CN104212778A - 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用，由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；pMD18载体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。本发明使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。

Description

基于 TALEN 和 pMD18 载体的定点突变系统及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于TALEN和pMD18载体的人类AR基因定点突变系统及其基因组水平定点突变系统的应用。

背景技术

基因组靶向修饰是近年来生命科学研究的热点之一，特别是在基因治疗人类疾病方面，基因组靶向修饰具有广阔的应用前景。通过转基因或者基因敲除等操作改变基因的遗传组成，获得满足各种需要的基因工程工具。传统较常用的转基因方法为质粒稳定转染法、反转录病毒携带法和同源重组法。但质粒转染稳定筛选的插入位点随机，且需要抗生素维持，容易导致非正常的细胞表型；而反转录病毒携带目的基因的效率虽高，但是插入位点不确定，影响其它内源基因的表达，限制了该方法的应用；另外，同源重组法虽然可以定点插入，但是成功率很低（重组概率为10^-6-10^-7）。

目前，基因组工程学中的三大利器为：ZFN（Zinc Finger Nucleases）、TALEN（Transcription Activator-like Effector Nuclease）和CRISPR/Cas9。

ZFN是指锌指蛋白，是转录因子，每个模块识别3-4个碱基序列，将这些模块混合搭配，可以靶定任何序列，然后，通过C末端的Fok I核酸内切酶结构域可以切断双链DNA分子。Sangamo生物科学公司和Sigma- Aldrich公司已经将ZFN技术商业化，推出CompoZr® ZFN平台。但是，由于锌指蛋白之间存在相互作用，锌指模块与DNA序列之间没有一个简单的对应关系，所以以锌指蛋白为基础设计针对序列特异性DNA结合蛋白依然是个难题，并且花费昂贵，经常要做大规模的筛选，构建过程长达几周至数月。

CRISPR/Cas9系统是由短的向导RNA介导，Cas9核酸酶在特定的双链DNA位点上产生断裂。CRISPR/Cas可通过添加多个向导RNA而实现多重编辑。然而，由于向导RNA序列比ZFN或TALEN所靶定的序列短，致使脱靶效应高。但Church最近发现，通过利用Cas9的一种突变形式（只切割单链DNA）和两个紧挨着的向导RNA，有可能大大提高系统的切割位点保真性，降低脱靶效应。

TALEN技术是一种崭新的分子生物学工具。TALEN是转录激活样效应因子，来源于黄单胞杆菌。利用TALEN蛋白的核酸结合结构域的氨基酸序列与核酸序列有恒定的对应关系，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，再通过添加非特异内切酶Fok I结构域，TALEN蛋白在理论上可以靶向切割任意基因组DNA双链。TALEN蛋白中DNA结合域为高度保守的重复单元，每个重复单元含有34个氨基酸，除了第12和13位氨基酸变化外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基（repeatvariable di-residues，RVD），与碱基识别相关。TALEN识别DNA的机制在于每个重复序列的RVD可以特异识别DNA的1个碱基，HD特异识别C碱基，NI识别A碱基，NN识别G碱基，NG识别T碱基。另外，通过对天然TALEN的研究发现，TALEN蛋白框架固定识别1个T碱基，所以TALEN的识别序列总是以T碱基开始。

在真核细胞内，TALEN切割的双链DNA，可以激活两条保守的DNA修复通路。非同源末端连接修复（non-homologous end joining，NHEJ），细胞基本上磨平断裂DNA的两端，再将其彼此拉近，将断裂的染色体重新连接，这个过程往往产生移码，或者在断裂位点引进小片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（homology-directed repair，HDR）是指利用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，从而实现特定突变或导入外源DNA序列的目的。在本发明专利中，采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑。

TALEN技术可以广泛的应用于基因组编辑的各个方面：细胞水平的基因敲除，定点突变，结构域缺失，定点整合等等，在疾病治疗领域具有广泛的应用前景。目前TALEN 技术主要的缺陷是效率相对较低，一般在5%-20%，无法直接获取100%编辑的细胞，只能通过挑选阳性的单克隆细胞，扩增成为稳定株。在本发明专利中，采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用，采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，所述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；所述pMD18载体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。

