KR102151065B1 - 동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법 - Google Patents

동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법 Download PDF

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Abstract

디아미나제 및 표적특이적 뉴클레레아제를 포함하는 염기 교정용 조성물, 및 상기 염기 교정용 조성물을 이용한 염기 교정 방법 및 유전자 변형 동물 제조 방법이 제공된다. 상기 염기 교정용 조성물은 포유 동물의 배아에서 염기 교정 활성을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

동물 배아의 염기 교정용 조성물 및 염기 교정 방법{Composition and method for base editing in animal embryos}
디아미나제 및 표적특이적 뉴클레레아제를 포함하는 염기 교정용 조성물, 및 상기 염기 교정용 조성물을 이용한 염기 교정 방법 및 유전자 변형 동물 제조 방법이 제공된다.
대다수의 인간 유전 질환은, 몇몇 삽입/결실(insertions/deletions; indels) 또는 게놈에서의 광범위한 염색체 재배열보다는, 단일 염기 치환 또는 점 돌연변이에 의해 유발된다. CRISPR (clustered, regular interspaced, short palindromic repeat)-Cas9 또는 Cpf1 시스템과 같은 programmable nuclease에 의한 게놈 교정 (genome editing)은 선천적 유전 질환을 일으키는 유전적 결함을 치료하기 위한 유전자 교정 (gene correction)을 가능하게 하지만, 표적 특이적으로 단일 염기 치환을 유도하기에는 기술적으로 어려움이 있다. 이는 programmable nuclease에 의해 생성된 대부분의 DNA 이중 가닥 절단 (DSB)이 template donor DNA를 사용하는 상동성 재조합 (homologous recombination, HR)이 아닌 오류가 발생하기 쉬운 비상동 말단연결 (error-prone non-homologous end-joining (NHEJ)에 의해 복구되기 때문이다. 그 결과, 단일 뉴클레오타이드 치환보다 뉴클레아제 표적 부위에서의 indel이 보다 빈번하게 얻어진다.
최근, APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1) 또는 AID (activation-induced deaminase)와 같은 시티딘 디아미나제 (cytidine deaminase)가 Cas9 니카아제 (Cas9 nickase; nCas9) 또는 촉매활성 결핍 Cas9 (catalytically-deficient Cas9; dCas9)와 연결되어, 표적 부위에서, DSB 생성 없이, C를 T로 (또는 G를 A로) 치환시킴이 보고된 바 있으며, 이는 효모 및 배양된 포유류 세포에서의 염기 교정 (base editing)을 보여주는 것이라고 할 수 있다. 이러한 RNA-guided programmable deaminase는 게놈 교정의 범위를 새로운 차원으로 확대시키고, 인간을 포함한 전 유기체에서 표적 돌연변이를 유발하거나 유전자 교정을 시행할 수 있는 방법을 제안할 수 있다. 그러나 RNA-programmable deaminase의 생체 내(in vivo)에서의 염기 교정 기능은 아직 증명되지 않았다.
본 명세서는 programmable deaminase를 이용하여 마우스와 같은 진핵 세포 (예컨대, 포유류 등의 동물 세포)에서 단일 뉴클레오타이드 치환을 유도하는 기술을 제공한다.
일 예는 (1) 디아미나제, 및 이의 코딩 유전자, 및 (2) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자를 포함하는 염기 교정용 조성물을 제공한다. 상기 세포는 진핵세포 (예컨대, 진핵 동물의 배아 세포)일 수 있고, 상기 염기 교정 방법은 진핵세포에서 염기 교정 (예컨대, 염기 치환)을 수행하는 것일 수 있다.
상기 변형 표적 특이적 뉴클레아제는 RNA-가이드 뉴클레아제 및 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 (상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA (또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터)를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 염기 교정용 조성물은, (1) 디아미나제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), (2) RNA-가이드 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및 (3) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 유전자 (DNA)를 포함하는 것일 수 있다.
상기 염기 교정용 조성물은, (1) 디아미나제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), (2) RNA-가이드 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및 (3) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 유전자 (DNA)에 더하여, (4) 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자 및/또는 (5) 핵위치화서열 (NLS) 또는 이의 코딩 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 염기 교정용 조성물에서, 상기 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 임의로 UGI 및/또는 NLS가 연결된 융합 단백질 또는 이들의 코딩 유전자가 연결된 융합 유전자 형태로 사용되는 경우, 각각의 단백질 또는 유전자 사이 중 하나 이상, 예컨대, 상기 디아미나제와 RNA-가이드 뉴클레아제 사이, 뉴클레아제와 UGI 사이, 및 UGI와 NLS 사이 중 하나 이상에 적절한 링커 (융합 단백질의 경우 펩타이드 링커 (3-30, 또는 3-20 아미노산), 융합 유전자의 경우 올리고뉴클레오타이드 링커 (9 내지 90 또는 9-60nt))를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 염기 교정용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 염기 교정 방법을 제공한다. 상기 세포는 진핵세포일 수 있고, 상기 염기 교정 방법은 진핵세포에서 염기 교정 (예컨대, 염기 치환)을 수행하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 세포에 염기 교정용 조성물을 도입하는 단계는,
1) 상기 세포를 디아미나제 코딩 DNA, RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 DNA, 및 가이드 RNA 코딩 유전자를 각각 포함하거나 이들 중 2 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질감염시키거나,
2) 상기 세포에 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA (예컨대, 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA가 복합체를 형성한 리보핵산단백질)를 직접 주입하거나,
3) 상기 세포에 디아미나제 코딩 mRNA, RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 mRNA, 및 가이드 RNA를 직접 주입하여 수행할 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 염기 교정용 조성물을 도입하는 단계 1) 2) 또는 3)에서 사용된 염기 교정용 조성물은 각각 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자 및/또는 (5) 핵위치화서열 (NLS) 또는 이의 코딩 유전자를 추가로 포함할 수 있으며, 경우에 따라서 적절한 링커를 추가로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 염기 교정 방법에 의하여 교정된 염기를 포함하는 유전자 변형 세포를 제공한다.
다른 예는 상기 유전자 변형 세포로부터 얻어진 유전자 변형 동물을 제공한다.
다른 예는 상기 염기 교정용 조성물이 도입된 포유 동물 배아를 포유 동물 위탁모 난관에 이식하는 단계를 포함하는 유전자 변형 동물의 제조 방법을 제공한다.
본 발명자들은 programmable deaminase를 이용하여 마우스와 같은 진핵 세포 (예컨대, 포유류 등의 동물 세포)에서 단일 염기 치환을 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
일 예는 (1) 디아미나제, 및 이의 코딩 유전자, 및 (2) 표적 특이적 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자를 포함하는 염기 교정용 조성물을 제공한다. 상기 염기 교정용 조성물은 진핵세포에서 염기 교정 (예컨대, 염기 치환) 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 진핵세포는 진핵 동물의 세포, 예컨대 배아 세포일 수 있으며, 일 구체예에서, 포유 동물 세포, 예컨대 포유 동물 배아세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된 코딩 유전자는 cDNA, rDNA 또는 이를 포함하는 재조합 벡터, 또는 mRNA 형태로 사용될 수 있다.
상기 디아미나제는 진핵세포에서 특정 염기에서 아민기를 제거하는 활성을 갖는 효소를 총칭하는 것으로, 예컨대, 시티딘을 우리딘으로 전환시키는 시티딘 디아미나제 및/또는 아데노신 디아미나제일 수 있다. 일 예에서 상기 디아미나제는 APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), AID (activation-induced deaminase), tadA (tRNA-specific adenosine deaminase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 염기 전환 (예컨대, 시티딘을 우리딘으로 전환)에 의하여 진핵세포에서 단일 뉴클레오타이드 치환을 유도할 수 있다.
상기 표적 특이적 뉴클레아제는 RNA-가이드 뉴클레아제 및 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 (또는 상보적 핵산 서열을 갖는) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA (또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터)를 포함하는 것일 수 있다. 이 경우, 상기 염기 교정용 조성물은, (1) 디아미나제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), (2) 변형 RNA-가이드 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및 (3) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 DNA를 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 염기 교정용 조성물은, (1) 디아미나제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), (2) RNA-가이드 뉴클레아제 또는 이의 코딩 유전자 (mRNA 또는 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터), 및 (3) 가이드 RNA 또는 이의 코딩 유전자 (DNA)에 더하여, (4) 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자 및/또는 (5) 핵위치화서열 (NLS) 또는 이의 코딩 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 염기 교정용 조성물에서, 상기 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 임의로 UGI 및/또는 NLS가 연결된 융합 단백질 또는 이들의 코딩 유전자가 연결된 융합 유전자 형태로 사용되는 경우, 각각의 단백질 또는 유전자 사이 중 하나 이상, 예컨대, 상기 디아미나제와 RNA-가이드 뉴클레아제 사이, 뉴클레아제와 UGI 사이, 및 UGI와 NLS 사이 중 하나 이상에 적절한 링커 (융합 단백질의 경우 펩타이드 링커 (3-30, 또는 3-20 아미노산), 융합 유전자의 경우 올리고뉴클레오타이드 링커 (9 내지 90 또는 9-60nt))를 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 유전자 이중가닥 절단 활성을 상실하도록 변형된 변형 RNA-가이드 뉴클레아제일 수 있다.
상기 변형 RNA-가이드 뉴클레아제는 표적 유전자의 한 가닥을 절단 (닉 (nick) 생성)하도록 변형된 변형 Cas9 (CRISPR 관련 단백질 9) 또는 변형 Cpf1 (Prevotella 및 Francisella 1 유래 CRISPR) 시스템일 수 있다. 일 예에서, 상기 변형 RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 니카아제 (Cas9 nickase; nCas9) 또는 촉매활성 결핍 Cas9 (catalytically-deficient Cas9; dCas9) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 염기 교정용 조성물이 디아미나제 코딩 유전자 및 RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 유전자를 포함하는 경우, 상기 코딩 유전자는 코딩 DNA 또는 mRNA일 수 있다. 또한, 상기 디아미나제 코딩 유전자 및 RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 유전자는 mRNA 형태로 포함되거나, 상기 유전자(DNA)를 각각 별개의 벡터에 포함하는 재조합 벡터 (즉, 디아미나제 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터 및 RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터) 또는 하나의 벡터에 함께 포함하는 재조합 벡터의 형태로 포함될 수 있다.
상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA), trans-activating crRNA (tracrRNA), crRNA 및 tracrRNA (crRNA 및 tracrRNA의 복합체)를 포함하는 이중 가이드 RNA, 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다. 일 예에서, 상기 염기 교정용 조성물은 디아미나제 및 변형 RNA-가이드 뉴클레아제를 코딩하는 mRNA와 가이드 RNA를 포함하거나, 디아미나제 및 변형 RNA-가이드 뉴클레아제와 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질 (ribonucleoprotein; RNP)를 포함하는 것일 수 있다. 상기 리보핵산단백질은 디아미나제 및 변형 RNA-가이드 뉴클레아제와 가이드 RNA를 혼합물 형태로 포함하거나, 디아미나제 및 변형 RNA-가이드 뉴클레아제와 가이드 RNA가 결합된 복합체 형태로 포함할 수 있다.
다른 예는 상기 염기 교정용 조성물을 세포에 도입시키는 단계를 포함하는, 염기 교정 방법을 제공한다. 상기 세포는 진핵세포일 수 있고, 상기 염기 교정 방법은 진핵세포에서 염기 교정 (예컨대, 염기 치환)을 수행하는 것일 수 있다.
상기 진핵세포는 진핵 동물의 세포, 예컨대, 진핵 동물의 배아 세포일 수 있으며, 일 구체예에서, 포유 동물 세포, 예컨대 포유 동물 배아 세포일 수 있다. 상기 염기 교정 방법에 의하여 진핵 세포 (예컨대, 진핵 동물 배아 세포)에서 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상 또는 100%의 염기 전환률 (염기 치환률)을 달성할 수 있다. 또한, 상기 염기 편집 방법은 염기 치환에 의해 유전자 (예컨대, 코딩 서열) 내에 종결코돈을 생성하여 상기 유전자를 불활성화 (knock-out)시키거나, 단백질을 생성하지 않는 비코딩 DNA 서열에 변이를 도입하는 등, 다양한 돌연변이를 유발시킬 수 있다.
특히, 상기 염기 교정용 조성물은 포유 동물 배아에 적용되어, 소망하는 유전자가 불활성화되거나 소망하는 돌연변이가 유발된 포유 동물 성체 제작에 유용하게 적용될 수 있다.
상기 세포에 염기 교정용 조성물을 도입하는 단계는 상기 세포에 디아미나제 또는 디아미나제 코딩 유전자, RNA-가이드 뉴클레아제 또는 RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 유전자, 및 가이드 RNA 또는 가이드 RNA 코딩 유전자를 도입시키는 단계일 수 있다. 상기 코딩 유전자들 중 하나 이상은 각각 별개의 또는 하나의 재조합 벡터에 포함되어 도입될 수 있다.
일 예에서, 상기 세포에 염기 교정용 조성물을 도입하는 단계는,
1) 상기 세포를 디아미나제 코딩 DNA, RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 DNA, 및 가이드 RNA 코딩 유전자를 각각 포함하거나 이들 중 2 이상을 포함하는 재조합 벡터로 형질감염시키거나,
2) 상기 세포에 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA (예컨대, 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는 혼합물 또는 복합체 형태의 리보핵산단백질)를 직접 주입하거나,
3) 상기 세포에 디아미나제 코딩 mRNA, RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 mRNA 및 가이드 RNA의 혼합물 또는 이들 각각을 직접 주입하여 수행할 수 있다.
