CN106636199A - 用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品 - Google Patents

用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品。本发明针对目的基因—Nedd4基因的外显子，设计靶向外显子的sgRNA，用CRISPR/Cas9技术并通过puromycin或blasticidin筛选及Western blot鉴定，获得了稳定敲除Nedd4基因并可用puromycin或blasticidin进行筛选的细胞系。本发明将PX330载体(CRISPR/Cas9载体)和Tiall载体联合使用获得了目的基因敲除的细胞系，为研究基因的功能及作用机制提供了有效工具。

Description

用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方 法及产品
技术领域
本发明属于基因工程技术领域中基因组编辑技术，涉及一种用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中目的基因进行基因定向编辑并易于筛选获得细胞系的方法与应用。
背景技术
CRISPR/Cas9基因组编辑技术具有“基因魔剪”之称,是最近几年兴起的用于靶向基因编辑的一种重要工具，已被应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、秀丽隐杆线虫、植物及细菌的基因编辑。该技术是利用人工设计特殊的向导RNA(single-guideRNA，sgRNA，又称靶向RNA)介导外源表达的核酸内切酶cas9蛋白对基因组DNA上的靶点进行特异性剪切，随后，细胞的非同源末端连接修复机制(NHEJ)重新连接断裂处的基因组DNA，从而引入碱基插入或缺失突变，达到基因敲除实现基因定向编辑的目的。
实验室目前普遍使用的PX330载体质粒(Addgene/Feng Zhang Lab Plasmids)具有Cas9表达盒和U6启动子表达盒，可以将gRNA序列插入到U6启动子之后。当把该质粒转入细胞之后，质粒将表达特异性gRNA和Cas9，在gRNA的介导下，Cas9对基因进行切割。被剪切的基因在机体修复作用下有可能引入移码造成目的基因缺失，然而转染后的细胞中存在未被转染的细胞和经过机体修复目的基因只是发生点突变而没有发生移码的细胞。PX330没有筛选标记基因，从而造成筛选工作量非常巨大、获得基因敲除的阳性细胞系的几率比较低的问题，将给后续研究造成极大的不便和困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中目的基因易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法。
本发明用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中目的基因易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法，可包括以下步骤：
1)构建携带筛选标记基因及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体；所述筛选标记可选但不限于puromycin(嘌呤霉素)或blasticidin(杀稻瘟菌素)；
2)设计目的基因的sgRNA，合成其Oligo DNA，构建携带目的基因的sgRNA OligoDNA和Cas9基因的重组载体(CRISPR/Cas9载体)；
3)将步骤1)和步骤2)构建的重组载体共转染细胞；
4)用筛选标志物(puromycin或blasticidin)进行筛选，快速筛选得到目的基因敲除的细胞系。
在上述方法中，所述步骤1)中构建的Tia1l重组载体，具体为携带puromycin或blasticidin筛选标记及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体，可包括以下过程：
1.1)Overlapping PCR扩增BamH Ⅰ-2A-筛选标志基因-BGHpA-HindⅢ片段，具体可为BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段(对应puromycin)或BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段(对应blasticidin)；
1.2)用BamH1、HindⅢ双酶切Tiall载体、BamH Ⅰ-2A-筛选标志基因-BGHpA-HindⅢ片段(BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段)，回收酶切产物；
1.3)将线性Tia1l载体与BamH Ⅰ-2A-筛选标志基因-BGHpA-HindⅢ酶切片段(BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ酶切片段或BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ酶切片段)进行连接，得到Tia1l重组载(携带puromycin筛选标记的重组载体Tia1l-Puro或携带blasticidin筛选标记的重组载体Tia1l-Bsd)。
所述步骤1.1)中的BamH Ⅰ-2A-筛选标志基因-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamH Ⅰ识别序列、2A自剪切肽编码序列、筛选标志基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成。具体的：BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamH Ⅰ识别序列、2A自剪切肽编码序列、puromycin基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamH Ⅰ识别序列、2A自剪切肽编码序列、blasticidin基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
所述步骤2)中设计目的基因的sgRNA，合成编码目的基因sgRNA的双链Oligo DNA，在正义链模板的5’端添加CACC，反义链模板的5’端添加AAAC，使其可与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补。
