CN116426538B - 一种控制种子休眠和萌发的蛋白erf4以及编码基因的应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种控制种子休眠和萌发的蛋白ERF4以及编码基因的应用。本申请首次发现ERF4蛋白具有促进种子休眠，抑制种子萌发的功能；ERF4的转基因应用可以提高作物种子休眠，防止穗发芽，适用于农业生产。
Description
技术领域
本申请涉及一种控制种子休眠和萌发的蛋白ERF4以及编码基因的应用，属于分子生物学技术领域。
背景技术
种子休眠是种子植物长期进化出来的一种适应性性状。种子的萌发时间关系着植物个体接下来的生长环境，甚至个体的生死存亡；萌发过早可能遭遇不利气候条件，面临严酷的生长环境，轻则生长不良，重则直接死亡；但如果休眠过强，萌发过晚，则可能遭受虫、鸟的直接吞食毁坏，或者错过最佳萌发阶段，缩短生育期，影响后续生长发育。因此，在农业生产上，一直有这样的两方面需求：一方面要保证播种期的种子萌发齐、萌发快；另一方面，要维持正常生长条件下种子适度的休眠性能，减少穗发芽、存储期发芽，降低过早发芽对种子品质所带来的不良影响。
关于植物休眠，科研工作者已做了大量的研究工作。以脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)为主要代表的植物激素在种子休眠中发挥着重要作用，然而这些激素同时也调控了其他农艺性状(如抗逆,根茎生长等)，故而，这些激素通路相关基因并不适宜作为农业生产中调控种子休眠的具体靶标。另有部分工作的研究重点为生长逆境所诱导的次生休眠，或者是非种子组织(如芽，块茎)的休眠。这些研究都还不能为农业生产中“如何控制种子在正常生长条件下的休眠强度”带来具体的指导作用，因此需要寻找更加特异控制种子休眠的基因。
乙烯响应因子(ERF)是植物AP2/ERF转录因子超家族成员。ERF家族成员较多，在拟南芥和水稻中分别包含122和139个成员，这些成员功能各异，有的功能甚至完全相反。例如，ERF4所属的VIII亚类是唯一包含EAR结构域的亚类，EAR结构域的存在使得ERF转录因子对下游基因发挥转录抑制作用，这是其他亚类所不具备的功能。VIII亚类主要包含ERF3、ERF4、ERF7、ERF8、ERF9、ERF10、ERF11、ERF12等。其中,ERF4只与ERF8仅仅在亲缘关系上相对更近些，功能的相似性并不确定。另外，与其他的ERF成员不同，ERF4主要在种子中发挥作用，具有较强的农业应用价值。
发明内容
为了在农业生产中，有效控制种子在正常生长条件下的休眠强度，本申请提供了一种ERF4基因在调控种子休眠中的用途。
本申请还提供一种促进种子休眠的方法：提高种子中ERF4基因的表达量。在一种实施方式中，通过将外源ERF4基因转入目标种子中来提高ERF4基因的表达量。
本申请还提供一种促进种子萌发的方法：修饰或敲除种子中的ERF4基因，使ERF4基因不能表达、或低表达、或丧失ERF4蛋白或ERF4基因的全部或部分功能。
在一些实施方式中，ERF4蛋白的序列如SEQ ID NO 1所示；或所述ERF4基因的序列如SEQ ID NO 2所示。
在一些实施方式中，种子为任何植物的种子，包括双子叶植物或单子叶植物的种子，优选为拟南芥的种子。
本申请的优点：ERF4缺失后种子的休眠弱，萌发快；超表达后休眠强；且没有ABA敏感性的差异，故而不影响植物的抗逆功能，具有较强的农业应用价值。
附图说明
图1Col-0、erf4-1、erf4-2和ERF4OE材料中ERF4表达量鉴定。
图2Col-0、erf4-1、erf4-2和ERF4OE新收获种子的萌发率测定。其中，A图为第0周萌发结果示例图，B图为收获后0到3周的萌发率统计结果。
图3Col-0与erf4-1后熟种子的ABA敏感性测定。
具体实施方式
种子休眠是指有活力的种子在适宜萌发的环境中仍然不能萌发的现象。
根据种子休眠形成时期的不同，研究人员将种子休眠分为两个大类，即初生休眠和次生休眠。初生休眠在种子成熟脱水过程中逐渐形成，是发生于母本植物上的，受到遗传和环境因素的双重影响。次生休眠是指成熟的非休眠的种子在遭受到不良环境影响后不能萌发而再次进入休眠的现象，发生于脱离母体，丧失初生休眠且胁迫浸泡后。初生休眠是拟南芥和水稻、小麦等作物物种的固有属性；次生休眠则受环境影响较大，表型不够稳定，难以控制。除非特别说明，本申请的种子休眠指种子的初生休眠。
