiII-AtAAP1-1的叶绿素含量均处于较高水平，低氮条件下，HiII-AtAAP1-1的叶绿素SPAD值为60.46，显著高于对照材料。在回交群体BC2中，在低氮条件下，阳性植株的叶绿素SPAD值显著高于阴性植株。
3、全氮含量
中间试验阶段检测了T4代转基因玉米HiII-AtAAP1-1在不同氮素水平下的植株全氮含量。具体检测步骤如下：将成熟期的植株烘至恒重，磨碎至粉末状，称取0.3g，置于100mL消化管中，加入浓硫酸5mL，轻轻摇匀，在消化炉上缓缓加热，待消化管口有白烟产生时滴10滴浓度为300g/L的H2O2，直至消煮液呈现无色或清亮色后，再加热5～10min，以除净过剩的H2O2。取出消化管，过滤定容至100mL。此时的过滤液用凯氏定氮仪测定植株全氮含量，并计算植株的总氮量。全氮含量(％)＝C(v-v0)×0.014×100/(m×v2÷v1)，其中：C—酸标准溶液浓度(mol/L)；V—滴定式样所用的酸标准液(ml)；V0—滴定空白所用的酸标准液(ml)；0.014—N的毫摩尔质量(g/mmol)；m—称样量(g)；V1—消煮液定容体积(ml)；V2—吸取测定的消煮液体积(ml)。总氮量＝植株氮含量(％)×总干重(g)。
结果如图4所示。结果表明：HiII-AtAAP1-1在不同氮素水平下植株全氮含量相对稳定，而对照材料的全氮含量则随着土壤氮素含量的下降显现出下降的趋势。低氮条件下，HiII-AtAAP1-1的全氮含量为25.87g/kg，而对照植株的全氮含量仅为18.79g/kg，显著低于转基因玉米HiII-AtAAP1-1。说明HiII-AtAAP1-1玉米在土壤低氮条件下仍然可以保证吸收足够的氮素，以供植株正常生长。
4、产量
将T6代转基因玉米HiII-AtAAP1-1与郑58杂交，将得到的F1代植株和非转基因材料HiII进行了产量测定。具体测定方法如下：每小区取中间两行全部收获并脱粒，测定籽粒重及含水量，以此计算含水量为14％时的籽粒重，并计算亩产。
结果如表2所示。结果表明：转基因玉米HiII-AtAAP1-1在三个氮素梯度下的穗行数均显著高于对照HiII。另外，阳性植株的产量在不同氮素条件下均高于对照，在低氮条件下表现尤为突出，阳性植株的产量较对照材料高23.33％。
表2、F1代HiII-AtAAP1-1的产量分析
Figure BDA0001902202450000081
其中，HN水平为正常施氮水平，即38kg/亩，MN水平为HN的50％，LN水平为不施氮肥。
另外，对BC2群体进行了产量测定，结果如图5和图6所示。结果表明：在低氮和中氮水平下，阳性植株的产量均高于阴性植株，在高氮水平下，阳性植株和阴性植株的产量相当(图5)。另外，在中氮水平下，阳性植株的百粒重显著高于阴性植株，比阴性植株高27.04％(图6)。
以上结果表明：转基因玉米HiII-AtAAP1-1的株高、叶绿素SPAD值、植株地上部全氮含量以及产量与对照材料相比，尤其是在低氮条件下具有提高的趋势，而且在不同的世代表型稳定，说明HiII-AtAAP1-1玉米具有较高的养分利用效率且能稳定遗传，有望培育出养分利用效率高、综合性状优良的突破性转基因玉米新品种。
5、目的基因bar的性状鉴定
对转基因玉米HiII-AtAAP1-1在不同世代的耐草铵膦能力进行了评估。具体评估方法如下：在6-8叶期时分别对转基因玉米HiII-AtAAP1-1及其对照喷施4倍浓度的草铵膦除草剂，统计转基因玉米HiII-AtAAP1-1及对照的死亡率。
结果如表3和图7所示。结果表明：不同世代的转基因玉米HiII-AtAAP1-1的耐草铵膦能力显著高于对照材料，而且能力稳定，说明转基因玉米中bar基因目标性状表现稳定。
表3、不同世代转基因玉米耐草铵膦能力试验
玉米材料 <![CDATA[T<sub>4</sub>代]]> <![CDATA[T<sub>5</sub>代]]> <![CDATA[T<sub>6</sub>代]]>
HiII-AtAAP1-1 没有明显药害 没有明显药害 没有明显药害
对照 全部死亡 全部死亡 全部死亡
三、转化事件HiII-AtAAP1-1的拷贝数分析及侧翼序列
1、目的基因AtAAP1的Southern杂交
(1)用CTAB法提取玉米基因组DNA，用AtAAP1基因内部引物扩增基因组DNA，将扩增得到的PCR产物(大小为461bp)制成AtAAP1探针。AtAAP1基因引物如下：
Fragment-AtAAP1-F：TTGCCGATTGCTACCGTGC(SEQ ID NO.17)；
Fragment-AtAAP1-R：CTGTGCCCGTCATACTCGTCT(SEQ ID NO.18)。
(2)将阳性植株DNA分别用限制性内切酶Hind III、Sac I和Kpn I进行酶切，酶切后的DNA经过乙醇沉淀后用ddH2O溶解，30V电压电泳过夜。
(3)琼脂糖凝胶用变性液处理45min，中和液处理60min后，采用向上毛细管转移法进行过夜转膜。转印后的膜在121℃条件下对DNA进行固定30min。
(4)AtAAP1探针在沸水中变性5min后立即置于冰水混合物中。
(5)42℃预杂交30min后加入步骤(4)制备的AtAAP1探针，杂交过夜。
(6)洗膜后观察条带，确定拷贝数。
2、目的基因bar的Southern杂交
(1)用CTAB法提取玉米基因组DNA，用bar基因内部引物扩增基因组DNA，将扩增得到的PCR产物(大小为480bp)制成bar探针。bar基因引物如下：
Fragment-bar-F：GCAAATCTCGGTGACGGG(SEQ ID NO.19)；
Fragment-bar-R：ATGAGCCCAGAACGACGC(SEQ ID NO.20)。
(2)将阳性植株DNA分别用限制性内切酶Hind III和Sac I进行酶切，酶切后的DNA经过乙醇沉淀后用ddH2O溶解，30V电压电泳过夜。
(3)琼脂糖凝胶用变性液处理45min，中和液处理60min后，采用向上毛细管转移法进行过夜转膜。转印后的膜在121℃条件下对DNA进行固定30min。
(4)bar探针在沸水中变性5min后立即置于冰水混合物中。
(5)42℃预杂交30min后加入步骤(4)制备的bar探针，杂交过夜。
(6)洗膜后观察条带，确定拷贝数。
结果如图8和图9所示。根据目的基因AtAAP1和bar的Southern杂交结果，推测出转基因玉米HiII-AtAAP1-1中T-DNA区的插入拷贝数为2，而且两个T-DNA区是以“头碰头”的形式插入到玉米基因组中(图10)。在此基础上预测的杂交片段的大小跟Southern杂交结果中的片段大小一致(图10，表4)。
表4、转化体限制性内切酶酶切片段与不同探针的杂交片段大小预测
Figure BDA0001902202450000101
根据重测序分析，转基因玉米HiII-AtAAP1-1的T-DNA区插入位点在玉米第10条染色体上的非编码序列区域，对基因编码区无影响，没有破坏玉米基因组行驶正常的生物功能(图11)。除了左侧的右边界序列减少了44个碱基(包括右侧识别序列RB)，右侧的右边界序列减少了45个碱基之外，HiII-AtAAP1-1的其余的插入片段与pCAM-UPN-AAP1质粒中的T-DNA相应片段是完全吻合的。边界序列出现少量碱基的缺失或增加是农杆菌介导植物遗传转化中的正常现象，对玉米基因组和插入表达盒的功能无影响。
结合Southern杂交和T-DNA区插入玉米基因组的全长DNA序列以及插入位点的两端边界序列的分析结果得出：转基因玉米HiII-AtAAP1-1中T-DNA区的插入拷贝数为2，两个T-DNA区以“头碰头”的形式插入到玉米基因组中，而且在不同世代间遗传稳定。
本发明的转基因玉米HiII-AtAAP1-1为将SEQ ID NO.5所示的外源DNA片段插入目的玉米基因组第10号染色体的92016364-92016366位间，替换掉第10号染色体的第92016364-92016366位间1bp的碱基序列后得到的转基因玉米。且自第92016364位上游且紧邻第92016364位核苷酸的上游侧翼片段的核苷酸序列(左侧翼序列)如SEQ ID NO.1所示，自第92016366位下游且紧邻第92016366位核苷酸的下游侧翼片段的核苷酸序列(右侧翼序列)如SEQ ID NO.2所示。
实施例2、转化事件HiII-AtAAP1-1的遗传稳定性检测
一、PCR检测
种植转基因玉米HiII-AtAAP1-1的T4代、T5代和T6代材料和非转基因玉米受体材料HiII，并在目的基因AtAAP1和bar序列上设计特异性引物(扩增片段的名称分别为Fragment-AtAAP1和Fragment-bar)，用外源基因的特异性PCR分析目的基因的遗传稳定性。HiII-AtAAP1-1和受体材料HiII生长到5～6叶期时，提取植株的叶片基因组DNA进行PCR扩增。设计的引物序列如表5所示。
表5、引物序列
片段名称 上游引物序列 下游引物序列 产物大小
Fragment-AtAAP1 TCCCAAATTTCCACAAGCTC AATAAGGTGGACAGCGATGC 461bp
Fragment-bar AAACCCACGTCATGCCAGTT GCACCATCGTCAACCACTACAT 480bp
PCR反应结束后，制作1％的琼脂糖凝胶，将PCR产物点样电泳25min，用凝胶成像系统观察结果并拍照。结果如图12所示。
结果表明，转基因玉米HiII-AtAAP1-1连续三代的PCR检测结果与质粒阳性对照一致，而阴性对照HiII中没有扩增条带。证明外源基因AtAAP1和bar已整合到玉米基因组中，而且能够稳定遗传。
在Ubi启动子序列和玉米基因组序列上设计特异性引物PR1和PR2进行转化体的特异性PCR检测。设计的引物序列如表6所示。PCR反应体系如表7所示，PCR反应条件如表8所示。
表6、引物序列
Figure BDA0001902202450000111
表7、PCR反应体系
组分 用量
<![CDATA[10×PCR Buffer(with MgCl<sub>2</sub>)]]> 1ul
dNTP(2.5mM) 0.2ul
Left primer(10uM) 0.2ul
Right primer(10uM) 0.2ul
Taq polymerase(5U/ul) 0.1ul
DNA(50ng/ul) 1ul
<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]> 7.3ul
Total 10ul