所述步骤2)中携带目的基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体的构建方法，可包括以下步骤：
2.1)根据设计的sgRNA序列，合成相应的单链Oligo DNA及其互补链的Oligo DNA单链，将合成的Oligo DNA及其互补链按照分子数1：1比例混合，进行退火处理，以形成双链Oligo DNA；
2.2)使用Bbs I酶切PX330质粒和sgRNA Oligo DNA，再将两者进行连接，得到携带目的基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体，命名为“PX330-目的基因-sgRNA”。
所述步骤3)中将步骤1)构建的Tia1l重组载体(重组载体Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd)与步骤2)构建的重组载体PX330-目的基因-sgRNA共转染细胞的方法为：将细胞用DMEM高糖培养基(含10％灭活的胎牛血清)、双抗(青霉素100unit/mL和链霉素100ug/mL，以防止细胞污染)、37℃、5％CO2恒温培养，转染前将4×106个细胞接种于100mm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％-90％时使用胰酶消化，取出1/2的细胞，用PBS洗去培养基，用Invitrogen公司neon转染系统并按说明书中的操作方法将Tia1l重组载体(Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd)与PX330-目的基因-sgRNA共转染细胞，将重组载体转入细胞，载体使用量7μg，转染体系为：PX330-Nedd4-sgRNA质粒3.5μg、Tia1l重组载体质粒(Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd质粒)3.5μg，电转条件为：1960V、10ms、2pulse，电转完成后继续培养细胞48-72h使细胞恢复。
所述步骤4)中用筛选标记物(puromycin或blasticidin)筛选目的基因敲除的细胞的方法为：当细胞生长至正常状态时，加入10μg/mL筛选药物(puromycin或blasticidin)，2天更换1次培养基，持续培养细胞2周，获得稳定敲除目的基因的细胞系。
用上述方法筛选获得的敲除目的基因的细胞系也属于本发明。
上述方法步骤1)中扩增得到BamH Ⅰ-2A-筛选标记基因-BGHpA-HindⅢ片段，具体为BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-Hind Ⅲ片段(对应puromycin)或BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段(对应blasticidin)也属于本发明。
上述方法步骤1)中构建的Tia1l重组载体，具体为携带puromycin筛选标记的重组载体Tia1l-Puro或携带blasticidin筛选标记的重组载体Tia1l-Bsd也属于本发明。
上述方法步骤2)获得的重组载体PX330-目的基因-sgRNA也属于本发明。
具体来讲，所述目的基因为Nedd4基因，在用CRISPR/Cas9技术敲除细胞中Nedd4基因中，所述步骤2)中设计并合成Nedd4基因的sgRNA，共设计3种sgRNA，其中两种针对外显子1(Exon1)，一种针对外显子4(Exon4)，其RNA序列如下：
(1)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的sgRNA，序列表中序列3，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA1(sgRNA1)；
(2)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的sgRNA，序列表中序列4，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA2(sgRNA2)；
(3)针对Nedd4基因外显子4(Exon4)的sgRNA，序列表中序列5，命名为Nedd4-Exon4-sgRNA3(sgRNA3)。
所述步骤2)中编码Nedd4基因sgRNA的双链Oligo DNA，在正义链模板的5’端添加CACC，反义链模板的5’端添加AAAC，使其可与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，可为下述双链DNA序列之一：
(1)sgRNA1的Oligo DNA单链为序列表中序列6，其互补链为序列表中序列7；
(2)sgRNA2的Oligo DNA单链为序列表中序列8，其互补链为序列表中序列9；
(3)sgRNA3的Oligo DNA单链为序列表中序列10，其互补链为序列表中序列11。
所述步骤2)中携带Nedd4基因的sgRNA1 Oligo DNA和Cas9基因的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA1，携带Nedd4基因的sgRNA2 Oligo DNA和Cas9基因的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA2，携带Nedd4基因的sgRNA3 Oligo DNA和Cas9基因的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA3，以上三种重组载体统称为“PX330-Nedd4-sgRNA”。
所述步骤3)中的细胞为BMDM细胞。
用上述方法筛选获得的敲除Nedd4基因的BMDM细胞系也属于本发明。
上述方法中步骤2)构建的携带Nedd4基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体PX330-Nedd4-sgRNA也属于本发明。