상기 직접 주입은 상기 2)의 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA (예컨대, 디아미나제, RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는 혼합물 또는 복합체 형태의 리보핵산단백질), 또는 3)의 디아미나제 코딩 mRNA, RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 mRNA 및 가이드 RNA가, 재조합 벡터를 사용하지 않고, 세포막 및/또는 핵막을 통과하여 유전체(genome)에 전달되는 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 전기천공법, 리포펙션, 미세주입 (microinjection) 등에 의하여 수행될 수 있다.
다른 예는 상기 염기 교정 방법에 의하여 교정된 염기를 포함하는 유전자 변형 세포를 제공한다. 상기 유전자 변형 세포는 상기 염기 교정에 의하여 표적 유전자에 염기 치환, 예컨대 단일 염기 치환 또는 점 돌연변이가 발생한 세포일 수 있다. 상기 세포는 진핵세포일 수 있다. 상기 진핵세포는 진핵 동물의 세포, 예컨대 배아 세포일 수 있으며, 일 구체예에서, 인간을 포함하거나 인간을 제외한 포유 동물 세포, 예컨대 인간을 포함하거나 인간을 제외한 포유 동물의 배아 세포일 수 있다.
다른 예는 염기 교정용 조성물이 주입된 포유 동물 배아 또는 상기 염기 교정 방법에 의하여 교정된 염기를 포함하는 유전자 변형 포유 동물 배아를 포유 동물의 난관에 이식하여, 유전자 변형 동물을 생산하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 동물의 제조 방법을 제공한다. 상기 유전자 변형 포유 동물은 상기 염기 교정에 의하여 표적 유전자에 염기 치환, 예컨대 단일 염기 치환 또는 점 돌연변이가 발생한 배아로부터 발생한 동물일 수 있다.
상기 배아 세포를 난관에 이식받는 포유 동물은 상기 배아 세포가 유래하는 포유 동물과 동종의 포유류 (위탁모)일 수 있다.
다른 예는 상기 유전자 변형 세포로부터 얻어진 유전자 변형 동물을 제공한다. 상기 유전자 변형 동물은 상기 유전자 변형 동물의 제조 방법에 의하여 제조된 것일 수 있다. 상기 동물은 진핵 동물, 예컨대 인간을 포함하거나 인간을 제외한 포유 동물일 수 있다.
본 명세서에서 상기 염기 교정용 조성물이 적용되는 세포는 진핵 세포, 예컨대, 진핵 동물 세포일 수 있다. 상기 진핵 동물은 인간 등의 영장류, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유 동물일 수 있다. 상기 진핵 동물 세포는 포유 동물의 배아일 수 있다. 예컨대, 상기 배아는 과배란 유도된 암컷 포유 동물 (예컨대, PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin), hCG (human Choirinic Gonadotropin) 등과 같은 생식선 호르몬 주입에 의한 과배란 유도 등)과 수컷 포유 동물을 교배하여 얻어진 수정된 배아를 상기 암컷 포유 동물의 난관에서 채취한 것일 수 있다. 상기 염기 교정용 조성물이 적용 (주입)되는 배아는 수정된 1-세포기의 배아 (zygote)일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "염기 교정 (base editing)"은 표적 유전자 내의 표적 부위에 점돌연변이를 유발하는 염기 변이 (치환, 결실 또는 부가)를 의미하는 것으로, 소수의 염기 (하나 또는 두 개의 염기, 예컨대 하나의 염기)만이 변이된다는 점에서 비교적 다수의 염기의 변이를 수반하는 유전자 교정 (gene editing)과 구별될 수 있다. 상기 염기 교정은 유전자의 이중가닥 절단 (double-stranded DNA cleavage)를 수반하지 않는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "염기 변이 (또는 염기 치환)"은 해당 염기를 포함하는 뉴클레오타이드에 변이 (예컨대, 치환)이 일어난 것을 의미하는 것으로, "뉴클레오타이드 변이 (또는 뉴클레오타이드 치환)"와 동일한 의미로 사용될 수 있으며, 이러한 염기 변이는 대립유전자 중 하나 또는 두 개 모두에서 일어날 수 있다.
일 예에서, 상기 염기 변이 또는 이를 수반하는 염기 교정은 표적 부위에 종료코돈을 생성시키거나, 야생형과 다른 아미노산을 코딩하는 코돈을 생성시킴으로써, 표적 유전자를 불활성화 (knock-out)시키거나, 단백질을 생성하지 않는 비코딩 DNA 서열에 변이를 도입하는 등 다양한 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 염기 교정 또는 염기 변이는 생체 외 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 수행되는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 용어 "염기 서열"은 해당 염기를 포함하는 뉴클레오타이드의 서열을 의미하는 것으로, 뉴클레오타이드 서열 또는 핵산 서열과 동일한 의미로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서,
'표적 유전자 (target gene)'는 염기 교정 (또는 염기 변이)의 대상이 되는 유전자를 의미하고,
'표적 부위 (target site or target region)'는 표적 유전자 내의 표적 특이적 뉴클레아제에 의한 염기 교정이 일어나는 부위를 의미하는 것으로, 일 예에서 상기 표적 특이적 뉴클레아제가 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided engineered nuclease; RGEN)를 포함하는 것인 경우, 표적 유전자 내의 RNA-가이드 뉴클레아제가 인식하는 서열 (PAM 서열)의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하고, 최대 길이가 약 50bp 또는 약 40bp인 유전자 부위 (이중 가닥 또는 이중 가닥 중 어느 하나의 단일 가닥)를 의미한다.
일 예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제가 RNA-가이드 뉴클레아제를 포함하는 경우, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제와 함께, 표적화 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함할 수 있다. 상기 '표적화 서열 (targeting sequence)'은 표적 부위 내의 연속하는 약 15 내지 약 30개, 약 15 내지 약 35개, 약 17 내지 약 23개, 또는 약 18개 내지 약 22개, 예컨대, 약 20개의 뉴클레오타이드(nt)를 포함하는 부위의 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는(혼성화 가능한) 가이드 RNA의 부위일 수 있다. 상기 표적화 서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 표적 부위의 염기서열을 '표적 서열 (target sequence)'이라고 칭할 수 있으며, 상기 표적 서열은 RNA-가이드 뉴클레아제가 인식하는 PAM 서열의 5' 말단 및/또는 3' 말단에 인접하여 위치하는 연속하는 약 15nt 내지 약 30nt, 약 15nt 내지 약 25nt, 약 17nt 내지 약 23nt, 또는 약 18nt 내지 약 22 nt, 예컨대, 약 20nt 길이의 염기서열을 의미할 수 있다.
상기 디아미나제는 진핵세포에서 특정 염기에서 아민기를 제거하는 활성을 갖는 효소를 총칭하는 것으로, 예컨대, 시티딘을 우리딘으로 전환시키는 시티딘 디아미나제 및/또는 아데노신 디아미나제일 수 있다. 일 예에서 상기 디아미나제는 APOBEC　(apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like) 효소, AID (activation-induced deaminase), tadA (tRNA-specific adenosine deaminase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 APOBEC1, AID, 및 tadA는 대장균 등의 원핵동물 유래, 또는 인간을 포함하는 영장류, 마우스를 포함하는 설치류 등의 포유동물과 같은 진핵 동물 유래의 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 APOBEC　는 포유류, 예컨대 인간, 래트, 마우스 등에서 유래하는 APOBEC1 (apolipoprotein B editing complex 1), APOBEC2, APOBEC3B, APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3E, APOBEC3F, APOBEC3G, APOBEC3H, APOBEC4 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 APOBEC1는 인간 APOBEC1 (예컨대, GenBank Accession No. NP_005880.2 (코딩 유전자: NM_005889.3), NP_001291495.1 (코딩 유전자: NM_001304566.1), NP_001635.2 (코딩 유전자: NM_001644.4) 등), 마우스 APOBEC1 (예컨대, GenBank Accession No. NP_001127863.1 (코딩 유전자: NM_001134391.1), NP_112436.1 (코딩 유전자: NM_031159.3) 등), 래트 APOBEC1 (예컨대, GenBank Accession No. NP_037039.1 (서열번호 6) (코딩 유전자: NM_012907.2) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 AID는 인간 AID (예컨대, GenBank Accession No. NP_001317272.1 (코딩 유전자: NM_001330343.1), NP_065712.1 (코딩 유전자: NM_020661.3) 등), 마우스 AID (예컨대, GenBank Accession No. NP_033775.1 (코딩 유전자: NM_009645.2) 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 tadA는 대장균 tadA (예컨대, GenBank Accession No. NP_417054.2, YP_002408701.1, YP_002413581.3 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이와 같은 염기 전환 (예컨대, 시티딘을 우리딘으로 전환)에 의하여 진핵세포에서 단일 뉴클레오타이드 치환을 유도할 수 있다.
상기 디아미나제는, 단백질, 이를 코딩하는 유전자 (예컨대, DNA 또는 mRNA), 또는 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 표적 특이적 뉴클레아제는, 유전자 가위 (programmable nuclease)라고도 불리며, 목적하는 유전체 DNA 상의 특정 위치를 인식하여 절단 (단일가닥 절단 또는 이중가닥 절단)할 수 있는 모든 형태의 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제)를 통칭한다.
예컨대, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 표적 유전자의 특정 서열을 인식하고 뉴클레오티드 절단 활성을 가져 표적 유전자에서 인델 (insertion and/or deletion, Indel)을 야기할 수 있는 모든 뉴클레아제에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 RGEN (RNA-guided engineered nuclease; 예컨대, Cas 단백질 (예컨대, Cas9 등), Cpf1, 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적 특이적 뉴클레아제는 원핵 세포, 및/또는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포 (예컨대, 진핵 세포)의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킬 수 있다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라, 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 생성시킬 수 있다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선될 수 있는데, 이 과정에 소망하는 변이를 표적 위치에 도입할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 Cas 단백질 (예컨대, Cas9 단백질(CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) associated protein 9)), Cpf1 단백질 (CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 등과 같은 타입 Ⅱ 및/또는 타입 V의 CRISPR 시스템에 수반되는 뉴클레아제 (예컨대, 엔도뉴클레아제) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이 경우, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 유전체 DNA의 표적 부위로 안내하기 위한 표적 DNA 특이적 가이드 RNA를 추가로 포함한다. 상기 가이드 RNA는 생체 외 (in vitro)에서 전사된(transcribed) 것일 수 있고, 예컨대 올리고뉴클레오티드 이중가닥 또는 플라스미드 주형으로부터 전사된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는, 생체 외에서 또는 생체(세포) 내 전달 후, 가이드 RNA에 결합된 리보핵산-단백질 복합체를 형성(RNA-Guided Engineered Nuclease)하여 리보핵산 단백질 (RNP) 형태로 작용할 수 있다.
Cas 단백질은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성 요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제 또는 nickase를 형성할 수 있는 단백질이다.
Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 예컨대, 상기 Cas 단백질은,
스트렙토코커스 sp. (Streptococcus sp.), 예컨대, 스트렙토코커스 피요게네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질 (예컨대, SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1));
캄필로박터 속, 예컨대, 캄필로박터 제주니 (Campylobacter jejuni) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;
스트렙토코커스 속, 예컨대, 스트렙토코커스 써모필러스 (Streptococcus thermophiles) 또는 스트렙토코커스 아우레우스 (Streptocuccus aureus) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;
네이세리아 메닝기디티스 (Neisseria meningitidis) 유래의 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 단백질;
파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 예컨대, 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질;
프란시셀라 (Francisella) 속, 예컨대, 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida) 유래의 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 단백질
등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
Cpf1 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고 tracrRNA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다. 또한, 티민 (thymine)이 풍부한 PAM (protospacer-adjacent motif) 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다.
예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium (GWC2011_GWC2_44_17), Lachnospiraceae bacterium (MC2017), Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium (GW2011_GWA_33_10), Acidaminococcus sp. (BV3L6), Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium (ND2006), Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi (237), Smiihella sp. (SC_KO8D17), Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium (MA2020), Francisella novicida (U112), Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Paceibacter , Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 .