所述定点突变系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。

一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法如下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；

所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-KO，所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，不表达AR蛋白。

所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R；所述pMD18载体包括pMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，所述细胞株RWPE-E872Q为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，所述细胞株RWPE-H874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，所述细胞株RWPE-T877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，所述细胞株RWPE-T877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。

所述构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，所述细胞株RWPE-M886I为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。

所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R；所述pMD18载体包括pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸。

所述人细胞株转染的pMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。

本发明的有益效果如下：

本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用，由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒组成，并将该相应质粒转染入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突变的AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。

本发明采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。

附图说明

图1为人类雄激素受体AR蛋白的结构示意图和mRNA的结构示意图：其中，深色框显示AR蛋白的结构域，包括：转录激活区、DNA结合区、铰链区和配体结合区，及各自对应的外显子；黑色框显示Q重复区，为富含谷氨酰胺残基的区域；箭头标识突变位点；

图2 为人类雄激素受体AR基因的序列图，AR基因由8个外显子和7个内含子组成，下划线的序列为外显子序列；框出的序列为TALEN的识别位点；箭头指示出点突变的目标碱基和本发明人工改造的替换碱基；其他序列已经省略；

图3 为pMD18载体骨架的示意图；

图4为 TALEN识别序列的上游（左）同源臂序列；

图5为TALEN识别序列的下游（右）同源臂序列；

图6 为TALEN Mut1E872Q识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut1的突变位点G/C；

图7 为TALEN Mut2 H874Y识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut2的突变位点C/T；

图8 为TALEN Mut3 T877A识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut3的突变位点A/G；

图9 为TALEN Mut4 T877S识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut4的突变位点A/T；

图10 为TALEN Mut5 M886I识别序列上游的同源臂序列，带入突变体Mut5的突变位点G/T；

图11 为TALEN Mut识别序列下游的同源臂序列；

图12 为TALEN识别位点的上下游同源臂扩增电泳结果，TALEN Mut 识别位点的上游5种同源臂，分别带入人类雄激素受体AR基因的5种定点突变，和TALEN Mut识别位点下游的同源臂的扩增电泳图，M为DL2000，自上而下的条带大小分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。

本发明中基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；pMD18载体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。

定点突变系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；目标基因为人类雄激素受体AR基因，所述的DNA序列为核苷酸序列。

本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，包括细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用，所述细胞株的构建方法如下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；

本发明定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-KO，所述细胞株细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，不表达AR蛋白。

本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R，核酸酶TALEN-L识别序列如SEQ ID NO.1所示，核酸酶TALEN-R识别序列如SEQ ID NO.2所示；pMD18载体包括pMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸，pMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列如图4所示核苷酸，pMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列如图5所示核苷酸。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，细胞株RWPE-E872Q为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，细胞株RWPE-H874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，细胞株RWPE-T877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，细胞株RWPE-T877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。

本发明中构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，细胞株RWPE-M886I为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。

本发明中核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R，核酸酶TALEN Mut L识别序列如SEQ ID NO.3所示，核酸酶TALEN Mut R识别序列如SEQ ID NO.4所示； pMD18载体包括pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸，pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列如图6-11所示核苷酸，pMD18载体的第8外显子下游的的同源右臂序列如图12所示核苷酸。

本发明中人细胞株转入的pMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。

本发明的第一方面，提供2对剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN质粒，分别在人类AR基因的2个位点切断DNA双链，造成定点插入外源同源重组序列的位点。其中，TALEN-L的识别序列如SEQ ID NO.1所示，TALEN-R的识别序列如SEQ ID NO.2所示。TALEN Mut L的识别序列如SEQ ID NO.3所示，TALEN Mut R的识别序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的第二方面，提供5种定点改造人类AR基因的同源重组质粒，质粒的骨架为pMD18载体，带有嘌呤霉素抗性基因。定点改造的人类AR基因序列如图6-11所示，扩增同源序列的引物如SEQ ID NO.9-19所示。