PX330载体(CRISPR/Cas9载体)缺少筛选标记，对后期细胞筛选带来巨大困难；本发明选择另外一种载体Tia1l，其含有Tia1l识别序列且两段Tia1l序列中间具有多克隆位点，载体可表达Tia1lgRNA，识别Tia1l序列，cas9蛋白可对其进行特异性切割，但是该载体不具有筛选标记，因此对其进行改进，在多克隆位点处插入筛选标记puromycin(嘌呤霉素)或blasticidin(杀稻瘟菌素)及2A自剪切肽编码序列，cas9蛋白特异性切割后，产生的片段两端可与切割后的基因组切口粘性互补，然后通过细胞修复功能将筛选标记puromycin和blasticidin及2A自剪切肽编码序列插入基因组切口处，细胞通过目的基因的启动子，正常启动puromycin或blasticidin转录后，在BGHpA处终止，细胞正常翻译，并通过2A自剪切作用表达puromycin或blasticidin抗性蛋白，然后加入适量浓度的药物puromycin和blasticidin筛选获得目的基因敲除的细胞系。
具体来讲，本发明针对目的基因—Nedd4基因的外显子，设计靶向外显子的sgRNA，用CRISPR/Cas9技术并通过puromycin或blasticidin筛选及Western blot鉴定，获得了稳定敲除Nedd4基因并携带有puromycin或blasticidin筛选标记基因的细胞系。本发明将PX330重组载体(CRISPR/Cas9载体)和Tia1l重组载体联合使用能快速筛选获得了目的基因敲除的细胞系，为研究基因的功能及作用机制提供了有效工具，同时插入筛选基因，在特异性插入目的基因方面进行了尝试并取得成功，这就意味着不仅可以敲除目的基因并且可以在特定的位点上特异性地插入想要插入的基因(Tia1l质粒中两段Tia1l序列之间具有多克隆位点，可以插入想要插入的基因，同时利用cas9蛋白对Tia1l序列和目的DNA序列的切割作用，切割出的Tia1l之间的序列，该序列可以和基因组间的切口互补，通过DNA修复，修复切口，这样就达到了在特定位点上插入目的基因的目的)，这为基因编辑方面奠定了坚实的基础。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为Tia1l载体结构及用其构建携带puromycin(Puro)或blasticidin(Bsd)筛选标记及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体的示意图；
图2为PX330载体结构(A)及Exon1/4sgRNA的靶向识别序列位置及其周围DNA序列(B)；
图3为使用neon系统将重组载体Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd与PX330-Nedd4-sgRNA共转染BMDM细胞的结果；
图4为用puromycin或blasticidin筛选Nedd4基因敲除的BMDM细胞的结果。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，DavidW.，MolecularCloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
所用引物由Invitrogen公司合成，使用超纯水溶解引物为100μm母液，再稀释成浓度为10μm的工作液。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例、用CRISPR/Cas9技术敲除BMDM细胞中Nedd4基因并快速获得细胞系
实施例用CRISPR/Cas9技术敲除BMDM细胞中Nedd4基因(实施例以Nedd4基因作为目的基因，其它目的基因与本例方法类似)并快速筛选获得细胞系，包括以下过程：
1)构建携带筛选标记及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体。实施例以puromycin(嘌呤霉素)或blasticidin(杀稻瘟菌素)作为筛选标记实例，使用其它筛选标记与本例方法类似。
如图1(A：Tia1l载体结构；B：Overlapping PCR扩增BamH1-2A-Puro(Bsd)-BGHpA-HindⅢ片段；C：Tial载体多克隆位点结构：多克隆位点包括BamH Ⅰ、EcoR Ⅴ、HindⅢ酶切位点，在多克隆位点处插入筛选基因)所示，Tia1l载体具有一个U6启动子、Tia1lgRNA片段及其两个特异性识别序列Tia1l，其识别序列之间具有多克隆位点，但是其不具有筛选标记。本发明通过Overlapping的方法合成具有puromycin(Puro)或blasticidin(Bsd)筛选标记的片段，然后将该片段插入Tia1l质粒的多克隆位点，通过转化，挑取单克隆，提取质粒，将质粒进行测序鉴定，获得阳性质粒。
1.1)Overlapping PCR扩增BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段和BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段
BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段对应puromycin(嘌呤霉素)，自5’至3’端依次由BamH Ⅰ识别序列、2A自剪切肽编码序列、puromycin基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列1所示(BamH Ⅰ：1-6bp，P2A：7-72bp，puromycin：73-669bp，BGH polyA:670-894bp，Hind Ⅲ:895-900bp)。
引物序列如下(5’-3’)：
BamHI-2A-F：CGGGATCCggaagcggagctacta，
P2A：gaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct，
2A-Puro-F：gagaaccctggacctaccgagtacaagccca，
Puro-R：AACTAGAAGGCACAGTCAGGCACCGGGCTT，
Puro-pA-F：aagcccggtgcctgactgtgccttctagtt，
HindIII-pA-R：cccAAGCTTccatagagcccaccg。
以PcDNA3.1(+)(购自Addgene)为模板，Overlapping PCR扩增BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段，PCR反应体系为：模板PcDNA3.1(+)1μL(20ng)，5×reaction buffer 10μL，dNTPs 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，BamHI-2A-F 1μL，HindIII-pA-R 1μL，P2A 0.3μL，2A-Puro-F 0.2μL，Puro-pA-F 0.1μL，Puro-R：0.3μL，用H2O补至50μL。