상기 표적 특이적 뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 in vitro에서 미리 전사된 mRNA 또는 미리 생산된 단백질 형태, 또는 표적 세포 또는 생체 내에서 발현하기 위하여 재조합 벡터에 포함된 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)는 재조합 DNA(Recombinant DNA; rDNA)에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 표적 특이적 뉴클레아제를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 코딩 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 상기 표적특이적 뉴클레아제는 변이된 형태의 변이 표적특이적 뉴클레아제일 수 있다. 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 DNA 이중 가닥을 절단하는 엔도뉴클레아제 활성을 상실하도록 변이된 것을 의미할 수 있으며, 예컨대, 엔도뉴클레아제 활성을 상실하고 니카아제 활성을 갖도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 활성과 니카아제 활성을 모두 상실하도록 변이된 변이 표적특이적 뉴클레아제 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제가 니카아제 활성을 갖는 것인 경우, 상기 디아미나제에 의한 염기변환(예컨대, 시티딘이 우라딘으로 변환)과 동시 또는 순서와 무관하게 순차적으로, 상기 염기 변환이 일어난 가닥 또는 그 반대 가닥 (예컨대, 염기 변환이 일어난 가닥의 반대 가닥)에서 nick이 도입될 수 있다 (예컨대, PAM 서열의 5' 말단 방향으로 3번째 뉴클레오타이드와 4번째 뉴클레오타이드 사이에 nick이 도입됨). 이와 같은 표적특이적 뉴클레아제의 변이 (예컨대, 아미노산 치환 등)는 적어도 뉴클레아제의 촉매 활성 도메인 (예컨대, Cas9의 경우 RuvC 촉매 도메인)에서 일어나는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적특이적 뉴클레아제가 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질 (SwissProt Accession number Q99ZW2(NP_269215.1); 서열번호 4)인 경우, 상기 변이는 촉매 활성을 갖는 아스파르트산 잔기 (catalytic aspartate residue; 예컨대, 서열번호 4의 경우 10번째 위치의 아스파르트산 (D10) 등), 서열번호 4의 762번째 위치의 글루탐산 (E762), 840번째 위치의 히스티딘 (H840), 854번째 위치의 아스파라긴 (N854), 863번째 위치의 아스파라긴 (N863), 986번째 위치의 아스파르트산 (D986) 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 임의의 다른 아미노산으로 치환된 돌연변이를 포함할 수 있다. 이 때, 치환되는 임의의 다른 아미노산은 알라닌 (alanine)일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
다른 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 야생형 Cas9 단백질과 상이한 PAM 서열을 인식하도록 변이된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 1135번째 위치의 아스파르트산 (D1135), 1335번째 위치의 아르기닌 (R1335), 및 1337번째 위치의 트레오닌 (T1337) 중 하나 이상, 예컨대 3개 모두가 다른 아미노산으로 치환되어, 야생형 Cas9의 PAM 서열 (NGG)와 상이한 NGA (N은 A, T, G, 및 C 중에서 선택된 임의의 염기임)을 인식하도록 변이된 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 유래 Cas9 단백질의 아미노산 서열 (서열번호 4) 중,
(1) D10, H840, 또는 D10 + H840;
(2) D1135, R1335, T1337, 또는 D1135 + R1335 + T1337; 또는
(3) (1)과 (2) 잔기 모두
에서 아미노산 치환이 일어난 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 상기 '다른 아미노산'은, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 트립토판, 발린, 아스파라긴산, 시스테인, 글루타민, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 라이신, 상기 아미노산들의 공지된 모든 변형체 중에서, 야생형 단백질이 원래 변이 위치에 갖는 아미노산을 제외한 아미노산들 중에서 선택된 아미노산을 의미한다. 일 예에서, 상기 '다른 아미노산'은 알라닌, 발린, 글루타민, 또는 아르기닌일 수 있다.
일 예에서, 상기 변이 표적특이적 뉴클레아제는 엔도뉴클레아제 활성을 상실(예컨대, 니카아제 활성을 갖거나, 엔도뉴클레아제 활성 및 니카아제 활성을 모두 상실)한 변형 Cas9 단백질, 또는 야생형 Cas9과 상이한 PAM 서열을 인식하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변형 Cas9 단백질은, 스트렙토코커스 피요제네스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질(서열번호 4)에 있어서,
(1) D10 또는 H840 위치에 돌연변이 (예컨대, 다른 아미노산으로의 치환)가 도입되어 엔도뉴클레아제 활성이 상실되고 니카아제 활성을 갖는 변형 Cas9, 또는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질에 D10 및 H840 위치에 모두 돌연변이 (예컨대, 다른 아미노산으로의 치환)가 도입되어 엔도뉴클레아제 활성 및 니카아제 활성을 모두 상실한 변형 Cas9 단백질;
(2) D1135, R1335 및 T1337 중에서 하나 이상 또는 이들 모두에 돌연변이(예컨대, 다른 아미노산으로의 치환)가 도입되어 야생형과 상이한 PAM 서열을 인식하는 변형 Cas9 단백질; 또는
(3) (1) 및 (2)의 돌연변이가 모두 도입되어 니카아제 활성을 갖고 야생형과 상이한 PAM 서열을 인식하거나, 엔도뉴클레아제 활성 및 니카아제 활성을 모두 상실하고 야생형과 상이한 PAM 서열을 인식하는 변형 Cas9 단백질
일 수 있다.
예컨대, 상기 CAs9 단백질의 D10 위치에서의 돌연변이는 D10A 돌연변이 (Cas9 단백질의 아미노산 중 10번째 아미노산인 D가 A로 치환된 돌연변이를 의미함; 이하, Cas9에 도입된 돌연변이는 동일한 방법으로 표기됨)일 수 있고, 상기 H840 위치에서의 돌연변이는 H840A 돌연변이일 수 있으며, D1135, R1335, 및 T1337 위치에서의 돌연변이는 각각 D1135V, R1335Q, 및T1337R일 수 있다.
본 명세서에서, "뉴클레아제"는, 다른 언급이 없는 한, 앞서 설명된, 예컨대, Cas9, Cpf1, 등과 같은 "표적 특이적 뉴클레아제"를 의미한다.
상기 뉴클레아제는 미생물에서 분리된 것 또는 재조합적 방법 또는 합성적 방법 등과 같이 인위적 또는 비자연적 생산된 것(non-naturally occurring)일 수 있다. 일 예에서, 상기 뉴클레아제 (예컨대, Cas9, Cpf1, 등)은 재조합 DNA에 의하여 만들어진 재조합 단백질일 수 있다. 재조합 DAN(Recombinant DNA; rDNA)는 다양한 유기체로부터 얻어진 이종 또는 동종 유전 물질을 포함하기 위하여 분자 클로닝과 같은 유전자 재조합 방법에 의하여 인공적으로 만들어진 DNA 분자를 의미한다. 예컨대, 재조합 DNA를 적절한 유기체에서 발현시켜 단백질 (뉴클레아제)를 생산 (in vivo 또는 in vitro)하는 경우, 재조합 DNA는 제조하고자 하는 단백질을 코딩 하는 코돈들 중에서 상기 유기체에 발현하기에 최적화된 코돈을 선택하여 재구성된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 뉴클레아제는, 단백질, 이를 코딩하는 핵산 분자 (예컨대, DNA 또는 mRNA), 가이드 RNA와 결합된 리보핵산 단백질, 상기 리보핵산 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터의 형태로 사용될 수 있다.
상기 디아미나제 및 뉴클레아제, 및/또는 이들을 코딩하는 핵산 분자는 핵 내로 전달, 작용, 및/또는 핵 내에서 발현될 수 있는 형태일 수 있다.
상기 디아미나제 및 뉴클레아제는 세포 내로 도입되기에 용이한 형태일 수 있다. 일 예로, 상기 디아미나제 및 뉴클레아제는 세포 침투 펩타이드 및/또는 단백질 전달 도메인 (protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌 또는 HIV 유래의 TAT 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 세포 침투 펩타이드 또는 단백질 전달 도메인은 상기 기술된 예 외에도 다양한 종류가 당업계에 공지되어 있으므로, 당업자는 상기 예에 제한되지 않고 다양한 예를 적용할 수 있다.
또한, 상기 디아미나제 및 뉴클레아제, 및/또는 이들을 코딩하는 핵산 분자는 핵 위치 신호 (nuclear localization signal, NLS) 서열 또는 이를 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 상기 디아미나제 코딩 핵산 분자 및/또는 뉴클레아제 코딩 핵산 분자를 포함하는 발현 카세트는 상기 디아미나제 및/또는 뉴클레아제를 발현시키기 위한 프로모터 서열 등의 조절 서열, 및, 임의로, NLS 서열(서열번호 13)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 NLS 서열은 당업계에 잘 알려져 있다.
상기 디아미나제 및 뉴클레아제, 및/또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 분리 및/또는 정제를 위한 태그 또는 상기 태그를 코딩하는 핵산 서열과 연결될 수 있다. 일 예로, 상기 태그는 His 태그, Flag 태그, S 태그 등과 같은 작은 펩타이드 태그, GST (Glutathione S-transferase) 태그, MBP (Maltose binding protein) 태그 등으로 이루어진 군에서 적절하게 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 명세서에 사용된 염기 교정용 조성물은 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자(코딩 DNA를 포함하는 재조합 벡터 형태 또는 in vitro 전사된 mRNA 형태 등)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 염기 교정용 조성물이 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함하는 경우, 이를 포함하지 않는 경우와 비교하여, 디아미나제에 의한 특정 염기 치환 (예컨대 시토신 디아미나제에 의한 C에서 T로의 치환)의 비율이 높아지며, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제를 추가로 포함하지 않는 경우에는 특정 염기 치환 (예컨대 시토신 디아미나제에 의한 C에서 T로의 치환) 이외의 형태의 염기 치환 비율이 높아진다 (즉, 다양한 형태의 염기 치환이 일어남). 일 예에서, 상기 우라실 DNA 글리코실라제 억제제는 서열번호 12에 의하여 코딩되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 유전자 내의 표적 부위 내의 특이적인 염기 서열 (표적서열)에 혼성화 가능한 표적화 서열을 포함하는 RNA를 의미하며, 생체 외 (in vitro) 또는 생체 (또는 세포) 내에서 Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 결합하여 이를 표적 유전자 (또는 표적 부위)로 인도하는 역할을 한다.
상기 가이드 RNA는 복합체를 형성할 뉴클레아제의 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
예컨대, 상기 가이드 RNA는,
표적 서열과 혼성화 가능한 부위 (표적화 서열)을 포함하는 CRISPR RNA (crRNA);
Cas 단백질, Cpf1 등과 같은 뉴클레아제와 상호작용하는 부위를 포함하는 trans-activating crRNA (tracrRNA); 및
상기 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위 (예컨대, 표적화 서열을 포함하는 crRNA 부위 및 뉴클레아제와 상호작용하는 tracrRNA의 부위)가 융합된 형태의 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며,
구체적으로 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA (dual RNA), 또는 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부위를 포함하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
상기 sgRNA는 표적 유전자 (표적 부위) 내의 표적 서열과 상보적인 서열 (표적화 서열)을 가지는 부분 (이를 Spacer region, Target DNA recognition sequence, base pairing region 등으로도 명명함) 및 Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 표적 유전자 내의 표적서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하는 부분, Cas 단백질 결합을 위한 hairpin 구조, 및 Terminator 서열을 포함할 수 있다. 상기 기술된 구조는 5'에서 3' 순으로 순차적으로 존재하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가이드 RNA가 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분 및 표적 DNA의 상보적인 부분을 포함하는 경우라면 어떠한 형태의 가이드 RNA도 본 발명에서 사용될 수 있다.
예컨대, Cas9 단백질은 표적 유전자 교정을 위하여 두 개의 가이드 RNA, 즉, 표적 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 Cas9 단백질와 상호작용하는 trans-activating crRNA (tracrRNA; Cas9 단백질과 상호작용함)를 필요로 하며, 이들 crRNA와 tracrRNA는 서로 결합된 이중 가닥 crRNA:tracrRNA 복합체 형태, 또는 링커를 통하여 연결되어 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA) 형태로 사용될 수 있다. 일 예에서, Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, sgRNA는 적어도 상기 crRNA의 혼성화 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA 일부 또는 전부와 상기 Cas9의 tracrRNA의 Cas9 단백질와 상호작용하는 부위를 적어도 포함하는 tracrRNA 일부 또는 전부가 뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때 뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당할 수 있음).
상기 가이드 RNA, 구체적으로 crRNA 또는 sgRNA는 표적 유전자 내 표적 서열과 상보적인 서열(표적화 서열)을 포함하며, crRNA 또는 sgRNA의 업스트림 부위, 구체적으로 sgRNA 또는 dualRNA의 crRNA의 5' 말단에 하나 이상, 예컨대, 1-10개, 1-5개, 또는 1-3개의 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 추가의 뉴클레오티드는 구아닌 (guanine, G)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 뉴클레아제가 Cpf1인 경우, 상기 가이드 RNA는 crRNA을 포함하는 것일 수 있으며, 복합체를 형성할 Cpf1 단백질 종류 및/또는 그 유래 미생물에 따라서 적절히 선택될 수 있다.
상기 가이드 RNA의 구체적 서열은 뉴클레아제 (Cas9 또는 Cpf1)의 종류 (즉, 유래 미생물)에 따라서 적절히 선택할 수 있으며, 이는 이 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 알 수 있는 사항이다.