表8、PCR反应条件
Figure BDA0001902202450000112
结果如图13所示。结果表明：转基因玉米HiII-AtAAP1-1连续三代均扩增出目的条带，而阴性对照HiII和转化体HiII-AtAAP1-2中没有扩增条带。说明外源基因已整合到玉米基因组并能够稳定遗传，而且引物PR1和PR2作为玉米转化体HiII-AtAAP1-1的特异性引物，可用来特异性地鉴定转化体HiII-AtAAP1-1。
二、HiII-AtAAP1-1插入序列世代表达稳定性的RT-PCR分析
取连续三代(T4、T5、T6)的转基因玉米HiII-AtAAP1-1在不同时期(苗期、拔节期、抽雄期和成熟期)的不同组织器官(根、茎、叶、花丝、雄穗和籽粒)的样品，分别提取总RNA。经反转录以RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的片段。
结果如图14和图15所示。结果表明：目的基因AtAAP1和bar在不同组织器官(根、茎、叶、花丝、雄穗和籽粒)均有表达，而且在不同世代间表达稳定。
三、HiII-AtAAP1-1插入序列世代表达稳定性的Real-time PCR分析
为了分析HiII-AtAAP1-1插入序列中目的基因AtAAP1和bar的表达量和不同世代的稳定性，分别在苗期、拔节期、抽雄期和成熟期取HiII-AtAAP1-1玉米不同世代(T4、T5、T6)和阴性对照HiII植株的不同组织(根、茎、叶、花丝、雄穗、籽粒和苞叶)进行Real-time PCR分析。引物序列如表9所示。
表9、引物序列
基因名称 上游引物序列 下游引物序列 产物大小
AtAAP1 TTGGAATCGGTCTAGCCATC GAGAACCGTGGCATAAGCAT 164bp
bar AGTCGACCGTGTACGTCTCC GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 242bp
GAPDH ATCAACGGCTTCGGAAGGAT CCGTGGACGGTGTCGTACTT 293bp
Real-time PCR的检测方法如下：
1)使用天根公司提供的植物总RNA提取试剂盒提取样品的总RNA。
2)以RNA为模板，反转录获得cDNA。
3)设计特异性的引物(产物大小介于150～200bp之间)，然后做标准曲线进行PCR扩增效率的验证，斜率值一般要求在0.9以上。
4)采用非特异性SYBR Green I染料法进行Real-time PCR。
5)采用2-△△Ct方法进行Real-time PCR数据处理。结果如图16、图17、表10和表11所示。
表10、AtAAP1基因在连续三代中各个组织器官和各个时期的相对表达量
Figure BDA0001902202450000121
表11、bar基因在连续三代中各个组织器官和各个时期的相对表达量
Figure BDA0001902202450000122
Figure BDA0001902202450000131
实施例3、氮高效耐草铵膦玉米品种培育
1、以转化事件HiII-AtAAP1-1的T6代自交系为供体亲本，以玉米自交系郑58为受体亲本进行一次杂交，得到杂交子代，将杂交子代与郑58回交，在回交过程中使用草铵膦清除每代中不含有HiII-AtAAP1-1转基因复合结构的分离株系，连续回交6次，得到BC6代株系。
2、从BC6代株系叶片组织中提取DNA，采用实施例2中的玉米转化事件HiII-AtAAP1-1特异性PCR鉴定的引物PR1和PR2进行PCR扩增，扩增出外源插入基因及其侧翼的DNA片段，并对其进行测序验证。经测序分析证实，与供体亲本的转基因结构序列一致，说明HiII-AtAAP1-1转化事件稳定转育到新的受体材料中。
3、以BC6代株系为母本，以昌7-2为父本进行杂交，得到杂交种，采用实施例2中的玉米转化事件HiII-AtAAP1-1特异性PCR鉴定的引物PR1和PR2对该杂交种进行外源插入基因及其侧翼DNA序列进行分析和测序。结果显示：该杂交种含有转化事件HiII-AtAAP1-1。
4、对步骤3获得的杂交种进行田间抗性试验。苗期喷施0.18％浓度的草铵膦，统计死亡株数及存活指数，计算杂交种的死亡率，以此反映其耐除草剂草铵膦的能力。收获后取植株地上部，利用凯氏定氮法测定植株含氮量，以此反映杂交种的氮素吸收利用能力。结果显示，该杂交种具有良好的氮素吸收利用能力及耐除草剂草铵膦的能力。
序列表
<110>郝东云
<120>玉米转化事件HiII-AtAAP1-1及其特异性鉴定方法与应用
<160>20
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>418
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>1
catggaagcg tttgtactcc agcgaggatt tcagttgtca ttgaagcctc ccgtgcccaa 60
taaccctcac gcgccaaccc cacggccact agcgaagacc attagccata tcccggatgt 120
cgatcggtgt ggggcgcgag ttatggtggc ggcggatcca ttagcccaca tcttccacac 180
gacggtggta gccggggtcc caggttaccg acgcaaggtg gatgtgaggg aagggttagc 240
ggtgcacgag atttatatcc ccctgaccac gagcccagcc gaattttgtt gcagcaattt 300
aggagaaaac tcagcgaccg ttttggtgtt ctgttcgcta cggtggtgct cggattcgga 360
gcatgaagaa gggtctggcg tcttgtcccc acctgacagt ggccgtcatg agcacacc 418
<210>2
<211>1172
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>2
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gggcctgaca tgtcgggcct gacatgtcgg gcccacgtgt cggtgccacg ggattcgggt 120
gcgctgaacc gggagaggct gacatgccgg gcccacatgt cagcgtcggc gcatgaaagg 180
ctggcgggtt aagttgggcc ttggcgtgac tctaggccga ggtggaggct cgcacaggtg 240
tgatcgagcg ggcctgtttg gtgaagtcgg cctaggttga ggaagactgt tttttgtttt 300
tctttggttc atccctattt ctccttcttt tctcctttca acttcaaatt caaattttga 360
atcccaaatt atatttgact tgagatctag aatctagtta aatacacaat caaagaaata 420
ctcagcatga tacatatttc tatttattta tatcaatact tttatatgca cattttatac 480
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gagaataatt ataaatatat attttaacaa agggatagct aaaatcatat agggcaattt 600
attaaatctt tattagaaac tatatttgtt ttaggagatg ttagtttcaa gaataagata 660
aggatcatta aatgatataa aaaatatttg gagaacattt cttagttttc aaaataggat 720
tttaggtgct acataatcag attctggaag acatgttgag agcctgtgca ttgcaagata 780
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<211>1458
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<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>3
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aatttttagt cactttattt tattctattt tatatctaaa ttattaaata aaaaaactaa 10800
aatagagttt tagttttctt aatttagagg ctaaaataga ataaaataga tgtactaaaa 10860
aaattagtct ataaaaacca ttaaccctaa accctaaatg gatgtactaa taaaatggat 10920
gaagtattat ataggtgaag ctatttgcaa aaaaaaagga gaacacatgc acactaaaaa 10980
gataaaactg tagagtcctg ttgtcaaaat actcaattgt cctttagacc atgtctaact 11040
gttcatttat atgattctct aaaacactga tattattgta gtactataga ttatattatt 11100
cgtagagtaa agtttaaata tatgtataaa gatagataaa ctgcacttca aacaagtgtg 11160
acaaaaaaaa tatgtggtaa ttttttataa cttagacatg caatgctcat tatctctaga 11220
gaggggcacg accgggtcac gctgcactgc aggcatgcaa gcttggcact ggccgtcgtt 11280
ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat 11340
ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag 11400