PCR反应条件为：先94℃5min；然后98℃10s，56℃5s，72℃1min，共40个循环；最后72℃：10min。
反应结束后，对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒(购自博迈德生物技术有限公司)进行胶回收900bp的BamH Ⅰ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段。
BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段对应blasticidin(杀稻瘟菌素)，自5’至3’端依次由BamH Ⅰ识别序列、2A自剪切肽编码序列、blasticidin基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列2所示(BamH1：1-6bp，P2A：7-72bp，blasticidin：73-468bp，BGH polyA：469-693bp，HindⅢ:694-699bp)。
引物序列如下(5’-3’)：
BamHI-2A-F：CGGGATCCggaagcggagctacta
P2A：gaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct
2A-Bsd-F：gagaaccctggacctgccaagcctttgtct
Bsd-pA-F：tgtgtgggagggctaactgtgccttctagtt
Bsd-R：AACTAGAAGGCACAGTTAGCCCTCCCACACA
pA-F：aagcccggtgcctgactgtgccttctagtt
HindIII-pA-R：cccAAGCTTccatagagcccaccg
以PcDNA3.1(+)为模板，Overlapping PCR扩增BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段，PCR反应体系为：模板PcDNA3.1(+)1μL(20ng)，5×reaction buffer 10μL，dNTPs 4μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5μL，BamHI-2A-F 1μL，HindIII-pA-R1μL，P2A 0.3μL，2A-Puro-F 0.2μL，Bsd-pA-F 0.1μL，Bsd-R 0.3μL，用H2O补至50μL。
PCR反应条件为：先94℃5min；然后98℃10s，56℃5s，72℃1min，共40个循环；最后72℃：10min。
反应结束后，对PCR产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒进行胶回收699bp的BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段。
1.2)使用BamH Ⅰ、HindⅢ双酶切Tia1l质粒、BamH1-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamH1-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段
酶切体系为：Tai1l质粒(D H Lackner,A Carre,P M Guzzardo,C Banning,RMangena,T Henley,S Oberndorfer,B V Gapp,S M Nijman,T R Brummelkamp,and TBurckstummer,A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging,NatCommun,2015,6(10237))10μL，BamH1-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamH1-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段20μL，BamHⅠ2μL，HindⅢ2μL，10×reaction buffer 5μL，用H2O补至50μL。
酶切条件为：37℃酶切4小时。
酶切结束后，对酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，回收2786bp的线性Tia1l质粒与900bp的BamH1-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ酶切片段或699bp的BamH1-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ酶切片段，与期望序列相同。
1.3)将线性Tia1l载体与BamHⅠ-2A-Puro---BGHpA-HindⅢ酶切片段或BamH Ⅰ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ酶切片段进行连接，得到携带puromycin筛选标记的重组载体Tia1l-Puro或携带blasticidin筛选标记的重组载体Tia1l-Bsd。
连接体系为：线性Tia1l载体5ul，BamH1-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ酶切片段或BamH1-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ酶切片段10ul，10×reaction buffer 2ul，T4DNA连接酶1ul，H2O 1ul。
连接条件为：16℃连接过夜(16小时)。
将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，小量提质粒并进行测序鉴定，测序结果表明获得了序列及结构正确的携带puromycin或blasticidin筛选标记及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体，分别命名为Tia1l-Puro和Tia1l-Bsd，选取阳性克隆，大量提质粒，备用。
2)设计Nedd4基因的sgRNA及其Oligo DNA，构建携带Nedd4基因的sgRNA OligoDNA和Cas9基因的重组载体
2.1)设计Nedd4基因的sgRNA及其Oligo DNA