种子休眠强度的衡量方式为：在无任何胁迫处理的最佳萌发条件下，新收获种子的萌发率用以衡量种子的休眠强度，新收获种子的萌发率越低表明其种子的休眠越强。
需要说明的是，种子休眠与(枝/花/叶)芽休眠或块茎休眠不同，它们分别属于不同的器官，由不同的机制调控，它们的形成因素、表现形式和调控基因都是不同的，无法简单借鉴使用。
在植物研究中，拟南芥是模式植物。因此，本申请采用该模式植物进行研究，在没有相反证据的前提下，应当可以预期本申请的结论适用于任何植物。
本申请提供了ERF4基因在调控种子休眠中的用途。在一些实施方式中，种子可以为任何植物的种子，例如双子叶植物的种子或单子叶植物的种子。本申请还提供了一种促进种子休眠的方法：提高种子中ERF4基因的表达量，例如通过将外源ERF4基因转入目标种子中来提高ERF4基因的表达量。本申请还提供了一种促进种子萌发的方法，修饰或敲除种子中的ERF4基因，使ERF4基因不能表达、或低表达、或丧失ERF4蛋白或ERF4基因的全部或部分功能。
本申请的结果总述：在种子休眠表型测定中，与野生型Col-0相比,缺失突变体erf4-1，erf4-2休眠弱，超表达ERF4休眠强；在ABA敏感性测试中：与野生型Col-0相比，缺失突变体erf4-1对ABA的敏感性差异不大。具体如下述实施例。
本申请通过下述实施例进一步阐明发明内容，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或者实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1材料的获得
1、双元载体pCAMBIA1305，公众可以从喀斯玛商城购得。
2、根癌农杆菌GV3101：参考文献：Clough S J，Bent AF.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.[J].Plant Journal for Cell&Molecular Biology，1998，16(6)：735-743.；公众可以从中国农业科学院农业基因组研究所获得。
3、哥伦比亚生态型拟南芥(野生型Col-0)：参考文献：Swarup K，Alonso-BlancoC，Lynn JR，Michaels SD，Amasino RM，Koornneef M，Millar AJ.Natural allelicvariation identifies new genes in the Arabidopsis circadian system.PlantJournal.1999.；公众可以从中国农业科学院农业基因组研究所获得。
4、拟南芥T-DNA插入突变体erf4-1和erf4-2，ERF4基因无内含子，外显子区域的T-DNA插入导致不能产生基因的完整转录，经过RT-qPCR验证确为ERF4缺失突变体。erf4-1和erf4-2购自拟南芥突变体库Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，储存编号分别为SALK_200761和SALK_073394。
5、ERF4超量表达载体构建(ERF4OE)，采用pCAMBIA1305质粒骨架，融合以拟南芥种子cDNA为模版扩增的ERF4编码区。转基因材料采用RT-qPCR检测ERF4表达量。
ERF4序列信息：提取哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA，并反转录为cDNA。经过序列分析、表达量检测与功能验证，发现了一个cDNA编码序列，其编码的蛋白质如序列表的SEQ.ID.NO.1所示:
MAKMGLKPDPATTNQTHNNAKEIRYRGVRKRPWGRYAAEIRDPGKKTRVWLGTFDTAEEAARAYDTAARDFRGAKAKTNFPTFLELSDQKVPTGFARSPSQSSTLDCASPPTLVVPSATAGNVPPQLELSLGGGGGGSCYQIPMSRPVYFLDLMGIGNVGRGQPPPVTSAFRSPVVHVATKMACGAQSDSDSSSVVDFEGGMEKRSQLLDLDLNLPPPSEQA。