ttgcgcagcc tgaatggcga atgctagagc agcttgagct tggatcagat tgtcgtttcc 11460
cgccttcagt ttaaactatc agtgttgagt ggaagagagg ctggccaaat gggcccacaa 11520
gtcggcgccc acccccacgt catgtcgggc ctgacatgtc gggcctgaca tgtcgggccc 11580
acgtgtcggt gccacgggat tcgggtgcgc tgaaccggga gaggctgaca tgccgggccc 11640
acatgtcagc gtcggcgcat gaaaggctgg cgggttaagt tgggccttgg cgtgactcta 11700
ggccgaggtg gaggctcgca caggtgtgat cgagcgggcc tgtttggtga agtcggccta 11760
ggttgaggaa gactgttttt tgtttttctt tggttcatcc ctatttctcc ttcttttctc 11820
ctttcaactt caaattcaaa ttttgaatcc caaattatat ttgacttgag atctagaatc 11880
tagttaaata cacaatcaaa gaaatactca gcatgataca tatttctatt tatttatatc 11940
aatactttta tatgcacatt ttatacacac taaaatagag aagaggtatt ttaagtaata 12000
taatttctag tttataaaat tctttagaga ataattataa atatatattt taacaaaggg 12060
atagctaaaa tcatataggg caatttatta aatctttatt agaaactata tttgttttag 12120
gagatgttag tttcaagaat aagataagga tcattaaatg atataaaaaa tatttggaga 12180
acatttctta gttttcaaaa taggatttta ggtgctacat aatcagattc tggaagacat 12240
gttgagagcc tgtgcattgc aagataagtc aggttagaat aagaaattac cttatgcaga 12300
attctcctat aacaatagcc atcaggccaa tttgaagatg tcgccgtttt aggcactgta 12360
cagaaggagt tgtagaactc cactgctctg gatcagcctg gagaaaggca ggtgtttggt 12420
cccgacattt tgctcgaagc cgaagagaac atcaaagtag tctgagagaa tctaaagata 12480
gcacagtcaa ggtaacgcag ttatggtgac acaagaagaa aagaactgag ttttgaagtg 12540
ggagattatg tctatctgaa ggtgtcacct atcagatgag tcagaaggtt cggagtcaag 12600
ggcaacttag caccacgata tatcggaccg taccagattc tggcaaggcg tggagaag 12658
<210>6
<211>1995
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>6
ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt cgtgcccctc tctagagata atgagcattg 60
catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag 120
tttatctatc tttatacata tatttaaact ttactctacg aataatataa tctatagtac 180
tacaataata tcagtgtttt agagaatcat ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg 240
acaattgagt attttgacaa caggactcta cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc 300
tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat ataatacttc atccatttta ttagtacatc 360
catttagggt ttagggttaa tggtttttat agactaattt ttttagtaca tctattttat 420
tctattttag cctctaaatt aagaaaacta aaactctatt ttagtttttt tatttaataa 480
tttagatata aaatagaata aaataaagtg actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa 540
attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac 600
gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc 660
gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc 720
accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga 780
gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct 840
ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc gcccgccgta ataaatagac accccctcca 900
caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg gagcgcacac acacacaacc agatctcccc 960
caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa ggtacgccgc tcgtcctccc cccccccccc 1020
tctctacctt ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct 1080
gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg 1140
gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg 1200
aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt 1260
cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt 1320
gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc 1380
ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg 1440
gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat 1500
atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc 1560
tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga 1620
tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg 1680
tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag 1740
gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat 1800
tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat 1860
tttgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc 1920
cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt 1980
tgtttggtgt tactt 1995
<210>7
<211>270
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>7
gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc 60
cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa 120
catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata 180
catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc 240
ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt 270
<210>8
<211>485
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>8
Met Lys Ser Phe Asn Thr Glu Gly His Asn His Ser Thr Ala Glu Ser