如图2中B幅(B：Exon1/4sgRNA的靶向识别序列位置及其周围DNA序列)所示，用哈佛大学的网上在线软件(http://crispr.mit.edu)设计Nedd4基因的向导RNA(sgRNA)。共设计3种sgRNA，其中两种针对外显子1(Exon1)，一种针对外显子4(Exon4)，其RNA序列如下：
(1)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的靶标序列(自5‘端第233-252位碱基)设计的sgRNA：ACGAGTCGGAGGCCCCAGTA，序列表中序列3，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA1(sgRNA1)；
(2)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的靶标序列(自5‘端第219-238位碱基)设计的sgRNA：GGACATGGCAGCCGACGAGT，序列表中序列4，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA2(sgRNA2)；
(3)针对Nedd4基因外显子4(Exon4)的靶标序列(自5‘端第14988-15007位碱基)设计的sgRNA：ACATTGTATGACCCGATGAG，序列表中序列5，命名为Nedd4-Exon4-sgRNA3(sgRNA3)。
编码Nedd4基因的sgRNA的双链Oligo DNA，在正义链模板的5’端添加CACC，反义链模板的5’端添加AAAC，使其可与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，如表1所示，可为下述双链DNA序列之一：
(1)sgRNA1的Oligo DNA单链为序列表中序列6，其互补链为序列表中序列7；
(2)sgRNA2的Oligo DNA单链为序列表中序列8，其互补链为序列表中序列9；
(3)sgRNA3的Oligo DNA单链为序列表中序列10，其互补链为序列表中序列11。
表1 编码Nedd4基因的sgRNA的双链Oligo DNA序列
向导RNA Oligo DNA序列
sgRNA Oligonucleotide sequence
Nedd4-Exon1-sgRNA1 F：5'-CACCGTACTGGGGCCTCCGACTCGT-3'(序列表中序列6)
R：5'-AAACACGAGTCGGAGGCCCCAGTAC-3'(序列表中序列7)
Nedd4-Exon1-sgRNA2 F：5'-CACCGGACATGGCAGCCGACGAGT-3'(序列表中序列8)
R：5'-AAACACTCGTCGGCTGCCATGTCC-3'(序列表中序列9)
Nedd4-Exon4-sgRNA3 F：5'-CACCGACATTGTATGACCCGATGAG-3'(序列表中序列10)
R：5'-AAACCTCATCGGGTCATACAATGTC-3'(序列表中序列11)
2.2)构建携带Nedd4基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的的重组载体
如图2中A幅(A：PX330载体结构：携带Case9基因和2个Bbs I酶切位点)所示，携带Nedd4基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
2.2.1)合成Nedd4基因的sgRNA Oligo DNA的单链及其互补链，将合成的OligoDNA单链及其互补链按照分子数1：1比例混合，进行退火处理，以形成双链Oligo DNA
两条sgRNA寡核苷酸单链退火形成双链Oligo DNA：两条单链DNA使用超纯水溶解使其浓度为100μm/L，退火体系为：sgRNA-F 1μL，sgRNA-R 1μL，10×PNK buffer1μL，T4PNK1μL，H2O 6μL。
退火条件为：37℃30min，95℃5min，-1℃/s降温至25℃。
将退火产物使用高纯水1:200稀释。
2.2.2)使用Bbs I酶切PX330载体(携带Cas9基因)和sgRNA Oligo DNA，再将两者进行连接，得到携带Nedd4基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体
用限制性内切酶Bbs I切割PX330载体，酶切体系为：PX330载体(购自Addgene)10μL(共计1μg)，Bbs I(购自Thrmo公司)1μL，10×reaction buffer 2μL，H2O7μL。
酶切条件为：37℃酶切1h。
用琼脂糖凝胶回收试剂盒切胶回收8500bp的线性PX330载体将线性PX330载体和sgRNA Oligo DNA进行连接，连接体系为：线性化PX330载体4μL(100ng)，sgRNA Oligo DNA2μL，10×T4DNA Ligase Buffer 2μL，T4DNA连接酶1μL，H2O 11μL。
连接条件为：16℃连接过夜(16小时)。
将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，氨苄抗性涂板筛选，挑取单克隆，小量提质粒并进行测序鉴定，测序结果表明获得了序列及结构正确的携带Nedd4基因的sgRNAOligo DNA和Cas9基因的重组载体，统称为PX330-Nedd4-sgRNA，其中，携带Nedd4基因的sgRNA1 Oligo DNA的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA1，携带Nedd4基因的sgRNA2Oligo DNA的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA2，携带Nedd4基因的sgRNA3Oligo DNA的重组载体为PX330-Nedd4-sgRNA3。选取阳性克隆，大量提质粒，备用。
3)将步骤1)和步骤2)构建的重组载体共转染BMDM细胞