进一步，提供AR敲除的同源臂扩增引物如SEQ ID NO.5-8所示。

本发明的第三方面，提供一种构建稳定表达人类AR点突变体的细胞株的方法，该细胞株的构建方法使用上述2对TALEN质粒中的一对，分别与5种同源重组模板pMD18质粒组合。用脂质体包裹质粒混合物转染人类正常前列腺细胞系RWPE-1，嘌呤霉素筛选出稳定整合点突变AR基因的细胞株，并传代、冻存、建系。

本发明的第四方面，采用上述方法构建的5种细胞株： RWPE-E872Q，RWPE-H874Y，RWPE-T877A，RWPE-T877S和RWPE-M886I。遗传背景清楚，可以稳定传代，点突变AR表达稳定，有嘌呤霉素抗性。

具体操作过程按照下面步骤进行：

（1）根据需整合到受体细胞基因组上的位置而设计出识别特异序列的TALEN；

（2）根据设计出的TALEN靶点序列构建TALEN质粒，同时，构建外源基因质粒；

（3）将TALEN质粒和外源基因共同转染受体细胞，TALEN 质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处整合进入受体基因组；

（4）对转染后的受体细胞进行稀释培养，嘌呤霉素筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合要求的阳性细胞克隆。

（5）所述的转染后得到的细胞克隆采用核酸PCR技术或测序进行鉴定，对外源基因在受体细胞基因组上整合的细胞克隆传达、冻存、建系。

本发明实施例中未注明具体条件的实验方法。通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 涉及的化学试剂盒、生物制品，如未特殊说明，表明它们均为商品化产品。

TALEN试剂盒购自上海斯丹赛生物技术有限公司。用于原代细胞/普通细胞/肿瘤细胞基因打靶的专用TALEN载体包括10个，左右臂各5个，它们均含有CMV启动子，NLS，N端，C端，Fok I，嘌呤霉素抗性基因（仅在左臂）等基本结构。载体间的不同之处在于TALEN识别序列的最后一个碱基的不同，分为A/T/C/G四种，此外，包括一个带有EGFP荧光标记的TALEN右臂。左右臂骨架的Fok I序列不同，在TALEN作用时，Fok I酶会形成一个异源二聚体的结构，大大增加TALEN切割的效率。

pMD18载体购自上海斯丹赛生物技术有限公司，经本发明发明人改建插入左右同源重组臂。

实施例中使用的细胞为人类正常前列腺细胞系RWPE-1，购自ATCC。

实施例 1

人类雄激素受体基因 AR 序列分析

从NCBI数据库下载人类雄激素受体基因AR的序列（NG_009014.2）。序列分析显示该基因包括8个外显子，7个内含子，如图2所示。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和第三外显子为理想的敲除靶标位点，本实施例以第二外显子为敲除靶序列。

序列的设计

根据人类雄激素受体基因AR的序列特征，我们选择第二外显子上的序列作为TALEN作用的靶序列，人类雄激素受体基因AR第二外显子核苷酸序列如图2所示，根据TALEN原理将结构为T（N11-18）的核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2作为TALEN识别的靶位点，其中N为A，G，T和C中的任一碱基。

表达载体的构建

按照上海斯丹赛生物技术有限公司提供的试剂盒说明书构建核酸酶TALEN左右臂表达载体。转化大肠杆菌感受态细胞，扩增后送测序，选择表达正确TALEN-L和TALEN-R的大肠杆菌克隆进行大量扩增，提取质粒，用于后续试验。

同源重组模板质粒 pMD18 的改建

按照人类雄激素受体AR基因的序列（如图2所示），在TALEN打靶位点的上下游500-1000bp的距离内设计上下游同源臂的扩增引物，序列如SEQ ID NO.5-8所示。

