CN105535977A - Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用 - Google Patents

Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105535977A
CN105535977A CN201511031368.5A CN201511031368A CN105535977A CN 105535977 A CN105535977 A CN 105535977A CN 201511031368 A CN201511031368 A CN 201511031368A CN 105535977 A CN105535977 A CN 105535977A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nedd4
glt
expression
glutamate transporter
glast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201511031368.5A
Other languages
English (en)
Inventor
瞿少刚
吴晓娟
张秀萍
何小亮
童辉纯
张云龙
孟行军
张文龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southern Medical University
Original Assignee
Southern Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southern Medical University filed Critical Southern Medical University
Priority to CN201511031368.5A priority Critical patent/CN105535977A/zh
Publication of CN105535977A publication Critical patent/CN105535977A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用。本发明发现Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节效应参与了PD的发病，重点研究了Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节异常在PD发病过程中的意义，在动物模型和细胞实验水平探讨了两者的相互作用及Nedd4-2浓度及活性的变化对谷氨酸转运体表达和功能的影响，分析了Nedd4-2对谷氨酸转运体调节的分子机制，认证了Nedd4-2可作为治疗PD的靶标。进而指导帕金森病的基因治疗和筛选有效的抗帕金森病药物，对改善帕金森病患者的生活质量具有重要意义。

Description

Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用
技术领域
本发明涉及Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用。
背景技术
帕金森病是一种中老年常见的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等运动系统症状为主要表现。最近几年帕金森病的非运动症状逐渐引起人们的注意，这些症状不仅包括多汗、便秘等自主神经功能障碍，嗅觉减退，视空间能力受损、记忆力下降等认知障碍和焦虑、抑郁等情绪障碍，而且还有幻觉、妄想等精神障碍，严重者伴发痴呆。
目前公认帕金森病的发病机制为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性缺失和路易小体(Lewybody)形成[6]，同时兴奋性毒性作用、环境因素、钙超载、线粒体功能障碍、氧化应激过度、年龄老化以及神经干细胞随衰老发生退行性变等诸多因素参与了帕金森病的发病过程[7]。
根据帕金森病的发病机制，延缓黑质多巴胺能神经元的变性和补充多巴胺是治疗的基本原则，基于此，目前，左旋多巴仍然是治疗帕金森病的“金标准”，它可以通过血脑屏障，在多巴胺脱羧酶的作用下变成多巴胺，发挥替代疗法的作用，在疾病初期具有明显的缓解作用，但长期服用容易出现直立性低血压、心律失常，并且易出现谵妄、幻觉等精神症状，严重时出现异动症、剂末恶化现象、“开-关”现象等并发症，神经干细胞移植和基因治疗是近几年新兴的治疗手段，但是因为成本和风险较高，尚不能用于临床的推广。
谷氨酸(glutamate,Glu)是哺乳动物中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质，释放到突触间隙，发挥作用后很快被位于星形胶质细胞和神经元胞膜上的兴奋性谷氨酸转运体所终止。真核生物高亲和力谷氨酸转运体(excitatoryaminoacidtransporters,EAATs)分为GLAST(EAAT1)、GLT-1(EAAT2)、EAAC1(EAAT3)、EAAT4和EAAT5等5个亚型，其中，GLAST和GLT-1主要表达于脑内的胶质细胞上，GLAST在小脑的Bergmann胶质细胞表达较高，在脊髓和前脑也有少量表达，GLT-1主要表达于前脑、海马、大脑皮层和纹状体等部位，GLAST和GLT-1不仅可单独表达在不同神经胶质细胞，亦可同时表达于同一细胞的不同部位。星形胶质细胞通过GLAST和GLT-1可以清除细胞间隙90%以上的谷氨酸，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤[8]。因为谷氨酸能突触没有降解递质的相应酶，只能通过突触前重摄取终止递质的传递，所以，EAATs在清除递质、终止突触传递中起重要作用，同时，EAATs通过迅速移除兴奋性突触释放出的谷氨酸，有效维持了细胞外谷氨酸的低浓度，防止了兴奋性扩布的发生，同时也限制了潜在的兴奋性毒性作用。
在帕金森病的众多病理机制中，兴奋性氨基酸的毒性作用一直是国内外研究的热点，目前的研究证据提示，突触前NMDA受体的激活等参与了谷氨酸的过度释放，通过谷氨酸受体介导的兴奋性神经毒性作用选择性导致黑质DA能神经元变性或坏死，在PD的发病中起到重要作用[9]。