将步骤1)构建的重组载体Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd与步骤2)构建的PX330-Nedd4-sgRNA共转染BMDM细胞的方法为：将BMDM细胞用DMEM高糖培养基(购自gibco公司)(含10％灭活的胎牛血清，购自ExCellBiology.Inc公司)、双抗(青霉素100unit/mL，链霉素100ug/mL，以防止细胞污染)、37℃、5％CO2恒温培养，转染前将4×106个BMDM细胞接种于100mm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％-90％时使用胰酶消化，取出1/2的细胞，用PBS洗去培养基，用Invitrogen公司neon转染系统并按说明书中的操作方法将重组载体Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd与PX330-Nedd4-sgRNA(PX330-Nedd4-sgRNA1、PX330-Nedd4-sgRNA2或PX330-Nedd4-sgRNA3)共转染BMDM细胞，以PX330-Nedd4-sgRNA(PX330-Nedd4-sgRNA1、PX330-Nedd4-sgRNA2或PX330-Nedd4-sgRNA3)单独转染BMDM细胞为对照，载体使用量7μg，转染体系为：PX330-Nedd4-sgRNA质粒3.5ug，Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd质粒3.5ug，电转条件为：1960V、10ms、2pulse，电转完成后继续培养细胞48-72h使细胞恢复。
BMDM细胞转染结果如图3(A：明场下视野(40×)；B：荧光下视野(40×))所示，细胞转染效率(达80％)及细胞存活率(达90％)均达到实验要求，说明细胞转染成功。
4)用puromycin或blasticidin进行筛选，得到Nedd4基因敲除的BMDM细胞
用puromycin或blasticidin筛选Nedd4基因敲除的BMDM细胞的方法为：当细胞生长至正常状态时，加入10μg/mL筛选药物(puromycin或blasticidin)，2天更换1次培养基，持续培养细胞2周。
单转PX330-Nedd4-sgRNA载体时，cas9蛋白靶向切割目的基因，同时利用DNA修复机制使基因发生移码、替换、插入或者缺失突变(图4中A幅)，使用无限稀释法获得单克隆细胞系，以期获得Nedd4基因敲除的单克隆细胞系，然后提取转染BMDM细胞总蛋白，用WesternBlot(抗体为Nedd4，购自santa cruz)方法检测Nedd4蛋白表达水平，结果如图4中C幅所示，gRNA-1.1为完全敲除细胞系，同时提取其基因组对其测序，结果如图4中D幅(带底纹字体表示相同碱基，-表示缺失碱基)所示，Nedd4基因发生了替换以及16bp的缺失突变，这说明获得一株Nedd4基因敲除的单克隆细胞系。
PX330-Nedd4-sgRNA载体和Tia1l-Puro(或Tai1l-Bsd)载体共转染BMDM细胞时，利用cas9蛋白的剪切作用，剪切后2A-Puro(或2A-Bsd)片段和基因组切口互补，通过连接作用将2A-Puro(或2A-Bsd)片段插入基因组(图4中B幅)，通过Nedd4基因的启动子，正常启动puromycin或blasticidin转录后，在BGHpA处终止，细胞正常翻译，通过2A自剪切作用使细胞表达puromycin或blasticidin抗性蛋白，然后使用puromycin或blasticidin进行筛选，持续处理2周，提取筛选细胞总蛋白，Western blot检测Nedd4蛋白表达水平。结果如图4中E幅所示，两种筛选方式均获得了Nedd4基因完全敲除的BMDM细胞株，这表明本方法通过简单操作就能筛选获得基因敲除的细胞系，与只用PX330载体通过有限稀释法筛选获得基因敲除的细胞系的方法相比大大提高了筛选效率。
序列表
<110> 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所
<120> 用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品
<130> CGCNB165182W
<160> 11
<210> 1
<211> 900
<212> DNA
<213> BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段
<400> 1
ggatccggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 60
aaccctggac ctaccgagta caagcccacg gtgcgcctcg ccacccgcga cgacgtcccc 120
agggccgtac gcaccctcgc cgccgcgttc gccgactacc ccgccacgcg ccacaccgtc 180
gatccggacc gccacatcga gcgggtcacc gagctgcaag aactcttcct cacgcgcgtc 240
gggctcgaca tcggcaaggt gtgggtcgcg gacgacggcg ccgcggtggc ggtctggacc 300
acgccggaga gcgtcgaagc gggggcggtg ttcgccgaga tcggcccgcg catggccgag 360
ttgagcggtt cccggctggc cgcgcagcaa cagatggaag gcctcctggc gccgcaccgg 420
cccaaggagc ccgcgtggtt cctggccacc gtcggcgtct cgcccgacca ccagggcaag 480
ggtctgggca gcgccgtcgt gctccccgga gtggaggcgg ccgagcgcgc cggggtgccc 540
gccttcctgg agacctccgc gccccgcaac ctccccttct acgagcggct cggcttcacc 600
gtcaccgccg acgtcgaggt gcccgaagga ccgcgcacct ggtgcatgac ccgcaagccc 660
ggtgcctgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt 720
ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat 780
cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg 840
gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggaagctt 900
<210> 2
<211> 699
<212> DNA
<213> BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段
<400> 2
ggatccggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag 60