1               5                   10                  15
Gly Asp Ala Tyr Thr Val Ser Asp Pro Thr Lys Asn Val Asp Glu Asp
            20                  25                  30
Gly Arg Glu Lys Arg Thr Gly Thr Trp Leu Thr Ala Ser Ala His Ile
        35                  40                  45
Ile Thr Ala Val Ile Gly Ser Gly Val Leu Ser Leu Ala Trp Ala Ile
    50                  55                  60
Ala Gln Leu Gly Trp Ile Ala Gly Thr Ser Ile Leu Leu Ile Phe Ser
65                  70                  75                  80
Phe Ile Thr Tyr Phe Thr Ser Thr Met Leu Ala Asp Cys Tyr Arg Ala
                85                  90                  95
Pro Asp Pro Val Thr Gly Lys Arg Asn Tyr Thr Tyr Met Asp Val Val
            100                 105                 110
Arg Ser Tyr Leu Gly Gly Arg Lys Val Gln Leu Cys Gly Val Ala Gln
        115                 120                 125
Tyr Gly Asn Leu Ile Gly Val Thr Val Gly Tyr Thr Ile Thr Ala Ser
    130                 135                 140
Ile Ser Leu Val Ala Val Gly Lys Ser Asn Cys Phe His Asp Lys Gly
145                 150                 155                 160
His Thr Ala Asp Cys Thr Ile Ser Asn Tyr Pro Tyr Met Ala Val Phe
                165                 170                 175
Gly Ile Ile Gln Val Ile Leu Ser Gln Ile Pro Asn Phe His Lys Leu
            180                 185                 190
Ser Phe Leu Ser Ile Met Ala Ala Val Met Ser Phe Thr Tyr Ala Thr
        195                 200                 205
Ile Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Thr Val Ala Gly Gly Lys Val Gly
    210                 215                 220
Lys Thr Ser Met Thr Gly Thr Ala Val Gly Val Asp Val Thr Ala Ala
225                 230                 235                 240
Gln Lys Ile Trp Arg Ser Phe Gln Ala Val Gly Asp Ile Ala Phe Ala
                245                 250                 255
Tyr Ala Tyr Ala Thr Val Leu Ile Glu Ile Gln Asp Thr Leu Arg Ser
            260                 265                 270
Ser Pro Ala Glu Asn Lys Ala Met Lys Arg Ala Ser Leu Val Gly Val
        275                 280                 285
Ser Thr Thr Thr Phe Phe Tyr Ile Leu Cys Gly Cys Ile Gly Tyr Ala
    290                 295                 300
Ala Phe Gly Asn Asn Ala Pro Gly Asp Phe Leu Thr Asp Phe Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Glu Pro Phe Trp Leu Ile Asp Phe Ala Asn Ala Cys Ile Ala Val
                325                 330                 335
His Leu Ile Gly Ala Tyr Gln Val Phe Ala Gln Pro Ile Phe Gln Phe
            340                 345                 350
Val Glu Lys Lys Cys Asn Arg Asn Tyr Pro Asp Asn Lys Phe Ile Thr
        355                 360                 365
Ser Glu Tyr Ser Val Asn Val Pro Phe Leu Gly Lys Phe Asn Ile Ser
    370                 375                 380
Leu Phe Arg Leu Val Trp Arg Thr Ala Tyr Val Val Ile Thr Thr Val
385                 390                 395                 400
Val Ala Met Ile Phe Pro Phe Phe Asn Ala Ile Leu Gly Leu Ile Gly
                405                 410                 415
Ala Ala Ser Phe Trp Pro Leu Thr Val Tyr Phe Pro Val Glu Met His
            420                 425                 430
Ile Ala Gln Thr Lys Ile Lys Lys Tyr Ser Ala Arg Trp Ile Ala Leu
        435                 440                 445
Lys Thr Met Cys Tyr Val Cys Leu Ile Val Ser Leu Leu Ala Ala Ala
    450                 455                 460
Gly Ser Ile Ala Gly Leu Ile Ser Ser Val Lys Thr Tyr Lys Pro Phe
465                 470                 475                 480
Arg Thr Met His Glu
                485
<210>9
<211>482
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>9
gcgtattggc tagagcagct tgccaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag 60
aatatcaaag atacagtctc agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta 120
atatcgggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca 180
gtagaaaagg aaggtggcac ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt 240
caagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg 300
gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact 360
gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga 420
agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct 480
ct 482
<210>10
<211>148
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>10
gtatttgtaa aatacttcta tcaataaaat ttctaattcc taaaaccaaa atccagtact 60
aaaatccaga tcccccgaat taattcggcg ttaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat 120
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatt 148