EAATs功能的异常和谷氨酸摄取的下降与帕金森病的发病密切相关，Ferrarese等[10]研究了34名PD患者和21名正常人的血小板谷氨酸摄取功能，发现与对照组相比，原发性PD患者谷氨酸摄取量减少了50%，且摄取减少量与PD的严重程度有关。在6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)及其离子MPP+制造的PD鼠模型中，发现GLT-1、EAAC1表达的减少和谷氨酸摄取的下降[11-13]。当应用抑制剂阻断GLT-1后，伴有多巴胺合成限速酶—酪氨酸羟化酶磷酸化水平的降低，导致了多巴胺合成的较少[14]。然而，在PD患者和动物模型上也发现了谷氨酸转运体表达的升高，Plaitakis等[15]进行的人脑原位杂交实验结果显示，黑质多巴胺能神经元具有高表达的EAAC1，说明EAAC1与PD具有密切的相关性。同时研究表明，在GLT-1表达下降的同时伴随有EAAC1摄取谷氨酸的增加和表达的增高[11,14]。同样Massie等[16]的研究也证实，在应用6-OHDA后的第3周和第12周，GLT-1的在PD大鼠模型双侧纹状体的表达增加。这些研究提示，在PD的发病过程中，随着EAATs表达的下降，其摄取谷氨酸的能力降低，导致了细胞外谷氨酸水平的升高，胞外的谷氨酸持续作用于代谢性谷氨酸受体，激活多巴胺能神经元胞内第二信使三磷酸肌醇(inositoltriphosphate,IP3)与环腺苷二磷酸核糖，通过各自信号调控途径诱导胞内Ca2+浓度升高，引起对Ca2+敏感的K+通道开放，多巴胺能神经元胞膜超极化导致细胞死亡，同时导致能量消耗增多、自由基形成，最终引发兴奋性神经毒性效应[17]。而在PD中谷氨酸转运体表达的增加可能作为一种补偿机制来对抗谷氨酸的兴奋性毒性效应，以EAAC1为例，其在PD中表达的增加，一方面，摄取谷氨酸用来合成γ-氨基丁酸(GABA)，参与中枢神经系统抑制性GABA能神经元的突触传递，一方面，摄取半胱氨酸用来合成谷胱甘肽，对抗机体的氧自由基损伤，研究表明，机体在氧化应激条件下，中枢神经系统通过激活转录因子2-抗氧化剂应答元件通路上调神经元转运体EAAC1的表达[18]，从而提高谷胱甘肽的合成，对抗氧自由基损伤，另一方面，也有研究表明，在神经退行性疾病患者的海马，伴随有非离子表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)处理后不可溶解的EAAC1的聚集和谷氨酸摄取的降低，这种功能异常的EAAC1是活性氧对其进行了翻译后氧化修饰形成的高分子量的多聚体，参与了神经退行性疾病的发病过程[19]。
研究表明，通过上调EAATs的表达，可以减弱兴奋性毒性对神经系统的损伤，例如，头孢曲松钠能够提高谷氨酸转运体GLT-1的表达，保护多巴胺神经元免受兴奋性毒性作用，从而减弱6-OHDA造成的运动缺陷[20]，国内胡刚实验室自主研制的ATP敏感性钾通道(ATP-sensitivepotassiumchannel，KATP)开放剂埃他卡林(iptakalim，IPT)可以增强星形胶质细胞谷氨酸转运体功能，降低细胞外谷氨酸水平，从而对PD模型鼠起到一定的治疗效应[21]，显示了该类药物应用于PD治疗的前景。
EAATs主要利用Na+-K+-ATP酶形成的Na+和K+的电化学浓度梯度来完成对谷氨酸的转运，EAATs每转运一个谷氨酸分子，伴有3个Na+和1个H+同向转入细胞内，1个K+转至细胞外，而EAATs只有在胞膜上表达才能发挥正常的摄取功能[22]。
调节谷氨酸摄取功能的一个重要机制是EAATs在胞浆和胞膜之间的动态周转循环。EAATs在胞浆合成、修饰完毕后，定位表达至细胞膜表面发挥摄取功能，而胞膜上的EAATs经泛素化过程被转运至胞浆的蛋白酶体系统，在蛋白酶体系统中，EAATs被降解或改变生物活性，从而维持细胞膜上EAATs的动态水平。整个周转循环受到复杂、精细的调控，一旦周转循环异常，则导致细胞膜上的EAATs不能正常发挥功能，摄取谷氨酸的能力下降，介导兴奋性毒性作用参与帕金森病的发生和发展。
泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程，是翻译后修饰的一种常见形式。早期的研究发现，泛素与靶蛋白结合，由泛素激活酶(ubiquitin-activatingenzyme,E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugaringenzyme,E2)和泛素连接酶(ubiquitinproteinligase,E3)级联催化形成多聚泛素链，在E3酶的作用下将被泛素化的底物提交给26S蛋白酶体降解，多聚泛素链在去泛素化酶(deubiquitinenzymes,DUBs)的作用下被解离为单体，重新回到泛素循环，这个过程称为泛素蛋白酶体通路，主要参与体内蛋白质的降解，这一研究获得2004年诺贝尔化学奖。其后的研究发现，并非所有泛素化修饰都会导致蛋白质的降解，研究发现泛素化介导的非蛋白降解功能包括DNA损伤修复、信号传导、转录调节、胞吞作用和蛋白激酶活化，因此，泛素化异常与多种疾病的发生和发展有关[23]。
在泛素化过程中，泛素激活酶E1只有一种，泛素结合酶E2有20余种，而泛素连接酶E3有几千种。E1是通用的，E2、E3则具有底物特异性，即每一种E2和E3只识别、转运、结合各自特定的一种或一类蛋白。其中，泛素连接酶E3分为HECT(homologoustoE6APCterminus)家族和RING-finger家族，通过多泛素化或单泛素化将泛素分子连接到靶蛋白上，提交给蛋白酶体降解或改变靶蛋白在细胞内的定位或功能[24]。
Nedd4属于泛素连接酶E3，其在细胞膜蛋白和离子通道的泛素化过程中起重要作用，Nedd4有两个异构体:Nedd4-1和Nedd4-2。前期的研究证实Nedd4-2介导了上皮钠离子通道和电压门控钾离子通道的泛素化降解过程[25]。
泛素连接酶E3功能异常与帕金森病的发病密切相关，如Parkin(PARK2)属于一个保守的泛素样和环基序蛋白质家族，是泛素连接酶E3的一种，Parkin基因突变导致蛋白酶体活性降低、线粒体自噬、氧化应激水平增加，参与了帕金森病的发病过程[26]。神经前体细胞表达的发育下调基因4-2(NeuronalprecursorcellExpressedDevelopmentallyDown-regulated4-2,Nedd4-2)蛋白质属于泛素连接酶E3的一种，在细胞膜蛋白的泛素化过程中起作用。有研究表明，长期接触锰元素造成的锰中毒症状类似于原发性帕金森病的症状，机体通过激活PKC，导致了Nedd4-2表达的上调，促进了星形胶质细胞上谷氨酰胺转运体(glutaminetransporters)因过度泛素化而表达减少，证实Nedd4-2表达异常参与了锰中毒导致的神经系统症状[27]。目前，尚未有研究涉及Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节异常在PD发病过程中的作用及其调节分子机制，我们拟对此进行深入研究。
参考文献
[1]ChenW,ChenS,XiaoQ,WangG,ChenSD.CurrentclinicalpracticeforParkinson'sdiseaseamongChinesephysicians,generalneurologistsandmovementdisordersspecialists:anationalsurvey.BMCNeurol.2012,12:155.
[2]KimK,LeeSG,KegelmanTP,SuZZ,DasSK,DashR,DasguptaS,BarralPM,HedvatM,DiazP,ReedJC,StebbinsJL,PellecchiaM,SarkarD,FisherPB.RoleofExcitatoryAminoAcidTransporter-2(EAAT2)andGlutamateinNeurodegeneration:OpportunitiesforDevelopingNovelTherapeutics.J.Cell.Physiol.2011,226(10):2484–2493.
[3]BoehmerC,PalmadaM,RajamanickamJ,SchnieppR.Post-translationalregulationofEAAT2functionbyco-expressedubiquitinligaseNedd4-2isimpactedbySGKkinases.JNeurochem.2006,97(4):911-921.