aaccctggac ctgccaagcc tttgtctcaa gaagaatcca ccctcattga aagagcaacg 120
gctacaatca acagcatccc catctctgaa gactacagcg tcgccagcgc agctctctct 180
agcgacggcc gcatcttcac tggtgtcaat gtatatcatt ttactggggg accttgtgca 240
gaactcgtgg tgctgggcac tgctgctgct gcggcagctg gcaacctgac ttgtatcgtc 300
gcgatcggaa atgagaacag gggcatcttg agcccctgcg gacggtgccg acaggtgctt 360
ctcgatctgc atcctgggat caaagccata gtgaaggaca gtgatggaca gccgacggca 420
gttgggattc gtgaattgct gccctctggt tatgtgtggg agggctaact gtgccttcta 480
gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 540
ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 600
attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 660
gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggaagctt 699
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA1（sgRNA1）
<400> 3
acgagucgga ggccccagua 20
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA2（sgRNA2）
<400> 4
ggacauggca gccgacgagu 20
<210> 5
<211> 20
<212> RNA
<213> Nedd4-Exon4-sgRNA3（sgRNA3）
<400> 5
acauuguaug acccgaugag 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA1（sgRNA1）的Oligo DNA单链（F）
<400> 6
caccgtactg gggcctccga ctcgt 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA1（sgRNA1）的Oligo DNA单链的互补链（R）
<400> 7
aaacacgagt cggaggcccc agtac 25
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA2（sgRNA2）的Oligo DNA单链（F）
<400> 8
caccggacat ggcagccgac gagt 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon1-sgRNA2（sgRNA2）的Oligo DNA单链的互补链（R）
<400> 9
aaacactcgt cggctgccat gtcc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon4-sgRNA3（sgRNA3）的Oligo DNA单链（F）
<400> 10
caccgacatt gtatgacccg atgag 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Nedd4-Exon4-sgRNA3（sgRNA3）的Oligo DNA单链的互补链（R）
<400> 11
aaacctcatc gggtcataca atgtc 25

Claims (10)

1.用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法，包括以下步骤：
1)构建携带筛选标记基因及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体；筛选标记物选自但不限于puromycin(嘌呤霉素)或blasticidin(杀稻瘟菌素)；
2)设计目的基因的sgRNA，合成其Oligo DNA，构建携带目的基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体；
3)将步骤1)和步骤2)构建的重组载体共转染细胞；
4)用对应筛选标记的筛选标志物(选自但不限于puromycin或blasticidin)进行筛选，得到目的基因敲除的细胞系。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中构建携带筛选标记(选自但不限于puromycin或blasticidin)基因及2A自剪切肽编码序列的Tia1l重组载体，包括以下过程：
1.1)扩增BamHⅠ-2A-筛选标记基因-BGHpA-HindⅢ片段，具体可为BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段(对应puromycin)或BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-Hind Ⅲ片段(对应blasticidin)；
1.2)用BamH1、HindⅢ双酶切Tia1l载体、BamHⅠ-2A-筛选标记基因-BGHpA-Hind Ⅲ片段(BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段)，回收酶切产物；