<210>11
<211>183
<212>PRT
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>11
Met Ser Pro Glu Arg Arg Pro Ala Asp Ile Arg Arg Ala Thr Glu Ala
1               5                   10                  15
Asp Met Pro Ala Val Cys Thr Ile Val Asn His Tyr Ile Glu Thr Ser
            20                  25                  30
Thr Val Asn Phe Arg Thr Glu Pro Gln Glu Pro Gln Glu Trp Thr Asp
        35                  40                  45
Asp Leu Val Arg Leu Arg Glu Arg Tyr Pro Trp Leu Val Ala Glu Val
    50                  55                  60
Asp Gly Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Ala Gly Pro Trp Lys Ala Arg
65                  70                  75                  80
Asn Ala Tyr Asp Trp Thr Ala Glu Ser Thr Val Tyr Val Ser Pro Arg
                85                  90                  95
His Gln Arg Thr Gly Leu Gly Ser Thr Leu Tyr Thr His Leu Leu Lys
            100                 105                 110
Ser Leu Glu Ala Gln Gly Phe Lys Ser Val Val Ala Val Ile Gly Leu
        115                 120                 125
Pro Asn Asp Pro Ser Val Arg Met His Glu Ala Leu Gly Tyr Ala Pro
    130                 135                 140
Arg Gly Met Leu Arg Ala Ala Gly Phe Lys His Gly Asn Trp His Asp
145                 150                 155                 160
Val Gly Phe Trp Gln Leu Asp Phe Ser Leu Pro Val Pro Pro Arg Pro
                165                 170                 175
Val Leu Pro Val Thr Glu Ile
            180
<210>12
<211>11807
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>12
catgccaacc acagggttcc cctcgggatc aaagtacttt gatccaaccc ctccgctgct 60
atagtgcagt cggcttctga cgttcagtgc gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 120
gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 180
ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 240
gagcgccgcc gctggcctgc tgggctatgc ccgcgtcagc accgacgacc aggacttgac 300
caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 360
cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 420
cgttgtgaca gtgaccaggc tagaccgcct ggcccgcagc acccgcgacc tactggacat 480
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caccaccacg ccggccggcc gcatggtgtt gaccgtgttc gccggcattg ccgagttcga 600
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ccaagaggaa caagcatgaa accgcaccag gacggccagg acgaaccgtt tttcattacc 960
gaagagatcg aggcggagat gatcgcggcc gggtacgtgt tcgagccgcc cgcgcacgtc 1020
tcaaccgtgc ggctgcatga aatcctggcc ggtttgtctg atgccaagct ggcggcctgg 1080
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ccgccgacct ggtggagctg gttaagcagc gcattgaggt cacggatgga aggctacaag 1620
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cgctggccgg gtacgagctg cccattcttg agtcccgtat cacgcagcgc gtgagctacc 1740
caggcactgc cgccgccggc acaaccgttc ttgaatcaga acccgagggc gacgctgccc 1800
gcgaggtcca ggcgctggcc gctgaaatta aatcaaaact catttgagtt aatgaggtaa 1860
agagaaaatg agcaaaagca caaacacgct aagtgccggc cgtccgagcg cacgcagcag 1920
caagctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 1980
ttgccggcgg aggatcacac caagctgaag atgtacgcgg tacgccaagg caagaccatt 2040
accgagctgc tatctgaata catcgcgcag ctaccagagt aaatgagcaa atgaataaat 2100
gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 2160
cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 2220
ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg 2280
gtcgcaaacc atccggcccg gtacaaatcg gcgcggcgct gggtgatgac ctggtggaga 2340
agttgaaggc cgcgcaggcc gcccagcggc aacgcatcga ggcagaagca cgccccggtg 2400
aatcgtggca agcggccgct gatcgaatcc gcaaagaatc ccggcaaccg ccggcagccg 2460
gtgcgccgtc gattaggaag ccgcccaagg gcgacgagca accagatttt ttcgttccga 2520
tgctctatga cgtgggcacc cgcgatagtc gcagcatcat ggacgtggcc gttttccgtc 2580
tgtcgaagcg tgaccgacga gctggcgagg tgatccgcta cgagcttcca gacgggcacg 2640
tagaggtttc cgcagggccg gccggcatgg ccagtgtgtg ggattacgac ctggtactga 2700
tggcggtttc ccatctaacc gaatccatga accgataccg ggaagggaag ggagacaagc 2760
ccggccgcgt gttccgtcca cacgttgcgg acgtactcaa gttctgccgg cgagccgatg 2820
gcggaaagca gaaagacgac ctggtagaaa cctgcattcg gttaaacacc acgcacgttg 2880
ccatgcagcg tacgaagaag gccaagaacg gccgcctggt gacggtatcc gagggtgaag 2940
ccttgattag ccgctacaag atcgtaaaga gcgaaaccgg gcggccggag tacatcgaga 3000
tcgagctagc tgattggatg taccgcgaga tcacagaagg caagaacccg gacgtgctga 3060
cggttcaccc cgattacttt ttgatcgatc ccggcatcgg ccgttttctc taccgcctgg 3120
cacgccgcgc cgcaggcaag gcagaagcca gatggttgtt caagacgatc tacgaacgca 3180
gtggcagcgc cggagagttc aagaagttct gtttcaccgt gcgcaagctg atcgggtcaa 3240