[4]LangF,Strutz-SeebohmN,SeebohmG,LangUE.SignificanceofSGK1intheregulationofneuronalfunction.JPhysiol.2010,588(18):3349-3354.
[5]García-TardónN,González-GonzálezIM,Martínez-VillarrealJ,Fernández-SánchezE,GiménezC,ZafraF.ProteinkinaseC(PKC)-promotedendocytosisofglutamatetransporterGLT-1requiresubiquitinligaseNedd4-2-dependentubiquitinationbutnotphosphorylation.JBiolChem.2012,287(23):19177-19187.
[6]SaikiS,SatoS,HattoriN.MolecularpathogenesisofParkinson'sdisease:update.JNeurolNeurosurgPsychiatry.2012,83(4):430-436.
[7]BlandiniF.AnupdateonthepotentialroleofexcitotoxicityinthepathogenesisofParkinson'sdisease.FunctNeurol.2010,25(2):65-71.
[8]LinCL,KongQ,CunyGD,GlicksmanMA.GlutamatetransporterEAAT2:anewtargetforthetreatmentofneurodegenerativediseases.FutureMedChem.2012,4(13):1689-1700.
[9]FerraroL,O'ConnorWT,BeggiatoS,TomasiniMC,FuxeK,TanganelliS,AntonelliT.StriatalNTS1,dopamineD2andNMDAreceptorregulationofpallidalGABAandglutamaterelease-adual-probemicrodialysisstudyintheintranigral6-hydroxydopamineunilaterallylesionedrat.EurJNeurosci.2012,35(2):207-220.
[10]FerrareseC,TremolizzoL,RigoldiM,SalaG,BegniB,BrighinaL,RicciG,AlbizzatiMG,PioltiR,CrostiF,DalpràL,FrattolaL.DecreasedplateletglutamateuptakeandgeneticriskfactorsinpatientswithParkinson’sdisease.NeurolSci.2001,22(1):65-66.
[11]ChungEK,ChenLW,ChanYS,YungKK.Downregulationofglialglutamatetransportersafterdopaminedenervationinthestriatumof6-hydroxydopamine-lesionedrats.J.Comp.Neurol.2008,511(4):421–437.
[12]KojiAoyama,NobukoMatsumura,MasahikoWatabeandToshioNakaki.OxidativestressonEAAC1isinvolvedinMPTP-inducedglutathionedepletionandmotordysfunction.EuropeanJournalofNeuroscience.2008,27(1):20–30.
[13]WuJY,NiuFN,HuangR,XuY.Enhancementofglutamateuptakein1-methyl-4-phenylpyridinium-treatedastrocytesbytrichostatinA.Neuroreport.2008,19(12):1209-1212.
[14]SalvatoreMF,DavisRW,ArnoldJC,ChotibutT.TransientstriatalGLT-1blockadeincreasesEAAC1expression,glutamatereuptakeanddecreasestyrosinehydroxylasephosphorylationatser(19).ExpNeurol.2012,234(2):428-436.
[15]PlaitakisA,ShashidharanP.Glutamatetransportandmetabolismindopaminergicneuronsofsubstantianigra:implicationsforthepathogenesisofParkonson’sdisease.J.Neurol.2000,247:Ⅱ25-35.
[16]MassieA,GoursaudS,SchallierA,VermoesenK,MeshulCK,HermansE,MichotteY.Time-dependentchangesinGLT-1functioninginstriatumofhemi-Parkinsonrats.NeurochemInt.2010,57(5):572-578.
[17]MehtaA,PrabhakarM,KumarP,DeshmukhR,SharmaPL.Excitotoxicity:Bridgetovarioustriggersinneurodegenerativedisorders.EurJPharmacol.2013,698(1-3):6-18.
[18]EscartinC,WonSJ,MalgornC,AureganG,BermanAE,ChenPC,DéglonN,JohnsonJA,SuhSW,SwansonRA.Nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2facilitatesneuronalglutathionesynthesisbyupregulatingneuronalexcitatoryaminoacidtransporter3expression.TheJournalofNeuroscience.2011,31(20):7392-7401.
[19]RandallL.Woltjer,KevinDuerson,JosephM.Fullmer,MookherjeeP,RyanAM,MontineTJ,KayeJA,QuinnJF,SilbertL,Erten-LyonsD,LeverenzJB,BirdTD,PowDV,TanakaK,WatsonGS,CookDG..AberrantDetergent-InsolubleExcitatoryAminoAcidTransporter2AccumulatesinAlzheimerDisease.JNeuropatholExpNeurol.2010,69(7):667–676.
[20]LeungTC,LuiCN,ChenLW,YungWH,ChanYS,YungKK.Ceftriaxoneamelioratesmotordeficitsandprotectsdopaminergicneuronsin6-hydroxydopamine-lesionedrats.ACSChemNeurosci.2012,3(1):22-30.