일 예에서, 표적특이적 뉴클레아제로서 Streptococcus pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 사용하는 경우, crRNA는 다음의 일반식 1로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(Xcas9)m-3' (일반식 1)
상기 일반식 1에서,
Ncas9는 표적화 서열, 즉 표적 유전자(target gene)의 표적 부위(target site)의 서열에 따라서 결정되는 부위 (표적 부위의 표적 서열과 혼성화 가능)이며, l은 상기 표적화 서열에 포함된 뉴클레오타이드 수를 나타내는 것으로 15 내지 30, 17 내지 23, 또는 18 내지 22의 정수, 예컨대 20일 수 있고,
상기 표적화 서열의 3' 방향으로 인접하여 위치하는 연속하는 12개의 뉴클레오타이드(GUUUUAGAGCUA) (서열번호 1)를 포함하는 부위는 crRNA의 필수적 부분이고,
Xcas9는 crRNA의 3' 말단쪽에 위치하는 (즉, 상기 crRNA의 필수적 부분의 3' 방향으로 인접하여 위치하는) m개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, m은 8 내지 12의 정수, 예컨대 11일 수 있으며, 상기 m개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있으며, 각각 독립적으로 A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
일 예에서, 상기 Xcas9는 UGCUGUUUUG (서열번호 2)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 tracrRNA는 다음의 일반식 2로 표현될 수 있다:
5'-(Ycas9)p-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 2)
상기 일반식 2에서,
60개의 뉴클레오타이드 (UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC) (서열번호 3)로 표시된 부위는 tracrRNA의 필수적 부분이고,
Ycas9는 상기 tracrRNA의 필수적 부분의 5' 말단에 인접하여 위치하는 p개의 뉴클레오타이드를 포함하는 부위로, p는 6 내지 20의 정수, 예컨대 8 내지 19의 정수일 수 있으며, 상기 p개의 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
또한, sgRNA는 상기 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부위를 포함하는 crRNA 부분과 상기 tracrRNA의 필수적 부분 (60개 뉴클레오타이드)를 포함하는 tracrRNA 부분이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 헤어핀 구조 (stem-loop 구조)를 형성하는 것일 수 있다 (이 때, 올리고뉴클레오타이드 링커가 루프 구조에 해당함). 보다 구체적으로, 상기 sgRNA는 crRNA의 표적화 서열과 필수적 부분을 포함하는 crRNA 부분과 tracrRNA의 필수적 부분을 포함하는 tracrRNA 부분이 서로 결합된 이중 가닥 RNA 분자에서, crRNA 부위의 3' 말단과 tracrRNA 부위의 5' 말단이 올리고뉴클레오타이드 링커를 통하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는 것일 수 있다.
일 예에서, sgRNA는 다음의 일반식 3으로 표현될 수 있다:
5'-(Ncas9)l-(GUUUUAGAGCUA)-(올리고뉴클레오타이드 링커)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC)-3' (일반식 3)
상기 일반식 3에서, (Ncas9)l는 표적화 서열로서 앞서 일반식 1에서 설명한 바와 같다.
상기 sgRNA에 포함되는 올리고뉴클레오타이드 링커는 3 내지 5개, 예컨대 4개의 뉴클레오타이드를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 뉴클레오타이드들은 서로 같거나 다를 수 있고, A, U, C 및 G로 이루어진 군에서 각각 독립적으로 선택될 수 있다.
상기 crRNA 또는 sgRNA는 5' 말단 (즉, crRNA의 타겟팅 서열 부위의 5' 말단)에 1 내지 3개의 구아닌(G)을 추가로 포함할 수 있다.
상기 tracrRNA 또는 sgRNA는 tracrRNA의 필수적 부분(60nt)의 3' 말단에 5개 내지 7개의 우라실 (U)을 포함하는 종결부위를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열은 표적 DNA 상의 PAM (Protospacer Adjacent Motif　서열(S. pyogenes Cas9의 경우, 5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임))의 5'에 인접하여 위치하는 약 17개 내지 약 23개 또는 약 18개 내지 약22개, 예컨대 20개의 연속하는 핵산 서열일 수 있다.
상기 가이드 RNA의 표적 서열과 혼성화 가능한 가이드 RNA의 표적화 서열은 상기 표적 서열이 위치하는 DNA 가닥 (즉, PAM 서열(5'-NGG-3' (N은 A, T, G, 또는 C임)이 위치하는 DNA 가닥) 또는 이의 상보적인 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 또는 100%의 서열 상보성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로, 상기 상보적 가닥의 뉴클레오타이드 서열과 상보적 결합이 가능하다.
본 명세서에서, 표적 부위의 핵산 서열(표적 서열)은 표적 유전자의 해당 유전자 부위의 두 개의 DNA 가닥 중 PAM 서열이 위치하는 가닥의 핵산 서열로 표시된다. 이 때, 실제로 가이드 RNA가 결합하는 DNA 가닥은 PAM 서열이 위치하는 가닥의 상보적 가닥일 수 있으므로, 상기 가이드 RNA에 포함된 표적화 서열은, RNA 특성상 T를 U로 변경하는 것을 제외하고, 표적 서열과 동일한 핵산 서열을 가질 수 있다. 따라서, 본 명세서에서, 가이드 RNA의 표적화 서열과 표적 서열은 T와 U가 상호 변경되는 것을 제외하고 동일한 핵산 서열로 표시된다.
상기 가이드 RNA는 RNA 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)되거나, 이를 코딩하는 DNA를 포함하는 플라스미드 형태로 사용 (또는 상기 조성물에 포함)될 수 있다.
본 명세서에 기술된 바에 따라서, 디아미나제 및 표적 특이적 뉴클레아제를, 예컨대, mRNA 또는 RNP의 형태로 microinjection 또는 electroporation 방법으로, 포유 동물 (예컨대, 마우스) 세포에 주입함으로써, 포유 동물 세포 내의 표적 유전자 또는 표적 부위에서 효율적으로 염기 편집 (예컨대, 단일 염기 치환)을 수행할 수 있고, 이러한 염기 편집이 포유 동물 배아에서 수행되는 경우, 상기 염기 편집으로 인한 점돌연변이가 유발된 개체로 성공적으로 발생시킬 수 있다. 이러한 결과는 디아미나제 및 표적 특이적 뉴클레아제를 이용하여 단일 아미노산 치환 또는 난센스 돌연변이가 유발된 다양한 동물 모델을 제작할 수 있을 뿐 아니라, 인간 배아의 유전적 결함 수정에의 적용 가능성을 보여준다.
도 1a 내지 1e는 시티딘 디아미나제 매개 염기 교정에 의해 생성된 디스트로핀 결핍 변이 마우스 (dystrophin-deficient mutant mice)와 관련된 것으로,
도 1a는 디스트로핀 유전자 (Dmd)의 표적 부위의 핵산 서열을 보여주고 (PAM 서열 (NGG)은 파란색으로, sgRNA의 표적 서열은 검은색으로 나타내고, 시티딘 디아미나제 매개 염기 교정에 의해 치환된 염기는 붉은 색으로 표시함),
도 1b는 염기교정제 3 (BE3) (rAPOBEC1-nCas9-UGI) 코딩 mRNA 및 도 1a의 Dmd 유전자의 표적 서열과 혼성화 가능한 sgRNA를 마우스 접합체(zygote)에 미세주입한 후 발생된 신생개체의 Dmd 유전자 표적 부위 핵산 서열을 정렬한 결과를 보여주고 (Wt, 야생형; 표적 서열은 밑줄로 표시함; PAM 서열은 파란색으로, 치환된 염기는 붉은색으로 각각 표시함; 오른쪽 열의 'frequency (%)'는 변이(염기 치환)된 대립 유전자의 빈도를 나타내고, '-'는 해당 위치에 뉴클레오타이드가 존재하지 않음 (결실)을 나타냄; 왼쪽 열의 수치는 Dmd 돌연변이 마우스 번호임),
도 1c는 야생형 및 Dmd 돌연변이 마우스 D108의 DNA의 Sanger sequencing chromatograms을 보여주고 (화살표는 치환된 염기를 나타내며, 염기 치환에 의하여 Gln 코딩 코돈이 종료코돈으로 변이된 것을 보여줌),
도 1d는 야생형 및 Dmd 돌연변이 마우스 D108의 전방 경골 (tibialis anterior; TA) 근육의 조직학적 분석 (형광 분석) 결과를 보여주고 (라미닌(Laminin): 대조군; 4주령의 야생형 마우스 또는 Dmd 돌연변이 마우스 (D108)로부터 근육을 채취하고 liquid nitrogen-cooled isopentane에서 동결시켜서 근육 시료를 준비함; 스케일 바: 50 ㎛),
도 1e는 Dmd 유전자의 표적 부위에 염기치환 돌연변이를 유도한 과정 및 결과를 정리하여 보여준다.
도 2a 내지 2e는 시티딘 디아미나제 매개 염기 교정에 의해 생성된 백색증 마우스과 관련된 것으로,
도 2a는 티로시나제 유전자 (Tyr)의 표적 부위의 핵산 서열을 보여주고 (PAM 서열 (NGG)은 파란색으로, sgRNA의 표적 서열은 검은색으로 나타내고, 시티딘 디아미나제 매개 염기 교정에 의해 치환된 염기는 붉은 색으로 표시함),
도 2b는 염기교정제 3 (BE3) (rAPOBEC1-nCas9-UGI) RNP (BE3와 도 2a의 Tyr 유전자의 표적 서열과 혼성화 가능한 sgRNA와의 복합체)의 전기천공법에 의한 마우스 접합체(zygote) 내로의 도입 후 발생된 신생 개체의 Tyr 유전자 표적 부위의 핵산 서열을 정렬한 결과를 보여주고 (Wt, 야생형; 표적 서열은 밑줄로 표시함; PAM 서열은 파란색으로, 치환된 염기는 붉은색으로 각각 표시함; 오른쪽 열의 'frequency (%)'는 변이(염기 치환)된 대립 유전자의 빈도를 나타내고, '-'는 해당 위치에 뉴클레오타이드가 존재하지 않음을 나타냄; 왼쪽 열의 수치는 Tyr 돌연변이 마우스 번호임),
도 2c는 야생형 및 Tyr 돌연변이 마우스 T113 및 T114의 DNA의 Sanger sequencing chromatograms을 보여주고 (화살표는 치환된 염기를 나타내며, 염기 치환에 의하여 Gln 코딩 코돈이 종료코돈으로 변이된 것을 보여줌),
도 2d는 BE3 RNP의 전기천공 주입 후에 발생한 Tyr 돌연변이 마우스들의 눈에 백색증(화살표, T113 및 T114)이 나타남을 보여주고,
도 2e는 Tyr 유전자의 표적 부위에 염기치환 돌연변이를 유도한 과정 및 결과를 정리하여 보여준다.
도 3a 및 3b는 BE3(디아미나제-Cas9) mRNA와 sgRNA의 마우스 배아에의 미세주입에 의한 마우스 배아에서의 표적 돌연변이 유발을 보여주는 것으로, 보다 구체적으로, BE3 코딩 mRNA와 sgRNA를 마우스 접합체에 미세주입 후 발생된 포배(blastocyst)의 표적 유전자 (Dmd 및 Tyr)의 표적 부위의 핵산 서열을 정렬한 결과를 보여준다 (3a: Dmd 변이 결과; 3b: Tyr 변이 결과; Wt, 야생형; 표적 서열은 밑줄로 표시함; PAM 서열은 파란색으로, 치환된 염기는 붉은색으로 각각 표시함; 오른쪽 열의 'frequency (%)'는 변이(염기 치환)된 대립 유전자의 빈도를 나타내고, '-'는 해당 위치에 뉴클레오타이드가 존재하지 않음(결실됨)을 나타냄; 왼쪽 열의 수치는 돌연변이 마우스 배아세포의 번호임).
도 3은 야생형 및 Dmd 돌연변이 마우스들의 DNA의 Sanger sequencing chromatograms을 보여준다 (화살표는 치환된 염기를 나타냄)
도 4는 잠재적인 비표적 부위 (off-target site)에서의 Dmd 돌연변이 여부를 시험한 결과를 보여주는 그래프로서, 비표적 부위에서 돌연변이가 거의 유발되지 않음을 확인할 수 있다 (Dmd 돌연변이 마우스 (n = 3)의 비표적 부위에서의 돌연변이 (염기 교정) 비율(%)는 심부 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)에 의하여 측정됨; 미스매치 뉴클레오타이드 및 PAM 서열은 각각 적색 및 청색으로 표시됨).
도 5는 잠재적인 비표적 부위 (off-target site)에서의 Tyr 돌연변이 여부를 시험한 결과를 보여주는 그래프로서, 비표적 부위에서 돌연변이가 거의 유발되지 않음을 확인할 수 있다 (Tyr 돌연변이 마우스 (n = 2)의 비표적 부위에서의 돌연변이 (염기 교정) 비율(%)는 심부 시퀀싱 (Targeted deep sequencing)에 의하여 측정됨; 미스매치 뉴클레오타이드 및 PAM 서열은 각각 적색 및 청색으로 표시됨).
도 6은 pCMV-BE3 벡터의 개열지도이다.
도 7은 pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS 벡터의 개열지도이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1: BE3 mRNA 준비
pCMV-BE3 (Addgene; cat. #73021; 도 6)로부터 rAPOBEC1-XTEN (링커) 및 UGI (uracil DNA glycosylase inhibitor)를 절단하여 분리한 후, pET-nCas9(D10A)-NLS 벡터(Cho, S.W. et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res 24, 132-141 (2014) 참조)에 삽입하여, pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS (서열번호 7; 도 7)를 제작하고, 이를 BE3 mRNA 주형으로 사용하였다.
pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS (서열번호 7)의 각 부위의 서열을 정리하면 다음과 같다:
Hisx6: 서열번호 8;
rAPOBEC1: 서열번호 9;
XTEN (링커): 서열번호 10;
nCas9 (D10A): 서열번호 11;
링커: TCTGGTGGTTCT (서열번호 14)
UGI: 서열번호 12;
링커: TCTGGTGGTTCT (서열번호 14)
NLS: 서열번호 13.