atgacctgcc ggagtacgat ttgaaggagg aggcggggca ggctggcccg atcctagtca 3300
tgcgctaccg caacctgatc gagggcgaag catccgccgg ttcctaatgt acggagcaga 3360
tgctagggca aattgcccta gcaggggaaa aaggtcgaaa aggtctcttt cctgtggata 3420
gcacgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gaacccgtac attgggaacc 3480
caaagccgta cattgggaac cggtcacaca tgtaagtgac tgatataaaa gagaaaaaag 3540
gcgatttttc cgcctaaaac tctttaaaac ttattaaaac tcttaaaacc cgcctggcct 3600
gtgcataact gtctggccag cgcacagccg aagagctgca aaaagcgcct acccttcggt 3660
cgctgcgctc cctacgcccc gccgcttcgc gtcggcctat cgcggccgct ggccgctcaa 3720
aaatggctgg cctacggcca ggcaatctac cagggcgcgg acaagccgcg ccgtcgccac 3780
tcgaccgccg gcgcccacat caaggcaccc tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 3840
aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 3900
agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg 3960
acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga 4020
ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat 4080
accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 4140
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 4200
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 4260
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 4320
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 4380
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 4440
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 4500
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 4560
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 4620
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 4680
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 4740
tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 4800
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4860
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4920
gttaagggat tttggtcatg cattctaggt actaaaacaa ttcatccagt aaaatataat 4980
attttatttt ctcccaatca ggcttgatcc ccagtaagtc aaaaaatagc tcgacatact 5040
gttcttcccc gatatcctcc ctgatcgacc ggacgcagaa ggcaatgtca taccacttgt 5100
ccgccctgcc gcttctccca agatcaataa agccacttac tttgccatct ttcacaaaga 5160
tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct 5220
ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc 5280
aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta 5340
agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg 5400
catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga 5460
cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga 5520
cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat 5580
cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc 5640
ccaccagctt atatacctta gcaggagaca ttccttccgt atcttttacg cagcggtatt 5700
tttcgatcag ttttttcaat tccggtgata ttctcatttt agccatttat tatttccttt 5760
cctcttttct acagtattta aagatacccc aagaagctaa ttataacaag acgaactcca 5820
attcactgtt ccttgcattc taaaacctta aataccagaa aacagctttt tcaaagttgt 5880
tttcaaagtt ggcgtataac atagtatcga cggagccgat tttgaaaccg cggtgatcac 5940
aggcagcaac gctctgtcat cgttacaatc aacatgctac cctccgcgag atcatccgtg 6000
tttcaaaccc ggcagcttag ttgccgttct tccgaatagc atcggtaaca tgagcaaagt 6060
ctgccgcctt acaacggctc tcccgctgac gccgtcccgg actgatgggc tgcctgtatc 6120
gagtggtgat tttgtgccga gctgccggtc ggggagctgt tggctggctg gtggcaggat 6180
atattgtggt gtaaacaaat tgacgcttag acaacttaat aacacattgc ggacgttttt 6240
aatgtactga attaacgccg aattaattcg ggggatctgg attttagtac tggattttgg 6300
ttttaggaat tagaaatttt attgatagaa gtattttaca aatacaaata catactaagg 6360
gtttcttata tgctcaacac atgagcgaaa ccctatagga accctaattc ccttatctgg 6420
gaactactca cacattatta tggagaaact cgagtcaaat ctcggtgacg ggcaggaccg 6480
gacggggcgg taccggcagg ctgaagtcca gctgccagaa acccacgtca tgccagttcc 6540
cgtgcttgaa gccggccgcc cgcagcatgc cgcggggggc atatccgagc gcctcgtgca 6600
tgcgcacgct cgggtcgttg ggcagcccga tgacagcgac cacgctcttg aagccctgtg 6660
cctccaggga cttcagcagg tgggtgtaga gcgtggagcc cagtcccgtc cgctggtggc 6720
ggggggagac gtacacggtc gactcggccg tccagtcgta ggcgttgcgt gccttccagg 6780
ggcccgcgta ggcgatgccg gcgacctcgc cgtccacctc ggcgacgagc cagggatagc 6840
gctcccgcag acggacgagg tcgtccgtcc actcctgcgg ttcctgcggc tcggtacgga 6900
agttgaccgt gcttgtctcg atgtagtggt tgacgatggt gcagaccgcc ggcatgtccg 6960
cctcggtggc acggcggatg tcggccgggc gtcgttctgg gctcatggta gactcgagag 7020
agatagattt gtagagagag actggtgatt tcagcgtgtc ctctccaaat gaaatgaact 7080
tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc 7140
agtggagata tcacatcaat ccacttgctt tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc 7200
cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttg 7260
aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg gcatttgtag gtgccacctt ccttttctac 7320
tgtccttttg atgaagtgac agatagctgg gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat 7380
taccctttgt tgaaaagtct caatagccct ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt 7440
cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac catgttggca agctgctcta gccaatacgc 7500
aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 7560
gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac tcattaggca 7620
ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa 7680
caatttcaca caggaaacag ctatgacatg attacgaatt cccgatctag taacatagat 7740
gacaccgcgc gcgataattt atcctagttt gcgcgctata ttttgttttc tatcgcgtat 7800
taaatgtata attgcgggac tctaatcata aaaacccatc tcataaataa cgtcatgcat 7860
tacatgttaa ttattacatg cttaacgtaa ttcaacagaa attatatgat aatcatcgca 7920
agaccggcaa caggattcaa tcttaagaaa ctttattgcc aaatgtttga acgatcgggg 7980
aaattcgagc tctcactcat gcatagtccg gaagggcttg taggttttga cactacttat 8040
aagtcctgcg atggatccgg ctgcagctaa gagcgagacg atcaagcaaa catagcacat 8100
cgttttcagc gcaatccatc tagcagagta cttcttaatc ttggtttgtg caatgtgcat 8160
ctccacaggg aaataaaccg ttaaaggcca gaaggaagct gctccgataa gacctaagat 8220
cgcgttgaag aaagggaata tcatagctac aacagtggtt ataaccacat aagctgtcct 8280
ccacaccaat ctgaagaggc taatgttgaa ttttccaagg aaaggtacgt ttactgaata 8340
ttcagaagtg atgaacttgt tgtctggata gtttctgttg cattttttct caacaaactg 8400
gaatatcggc tgcgcgaaca cctgataggc accaataagg tggacagcga tgcaagcgtt 8460
tgcaaagtca atgagccaaa agggctcgaa aaacccgaaa tctgtgagga aatctccagg 8520
ggcattgttt ccaaatgcag catagccgat gcatccacat aagatgtaga aaaaagtggt 8580
ggttgatact cccacaagac ttgctctttt catggctttg ttctcagctg ggctagatct 8640
tagtgtatcc tgaatctcga tgagaaccgt ggcataagca taggcgaacg ctatgtcccc 8700
aaccgcttga aacgatctcc atatcttttg agctgcggtt acatctactc caaccgctgt 8760
gcccgtcata ctcgtcttac ccactttccc acctgcgacg gttgcgatgg ctagaccgat 8820
tccaatagtt gcataagtaa aggacatgac cgcggccata atggaaagaa aagagagctt 8880
gtggaaattt gggatctggc taagaataac ctgaataatg ccaaaaaccg ccatatacgg 8940
ataattcgat atagtacaat ccgcagtgtg ccctttatcg tggaagcagt tcgatttccc 9000
taccgctacc aaactaatag aagcagtgat ggtgtaacca acagtgaccc caatcagatt 9060
cccatattgt gccactccac agagctgcac tttcctacca ccgaggtaag atcgaacaac 9120
gtccatgtaa gtgtaattcc gttttccggt gacgggatcc ggcgcacggt agcaatcggc 9180
aagcatggtg gaggtgaagt aagtaatgaa cgagaaaatg agtaagatcg atgtccctgc 9240
gatccaacca agctgagcta tagcccatgc taaagacaac actccggagc ctatcaccgc 9300
cgtgataata tgcgcactcg ccgtaagcca cgtcccggta cgcttctctc gaccatcttc 9360
atcgacgttc tttgtcgggt ccgacacggt gtaggcatcg ccggattccg ccgtggagtg 9420
gttgtgtcct tctgtgttga aactcttcat cccggggatc ctctagagtc gacctgcaga 9480
agtaacacca aacaacaggg tgagcatcga caaaagaaac agtaccaagc aaataaatag 9540
cgtatgaagg cagggctaaa aaaatccaca tatagctgct gcatatgcca tcatccaagt 9600
atatcaagat caaaataatt ataaaacata cttgtttatt ataatagata ggtactcaag 9660
gttagagcat atgaatagat gctgcatatg ccatcatgta tatgcatcag taaaacccac 9720
atcaacatgt atacctatcc tagatcgata tttccatcca tcttaaactc gtaactatga 9780
agatgtatga cacacacata cagttccaaa attaataaat acaccaggta gtttgaaaca 9840
gtattctact ccgatctaga acgaatgaac gaccgcccaa ccacaccaca tcatcacaac 9900
caagcgaaca aaaagcatct ctgtatatgc atcagtaaaa cccgcatcaa catgtatacc 9960
tatcctagat cgatatttcc atccatcatc ttcaattcgt aactatgaat atgtatggca 10020
cacacataca gatccaaaat taataaatcc accaggtagt ttgaaacaga attctactcc 10080
gatctagaac gaccgcccaa ccagaccaca tcatcacaac caagacaaaa aaaagcatga 10140
aaagatgacc cgacaaacaa gtgcacggca tatattgaaa taaaggaaaa gggcaaacca 10200
aaccctatgc aacgaaacaa aaaaaatcat gaaatcgatc ccgtctgcgg aacggctaga 10260
gccatcccag gattccccaa agagaaacac tggcaagtta gcaatcagaa cgtgtctgac 10320
gtacaggtcg catccgtgta cgaacgctag cagcacggat ctaacacaaa cacggatcta 10380
acacaaacat gaacagaagt agaactaccg ggccctaacc atggaccgga acgccgatct 10440
agagaaggta gagagggggg gggggggagg acgagcggcg taccttgaag cggaggtgcc 10500
gacgggtgga tttgggggag atctggttgt gtgtgtgtgc gctccgaaca acacgaggtt 10560
ggggaaagag ggtgtggagg gggtgtctat ttattacggc gggcgaggaa gggaaagcga 10620
aggagcggtg ggaaaggaat cccccgtagc tgccggtgcc gtgagaggag gaggaggccg 10680
cctgccgtgc cggctcacgt ctgccgctcc gccacgcaat ttctggatgc cgacagcgga 10740
gcaagtccaa cggtggagcg gaactctcga gaggggtcca gaggcagcga cagagatgcc 10800
gtgccgtctg cttcgcttgg cccgacgcga cgctgctggt tcgctggttg gtgtccgtta 10860
gactcgtcga cggcgtttaa caggctggca ttatctactc gaaacaagaa aaatgtttcc 10920
ttagtttttt taatttctta aagggtattt gtttaatttt tagtcacttt attttattct 10980