[21]SunXL,ZengXN,ZhouF,DaiCP,DingJH,HuG..KATPchannelopenersfacilitateglutamateuptakebyGluTsinratprimaryculturedastrocytes.Neuropsychopharmacology.2008,33(6):1336-1342.
[22]ZerangueN,KavanaughMP.Fluxcouplinginaneuronalglutamatetransporter.Nature.1996,383(6601):634-637.
[23]TaiHC,Serrano-PozoA,HashimotoT,FroschMP,Spires-JonesTL,HymanBT.ThesynapticaccumulationofhyperphosphorylatedtauoligomersinAlzheimerdiseaseisassociatedwithdysfunctionoftheubiquitin-proteasomesystem.AmJPathol.2012,181(4):1426-1435.
[24]PickartCM.Mechanismsunderlyingubiquitination.AnnuRevBiochem.2001,70:503-533.
[25]KennethR.Hallows,VivekBhalla,NicholasM.Oyster,MarjoleinA.Wijngaarden,JeffreyK.Lee,HuiLi,SindhuChandran,XiaoyuXia,ZhirongHuang,RobertJ.Chalkley,AlmaL.Burlingame,andDavidPearce.PhosphopeptidescreenuncoversnovelphosphorylationsitesofNedd4-2thatpotentiateitsinhibitionoftheepithelialNa+channel.JBiolChem.2010,285(28):21671–21678.
[26]HauserDN,HastingsTG.MitochondrialdysfunctionandoxidativestressinParkinson'sdiseaseandmonogenicparkinsonism.NeurobiolDis.2013,51:35-42.
[27]Sidoryk-WegrzynowiczM,LeeE,MingweiN,AschnerM.DisruptionofastrocyticglutamineturnoverbymanganeseismediatedbytheproteinkinaseCpathway.Glia.2011,59(11):1732-1743。
发明内容
本发明阐明Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节效应在PD进展中的意义，揭示PD发病过程中Nedd4-2对谷氨酸转运体调节的分子机制，并且，通过设计研究Nedd4-2RNAi的PD模型，使Nedd4-2基因表达下调，从而提高谷氨酸转运体的表达，减轻谷氨酸兴奋性毒性效应，探讨了Nedd4-2作为治疗PD靶标的可能性。
本发明的目的在于提供Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
Nedd4-2作为治疗帕金森疾病靶点的应用。
蛋白Nedd4-2表达抑制剂和/或活性抑制剂在制备治疗帕金森药物中的应用。
进一步的，所述蛋白Nedd4-2表达抑制剂为能够使基因Nedd4-2沉默的物质。
进一步的，所述蛋白Nedd4-2表达抑制剂为能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列。
进一步的，所述能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列选自SEQIDNO：1～3中的至少一种。
进一步的，所述能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列为SEQIDNO：3。
进一步的，所述的Nedd4-2为鼠源Nedd4-2。
本发明的有益效果是：
1）本发明通过设计研究Nedd4-2RNAi的PD模型，使Nedd4-2基因表达下调，发现Nedd4-2基因表达下调可提高谷氨酸转运体的表达，从而减轻谷氨酸兴奋性毒性效应，说明Nedd4-2可作为治疗PD的靶标。
2）目前已有较多关于谷氨酸转运体和PD关系的研究，但是这些研究多集中在谷氨酸转运体在疾病中表达的检测上，调控机制研究相对缺乏。本发明发现Nedd4-2对谷氨酸转运体的这种调节效应参与了PD的发病，我们重点研究Nedd4-2对谷氨酸转运体的调节异常在PD发病过程中的意义，在动物模型和细胞实验水平探讨两者的相互作用及Nedd4-2浓度及活性的变化对谷氨酸转运体表达和功能的影响，分析Nedd4-2对谷氨酸转运体调节的分子机制，认证了Nedd4-2可作为治疗PD的靶标。进而指导帕金森病的基因治疗和筛选有效的抗帕金森病药物，改善帕金森病患者的生活质量。
附图说明
图1为PD小鼠出现运动障碍伴随有酪氨酸羟化酶表达降低；a为悬挂实验结果；b为爬杆试验结果；c为黑质酪氨酸羟化酶(TH)免疫组化染色检测多巴胺能神经元的染色图及该神经元细胞数的柱形统计图；d为c图的光密度检测图和柱形统计图；图中Con表示对照组；SNpc表示黑质致密部；
图2为小鼠中脑部位GLT-1、GLAST以及Nedd4-2的mRNA表达水平；图中3d表示注射MPTP后的第3天，5+1d、5+3d分别表示PD造模后的第1天和第3天；
图3为纹状体部位GLT-1、GLAST以及Nedd4-2的mRNA表达水平；图中3d表示注射MPTP后的第3天，5+1d、5+3d分别表示PD造模后的第1天和第3天；
图4为大脑皮层部位GLT-1、GLAST以及Nedd4-2的mRNA表达水平；图中3d表示注射MPTP后的第3天，5+1d、5+3d分别表示PD造模后的第1天和第3天；
图5为小鼠中脑部位GLT-1、GLAST、p-Nedd4-2以及Nedd4-2的蛋白表达水平；
图6为PD小鼠和对照小鼠纹状体GLT-1、GLAST、p-Nedd4-2以及Nedd4-2的蛋白表达水平；
图7为PD小鼠和对照小鼠大脑皮层GLT-1、GLAST、p-Nedd4-2以及Nedd4-2蛋白表达水平；
图8为MPP+对磷酸化Nedd4-2、Nedd4-2以及GLT-1表达水平的影响；图中Actin作为内参；
图9为MPP+染毒的和正常的星形胶质细胞中Nedd4-2和GLT-1的相互作用结果以及泛素化GLT-1表达水平检测结果；图a和e是以GLT-1为捕获抗体，检测Nedd4-2、EEA1以及Ub的表达；图b、c和d是以Nedd4-2为捕获抗体，检测GLT-1、GLAST和EEA1的表达；图f是以Ub为捕获抗体，检测GLT-1、Nedd4-2、GLAST和EEA1的表达；其中图c和d分别是MPP+处理24h、48h后的免疫共沉淀结果；Lysates组中各样品是与Co-IP相同的平行样品；