高保真pfu酶扩增出的上游（左同源臂）片段（产物如图4所示，PCR扩增后的电泳结果如图12所示）经BamH I和EcoR I双酶切后，插入pMD18骨架载体中；下游（右同源臂）片段（产物如图5所示，PCR扩增后的电泳结果如图12所示）经Hind III和Xba I双酶切后，插入pMD18骨架载体中。经连接、转化、测序验证得到正确插入上下游同源臂的pMD18质粒。大量扩增后，提取质粒，用于后续试验。

建立敲除人类雄激素受体 AR 的前列腺细胞株 RWPE-AR-KO

细胞的培养：人类正常前列腺细胞系RWPE-1购自ATCC，用含有10%胎牛血清的1640培养基于37℃，5% CO2孵箱中培养。将对数生长期的细胞用胰酶消化于转染前一天铺6孔板，使其转染时汇合率达到80%。

质粒转染：按照Fugene 6说明书进行操作。TALEN-L质粒和TALEN-R质粒每6孔板各2ug，pMD18质粒每6孔板0.5ug。另外，按质粒：脂质体=1:3比例预混脂质体混合物。

嘌呤霉素筛选：转染后24小时，换含0.5ug/ml嘌呤霉素的完全培养液筛选3-4天，待对照组细胞全部死亡，稀释传代于10cm培养皿中培养，使细胞之间保持适当距离，便于形成单个克隆，培养时可加嘌呤霉素也可不加嘌呤霉素，因为同源重组序列已经携带嘌呤霉素抗性基因至基因组中，可以稳定遗传。

PCR扩增及测序鉴定：提取细胞基因组DNA，采用同源臂扩增引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.8进行PCR扩增验证和测序验证。

实施例 2

实施例2与实施例1的不同之处在于：①实施例2的目的是构建5种人类雄激素受体AR点突变体，而实施例1的目的是敲除AR，使其失活；②基于实施例2与实施例1的目的不同，TALEN-L和TALEN-R的识别位点在人类雄激素受体AR基因的第8外显子下游，如图2所示；③基于实施例2中的点突变位点均位于AR基因的第8外显子，故它们可以共用同源重组右臂，如图11所示，由引物SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19扩增；④5种AR点突变体均为人工设计合成引物带入突变位点，突变位点均为下游引物（如SEQ ID NO.10、12、14、15、17所示）带入，产物如图6-10所示。并且，上下游同源臂（左右同源臂）之间带有嘌呤霉素抗性基因。

本发明基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及其应用，由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒组成，并将该相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，获得稳定细胞株，表达点突变的AR。该系统能够准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代，遗传背景清晰，准确表达定点突变的AR。

本发明采用携带同源模板的pMD18载体共同转染细胞系的方法，使细胞基因组在TALEN切断双链DNA分子时，利用pMD18载体提供的同源序列，高效精确地对基因组进行编辑；采用导入同源序列以重新编辑DNA序列的同时，带入嘌呤霉素抗性基因，从而大大简化筛选过程中的人工劳动。

上述实施例仅用于解释说明本发明的发明构思，而非对本发明权利保护的限定，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应落入本发明的保护范围。

SEQ ID NO.1 TALEN-L识别序列5’-CTGGGTGTCACTATGGA-3’

SEQ ID NO.2 TALEN-R识别序列5’-GAAGAAGACCTTGCAGC-3’

SEQ ID NO.3 TALEN Mut L识别序列 5’-TAAATACGTACATACAT-3’

SEQ ID NO.4 TALEN Mut R识别序列5’-TTGGGGATTTCTATATGT-3’

SEQ ID NO.5 同源臂引物L上5’-G GAATTCTGAGAAGACAATAGGGTAATG-3’

SEQ ID NO.6 同源臂引物L下5’- CG GGATCCTCAGAAGTCACCTTGTCTAAC -3’

SEQ ID NO.7 同源臂引物R上5’- GC TCTAGAGCCCACATTCTGCAGTAG -3’

SEQ ID NO.8 同源臂引物R下5’- CCC AAGCTTAGTATCAGTACATTCGTGGTG -3’

SEQ ID NO.9 Mut1上 5’-G GAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC-3’

SEQ ID NO.10 Mut1下 5’-CG GGATCCGTCTCGCAATCTGTAGGG -3’