상기 pET-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9-UGI-NLS 벡터에 대하여 프라이머 (F: 5'-GGT GAT GTC GGC GAT ATA GG-3', R: 5'-CCC CAA GGG GTT ATG CTA GT-3') 및 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific)를 사용하는 PCR을 수행하여, 상기 mRNA 주형을 준비하였다. in vitro RNA 전사 키트 (mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit, Ambion)를 사용하여 상기 준비된 mRNA 주형으로부터 BE3 mRNA 합성하고, MEGAclear kit (Ambion)로 정제하였다.
실시예 2: sgRNA 준비
다음의 핵산 서열을 갖는 디스트로핀 유전자 Dmd 또는 티로시나제 유전자 Tyr 표적 가이드 RNA (sgRNA)를 각각 합성하여, 하기의 시험에 사용하였다:
5'-(표적 서열)-(GUUUUAGAGCUA; 서열번호 1)-(뉴클레오타이드 링커)-(UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC; 서열번호 3)-3'
(상기 표적 서열은 하기의 도 1a (Dmd) 또는 도 2a (Tyr)에 밑줄로 표시된 핵산 서열에서 "T"를 "U"로 변환한 서열이며,
상기 뉴클레오타이드 링커는 GAAA의 뉴클레오타이드 서열을 가짐).
상기 sgRNA는 T7 RNA polymerase를 이용하는 in vitro 전사에 의하여 제작하였다 (Cho, S.W., Kim, S., Kim, J.M. & Kim, J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013) 참조)
실시예 3: 리보핵산단백질 (ribonucleoproteins; RNPs)의 준비
Rosetta 발현 세포 (EMD Milipore)를 상기 참고예 1에서 준비된 pET28-Hisx6-rAPOBEC1-XTEN-nCas9(D10A)-UGI-NLS (BE3) 발현 벡터로 형질전환시키고, 18℃에서 12 내지 14 시간 동안 0.5 mM 이소프로필 베타-D-1-티오갈락토피라노사이드 (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside; IPTG)를 처리하여 단백질 발현을 유도하였다. 단백질 발현 유도 후, 원심분리하여 박테리아 세포를 수확하고, 펠렛화된 세포를 용해 완충액 [50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, and 1 mg/ml lysozyme]에서 소니케이션하여 용해시켰다.
상기 얻어진 세포 용해물을 5,251xg에서 30분동안 원심분리하여 제거하고, 가용성 용해물을 Ni-NTA 비드 (Qiagen)를 사용하여 4℃에서 1 시간동안 배양하였다. 그 후, Ni-NTA 비드를 세정 완충액 [50 mM NaH2PO4 (pH 8.0), 300 mM NaCl, and 20 mM imidazole]으로 3회 세척하고, 용출 완충액 [50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 150-500 mM NaCl, 10-25% glycerol, and 0.2 M imidazole]로 BE3 단백질을 용출시켰다. 정제된 BE3 단백질을 Ultracell 100K 셀룰로스 컬럼 (Millipore)을 사용하여 저장 완충액[20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM KCl, 1 mM DTT, and 10% glycerol]으로 교환 및 농축시켰다. 상기 단백질의 순도를 SDS-PAGE로 결정하였다. sgRNA는 실시예 3에 기재된 바와 같이 T7 RNA polymerase를 이용하는 in vitro 전사에 의하여 준비하였다.
실시예 4: 동물의 준비
마우스를 대상으로 하는 실험은 서울대학교의 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)의 승인을 받아 수행하였다. 마우스를 SPF (specific pathogen-free) 시설에서 12 시간의 암영 주기로 유지시켰다. C57BL/6J 및 ICR 마우스를 각각 배아 기증자 (embryo donor) 및 위탁모(foster mother)로 사용하였다.
실시예 5: 마우스 접합체 (zygote)로의 미세주입 및 전기천공
과배란, 배아 채취, 미세주입 및 전기천공은 "Hur, J.K. et al., Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol 34, 807-808 (2016)"를 참조하여 수행하였다.
미세주입의 경우, BE3 mRNA (10 ng/ul)와 sgRNA (100 ng/ul)의 복합체를 포함하는 용액을 DEPC-처리된 주입 완충액 (0.25 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 7.4)을 사용하여 희석시키고 (Sung, Y.H. et al. Highly efficient gene knockout in mice and zebrafish with RNA-guided endonucleases. Genome Res 24, 125-131 (2014) 참조), Nikon ECLIPSE Ti micromanipulator 및 FemtoJet 4i microinjector (Eppendorf)를 이용하여 수정된 1-세포기 배아의 전핵 (pronuclei) 내로 주입하였다.
전기천공의 경우, BE3-sgRNA RNP 복합체 (각각 10㎍/100㎕ 및 6.5㎍/100㎕ 함유)를 함유하는 opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) 100㎕으로 충진된 유리챔버를 포함하는 NEPA 21 electroporator (NEPA GENE Co. Ltd.)를 사용하여 상기 RNP 복합체를 1-세포기의 마우스 배아 세포에 전기천공으로 주입하였다 (Hur, J.K. et al. Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol 34, 807-808 (2016) 참조).
BE3 RNP 또는 mRNA 전달 후, 상기 배아를 KSOM+AA (Millipore)의 미세액적(microdrop)에서 배양하였으며, 상기 배양은 37℃ 및 5% CO2의 가습 조건하에서 4일간 수행하였다. 2-세포기 배아를 0.5-dpc pseudo pregnant foster mother의 난관에 이식하였다.
상기 과정을 아래의 그림에 요약하였다:
Figure 112017128559709-pat00001
실시예 6: Genotyping
PCR genotyping을 위하여, 참고예 4에서 난관에 이식된 배아로부터 얻어진 포배기 배아 또는 마우스 신생 개체의 ear clip에서 게놈 DNA를 추출하여, 이에 대한 targeted deep sequencing 및 Sanger sequencing을 수행하였다.
실시예 7: 표적심층시퀀싱(Targeted deep sequencing)
하기 실시예에서의 핵산 서열 분석은 아래와 같은 표적심층시퀀싱에 의하여 수행하였다.
Phusion polymerase (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 상기 참고예 5에서 추출된 게놈 DNA로부터 표적부위 또는 비표적 부위를 증폭시켰다. Illumina MiSeq를 사용하여 PCR 증폭산물 (PCR amplicons)의 paired-end sequencing을 수행하였다 (LAS, Inc. (South Korea)에 의뢰하여 수행). 비표적 부위 증폭에 사용된 프라이머들을 하기의 표 1 및 표 2에 나타내었다.
Dmd 표적 sgRNA의 잠재적인 비표적 부위(off-target sites)에서의 표적심층시퀀싱에 사용된 프라이머
1st PCR 2nd PCR
No. Forward(5' 3'→) Reverse(5' 3'→) Forward(5' 3'→) Reverse(5' 3'→)
Dmd -OT1 TTTTTGCTCCTTACAAACAAGG TTATGTGGCCTTGCTCATTG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCAGAGGAGCTACAAGCAAGG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGTGAGTCATTGCATCCATC
Dmd -OT2 ACCCCAAAATTCACCAGAGA TGAGGTCAGGGATGGTGATT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTGAAAGGATACATGGGCTGA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAATCCTGACAATCCATGAACA
Dmd -OT3 TTTGAGCCTCTGGGAACATT TCAGCCTCTTCTCCACTTTTT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCTATGCTGCCGATGATCC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCAAATTGTATAACTGAAGCAG
Dmd -OT4 TGAAGTCCTAGAAAACAAAAGCA TGGCATTGCATTGAATCTGT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAAGGATAAACAGGCTGAGAAAAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGGGATATCTTTCCAATTTCTGA
Dmd -OT5 GCTTTCTAAAGCCTTTTTAGCTTTT CACCTGCCAAGTGTGGTATG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTCTGGCAGTTTACCCAAGG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGAAAGTGACAGCAATTCCATT
Dmd -OT6 CAACCCATATATATTTTGGCCAGT TGCCAATTGCCCTTTCTATC ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCACCTAATCAGTGGCCTTT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATGAGCATGGGAAATCTT
Dmd -OT7 TTTCAGGGAAAGGTGACAGG TGTGTGCAATAAACCACAGTGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTTCAGGGAAAGGTGACAGG GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGTTTCACGTCTGGGAGT
Dmd -OT8 CATCCAAAGTGGCTTGAACA GTCTGGCCCAAACAGAATGT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCACCTCCCATAACCGTAAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCATGAATCTTCCCACAAGGAA
Dmd -OT9 GCACCTAGATTTTGGCCATC AATGCCAAATGCATTGAAGG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTAAAGGCATGCACAACCAC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAATGCCAAATGCATTGAAGG
Dmd -OT10 TGCAAGTTGTCTTCCGACTG AGGCAAGGTGAGGACTCAGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCAGACATGCACACACATA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCATTCTCACAGTTATCCCAAA
Dmd -OT11 CGAGAGGTTGAGACCTGGAG CTCCTGAGGGTAGGGAGCTT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAACCACACTACTGCTCTCATGC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCCCTGAGAAATGAACACG
Dmd -OT12 GTTTGGCGTGGGATATGACT GCACATCTTCCATGTGCTGT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTCCAACCAACAGGACGAT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTAGGCTGTGGTGATGGCTTT
Dmd -OT13 AGAAGAGGGCCATGAGTCAA GGTCTTAGCCTCCAGCCTCT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAGATAACGCCATAGCTGCAC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCTTCTTTTCCAGCTCCTT
Dmd -OT14 CCAGTCGTTAGGCCTGTGAG GGGTGACCTTGAATTCCTGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCAGGAGCGCACTAGAACCT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGCATGTACCATGACCACA
Dmd -OT15 GAGAACGAGTGCCAAAGGAG CCCATGTATTTTCCCATTGC ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTAACACATGGTTGGCTCCTT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTAGTTATGAGGGAACAGTTGCT
Tyr 표적 sgRNA의 잠재적인 비표적 부위(off-target sites)에서의 표적심층시퀀싱에 사용된 프라이머
1st PCR 2nd PCR
No. Forward(5' 3'→) Reverse(5' 3'→) Forward(5' 3'→) Reverse(5' 3'→)
Tyr -OT1 GCATGAGCACACACTGAAATATAA AGATGCCTGCTCTGTCTTTC ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTCCCAAGTACCCTACTAC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAACAAGAGCTCACATTATTGG
Tyr -OT2 AGTGGTTGGCTTCTCTCTTATC GCATGGTATGTACTCCCTGTT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCTTCTCTCTTATCCCACTCATATC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCCACAGACAGTAAGAAGTTCA
Tyr -OT3 CATGTGTCTTCCTGGCTATCTT TCTGTGGCCTAGAGGAGTAAT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTGTGCTATGCATTGGTAGA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATCAAGAGAAGGCAGCACATAG
Tyr -OT4 TTGTCTTCCTGTGTCTGCCTTA AGATTATGCCCAAGGGGTTT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCTATCCTATCCCCCTCTGC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGACTAAACCACCACCAGA
Tyr -OT5 TGGCCAGAAGACTAGGATGG AGGGTTTGCAACTCCATAGG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTCTTTTCCCAGTTTCCTTTCC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTGTAGCAGAGAATGGCCTTG
Tyr -OT6 TCACACCAGCTTGCCATT GAGAAAGGACCAAAGGAGTTGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACACCAGCTTGCCATTCTT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGAGAGGTCCTTGATCCTAT
Tyr -OT7 CCAACCAGAACCACCAGAAT CTCTTCCTCTTCCTCTTCCTCT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGAATTCCCAGGGACTAAGC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCCCTCCTCCTGATTCTATGA
Tyr -OT8 CAGTTTCGGTAGCCTTGACTTA CAATTGATAGTGGCTGCCTAGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAGTGCGATAACCCTTCTTGT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATTGCGAAACAGTGGATCT
Tyr -OT9 GGGAAATAGTAAGTAACAAGGAGAA GAGACTGGAACAGCAAACAC ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCACTTGTATGAGGGTGTTTCT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAATGCCCATGCAGCTCT
Tyr -OT10 TTTTGTTGTCAGCTGGCTTG TCCAGGGATTTTGTGTTGGT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCCCTATCCCATCCACTTTCC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAAGCCATCAACAAAGGATGG
Tyr -OT11 CTTTCCCAGTGCCACCTAAA GAGCCTTACAAATACAGAGATGGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCTTTCCCAGTGCCACCTAAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGACTAAGCCATCAACCAAGGA
Tyr -OT12 CAAGGCCGGAGAGTTTACTAAG CCTCCGCTAACACAACATACA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCATCTAAGTAGGAAGGCTAGA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGGGAGTAGGATGTAAGTA
Tyr -OT13 TACTCTGCTGCAAGAGGATTTC TGTGTGTGTGTGTGTGTGT ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGATGGATGCCTACCTGACAAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGAAGTAGACAGCATAGAGTACAGAAG
Tyr -OT14 AAAGGACTGAAGGAGTTGAAGG ACGTCCAGGAAGTTCTCTTTATG ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCAAAGAGCTCACAGGGACTAAA GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCCTGCTTCTATGAGGGTGTTC
Tyr -OT15 GGCCCTGTCTATTTACTAGAGTTG GGATATAACTCACAGACCTCAAGAA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGCTCCACATTTCCATTCATTC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGATATAACTCACAGACCTCAAGAA
Tyr -OT16 AGGAAGGAAGAAACTGAAACCA GTGAGGCAAACCCACAAGTA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAAAGAGGCCCAAGGATCAC GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATACATCTGACCCACCTTGC
Tyr -OT17 ATTGTTGTGTCTTCTGCCCTA GCTCTATTACCCAGTTCCTTCC ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTAGTCACAACTGTAGGCACATT GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTTCCTTCCTCTACCAGAAAGC
실시예 8: 면역형광염색(Immunofluorescent staining)
마우스로부터 절제한 전방 경골 (tibialis anterior; TA) 근육 절편을 라미닌(laminin) 또는 디스트로핀(dystrophin) 항체로 면역 염색하였다. 라미닌은 래빗 다클론항체 (abcam, ab11575)의 1:500 희석액과 Alexa Fluor 568 항-래빗 이차항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:1000 희석액을 차례로 사용하여 검출하였다. 디스트로핀은 래빗 다클론항체 (abcam, ab15277)의 1:500 희석액과 Alexa Fluor 488 항-래빗 이차항체 (Thermo Fisher Scientific)의 1:1000 희석액을 차례로 사용하여 검출하였다. 상기 면역형광 염색된 절편을 Leica DMI4000 B 형광현미경으로 관찰하였다.