图10为PD小鼠和对照小鼠中脑和纹状体部位Nedd4-2与GLT-1、GLAST的相互作用及定位情况；图a和c是以Nedd4-2为捕获抗体，分别通过免疫共沉淀来检测其在中脑和纹状体中与GLT-1、GLAST的相互作用；图b和d是通过免疫荧光的方法分别检测中脑和纹状体中中GLT-1和Nedd4-2的定位情况；图Merge中黄色部分即为GLT-1和Nedd4-2的免疫荧光共定位；如白色箭头表示的GLT-1和Nedd4-2的共定位；标尺=30μm；
图11为PD小鼠和对照小鼠中脑和纹状体部位谷氨酸转运体泛素化的情况；图a和b分别是在中脑和纹状体中，以泛素为捕获抗体，通过免疫共沉淀来检测PD小鼠和对照小鼠（Con）中GLT-1、GLAST的泛素化情况；图a中上排柱形图表示的是GLT-1的单体和多聚体，下排柱形图表示的是GLAST的单聚体和多聚体；图b中上排柱形图表示的是GLT-1的单体和多聚体，下排柱形图表示的是GLAST的单聚体和多聚体；均数±标准误；*p<0.05；**p<0.01；
图12为Nedd4-2表达量降低提高了MPP+染毒星形胶质细胞GLT-1的表达和谷氨酸摄取活性；a为将50和100nM的Cy3标记的siRNA转染星形胶质细胞，24h后检测荧光表达，发现100nM浓度的转染效率较高，该浓度可应用于后续实验；b为将设计合成的3条siNedd4-2分别单独转染、及混合后转染星形胶质细胞72h，通过Westernblotting检测各组中Nedd4-2的表达；其中pool表示3条siRNA的混合物；c和d分别为将设计合成的siNedd4-2转染星形胶质细胞72h后，加入MPP+处理24、48h后，通过Westernblotting检测Nedd4-2和GLT-1的表达；e和f分别为将设计合成的siNedd4-2转染星形胶质细胞72h后，加入MPP+处理24、48h，分离细胞膜蛋白，通过Westernblotting检测星形胶质细胞细胞膜上GLT-1和GLAST的表达；g和h分别为将设计合成的siNedd4-2转染星形胶质细胞72h后，加入MPP+处理24或48h，检测星形胶质细胞的谷氨酸摄取活性；**p<0.01；#p<0.05，均数±标准误。其中*表示各组和对照组的差异，#表示MPP+组和siRNA+MPP+组的差异；
图13为抑制Nedd4-2表达可降低MPP+染毒星形胶质细胞GLT-1的泛素化；siNedd4-2转染星形胶质细胞72h后，加入MPP+处理24或48h，分别以泛素（a和b）和GLT-1（c和d）为捕获抗体，通过免疫共沉淀检测泛素化GLT-1的表达；
图14为注射含有shNedd4-2的慢病毒后制备PD小鼠模型，通过行为学实验（a和b）和免疫组化（c）检测Nedd4-2干扰后对PD小鼠病情变化的影响；图中的shRNA也为shNedd4-2；
图15为注射含Nedd4-2干扰序列的慢病毒后制备PD小鼠模型，取材中脑，检测各种组谷氨酸转运体的表达情况（a）及相关激酶的表达量及磷酸化情况（b）；图中的shNedd4-2指包含Nedd4-2干扰序列的shRNA慢病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
本发明拟探讨Nedd4-2在帕金森病发病过程中的意义和分子作用机制，分析在PD进展的不同阶段，Nedd4-2浓度及活性的变化对作用底物表达、活性的影响和分子机制，观测Nedd4-2与PD病情的关系，探讨Nedd4-2作为PD治疗靶标的可能性。
实施例1：帕金森病小鼠模型的制备
原理：神经毒素MPTP经星形胶质细胞中的单胺氧化酶B催化形成的体内活性代谢产物MPP+，经多巴胺转运体转运进入神经元胞体内，抑制线粒体呼吸链复合物I，导致多巴胺能神经元的退行性变，因此我们选择C57/bl小鼠腹腔注射MPTP来制备帕金森病模型。谷氨酸转运体GLAST和GLT-1主要在星形胶质细胞上表达，并且星形胶质细胞通过GLAST和GLT-1可以清除细胞间隙90%以上的谷氨酸，从而保护神经元免受谷氨酸兴奋性毒性损伤，本实施例主要通过建立PD模型来研究PD中谷氨酸转运体GLT-1和GLAST的表达和活性变化及其相关的调控机制。
方法：12周龄健康雄性C57/bl小鼠(体重约25-30g)，随机分为正常对照组和MPTP建造PD模型组。腹腔注射MPTP20mg/kg，每天注射1次，共计5天，完成PD造模。在注射后（PD造模后）的第3天，各组取一定量小鼠进行行为学试验（悬挂试验和爬杆试验），以及取一定量小鼠，分离大脑，对中脑和纹状体黑质致密部的酪氨酸羟化酶(tyrosinehydroxylase,TH)进行免疫组化染色检测。
结果：在造模后的第3天，悬挂试验（图1a）显示了PD小鼠的悬挂时间显著缩短，爬杆试验（图1b）显示了PD小鼠爬杆时间显著延长；且PD小鼠较正常对照小鼠出现明显的立毛、震颤、行动迟缓等帕金森样表现，说明注射MPTP小鼠出现了运动行为障碍。对中脑和纹状体进行的酪氨酸羟化酶免疫组化染色显示，PD组在中脑和纹状体区域酪氨酸羟化酶的表达显著下降（图1c和1d），图1c统计图表示TH阳性的细胞数目，由于纹状体多是多巴胺神经元的纤维末端，不便于进行细胞数目的统计，因此，图1d统计图表示纹状体TH阳性的光密度值。均数±标准误。*p<0.05；**p<0.01。标尺=40μm。上述行为学试验和酪氨酸羟化酶染色证实了我们造模成功。
实施例2小鼠大脑各区域谷氨酸转运体及Nedd4-2的mRNA表达水平的检测
方法：应用MPTP腹腔注射制造PD小鼠模型（具体方法同实施例1），在注射MPTP后的第3天，以及PD造模后的第1天和第3天，各取一定量小鼠，分离中脑、纹状体和大脑皮层，通过qPCR检测各部位GLT-1、GLAST以及Nedd4-2的mRNA表达。均数±标准误。*p<0.05；**p<0.01。
结果：
图2显示在中脑部位，造模后3天PD小鼠中的GLT-1mRNA表达水平明显上调。
图3显示在纹状体，MPTP注射3天，造模后1天和造模后3天GLT-1mRNA水平在PD组显著降低，造模后3天GLAST和Nedd4-2mRNA水平在PD组显著降低。
图4显示在大脑皮层，造模后3天GLT-1和GLASTmRNA水平在PD组表达显著降低。
从图2~4中，可以看出，纹状体在注射MPTP的第3天和造模成功后的第1天以及第3天，GLT-1mRNA水平在PD组均出现了显著的降低（图3a，d和g），而在大脑皮层，仅在造模成功后第3天GLT-1mRNA水平在PD组出现了显著的降低（图4g）。GLAST则在纹状体和大脑皮层于造模成功后第3天mRNA水平在PD组出现了显著的降低（图3h和图4h）。中脑黑质部位在造模成功后第3天PD组比对照组GLT-1mRNA表达水平出现了显著的升高（图2g）。纹状体在造模成功后第3天PD组比对照组Nedd4-2mRNA表达水平出现了显著的降低（图3i），其它部位及时间点Nedd4-2在PD组和对照组mRNA水平并未显示显著差异。
实施例3小鼠大脑各区域中GLT-1、GLAST、p-Nedd4-2以及Nedd4-2蛋白表达水平的检测
方法：应用MPTP腹腔注射制造PD小鼠模型（具体方法同实施例1），在注射MPTP后的第3天（3d），以及PD造模后的第1天（5+1d）和第3天（5+3d），各取一定量小鼠，分离中脑、纹状体和大脑皮层，通过Westernblotting检测各部位GLT-1、GLAST、p-Nedd4-2以及Nedd4-2的蛋白表达水平，应用ImageJ软件进行数据统计分析。均数±标准误，*p<0.05。黑质是中脑的最大核团，但是由于黑质体积很小不易取材，因此在本实验中我们分离中脑并进行相应检测。另外，统计图形中磷酸化Nedd4-2的表达为p-Nedd4-2和Nedd4-2灰度值的百分比。