SEQ ID NO.11 Mut2上 5’-G GAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC-3’

SEQ ID NO.12 Mut2下 5’-CG GGATCCACAGCTCTCTCGCAATCT-3’

SEQ ID NO.13 Mut3-4上 5’-G GAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC -3’

SEQ ID NO.14 Mut3G下 5’-CG GGATCCCGAACTGATGCAGCTCTCTC -3’

SEQ ID NO.15 Mut4T下5’-CG GGATCCAGAACTGATGCAGCTCTCTC-3’

SEQ ID NO.16 Mut5上 5’-G GAATTCCAGACCTGGATGTTTTTC -3’

SEQ ID NO.17 Mut5下 5’-CG GGATCCTATGTGTGACTTGATTAGCAG-3’

SEQ ID NO.18 Mut R上 5’-GC TCTAGAGCTTGGCTGTTCTCCTGCTTAG-3’

SEQ ID NO.19 Mut R下 5’-CCC AAGCTTGAGCATTTGCAGGGTTTCTG-3’

Claims (12)

1.一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，其特征在于：由核酸酶TALEN和pMD18载体组成，所述核酸酶TALEN为剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子，TALEN由识别所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和识别所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；所述pMD18载体为插入人类AR定点突变基因的pMD18同源重组模板质粒，pMD18载体由靶基因的相应上下游序列和嘌呤霉素筛选标记组成。

2.如权利要求1基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统，其特征在于所述定点突变系统的定点突变方法为：切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过同源重组修复，将一对TALEN质粒和携带同源重组基因的质粒共同转染受体细胞，TALEN质粒表达的蛋白会在受体细胞基因组TALEN靶点的位置上切开一个口；外源基因会在切口处同源重组入受体基因组；所述的目标基因为人类雄激素受体AR基因。

3.一种基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于包括：细胞株的构建和定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用；所述细胞株的构建方法如下：对转染后的受体细胞进行稀释培养，药物筛选，获得细胞克隆，鉴定外源基因在受体细胞基因组上整合的情况，挑选出符合整合位置要求的阳性细胞克隆；

所述定点突变系统在人类基因组中改造人类雄激素受体AR基因的应用为采用权利要求2所述的定点突变系统为将相应质粒转入人类正常前列腺细胞系中，准确识别人类AR基因的特定序列，并在基因组中实现定点突变，获得的稳定细胞株可以稳定传代。

4.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-AR-KO，所述细胞株为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，不表达AR蛋白。

5.如权利要求4所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R；所述pMD18载体包括pMD18载体的第2外显子上游的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第2外显子下游的同源右臂序列核苷酸。

6.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-E872Q，所述细胞株RWPE-E872Q为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第872位氨基酸残基由谷氨酸突变为谷氨酰胺的AR蛋白。

7.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-H874Y，所述细胞株RWPE-H874Y为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第874位氨基酸残基由组氨酸突变为酪氨酸的AR蛋白。

8.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877A，所述细胞株RWPE-T877A为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸的AR蛋白。

9.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-T877S，所述细胞株RWPE-T877S为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第877位氨基酸残基由苏氨酸突变为丝氨酸的AR蛋白。

10.如权利要求3所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述构建的细胞株为细胞株RWPE-M886I，所述细胞株RWPE-M886I为人正常前列腺离体细胞系RWPE-1改造的细胞株，稳定表达第886位氨基酸残基由蛋氨酸突变为异亮氨酸的AR蛋白。

11.如权利要求6-10任一权利要求所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述核酸酶TALEN包括核酸酶TALEN Mut L和核酸酶TALEN Mut R；所述pMD18载体包括pMD18载体的携带点突变位点的同源左臂序列核苷酸和pMD18载体的第8外显子下游的同源右臂序列核苷酸。

12.如权利要求6-10任一权利要求所述基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统的应用，其特征在于：所述人细胞株转入的pMD18载体含有抗嘌呤霉素的基因，能将嘌呤霉素抗性基因带入基因组，从而表达抗嘌呤霉素的蛋白。