실시예 9: BE3를 사용하여 돌연변이가 유도된 마우스 배아의 서열분석
실시예 1-5에 기재된 바와 같이, 마우스 배아세포에 Base Editor 3 (BE3) (rAPOBEC1-nCas9-UGI)를 미세주입에 의하여 주입하여, 디스트로핀 코딩 유전자 Dmd 및 티로시나제 코딩 유전자 Tyr에서 각각 점 돌연변이를 유도하였다.
도 1a (Dmd) 및 도 2a (Tyr)에 나타낸 바와 같이, 각 유전자의 표적 부위 (도 1a 및 도 2a에서, 위에 기재된 핵산 서열 중 밑줄로 표시한 서열 부위)에서 단일 염기 치환 (C→T)에 의하여 종료코돈이 생성될 것으로 예상되었다 (도 1a 및 도 2a에서, 아래 기재된 핵산 서열이 단일 염기 치환이 일어난 핵산 서열이며, 치환(C→T)된 염기를 붉은색으로 표시).
도 1e 및 도 2e는 상기 수행된 Dmd 또는 Tyr 유전자에서의 표적 특이적 단일 염기 치환 돌연변이 과정 (미세주입 또는 전기천공) 및 결과를 요약해서 보여준다. 도 1e 및 도 2e에 나타난 바와 같이, Dmd 또는 Tyr 유전자의 표적 부위에서 각각 73% (Dmd; 15개 중 11개) 또는 100% (Tyr; 10개 중 10개)의 빈도로 배아에서 변이가 관찰되었다.
또한, BE3 mRNA와 sgRNA의 미세주입에 의하여 돌연변이가 유발된 마우스 배아의 표적 부위의 핵산 서열을 targeted deep sequencing로 확인하였다. 보다 구체적으로, BE3(rAPOBEC1-nCas9-UGI) mRNA와 sgRNA의 마우스 배아에의 미세주입에 의한 마우스 배아에서의 표적 돌연변이 유발을 보여주는 것으로, BE3 코딩 mRNA와 sgRNA를 마우스 접합체에 미세주입 후 발생된 포배(blastocyst)의 표적 유전자 (Dmd 및 Tyr)의 표적 부위의 핵산 서열을 정렬하였다.
[md 표적 mRNA 미세주입에 의한 변이 결과]
서열 빈도(%)
Wt ACAGCAATTAAAAGCCAGTTAAAAATTTGTA AGG (SEQ ID NO: 15)
#64 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 94
#65 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 53
ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 38
#66 ACAGCAATTAAAAG A CAGTTAAAAATTTGTAAGG 55
ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 34
ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 6
ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 3
#67 ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 16
#68 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 97
#72 ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 71
ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 25
#79 ACAGCAATTAAAAG GT AGTTAAAAATTTGTAAGG 99
#80 ACAGCAATTAAAAG TA AGTTAAAAATTTGTAAGG 39
ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 20
ACAGCAA---------------AAATTTGTAAGG 40 (-15 bp)
#87 ACAGCAATTAAAAGC A AGTTAAAAATTTGTAAGG 84
ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 12
#88 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 77
ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 22
#95 ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 54
ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 45
[Tyr 표적 mRNA 미세주입에 의한 변이 결과]
서열 빈도(%)
Wt GCACCATCTGGACCTCAGTTCCCCTTCAAAG GGG (SEQ ID NO: 17)
#47 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 73
#48 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 99
#49 GCACCATCTGGACCT T AGTT T CCCTTCAAAGGGG 49
GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 45
#50 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 99
#51 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 56
GCACCATCTGGACCTCAGTTCCC T TTCAAAGGGG 14
GCACCATCTGGACCTCA--------TCAAAGGGG 25 (-8 bp)
#52 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCC-TTCAAAGGGG 100 (-1 bp)
#53 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 26
GCACCATCTGGACCT A AGTTCCCCTTCAAAGGGG 23
#54 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 57
#55 GCACCATCT---------------------GGGG 16 (-21 bp)
GCACCATCTGGACCT A AGTTCCCCTTCAAAGGGG 15
GCACCATCTGGA T CT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 14
GCACCATCTGGACCT T AGTT A CCCTTCAAAGGGG 11
#56 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCCTTCAAAGGGG 86
(Wt, 야생형; 표적 서열은 밑줄로 표시함; PAM 서열 (NGG)은 볼드체로, 치환된 염기는 볼드체+밑줄로 각각 표시함; 오른쪽 열의 수치 (빈도(%))는 변이(염기 치환)된 대립 유전자의 빈도를 나타내고, '-'는 해당 위치에 뉴클레오타이드가 존재하지 않음(결실됨)을 나타냄; 왼쪽 열의 수치는 돌연변이 마우스 배아세포의 번호임)
상기에 나타난 바와 같이, 상기 두 개의 유전자(Dmd 또는 Tyr)의 표적 부위 모두에서, C→T 염기치환이 주요한 돌연변이 유발 패턴임을 확인할 수 있다.
실시예 10: BE3 및 Dmd 표적 sgRNA의 미세주입에 의하여 돌연변이가 유도된 마우스 개체의 돌연변이 유발 확인
마우스 배아에 BE3 mRNA와 Tyr 표적 sgRNA의 미세주입 후, foster mother 난관에 이식하여(실시예 5 참조), Dmd 유전자에 점 돌연변이를 갖는 신생 돌연변이 마우스(F0)를 얻었다.
도 1b 및 도 3은 BE3 (rAPOBEC1-nCas9-UGI) 코딩 mRNA 및 Dmd 유전자의 표적 부위의 핵산 서열과 혼성화 가능한 sgRNA를 마우스 접합체(zygote)에 미세주입한 후 발생된 신생개체의 표적 유전자 (Dmd)의 표적 부위의 핵산 서열을 분석한 결과를 보여준다. 도 1b에 나타난 바와 같이, Dmd 유전자에 점 돌연변이를 유발한 경우, 총 9 마리 생쥐 중 5 마리(D102, D103, D107, D108, 및 D109)가 Dmd 유전자의 표적 부위에 돌연변이를 가지며, 이들 5 개의 돌연변이 마우스 중 3 개 개체(D102, D103, D108)는 하나 또는 두 개의 돌연변이 대립 유전자를 보유하고 있으며 야생형 대립 형질이 결여되어 있는 것으로 확인되었다. 다른 두 돌연변이 마우스 (D107 및 D109)는 모자이크 형태로 10%의 빈도로 야생형 대립 유전자를 보유하고 있었다. 또한, 도 1b 및 도 3에 나타난 바와 같이, 돌연변이 마우스 D109는 점 돌연변이가 아닌 20-염기쌍 (bp) 결실을 보였고, 이는 BE3에 포함된 Cas9 니카아제가 표적 부위에서 indels을 유도하는 활성을 보유하고 있음을 보여준다.
도 1c는 야생형 및 Dmd 돌연변이 마우스 D108의 표적 유전자의 표적 부위의 Sanger sequencing chromatograms을 보여준다. 도 1c에서 보여지는 바와 같이, 야생형 대립 유전자가 없는 돌연변이 F0 마우스인 D108는 단일 염기 치환 (C→T)에 의하여 Dmd 유전자에 조기 종료코돈(TAG)이 도입되었다.
도 1d는 야생형 및 Dmd 돌연변이 마우스 D108의 TA 근육 절편에 대한 면역형광염색 (실시예 8 참조) 결과를 나타낸 것으로, 돌연변이 개체 (D108)의 근육에서 디스트로핀이 거의 발현되지 않음을 확인할 수 있다. 이는 BE3 mRNA 및 Dmd 표적 sgRNA의 주입 (미세주입)에 의하여 Dmd 유전자가 성공적으로 knock-down됨을 보여준다.
실시예 11: BE3 및 sgRNA를 포함하는 RNA의 전기천공에 의하여 돌연변이가 유도된 마우스 배아의 돌연변이 유발 확인
실시예 3에서 준비된 재조합 BE3 단백질과 in vitro 전사된 sgRNA의 혼합물(rAPOBEC1-nCas9(D10A)-UGI RNP)을 포함하는 BE3 리보핵산단백질 (RNPs)을 전기천공법으로 마우스 배아에 전달하였다 (실시예 5 참조). 전기천공 후 4 일째에, 마우스 배아의 각 표적 유전자 (Dmd 또는 Tyr)의 표적 부위의 핵산 서열을 분석하여 그 결과를 아래에 나타내었다:
[Dmd, RNP electroporation 변이 결과]
서열 빈도(%)
Wt ACAGCAATTAAAAGCCAGTTAAAAATTTGTA AGG (SEQ ID NO:15)
#17 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 85
#18 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 66
ACAGCAATTAAAAGC A AGTTAAAAATTTGTAAGG 18
#19 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 64
ACAGCAATTAAAAGC A AGTTAAAAATTTGTAAGG 24
#20 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 57
ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 30
#21 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 100
#22 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 96
#23 ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 42
#24 ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 51
#25 ACAGCAATTAAAAG TT AGTTAAAAATTTGTAAGG 68
ACAGCAATTAAAAG T CAGTTAAAAATTTGTAAGG 8
#26 ACAGCAATTAAAAGCCAGTT--------GTAAGG 98 (-8 bp)
#28 ACAGCAATTAAAAG TA AGTTAAAAATTTGTAAGG 100
#31 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 77
#32 ACAGCAATTAAAAGC T AGTTAAAAATTTGTAAGG 100
[Tyr, RNP electroporation 변이 결과]
서열 빈도(%)
Wt GCACCATCTGGACCTCAGTTCCCC-TTCAAAG GGGTGG (SEQ ID NO:17)
#83 GCACCATCTGGACCT A AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 25
GCACCATCTGGACCTCAGTT A CCC-TTCAAAGGGGTGG 18
GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 14
#34 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 54
GCACCATCTGGACCT G AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 45
#36 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 48
#37 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 56
#38 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 94
#40 GCACCATCTGGACCT G AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 59
GC-----------------------TTCAAAGGGGTGG 21 (-22 bp)
GCACCATCTGGACCT C AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 14
#41 GCACCATCTGGACCT T AGTT T CCC-TTCAAAGGGGTGG 44
#42 G------------------------------------G 35 (-35 bp)
#44 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC T TT T AAAGGGGTGG 25 (+1 bp)
GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 9
GCACCATCTGGACCTCAGTTC T CC-TTCAAAGGGGTGG 3
#45 GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 55
#46 GCACCATCTGGACCTCAG-----------------TGG 76 (-16 bp)
GCACCATCTGGACCT T AGTTCCCC-TTCAAAGGGGTGG 23
(Wt, 야생형; 표적 서열은 밑줄로 표시함; PAM 서열은 볼드체로, 치환된 염기는 볼드체+밑줄로 각각 표시함; 오른쪽 열의 수치 (빈도(%))는 변이(염기 치환)된 대립 유전자의 빈도를 나타내고, '-'는 해당 위치에 뉴클레오타이드가 존재하지 않음(결실됨)을 나타냄; 왼쪽 열의 수치는 돌연변이 마우스 번호임)
상기 결과 및 도 1e 및 도 2e에 나타난 바와 같이, BE3 RNP의 전기천공 주입에 의하여, 포배기 배아의 Dmd 및 Tyr 표적 부위에서 각각 81% (Dmd: 16개 중 13개) 및 85% (Tyr: 13개 중 11개)의 빈도로 돌연변이가 유도되었다.
실시예 12: BE3 및 Tyr 표적 sgRNA를 포함하는 RNP의 전기천공 주입에 의하여 돌연변이가 유도된 마우스 개체의 돌연변이 유발 확인
마우스 배아에 BE3 및 Tyr 특이적 sgRNA를 포함하는 RNP를 전기천공에 의하여 마우스 배아에 주입한 후, foster mother 난관에 이식하여(실시예 5 참조), Tyr 유전자에 점 돌연변이를 갖는 마우스(F0)를 얻었다.
도 2b는 상기 얻어진 신생 돌연변이 마우스의 Tyr 유전자의 표적 부위의 핵산 서열을 정렬한 결과를 보여준다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 얻어진 신생 돌연변이 마우스 7 마리 (T110, T111, T112, T113, T114, T117, 및 T118) 모두 Tyr 유전자의 표적 부위에서 다양한 돌연변이가 유발됨을 확인할 수 있다.