图5显示，造模后3天，PD小鼠中脑GLT-1表达较对照组显著下降。
图6显示，MPTP注射3天后，PD小鼠纹状体中GLAST和p-Nedd4-2表达下降；造模后3天PD小鼠纹状体中GLT-1和GLAST表达下降。
图7显示，PD组和对照组大脑皮层中GLT-1和GLAST表达无显著差异。
从图5~7中，可以看出，在造模成功后第3天，PD组中脑和纹状体中的GLT-1表达显著降低（图5和图6），而在注射MPTP的第3天和造模成功后第3天，纹状体PD组比对照组GLAST的表达显著降低（图6）。纹状体的Nedd4-2在注射MPTP的第3天PD组比对照组表达显著降低（图6）。
从上述实施例2和3中的结果可以得出：
1）在PD造模后伴随有谷氨酸转运体在蛋白和mRNA水平表达的降低，说明谷氨酸转运体表达的降低参与了PD的发病；
2）本部分主要检测了Nedd4-2在蛋白和mRNA水平表达的变化，但是PD组磷酸化和总的Nedd4-2在三个不同时间点的表达并未发现与对照组有显著差异，因此在这里还并不能说明Nedd4-2与PD有关系；
3）蛋白和mRNA的表达水平检测结果中并未发现Nedd4-2与谷氨酸转运体表达量之间的关联。
实施例4MPP+对磷酸化Nedd4-2、Nedd4-2以及GLT-1表达水平的影响
神经毒素MPTP经星形胶质细胞中的单胺氧化酶B催化形成的体内活性代谢产物MPP+，经多巴胺转运体转运进入神经元胞体内，抑制线粒体呼吸链复合物I，导致多巴胺能神经元的退行性变，由于MPP+首先在星形胶质细胞内代谢生成，其对星形胶质细胞的毒性作用也倍受关注，目前MPP+也成为了研究星形胶质细胞功能的常用造模毒素，研究表明，MPP+能够降低谷氨酸转运体的表达，影响谷氨酸的摄取，谷氨酸转运体主要表达在神经胶质细胞上，因此我们选择MPP+作为帕金森病造模的神经毒素。
方法：制备C57/bl乳鼠的原代星形胶质细胞，将原代星形胶质细胞分为溶剂对照组和神经毒素MPP+处理组，选择1000μMMPP+作为工作浓度，加入对照溶剂和神经毒素作用后，细胞置于37℃，5%CO2孵箱培养24h、48h后，收集细胞，采用免疫印迹杂交法分别检测各组细胞中GLT-1、Nedd4-2以及磷酸化Nedd4-2的表达水平。
结果：检测结果如图8所示，从中可以看出，经MPP+处理48h后，GLT-1的表达量下降最为明显，磷酸化Nedd4-2和Nedd4-2在两组中的表达量并未发现明显的差异。
上述结果说明在MPP+染毒星形胶质细胞上伴随有GLT-1表达的降低。
实施例5PD模型中Nedd4-2和GLT-1的相互作用情况以及泛素化GLT-1的表达情况
方法：利用MPP+作为帕金森病造模的神经毒素处理C57/bl乳鼠原代星形胶质细胞（具体方法同实施例4），分别处理24h、48h后，收集细胞，测定蛋白浓度后，分别以Nedd4-2、GLT-1和Ub为捕获抗体，通过免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)法检测Nedd4-2与GLT-1的相互作用情况和泛素化GLT-1的表达情况。
结果：
检测结果如图9所示，在MPP+染毒星形胶质细胞中，不管以Nedd4-2或GLT-1为捕获抗体，均证明Nedd4-2和GLT-1的相互作用相比对照组明显增强（图9a和b）；GLAST与Nedd4-2的相互作用不管在对照组还是MPP+组，其差异不明显（图9b）。
佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)可以促进Nedd4-2和GLT-1的相互作用，我们把PMA组作为阳性对照，检测Nedd4-2与GLT-1、GLAST的相互作用（图9c和d），其结果与图9b相似，同样可以看出在MPP+染毒星形胶质细胞上Nedd4-2与GLT-1、EEA1的相互作用明显增强（图9c和d）。
在以GLT-1或者泛素为捕获抗体的实验中，发现在MPP+染毒星形胶质细胞上伴随有GLT-1的泛素化，但是并未发现MPP+染毒星形胶质细胞上GLAST的泛素化（图9e和f）。这些结果证实在MPP+染毒星形胶质细胞上Nedd4-2确实导致了GLT-1的泛素化，而GLAST并未发生泛素化。另外，本实施例还发现GLT-1和早期核内体标志物—早期内吞体相关蛋白1(earlyendosomeantigen1,EEA1)具有相互作用，且该相互作用在MPP+组中明显增强（图9a），提示GLT-1泛素化后，有可能会通过EEA1在溶酶体内进行降解。
上述结果说明，在MPP+染毒星形胶质细胞上，Nedd4-2可以促进GLT-1的泛素化，从而导致更多的GLT-1被泛素化降解，加重了谷氨酸的兴奋性毒性对星形胶质细胞的损伤。
实施例6PD小鼠体内Nedd4-2与GLT-1、GLAST的相互作用情况
方法：应用MPTP腹腔注射制造PD小鼠模型（具体方法同实施例1），在PD造模后的第3天，各取一定量小鼠，利用免疫共沉淀的方法检测PD小鼠中脑和纹状体中Nedd4-2与GLT-1、GLAST的相互作用情况。利用免疫荧光的方法检测PD小鼠中脑和纹状体中Nedd4-2与GLT-1的共定位情况。
结果：
检测结果如图10所示，在PD模型上，通过免疫共沉淀我们发现在中脑部位GLT-1、GLAST与Nedd4-2在PD组的相互作用要比对照组强，以GLAST和Nedd4-2的相互作用较为明显（图10a）。而在纹状体部位GLT-1与Nedd4-2在对照组显示有明显的相互作用，GLAST和Nedd4-2的相互作用在PD组和对照组相比并未显示明显的差异（图10c）。中脑和纹状体的免疫荧光结果也证实了免疫共沉淀的结果，GLT-1和Nedd4-2的相互作用在PD小鼠的中脑部位更加明显，而在纹状体部位正好相反（图10b和d）。
上述结果说明在PD小鼠的中脑伴随有Nedd4-2与谷氨酸转运体的相互作用。
实施例7PD小鼠和对照小鼠中脑和纹状体部位谷氨酸转运体泛素化的水平检测
方法：应用MPTP腹腔注射制造PD小鼠模型（具体方法同实施例1），在PD造模后的第3天，各取一定量PD小鼠，应用免疫共沉淀检测其中脑和纹状体中谷氨酸转运体的泛素化水平。
结果：
检测结果如图11所示，在中脑倍位，从图11a左边的western结果中可以看出，以泛素为捕获抗体，EAATs（谷氨酸转运体）的泛素化主要在单聚体部位检测出，但是只有GLAST的泛素化在PD组比对照组有差异，PD组GLAST的泛素化水平高于对照组；GLT-1泛素化水平在两组之间无显著差异（图11a）。
在纹状体中，在多聚体部位泛素化的GLT-1和GLAST在PD组的表达较对照组均显著增强，而在单聚体部位仅有GLAST在PD组显示和对照组有显著差异（图11b）。
上述结果说明在PD小鼠的中脑伴随有谷氨酸转运体的泛素化。
实施例8Nedd4-2RNA干扰后谷氨酸转运体表达水平及活性检测
方法：制备小鼠原代星形胶质细胞；设计合成3条Nedd4-2的小干扰RNA序列（smallinterferenceRNA,siRNA）序列，并分别构建成RNAi载体，用于转染细胞；实验分为对照组和Nedd4-2siRNA转染组。
上述3条siRNA的序列分别为：
siRNA-1：5’-GCCAUCAGUGGCCUAUGUAdTdT-3’（SEQIDNO：1）；
siRNA-2：5’-GCAGAAAUACGACUACUUUdTdT-3’（SEQIDNO：2）；
siRNA-3：5’-GGUCCUCAGCUGUUUACAAdTdT-3’（SEQIDNO：3）；