将SEQ.ID.NO.1所示的蛋白质命名为ERF4蛋白，由222个氨基酸组成。将编码ERF4蛋白的基因命名为ERF4基因，其开放阅读框如序列表的SEQ.ID.NO.2所示。
atggccaagatgggcttgaaacccgacccggctactactaaccagacccacaataatgccaaggagattcgttacagaggcgttaggaagcgtccttggggccgttatgccgccgagatccgagatccgggcaagaaaacccgcgtctggcttggcactttcgatacggctgaagaggcggcgcgtgcttacgatacggcggcgcgtgattttcgtggtgctaaggctaagaccaatttcccaacttttctcgagctgagtgaccagaaggtccctaccggtttcgcgcgtagccctagccagagcagcacgctcgactgtgcttctcctccgacgttagttgtgccttcagcgacggctgggaatgttcccccgcagctcgagcttagtctcggcggaggaggcggcggctcgtgttatcagatcccgatgtcgcgtcctgtctactttttggacctgatggggatcggtaacgtaggtcgtggtcagcctcctcctgtgacatcggcgtttagatcgccggtggtgcatgttgcgacgaagatggcttgtggtgcccaaagcgactctgattcgtcatcggtcgttgatttcgaaggtgggatggagaagagatctcagctgttagatctagatcttaatttgcctcctccatcggaacaggcctga。
实施例2ERF4超量表达材料的构建
步骤1:提取哥伦比亚生态型拟南芥的总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用ERF4-1305-F和ERF4-1305-R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。
ERF4-1305-F 5`-TCTAGAATGGCCAAGATGGGCTTGAAACC-3`
ERF4-1305-R 5`-GTCGACTCAGGCCTGTTCCGATGGAGGAG-3`
其中，下划线分别标注XbaI和SalI酶切位点。
步骤2：限制性内切酶XbaI和SalI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
步骤3：用限制性内切酶XbaI和SalI双酶切载体pCAMBIA1305，回收载体骨架。
步骤4：将步骤2得到的酶切产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组表达载体Pro35S-ERF4。
步骤5：根据测序结果，对重组表达载体Pro35S-ERF4进行结构描述如下：将双元载体pCAMBIA1305载体的XbaI和SalI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列2的自5′端第1-669位核苷酸所示的双链DNA分子。
将重组表达载体Pro35S-ERF4导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。之后，采用花芽浸泡法(Clough and Bent，Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant Journal1998，16：735-743.)，将所述得到的重组农杆菌侵染哥伦比亚生态型拟南芥，收获T1代种子。在含50mg/L卡那霉素的MS固体培养基平板上筛选T1代植株并进行T2代和T3代的分离比统计，在T3代得到单拷贝插入的纯合转ERF4基因拟南芥株系。其中，T2代表示T1代自交产生的种子及由它所长成的植株；T3代表示T2代自交产生的种子及由它所长成的植株。
实施例3ERF4表达量鉴定
将20mg新收获的Col-0、erf4-1、erf4-2和ERF4OE种子分别于液氮中迅速研磨成粉末，采用诺唯赞多糖多酚植物RNA提取试剂盒来提取种子RNA。提取的RNA用NanoDrop测定浓度，取10μg总RNA，采用诺唯赞反转录试剂盒进行逆转录反应，合成cDNA。其中用去离子水对所获得的cDNA进行5-10倍的稀释；稀释后即可用于qPCR定量，引物对如下：