도 2c는 야생형 및 신생 돌연변이 마우스 (T113 및 T114)의 표적 유전자의 표적 부위의 Sanger sequencing chromatograms을 보여주는 것으로, 상기 신생 돌연변이 마우스의 표적 부위에서의 단일 염기 치환 (C→T)에 의하여 종료코돈 (TAG)이 생성됨을 확인할 수 있다.
도 2d는 신생 돌연변이 마우스들의 눈의 표현형을 보여주는 것으로, 돌연변이 마우스 (T113, T114)에서 눈 백색증이 나타남을 확인할 수 있다. 이는 BE3 mRNA 및 Tyr 표적 sgRNA의 RNP의 주입 (전기천공)에 의하여 Tyr 유전자가 성공적으로 knock-down됨을 보여준다.
실시예 12: off-target effect 시험
BE3의 off-target 효과를 평가하기 위해, Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)를 사용하여 마우스 게놈에서 최대 3-nucleotide mismatche를 갖는 잠재적인 비표적 부위 (off-target site)를 확인하고, 표적심층시퀀싱을 통해 신생 돌연변이 마우스 개체로부터 분리된 게놈 DNA를 분석하였다.
sgRNA 서열 및 표적심층시퀀싱에 사용된 프라이머 서열을 아래의 표 3에 정리하였다
sgRNA sequence
Dmd AAGCCAGTTAAAAATTTGTAAGG (서열번호 19)
Tyr ACCTCAGTTCCCCTTCAAAGGGG (서열번호 35)
sgRNA primer for T7 in vitro transcription (5'-3')
Dmd-F GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGA AGC CAG TTA AAA ATT TGT AGT TTT AGA GCT AGA AAT AGC AAG (서열번호 53)
Tyr-F GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGA CCT CAGTTC CCC TTC AAA GGT TTT AGA GCT AGA AATAGC AAG (서열번호 54)
R AAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC (서열번호 55)
Targeted deep sequencing primer (5'-3')
Dmd-1st PCR-F GCT AGA GTA TCA AAC CAA CAT CAT TAC (서열번호 56)
Dmd-1st PCR-R TGC TTC CTA TCT CAC CCA TCT (서열번호 57)
Dmd-2nd/adaptor PCR-F ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGA TCT GCT ACA ACA ATT GGA ACA GAT GAC (서열번호 58)
Dmd-2nd/adaptor PCR-R GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TTC TTC ACT GTA CAG AGC TCA ATG (서열번호 59)
Tyr-1st PCR-F TGT ATT GCC TTC TGT GGA GTT (서열번호 60)
Tyr-1st PCR-R GGT GTT GAC CCA TTG TTC ATT T (서열번호 61)
Tyr-2nd/adaptor PCR-F ACA CTC TTT CCC TAC ACG ACG CTC TTC CGATCT GGA GTT TCC AGA TCT CTG ATG G (서열번호 62)
Tyr-2nd/adaptor PCR-R GTG ACT GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCGATC TGC ACT GGC AGG TCC TAT TAT (서열번호 63)
상기 확인된 마우스 게놈에서의 비표적 부위 (off-target site) 및 상기 표적심층시퀀싱 결과를 하기의 표 4 (Dmd) 및 표 5 (Tyr), 및 도 4 (Dmd) 및 도 5 (Tyr)에 나타내었다:
마우스 게놈 내의 Dmd 표적 부위에 대한 비표적 부위 (Dmd-On: Dmd의 표적(on-target) 부위; Dmd-OT: Dmd의 비표적(off-target) 부위)
No. Gene Sequence Chromosome Position Direction
Dmd-On Dmd Exon AAGCCAGTTAAAAATTTGTAAGG (서열번호19) chrX 83781748 +
Dmd-OT1 Atp11c Intron AAGCCAGTTAgAAgTTTGTAAGG (서열번호20) chrX 60354718 +
Dmd-OT2 Intergenic region - AAGCaAGTgtAAAATTTGTATGG (서열번호21) chr3 123915964 -
Dmd-OT3 Ptprd Intron AAtaCAGTTAAtAATTTGTAAGG (서열번호22) chr4 78045958 +
Dmd-OT4 Cfh Intron AAGCaAGTaAAAcATTTGTATGG (서열번호23) chr1 139933967 +
Dmd-OT5 Sos1 Intron ttGCCAGTTtAAAATTTGTAAGG (서열번호24) chr17 80462531 -
Dmd-OT6 Intergenic region - AAGCaAtTgAAAAATTTGTATGG (서열번호25) chr17 81921018 +
Dmd-OT7 Grid2 Intron AAGCCAGaaAcAAATTTGTAGGG (서열번호26) chr6 64297703 -
Dmd-OT8 Intergenic region - AAGCtAGTggAAAATTTGTACGG (서열번호27) chr6 147759582 -
Dmd-OT9 Intergenic region - AActCAaTTAAAAATTTGTATGG (서열번호28) chr14 26539529 -
Dmd-OT10 Spag9 Intron AAGCCAGagAAtAATTTGTAGGG (서열번호29) chr11 94052933 +
Dmd-OT11 Tle1 Intron AAaCCAGTTAAAtATTTcTAAGG (서열번호30) chr4 72159600 +
Dmd-OT12 RNf114b Intron AAGCCAtTTAAAAATTTGagTGG (서열번호31) chr13 47235657 -
Dmd-OT13 Tnfrsf21 Intron AAcCCAGTTAgAAATTTtTATGG (서열번호32) chr17 43052831 +
Dmd-OT14 Aak1 Intron AAGaCAGaTAAAAATTTGgAGGG (서열번호33) chr6 86907351 -
Dmd-OT15 Gpm6b 3' UTR AgGCCAGaTAAAAATTTGaAGGG (서열번호34) chrX 166385994 +
마우스 게놈 내의 Tyr 표적 부위에 대한 비표적 부위 (Tyr-On: Tyr의 표적(on-target) 부위; Tyr -OT: Tyr의 비표적(off-target) 부위)
No. Gene Sequence Chromosome Position Direction
Tyr-On Tyr Exon ACCTCAGTTCCCCTTCAAAGGGG (서열번호35) chr7 87493130 -
Tyr-OT1 Zmat4 Intron cCCTCAGTTCCaCTTCAgAGAGG (서열번호36) chr8 23975596 -
Tyr-OT2 Intergenic - ACCTCAcTTgCCCTTCtAAGTGG (서열번호37) chr8 102059942 +
Tyr-OT3 Il2 Intron ACCTCAGTcCCCCTTtAcAGAGG (서열번호38) chr3 37123254 +
Tyr-OT4 Intergenic - ACCTCAGTTCCCCTaCActGGGG (서열번호39) chr3 9150768 -
Tyr-OT5 Intergenic - ACCTCAGTTCCCCTaCActGGGG (서열번호40) chr3 81773804 -
Tyr-OT6 Intergenic - tCCTCAGTTCCCCTTCActGGGG (서열번호41) chr7 11778250 +
Tyr-OT7 Intergenic - cCCTCAGTTCCCCTaCAcAGAGG (서열번호42) chr4 47766122 -
Tyr-OT8 Intergenic - ACCTCAGTTtCCCTTCcAgGAGG (서열번호43) chr4 54553337 -
Tyr-OT9 2810429I04Rik Intron cCCTCAGTTCCCCTTCActGGGG (서열번호44) chr13 3491261 +
Tyr -OT10 Intergenic - cCCTCAGTTCCCCTaCAcAGGGG (서열번호45) chr13 74957186 +
Tyr -OT11 MGP_C57BL6NJ_G0001126 - cCCTCAGTTCCCCTaCAcAGGGG (서열번호46) chr2 79031825 +
Tyr -OT12 Rai14 Intron ACCTCAGTTtCCCcTCAAAaTGG (서열번호47) chr15 10596653 +
Tyr -OT13 Intergenic - ACCTCAGTTgtCCTTCAAAcAGG (서열번호48) chr6 107384348 -
Tyr -OT14 D6Ertd474e Intron cCCTCAGTTCCCCTaCAAtGGGG (서열번호49) chr6 143247456 -
Tyr -OT15 Intergenic - AaCTCtGTTCCCCTTCtAAGTGG (서열번호50) chr18 23151245 +
Tyr -OT16 Intergenic - AtCTCAGTTtCCCTTCAcAGGGG (서열번호51) chr11 71708976 -
Tyr -OT17 Foxk2 Intron ACCTtAGTTCCCtTTCAAAcTGG (서열번호52) chr11 121271649 +
(상기 표 5 및 6에서, off-target 부위 중의 on-target 서열과 불일치하는 뉴클레오타이드는 소문자로 표시함; 3' 말단의 NGG는 PAM 서열을 나타냄)
표 4, 표 5, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 본 시험에서 사용된 표적 부위(on target site)는 마우스 게놈 내에서 유의미한 off-target 변이를 유발하지 않음을 확인할 수 있으며, 이는 상기 표적 부위를 표적으로 하는 BE3 시스템이 생체 내에서 상당히 표적 특이적임을 보여준다.
<110> INSTITUTE FOR BASIC SCIENCE <120> Composition and method for base editing in animal embryos <130> DPP20176865KR <150> 10-2016-0178429 <151> 2016-12-23 <160> 63 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of crRNA <400> 1 guuuuagagc ua 12 <210> 2 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-terminal part of crRNA <400> 2 ugcuguuuug 10 <210> 3 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Essential part of tracrRNA <400> 3 uagcaaguua aaauaaggcu aguccguuau caacuugaaa aaguggcacc gagucggugc 60 <210> 4 <211> 1368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cas9 from Streptococcus pyogenes <400> 4 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp 130 135 140 Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His 145 150 155 160 Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro 165 170 175 Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr 180 185 190 Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala 195 200 205 Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn 210 215 220 Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe 245 250 255 Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp 260 265 270 Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp 275 280 285 Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp 290 295 300 Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser 305 310 315 320 Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys 325 330 335 Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 545 550 555 560 Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp 565 570 575 Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly 580 585 590 Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp 595 600 605 Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr 610 615 620 Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala 625 630 635 640 His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr 645 650 655 Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp 660 665 670 Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe 675 680 685 Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe 690 695 700 Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu 705 710 715 720 His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly 725 730 735 Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly 740 745 750 Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln 755 760 765 Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile 770 775 780 Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro 785 790 795 800 Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu 805 810 815 Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg 820 825 830 Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys 835 840 845 Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg 850 855 860 Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys 865 870 875 880 Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys 885 890 895 Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp 900 905 910 Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr 915 920 925 Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp 930 935 940 Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser 945 950 955 960 Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg 965 970 975 Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val 980 985 990 Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe 995 1000 1005 Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys 1010 1015 1020 Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser 1025 1030 1035 1040 Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu 1045 1050 1055 Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile 1060 1065 1070 Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser 1075 1080 1085 Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1090 1095 1100 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile 1105 1110 1115 1120 Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser 1125 1130 1135 Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly 1140 1145 1150 Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile 1155 1160 1165 Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala 1170 1175 1180 Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys 1185 1190 1195 1200 Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser 1205 1210 1215 Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr 1220 1225 1230 Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser 1235 1240 1245 Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His 1250 1255 1260 Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val 1265 1270 1275 1280 Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys 1285 1290 1295 His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn 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ataaggttcc gtctaaaaag ttcaaggttc tgggaaatac agaccgccac 120 agtatcaaaa aaaatcttat aggggctctt ttatttgaca gtggagagac agcggaagcg 180 actcgtctca aacggacagc tcgtagaagg tatacacgtc ggaagaatcg tatttgttat 240 ctacaggaga ttttttcaaa tgagatggcg aaagtagatg atagtttctt tcatcgactt 300 gaagagtctt ttttggtgga agaagacaag aagcatgaac gtcatcctat ttttggaaat 360 atagtagatg aagttgctta tcatgagaaa tatccaacta tctatcatct gcgaaaaaaa 420 ttggtagatt ctactgataa agcggatttg cgcttaatct atttggcctt agcgcatatg 480 attaagtttc gtggtcattt tttgattgag ggagatttaa atcctgataa tagtgatgtg 540 gacaaactat ttatccagtt ggtacaaacc tacaatcaat tatttgaaga aaaccctatt 600 aacgcaagtg gagtagatgc taaagcgatt ctttctgcac gattgagtaa atcaagacga 660 ttagaaaatc tcattgctca gctccccggt gagaagaaaa atggcttatt tgggaatctc 720 attgctttgt cattgggttt gacccctaat tttaaatcaa attttgattt ggcagaagat 780 gctaaattac agctttcaaa agatacttac gatgatgatt tagataattt attggcgcaa 840 attggagatc aatatgctga tttgtttttg gcagctaaga atttatcaga tgctatttta 900 ctttcagata tcctaagagt aaatactgaa ataactaagg ctcccctatc agcttcaatg 960 attaaacgct acgatgaaca tcatcaagac ttgactcttt taaaagcttt agttcgacaa 1020 caacttccag aaaagtataa agaaatcttt tttgatcaat caaaaaacgg atatgcaggt 1080 tatattgatg ggggagctag ccaagaagaa ttttataaat ttatcaaacc aattttagaa 1140 aaaatggatg gtactgagga attattggtg aaactaaatc gtgaagattt gctgcgcaag 1200 caacggacct ttgacaacgg ctctattccc catcaaattc acttgggtga gctgcatgct 1260 attttgagaa gacaagaaga cttttatcca tttttaaaag acaatcgtga gaagattgaa 1320 aaaatcttga cttttcgaat tccttattat gttggtccat tggcgcgtgg caatagtcgt 1380 tttgcatgga tgactcggaa gtctgaagaa acaattaccc catggaattt tgaagaagtt 1440 gtcgataaag gtgcttcagc tcaatcattt attgaacgca tgacaaactt tgataaaaat 1500 cttccaaatg aaaaagtact accaaaacat agtttgcttt atgagtattt tacggtttat 1560 