1.3)将线性Tia1l载体分别与BamHⅠ-2A-筛选标记基因-BGHpA-HindⅢ酶切片段(BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ酶切片段或BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ酶切片段)进行连接，得到携带筛选标记的Tia1l重组载体(携带puromycin筛选标记的重组载体Tia1l-Puro或携带blasticidin筛选标记的重组载体Tia1l-Bsd)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1.1)中的BamHⅠ-2A-筛选标记基因-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamHⅠ识别序列、2A自剪切肽编码序列、筛选标记基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成；具体的，BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamHⅠ识别序列、2A自剪切肽编码序列、puromycin基因、BGHpA基因(BGH终止子)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段自5’至3’端依次由BamHⅠ识别序列、2A自剪切肽编码序列、blasticidin基因、BGHpA基因(BGH)、HindⅢ识别序列连接而成，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中设计目的基因的sgRNA，合成编码目的基因的sgRNA的双链Oligo DNA，在正义链模板的5’端添加CACC，反义链模板的5’端添加AAAC，使其可与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中携带目的基因的sgRNAOligo DNA和Cas9基因的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
2.1)根据设计的sgRNA序列，合成相应的单链Oligo DNA及其互补链的Oligo DNA单链，将合成的Oligo DNA及其互补链按照分子数1：1比例混合，进行退火处理，以形成双链OligoDNA；
2.2)使用Bbs I酶切PX330载体和sgRNA Oligo DNA，再将两者进行连接，得到携带目的基因的sgRNA Oligo DNA和Cas9基因的重组载体。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于：所述3)中将步骤1)构建的Tia1l重组载体(Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd)与步骤2)构建的重组载体PX330-目的基因-sgRNA共转染细胞的方法为：将细胞用DMEM高糖培养基(含10％灭活的胎牛血清)、双抗(青霉素100unit/mL，链霉素100ug/mL)、37℃、5％CO2恒温培养，转染前将4×106个细胞接种于100mm细胞培养皿中，当细胞密度达到80％-90％时使用胰酶消化，取出1/2的细胞，用PBS洗去培养基，用Invitrogen公司neon转染系统并按说明书中的操作方法将Tia1l重组载体重组载体与PX330-Nedd4-sgRNA共转染细胞，将重组载体转入细胞，载体使用量7μg，转染体系为：PX330-Nedd4-sgRNA质粒3.5μg、Tia1l重组载体质粒3.5μg，电转条件为：1960V、10ms、2pulse，电转完成后继续培养细胞48-72h使细胞恢复。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中用筛选标志物(puromycin或blasticidin)筛选目的基因敲除的细胞的方法为：当细胞生长至正常状态时，加入10μg/mL筛选药物(puromycin或blasticidin)，2天更换1次培养基，持续培养细胞2周，获得稳定敲除目的基因的细胞。
8.权利要求1-7任一所述方法中步骤1)获得的Tia1l重组载体(Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd)、BamHⅠ-2A-筛选标记基因-BGHpA-HindⅢ片段(BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段)、步骤2)获得的重组载体PX330-目的基因-sgRNA或步骤4)获得的敲除目的基因的细胞系。
9.根据权利要求1至7任一所述的方法，其特征在于：所述目的基因为Nedd4基因，所述步骤2)中设计并合成Nedd4基因的sgRNA，共设计3种sgRNA，其中两种针对外显子1(Exon1)，一种针对外显子4(Exon4)，其RNA序列如下：
(1)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的sgRNA，序列表中序列3，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA1(sgRNA1)；
(2)针对Nedd4基因外显子1(Exon1)的sgRNA，序列表中序列4，命名为Nedd4-Exon1-sgRNA2(sgRNA2)；
(3)针对Nedd4基因外显子4(Exon4)的sgRNA，序列表中序列5，命名为Nedd4-Exon4-sgRNA3(sgRNA3)；
所述步骤2)中编码Nedd4基因sgRNA的双链Oligo DNA，在正义链模板的5’端添加CACC，反义链模板的5’端添加AAAC，使其可与Bbs I酶切后形成的粘性末端互补，可为下述双链DNA序列之一：
(1)sgRNA1的Oligo DNA单链为序列表中序列6，其互补链为序列表中序列7；
(2)sgRNA2的Oligo DNA单链为序列表中序列8，其互补链为序列表中序列9；
(3)sgRNA3的Oligo DNA单链为序列表中序列10，其互补链为序列表中序列11；
所述步骤2)中携带Nedd4基因的sgRNA1Oligo DNA的重组载体命名为PX330-Nedd4-sgRNA1，携带Nedd4基因的sgRNA2Oligo DNA的重组载体命名为PX330-Nedd4-sgRNA2，携带Nedd4基因的sgRNA3Oligo DNA的重组载体命名为PX330-Nedd4-sgRNA3，统称为PX330-Nedd4-sgRNA；
所述步骤3)中的细胞为BMDM细胞。
10.权利要求9所述方法步骤1)获得的重组载体Tia1l-Puro或Tia1l-Bsd、BamHⅠ-2A-Puro-BGHpA-HindⅢ片段或BamHⅠ-2A-Bsd-BGHpA-HindⅢ片段、步骤2)获得的重组载体PX330-Nedd4-sgRNA或步骤4)获得的敲除Nedd4基因的BMDM细胞系。
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