1）将上述合成的Nedd4-2siRNA转染星形胶质细胞，72h后通过Westernblotting检测Nedd4-2的表达量，对Nedd4-2RNA干扰进行鉴定。
2）将上述合成的Nedd4-2siRNA转染星形胶质细胞，72h后加入MPP+分别处理24、48h，然后裂解细胞，提取总蛋白、测定浓度。经SDS-PAGE蛋白电泳后进行半干免疫印迹杂交，检测GLT-1蛋白表达情况，用目的蛋白灰度值与内参β-actin灰度值之比进行半定量分析（如图12c和d所示）。
3）生物素化实验检测细胞膜表面谷氨酸转运体蛋白的表达：将上述合成的Nedd4-2siRNA转染星形胶质细胞，72h后加入MPP+分别处理24、48h，WesternBlot检测总蛋白后，进一步运用生物素化实验分离细胞膜蛋白，运用SDS-PAGE和免疫印迹杂交检测谷氨酸转运体（GLT-1和GLAST）在细胞膜上的表达，通过与总蛋白表达的比较，揭示蛋白水平上谷氨酸转运体在胞膜和胞浆的周转循环机制。
4）检测谷氨酸转运体的转运活性：将上述合成的Nedd4-2siRNA转染星形胶质细胞，72h后加入MPP+分别处理24、48h，进行谷氨酸转运体活性检测。首先用氯化胆碱(ChCl)溶液洗涤细胞二次，然后每孔细胞加入200μl3H标记的底物(0.4μCi/孔)室温孵育10分钟后吸去标记底物，冰浴NaCl溶液洗涤二次后加入1%SDS溶液裂解细胞，加入闪烁液用液体闪烁计数仪检测转运至细胞内3H标记底物的放射性活性大小。
结果：
检测结果如图12所示，本实施例设计并合成了针对Nedd4-2的siRNA，通过转染红色荧光染料Cy3标记的siRNA转染细胞，我们发现100nMsiRNA转染效率较高（图12a），该浓度可应用于后续实验。3条siRNA分别单独转染、及混合后转染星形胶质后，发现干扰效率较高的siRNA为siRNA3（以下简称siNedd4-2），其序列为5’-GGUCCUCAGCUGUUUACAAdTdT-3’（SEQIDNO：3）；其工作浓度为100nM（图12b）。
在确定了干扰序列后，我们应用siNedd4-2和MPP+处理星形胶质细胞，通过Westernblotting，我们发现应用siNedd4-2可以提高MPP+染毒星形胶质细胞上谷氨酸转运体GLT-1在细胞膜和总蛋白水平的表达（图12c~f）。同时我们发现GLAST在细胞膜上的表达水平在加入siNedd4-2出现了明显的下降（图12e和f）。我们进一步检测了siNedd4-2和MPP+处理后的星形胶质细胞谷氨酸摄取活性，MPP+处理24h后，siNedd4-2和MPP+处理组星形胶质细胞谷氨酸摄取活性（57.1±0.5%）显著高于MPP+单独处理组（38.1±2.3%），见图12g；而在MPP+处理48h后，加入siNedd4-2并未显著影响MPP+染毒星形胶质细胞的谷氨酸摄取活性（23.7±2.4%和27.0±1.5%，相对于对照组），见图12h。
上述结果说明将Nedd4-2表达下调后提高了GLT-1在细胞膜和总蛋白的表达水平，以及星形胶质细胞对于谷氨酸的摄取活性。
实施例9Nedd4-2RNA干扰后谷氨酸转运体泛素化水平的检测
方法：siNedd4-2转染星形胶质细胞72h后，加入MPP+处理24或48h，分别以泛素和GLT-1为捕获抗体，通过免疫共沉淀检测泛素化GLT-1的表达。
结果：
检测结果如图13所示，以Ub为捕获抗体，发现在加入siNedd4-2后，伴随有MPP+染毒星形胶质细胞上泛素化GLT-1表达水平的降低（图13a和b）。而以GLT-1为捕获抗体，发现在加入siNedd4-2后，伴随有MPP+染毒星形胶质细胞上与GLT-1结合的泛素表达水平的降低（图13c和d）。
上述结果说明抑制Nedd4-2的表达可降低MPP+染毒星形胶质细胞中GLT-1的泛素化，从而有利于细胞的解毒。
实施例10Nedd4-2RNA干扰后对PD小鼠有一定的保护作用
方法：在PD小鼠的黑质立体定位注射包含Nedd4-2干扰序列5’-GGUCCUCAGCUGUUUACAAdTdT-3’（SEQIDNO：3）的短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）慢病毒载体（以下简称shNedd4-2），慢病毒实施同细胞实验，在注射慢病毒第5天后，腹腔注射MPTP制备PD模型，在末次注射3天后，进行动物行为学测试以及通过免疫组化检测中脑部位酪氨酸羟化酶的表达水平。
结果：
检测结果如图14所示，大脑黑质注射含有shNedd4-2的慢病毒后缩短了PD小鼠的爬杆时间（a），提高了PD小鼠的悬挂时间（b）。注射含有shNedd4-2的慢病毒后提高了中脑酪氨酸羟化酶的表达水平（c）。
上述结果说明在黑质中降低Nedd4-2表达对PD小鼠显示有一定的保护作用。
实施例11Nedd4-2干扰后通过SGK/PKC通路提高了PD小鼠中脑EAATs的表达
方法：在PD小鼠的黑质立体定位注射包含Nedd4-2干扰序列的慢病毒，在注射慢病毒第5天后，腹腔注射MPTP制备PD模型，在末次注射3天后，取材中脑，通过免疫印迹杂交检测谷氨酸转运体和相关信号通路的表达变化。
结果：
检测结果如图15a所示，小鼠黑质定位注射含Nedd4-2干扰序列的慢病毒后提高了中脑谷氨酸转运体亚型GLAST在总蛋白中的表达水平，图15b中，注射含Nedd4-2干扰序列的慢病毒后降低了中脑磷酸化蛋白激酶C(proteinkinaseC,PKC)的表达量，提高了血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(serumandglucocorticoidinducedkinase,SGK)磷酸化的表达量，预测Nedd4-2干扰后通过SGK/PKC通路对EAATs的表达进行了调控。
以上结果说明Nedd4-2干扰后提高了PD小鼠黑质谷氨酸转运体的表达，说明Nedd4-2有可能是治疗PD的一个靶标，并且也发现了相关的调控机制，有利于进一步研发针对Nedd4-2的相关药物和制剂。综上所述，在PD进展的不同阶段伴随有谷氨酸转运体表达和活性的降低，说明谷氨酸转运体表达的降低参与了PD的发病。Nedd4-2通过介导EAATs的泛素化导致了其表达和活性的降低，在细胞和动物模型上将Nedd4-2表达降低后提高谷氨酸转运体的表达和转运活性，降低谷氨酸对神经系统的兴奋性毒性效应，改善PD临床症状；说明Nedd4-2可作为治疗PD的靶标。可将能够抑制蛋白Nedd4-2表达的人工合成物质（如抑制Nedd4-2表达的dsRNA、RNAi序列）或筛选出的可特异性抑制蛋白Nedd4-2活性的化合物作为制备治疗帕金森的药物。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110>南方医科大学
<120>Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>T
<222>(20)..(21)
<223>碱基T即为dT
<400>1
gccaucaguggccuauguatt21
<210>2
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>T
<222>(20)..(21)
<223>碱基T即为dT
<400>2
gcagaaauacgacuacuuutt21
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>T
<222>(20)..(21)
<223>碱基T即为dT
<400>3
gguccucagcuguuuacaatt21