aacgaattga caaaggtcaa atatgttact gaaggaatgc gaaaaccagc atttctttca 1620 ggtgaacaga agaaagccat tgttgattta ctcttcaaaa caaatcgaaa agtaaccgtt 1680 aagcaattaa aagaagatta tttcaaaaaa atagaatgtt ttgatagtgt tgaaatttca 1740 ggagttgaag atagatttaa tgcttcatta ggtacctacc atgatttgct aaaaattatt 1800 aaagataaag attttttgga taatgaagaa aatgaagata tcttagagga tattgtttta 1860 acattgacct tatttgaaga tagggagatg attgaggaaa gacttaaaac atatgctcac 1920 ctctttgatg ataaggtgat gaaacagctt aaacgtcgcc gttatactgg ttggggacgt 1980 ttgtctcgaa aattgattaa tggtattagg gataagcaat ctggcaaaac aatattagat 2040 tttttgaaat cagatggttt tgccaatcgc aattttatgc agctgatcca tgatgatagt 2100 ttgacattta aagaagacat tcaaaaagca caagtgtctg gacaaggcga tagtttacat 2160 gaacatattg caaatttagc tggtagccct gctattaaaa aaggtatttt acagactgta 2220 aaagttgttg atgaattggt caaagtaatg gggcggcata agccagaaaa tatcgttatt 2280 gaaatggcac gtgaaaatca gacaactcaa aagggccaga aaaattcgcg agagcgtatg 2340 aaacgaatcg aagaaggtat caaagaatta ggaagtcaga ttcttaaaga gcatcctgtt 2400 gaaaatactc aattgcaaaa tgaaaagctc tatctctatt atctccaaaa tggaagagac 2460 atgtatgtgg accaagaatt agatattaat cgtttaagtg attatgatgt cgatcacatt 2520 gttccacaaa gtttccttaa agacgattca atagacaata aggtcttaac gcgttctgat 2580 aaaaatcgtg gtaaatcgga taacgttcca agtgaagaag tagtcaaaaa gatgaaaaac 2640 tattggagac aacttctaaa cgccaagtta atcactcaac gtaagtttga taatttaacg 2700 aaagctgaac gtggaggttt gagtgaactt gataaagctg gttttatcaa acgccaattg 2760 gttgaaactc gccaaatcac taagcatgtg gcacaaattt tggatagtcg catgaatact 2820 aaatacgatg aaaatgataa acttattcga gaggttaaag tgattacctt aaaatctaaa 2880 ttagtttctg acttccgaaa agatttccaa ttctataaag tacgtgagat taacaattac 2940 catcatgccc atgatgcgta tctaaatgcc gtcgttggaa ctgctttgat taagaaatat 3000 ccaaaacttg aatcggagtt tgtctatggt gattataaag tttatgatgt tcgtaaaatg 3060 attgctaagt ctgagcaaga aataggcaaa gcaaccgcaa aatatttctt ttactctaat 3120 atcatgaact tcttcaaaac agaaattaca cttgcaaatg gagagattcg caaacgccct 3180 ctaatcgaaa ctaatgggga aactggagaa attgtctggg ataaagggcg agattttgcc 3240 acagtgcgca aagtattgtc catgccccaa gtcaatattg tcaagaaaac agaagtacag 3300 acaggcggat tctccaagga gtcaatttta ccaaaaagaa attcggacaa gcttattgct 3360 cgtaaaaaag actgggatcc aaaaaaatat ggtggttttg atagtccaac ggtagcttat 3420 tcagtcctag tggttgctaa ggtggaaaaa gggaaatcga agaagttaaa atccgttaaa 3480 gagttactag ggatcacaat tatggaaaga agttcctttg aaaaaaatcc gattgacttt 3540 ttagaagcta aaggatataa ggaagttaaa aaagacttaa tcattaaact acctaaatat 3600 agtctttttg agttagaaaa cggtcgtaaa cggatgctgg ctagtgccgg agaattacaa 3660 aaaggaaatg agctggctct gccaagcaaa tatgtgaatt ttttatattt agctagtcat 3720 tatgaaaagt tgaagggtag tccagaagat aacgaacaaa aacaattgtt tgtggagcag 3780 cataagcatt atttagatga gattattgag caaatcagtg aattttctaa gcgtgttatt 3840 ttagcagatg ccaatttaga taaagttctt agtgcatata acaaacatag agacaaacca 3900 atacgtgaac aagcagaaaa tattattcat ttatttacgt tgacgaatct tggagctcca 3960 gccgcattca agtattttga cacaacgata gatcgcaaac gatacacttc taccaaggag 4020 gtgctagacg cgacactgat tcaccaatcc atcacgggat tatatgaaac tcggatagat 4080 ttgtcacagc ttgggggtga c 4101 <210> 12 <211> 249 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> coding gene of UGI (uracil DNA glycosylase inhibitor) <400> 12 actaatctgt cagatattat tgaaaaggag accggtaagc aactggttat ccaggaatcc 60 atcctcatgc tcccagagga ggtggaagaa gtcattggga acaagccgga aagcgatata 120 ctcgtgcaca ccgcctacga cgagagcacc gacgagaatg tcatgcttct gactagcgac 180 gcccctgaat acaagccttg ggctctggtc atacaggata gcaacggtga gaacaagatt 240 aagatgctc 249 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NLS <400> 13 cccaagaaga agaggaaagt c 21 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 14 tctggtggtt ct 12 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd target region with PAM <400> 15 caattaaaag ccagttaaaa atttgtaagg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base-edited Dmd target region with PAM <400> 16 caattaaaag ctagttaaaa atttgtaagg 30 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr target region with PAM <400> 17 gcaccatctg gacctcagtt ccccttcaaa gggg 34 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> base-edited Tyr target region with PAM <400> 18 gcaccatctg gaccttagtt ccccttcaaa gggg 34 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-On target sequence <400> 19 aagccagtta aaaatttgta agg 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT1 <400> 20 aagccagtta gaagtttgta agg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT2 <400> 21 aagcaagtgt aaaatttgta tgg 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT3 <400> 22 aatacagtta ataatttgta agg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT4 <400> 23 aagcaagtaa aacatttgta tgg 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT5 <400> 24 ttgccagttt aaaatttgta agg 23 <210> 25 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT6 <400> 25 aagcaattga aaaatttgta tgg 23 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT7 <400> 26 aagccagaaa caaatttgta ggg 23 <210> 27 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT8 <400> 27 aagctagtgg aaaatttgta cgg 23 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT9 <400> 28 aactcaatta aaaatttgta tgg 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT10 <400> 29 aagccagaga ataatttgta ggg 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT11 <400> 30 aaaccagtta aatatttcta agg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT12 <400> 31 aagccattta aaaatttgag tgg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT13 <400> 32 aacccagtta gaaattttta tgg 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT14 <400> 33 aagacagata aaaatttgga ggg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-OT15 <400> 34 aggccagata aaaatttgaa ggg 23 <210> 35 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-On target sequence <400> 35 acctcagttc cccttcaaag ggg 23 <210> 36 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT1 <400> 36 ccctcagttc cacttcagag agg 23 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT2 <400> 37 acctcacttg cccttctaag tgg 23 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT3 <400> 38 acctcagtcc ccctttacag agg 23 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT4 <400> 39 acctcagttc ccctacactg ggg 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT5 <400> 40 acctcagttc ccctacactg ggg 23 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT6 <400> 41 tcctcagttc cccttcactg ggg 23 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT7 <400> 42 ccctcagttc ccctacacag agg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT8 <400> 43 acctcagttt cccttccagg agg 23 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT9 <400> 44 ccctcagttc cccttcactg ggg 23 <210> 45 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT10 <400> 45 ccctcagttc ccctacacag ggg 23 <210> 46 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT11 <400> 46 ccctcagttc ccctacacag ggg 23 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT12 <400> 47 acctcagttt cccctcaaaa tgg 23 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT13 <400> 48 acctcagttg tccttcaaac agg 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT14 <400> 49 ccctcagttc ccctacaatg ggg 23 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT15 <400> 50 aactctgttc cccttctaag tgg 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT16 <400> 51 atctcagttt cccttcacag ggg 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-OT17 <400> 52 accttagttc cctttcaaac tgg 23 <210> 53 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-F primer <400> 53 gaaattaata cgactcacta tagaagccag ttaaaaattt gtagttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 54 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-F primer <400> 54 gaaattaata cgactcacta tagacctcag ttccccttca aaggttttag agctagaaat 60 agcaag 66 <210> 55 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R primer <400> 55 aaaaaagcac cgactcggtg ccactttttc aagttgataa cggactagcc ttattttaac 60 ttgctatttc tagctctaaa ac 82 <210> 56 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-1st PCR-F primer <400> 56 gctagagtat caaaccaaca tcattac 27 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-1st PCR-R primer <400> 57 tgcttcctat ctcacccatc t 21 <210> 58 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-2nd/adaptor PCR-F primer <400> 58 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctgctacaa caattggaac agatgac 57 <210> 59 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dmd-2nd/adaptor PCR-R primer <400> 59 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atcttcttca ctgtacagag ctcaatg 57 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-1st PCR-F primer <400> 60 tgtattgcct tctgtggagt t 21 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-1st PCR-R primer <400> 61 ggtgttgacc cattgttcat tt 22 <210> 62 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-2nd/adaptor PCR-F primer <400> 62 acactctttc cctacacgac gctcttccga tctggagttt ccagatctct gatgg 55 <210> 63 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tyr-2nd/adaptor PCR-R primer <400> 63 gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcactg gcaggtccta ttat 54

Claims (20)

  1. 시티딘 디아미나제, 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질을 포함하는 포유 동물 배아 세포의 염기 교정용 조성물을 인간을 제외한 포유 동물의 배아 세포에 재조합 벡터를 사용하지 않고 전기천공에 의하여 직접 주입하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 염기 교정은 표적 부위에 종료코돈을 생성시키는 것인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 Cas9 니카아제, 촉매활성 결핍 Cas9 단백질, 또는 야생형과 상이한 PAM 서열을 인식하는 Cas9 단백질인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피요젠스 (Streptococcus pyogenes) 유래의 Cas9 단백질의
    (1) D10, H840, 또는 D10 및 H840이 야생형과 다른 아미노산으로 치환되거나;
    (2) D1135, R1335, 및 T1337로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 야생형과 다른 아미노산으로 치환되거나; 또는
    (3) D10 및 H840로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상 및 D1135, R1335, 및 T1337로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이 야생형과 다른 아미노산으로 치환된 것인,
    인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA (crRNA) 및 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함하는 이중 RNA, 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA)인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 시티딘 디아미나제는 APOBEC　(apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like), AID (activation-induced cytidine deaminase), tadA (tRNA-specific adenosine deaminase) 또는 이들이 조합인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 항에 있어서, 상기 포유 동물 배아 세포의 염기 교정용 조성물은 시티딘 디아미나제 코딩 mRNA, 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제 코딩 mRNA, 및 가이드 RNA의 혼합물을 포함하는 것인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 항에 있어서, 상기 포유 동물 배아 세포의 염기 교정용 조성물은 시티딘 디아미나제, 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA가 복합체를 형성하는 리보핵산단백질을 포함하는 것인, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자, 핵위치화서열 (NLS) 또는 이의 코딩 유전자, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 포유 동물 배아 세포의 염기 교정 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 시티딘 디아미나제, 표적 특이적 RNA-가이드 뉴클레아제, 및 가이드 RNA를 포함하는 리보핵산단백질을 포함하는 포유 동물 배아 세포의 염기 교정용 조성물이 인간을 제외한 포유 동물의 배아 세포에 재조합 벡터를 사용하지 않고 전기천공에 의하여 직접 주입된, 인간을 제외한 포유 동물의 분리된 유전자 변형 배아 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 염기 교정용 조성물은 우라실 DNA 글리코실라제 억제제 (uracil DNA glycosylase inhibitor: UGI) 또는 이의 코딩 유전자, 핵위치화서열 (NLS) 또는 이의 코딩 유전자, 또는 이들 모두를 추가로 포함하는 것인, 인간을 제외한 포유 동물의 분리된 유전자 변형 배아 세포.
  18. 제16항에 있어서, 상기 염기 교정은 표적 부위에 종료코돈을 생성시키는 것인, 인간을 제외한 포유 동물의 분리된 유전자 변형 배아 세포.
  19. 제16항의 인간을 제외한 포유 동물의 분리된 유전자 변형 배아 세포를 인간을 제외한 포유 동물 위탁모 난관에 이식하여 발생시킨, 인간을 제외한 유전자 변형 포유 동물.
  20. 제16항의 인간을 제외한 포유 동물의 분리된 유전자 변형 배아 세포를 인간을 제외한 포유 동물 위탁모 난관에 이식하는 단계를 포함하는, 인간을 제외한 유전자 변형 포유 동물의 제조 방법.
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