attttatatc taaattatta aataaaaaaa ctaaaataga gttttagttt tcttaattta 11040
gaggctaaaa tagaataaaa tagatgtact aaaaaaatta gtctataaaa accattaacc 11100
ctaaacccta aatggatgta ctaataaaat ggatgaagta ttatataggt gaagctattt 11160
gcaaaaaaaa aggagaacac atgcacacta aaaagataaa actgtagagt cctgttgtca 11220
aaatactcaa ttgtccttta gaccatgtct aactgttcat ttatatgatt ctctaaaaca 11280
ctgatattat tgtagtacta tagattatat tattcgtaga gtaaagttta aatatatgta 11340
taaagataga taaactgcac ttcaaacaag tgtgacaaaa aaaatatgtg gtaatttttt 11400
ataacttaga catgcaatgc tcattatctc tagagagggg cacgaccggg tcacgctgca 11460
ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 11520
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 11580
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta 11640
gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt 11700
tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataatcggat 11760
atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtg 11807
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>13
cattaccatg gatcgtgcag 20
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>14
aacgtcgtga ctgggaaaac 20
<210>15
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>15
catgctgagt atttctttga ttgtg 25
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>16
aacgtcgtga ctgggaaaac 20
<210>17
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>17
tcccaaattt ccacaagctc 20
<210>18
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>18
aataaggtgg acagcgatgc 20
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>19
aaacccacgt catgccagtt 20
<210>20
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列(Artificial Sequence)
<400>20
gcaccatcgt caaccactac at 22

Claims (2)

1.用于检测或辅助检测待测植物样品是否为转基因玉米或其后代的方法，包括如下步骤：检测所述待测植物样品的基因组DNA中是否含有DNA片段A，
所述DNA片段A依次由左侧翼序列、外源DNA片段和右侧翼序列组成；
若所述待测植物样品的基因组DNA含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；
若所述待测植物样品的基因组DNA不含有所述DNA片段A，则所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述左侧翼序列如SEQ ID NO.1所示；
所述右侧翼序列如SEQ ID NO.2所示；
所述转基因玉米是通过包括如下步骤的方法培养获得的：
将目的玉米基因组第10号染色体的第92016364-92016366位之间的碱基替换为外源DNA片段，得到转基因玉米；其中，所述目的玉米为玉米HiII；
所述外源DNA片段含有氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒和耐草铵膦基因bar表达盒；
所述转基因玉米的氮肥利用效率高于所述目的玉米和/或所述转基因玉米的耐草铵膦的能力高于所述目的玉米；
所述外源DNA片段依次由所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒、所述耐草铵膦基因bar表达盒和所述氨基酸通透酶基因AtAAP1表达盒组成；
所述外源DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述转基因玉米的氮肥利用效率高于所述目的玉米体现在如下B1)-B4)中任一种：
B1)所述转基因玉米的株高高于所述目的玉米；
B2)所述转基因玉米的叶绿素含量高于所述目的玉米；
B3)所述转基因玉米的全氮含量和/或总氮量高于所述目的玉米；
B4)所述转基因玉米的产量和/或百粒重高于所述目的玉米。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法为如下1)或2)或3)：
1)直接测序；
2)用引物对甲和/或引物对乙对待测植物样品的基因组DNA进行PCR扩增，检测扩增产物大小，若引物对甲扩增得到大小为673bp的条带和/或引物对乙扩增得到大小为631bp的条带，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述引物对甲由SEQ ID NO.13所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.14所示的单链DNA分子组成；
所述引物对乙由SEQ ID NO.15所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.16所示的单链DNA分子组成；
3)用探针甲和/或探针乙对所述待测植物样品的基因组DNA进行Southern杂交，若能杂交得到杂交片段，则所述待测植物样品为或候选为所述转基因玉米或其后代；否则，所述待测植物样品不为或候选不为所述转基因玉米或其后代；
所述探针甲为以玉米基因组DNA为模板，采用由SEQ ID NO.17所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.18所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段；
所述探针乙为以玉米基因组DNA为模板，采用由SEQ ID NO.19所示的单链DNA分子和SEQ ID NO.20所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增得到的DNA片段。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110195122A (zh) * 2019-01-02 2019-09-03 四川省农业科学院生物技术核技术研究所 一种用于检测玉米植物t抗-4的核酸序列及其检测方法
CN112280786B (zh) * 2020-11-09 2022-12-02 大连理工大学 一种养分高效利用耐除草剂玉米连hh2823转化事件及其特异性鉴定方法和应用
CN112616649B (zh) * 2020-12-14 2022-03-01 四川省农业科学院作物研究所 一种氮高效利用转基因玉米自交系快速培育方法
CN112795693B (zh) * 2021-03-24 2022-02-18 湖南农业大学 与玉米叶片叶绿素含量相关的分子标记及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI0707413A2 (pt) * 2006-02-09 2011-05-03 Pioneer Hi Bred Int genes para aprimoramento da eficiência de utilização do nitrogênio em culturas
BRPI0907786B1 (pt) * 2008-02-20 2021-06-01 Ceres, Inc. Método de produção de uma planta e método de aumentar o nível de tolerância a baixo teor de nitrogênio em uma planta
US20120005773A1 (en) * 2008-10-01 2012-01-05 Aasen Eric D Transgenic plants with enhanced agronomic traits
CN103205458B (zh) * 2013-03-31 2014-09-17 吉林省农业科学院 一种适合单子叶植物转化的中间表达载体及其构建方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
张传海等.转化体的筛选和鉴定.《植物生物技术》.2015, *
米国华等.次级筛选指标.《作物养分高效的生理基础与遗传改良》.北京：中国农业大学出版社,2012, *
郑振宇等.侧翼序列分析.《基因工程》.2015, *

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