ERF4-qRT-F 5`-CTTACGATACGGCGGCGCGT-3`；
ERF4-qRT-R 5`-GCGCGAAACCGGTAGGGACC-3`；
ACTIN 8-qRT-F 5`-GCACTTTCCAGCAGATGTGGAT-3`；
ACTIN 8-qRT-R 5`-GATCCCGTCATGGAAACGATGT-3`。
实验过程如下：
1.按如下体积配置Real-time PCR反应混合液：1.5μL cDNA模板，10μL 2×ChamQUniversal SYBR qPCR Master Mix溶液，正反向引物各1μL，加入双蒸水至20μL。
2.混匀反应液后，按如下程序进行Real-time PCR实验：预变性阶段以95℃，30s进行1个循环；热循环阶段以95℃，10s及60℃，30s进行40个循环；溶解曲线阶段按95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s进行。使用仪器为BioRad荧光定量PCR仪。
3.实验所得到的CT值，以2-ΔΔCT算法进行换算，得出测定基因的相对表达情况，内参基因为ACTIN8。
qRT-PCR检测结果如图1所示：相比于野生型Col-0新收种子中ERF4基因的表达水平，T-DNA插入突变体erf4-1和erf4-2种子中几乎未检测到ERF4的表达；ERF4OE中的表达量则为Col的4倍左右。
实施例4Col-0与erf4-1，erf4-2和ERF4OE新收获种子的萌发率测定
取50-100粒新收获种子，均匀撒播至塑料盒中湿润的吸水纸板上，利用保鲜膜封闭塑料盒，并将塑料盒置于23℃,16小时光照8小时黑暗光周期的培养箱中进行休眠表型鉴定。每组实验材料选取3个同系纯合单株的种子作为实验重复，萌发率统计周期为一周一次，至所有实验材料的种子萌发率达到100％为止。
新收获种子的萌发实验结果如图2所示：erf4-1，erf4-2的萌发率高于Col，而ERF4OE则低于Col，表明休眠强度依次为：ERF4OE>Col>erf4-1/erf4-2。可见，ERF4发挥着促进种子休眠，抑制种子萌发的作用。
实施例5Col-0与erf4-1后熟种子的ABA敏感性测定
以自然存储的后熟种子来检测erf4-1对ABA的敏感性。后熟种子使用次氯酸钠液(15％次氯酸钠+0.1％ Triton)消毒5分钟后，使用无菌水反复冲洗5次；将除菌后的拟南芥种子分别点播至含有指定浓度ABA的1/2MS固体培养基上。将点播有种子的培养皿置于4℃冰箱内，避光层积3天；随后，取出培养皿，置于23℃，16小时光照8小时黑暗光周期的培养箱中进行萌发培养。1周后，统计种子萌发率。
结果如图3所示：与Col相比，erf4-1对ABA的敏感性没有显著差异。可见，ERF4能显著促进种子休眠，但没有显著的ABA敏感性差异。也就是说，ERF4特异性调控种子休眠并不依赖ABA途径。由于ERF4特异性调控种子休眠，且不影响ABA信号通路的正常运转，可作为生产应用中调控种子休眠的有效靶点，具有重要的农业应用价值。
本申请已尽力描述了发明的思路和实施效果证据。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚的明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或者改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。
Claims (3)
1.一种促进种子休眠的方法，其特征在于，提高种子中ERF4基因的表达量；所述ERF4基因的序列如SEQ ID NO 2所示；所述休眠为初生休眠；所述种子为拟南芥种子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过将外源ERF4基因转入目标种子中来提高ERF4基因的表达量。
3.一种促进种子萌发的方法，其特征在于，修饰或敲除种子中的ERF4基因，使ERF4基因不能表达、或丧失ERF4蛋白或ERF4基因的全部功能；所述ERF4基因的序列如SEQ ID NO 2所示；所述种子为拟南芥种子。
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