Claims (7)

1.Nedd4-2作为治疗帕金森疾病靶点的应用。
2.蛋白Nedd4-2表达抑制剂和/或活性抑制剂在制备治疗帕金森药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白Nedd4-2表达抑制剂为能够使基因Nedd4-2沉默的物质。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述蛋白Nedd4-2表达抑制剂为能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列选自SEQIDNO：1～3中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述能够对基因Nedd4-2进行RNA干涉的序列为SEQIDNO：3。
7.根据权利要求1、2、3、5或6所述的应用，其特征在于：所述的Nedd4-2为鼠源Nedd4-2。
CN201511031368.5A 2015-12-30 2015-12-30 Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用 Pending CN105535977A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031368.5A CN105535977A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201511031368.5A CN105535977A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105535977A true CN105535977A (zh) 2016-05-04

Family

ID=55815850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201511031368.5A Pending CN105535977A (zh) 2015-12-30 2015-12-30 Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105535977A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636199A (zh) * 2016-12-02 2017-05-10 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005024024A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Bionomics Limited Mutations in the nedd4 gene family in epilepsy and other cns disorders
CN101241127A (zh) * 2002-06-04 2008-08-13 弗洛里安·朗 用作诊断和治疗靶标的Sgk和Nedd
CN104673762A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 江苏大学 抗泛素连接酶Nedd4-1的特异性抗体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101241127A (zh) * 2002-06-04 2008-08-13 弗洛里安·朗 用作诊断和治疗靶标的Sgk和Nedd
WO2005024024A1 (en) * 2003-09-10 2005-03-17 Bionomics Limited Mutations in the nedd4 gene family in epilepsy and other cns disorders
CN104673762A (zh) * 2015-01-19 2015-06-03 江苏大学 抗泛素连接酶Nedd4-1的特异性抗体及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARTA SIDORYK-WEGRZYNOWICZ ET AL.: "Disruption of astrocytic glutamine turnover by manganese is mediated by the protein kinase C pathway.", 《GLIA》 *
瞿少刚等: "泛素连接酶E3 Nedd4-2对PD模型中谷氨酸转运体表达的调节机制", 《中华医学会第十八次全国神经病学术会议论文汇编（下）》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106636199A (zh) * 2016-12-02 2017-05-10 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 用CRISPR/Cas9技术易于筛选获得目的基因敲除细胞系的方法及产品

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice
Wang et al. α2A-adrenoceptors strengthen working memory networks by inhibiting cAMP-HCN channel signaling in prefrontal cortex
Mathew et al. Novel drugs and therapeutic targets for severe mood disorders
Corti et al. What genetics tells us about the causes and mechanisms of Parkinson's disease
Sando et al. HDAC4 governs a transcriptional program essential for synaptic plasticity and memory
Cenci Dopamine dysregulation of movement control in L-DOPA-induced dyskinesia
Kawai et al. Long-term selective stimulation of transplanted neural stem/progenitor cells for spinal cord injury improves locomotor function
Dubinsky Towards an understanding of energy impairment in Huntington’s disease brain
Borger et al. Is amyloid binding alcohol dehydrogenase a drug target for treating Alzheimer's disease?
Contreras et al. c-Abl inhibition activates TFEB and promotes cellular clearance in a lysosomal disorder
Volonté et al. Histamine beyond its effects on allergy: Potential therapeutic benefits for the treatment of Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS)
Caballero et al. Insights into the Mechanisms Involved in Protective Effects of VEGF‐B in Dopaminergic Neurons
Pierucci et al. Nitric oxide modulation of the basal ganglia circuitry: therapeutic implication for Parkinson's disease and other motor disorders
Parekh et al. A cleaning crew: the pursuit of autophagy in Parkinson’s disease
Wang et al. microRNA‐454‐mediated NEDD4‐2/TrkA/cAMP axis in heart failure: Mechanisms and cardioprotective implications
Wang et al. CaMKII activation state underlies synaptic labile phase of LTP and short-term memory formation
Sellnow et al. Striatal Nurr1 facilitates the dyskinetic state and exacerbates levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease
Chen et al. Mood stabilizers regulate cytoprotective and mRNA-binding proteins in the brain: long-term effects on cell survival and transcript stability
Dumbhare et al. A review of genetic and gene therapy for Parkinson’s disease
Cesaroni et al. Dyskinesia and Parkinson’s disease: animal model, drug targets, and agents in preclinical testing
Mongin et al. Selective vulnerability of synaptic signaling and metabolism to nitrosative stress
Dong et al. miR-214-3p promotes the pathogenesis of Parkinson's disease by inhibiting autophagy
Fernández-Alvarez et al. Update on pediatric dystonias: etiology, epidemiology, and management
CN105535977A (zh) Nedd4-2在帕金森病治疗中的应用
McGrady et al. Ocular stress enhances contralateral transfer of lenadogene nolparvovec gene therapy through astrocyte networks

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Ji Shaogang

Inventor after: Zhang Yunlong

Inventor after: He Xiaoliang

Inventor after: Zhang Xiuping

Inventor after: Wu Xiaojuan

Inventor after: Tong Huichun

Inventor after: Lu Lingli

Inventor after: Qin Sheng

Inventor before: Ji Shaogang

Inventor before: Wu Xiaojuan

Inventor before: Zhang Xiuping

Inventor before: He Xiaoliang

Inventor before: Tong Huichun

Inventor before: Zhang Yunlong

Inventor before: Meng Xingjun

Inventor before: Zhang Wenlong

RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160504