CN109414001A - 通过cas9蛋白的多循环电穿孔产生的遗传修饰的非人哺乳动物 - Google Patents
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Abstract
本文描述的发明通过将包含Cas9蛋白的CRISPR/Cas9系统经由多个循环(例如,4‑10个循环)的电穿孔引入配子或植入前期胚胎(例如,单细胞胚胎或合子)中,导致对动物基因组的可基因遗传的修饰,而提供了用于产生转基因动物(例如,非人哺乳动物)的高通量方法和试剂。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2016年1月15日提交的美国临时申请号62/279,023的申请日的权益。本申请还涉及于2015年9月29日提交的国际申请号PCT/US2015/052928,其根据35U.S.C.§119(e)要求于2014年9月29日提交的美国临时申请号62/056,687的申请日的权益。每个上述引用的申请的全部内容通过引用并入本文。
政府支持
本文描述的发明是在NIH的国立癌症研究所颁发的批准号P30CA034196下借助美国政府的支持完成的。美国政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
将生物或遗传材料递送到哺乳动物合子中通常是修饰哺乳动物基因组的第一步,例如遗传修饰动物模型的创建。这在传统上和目前通过使用玻璃针将期望的生物/遗传材料显微注射到合子中而实现。
DNA直接显微注射早在80年代末就已经用于将单纯疱疹病毒(HSV)TK基因引入培养的哺乳动物细胞(Capecchi,Cell,22:479-488,1980年11月)。然而,甚至在小的pBR 322/TK DNA与SV40 DNA共注射时,转化效率也是极低的,即每1,000个注射的细胞15个转化体。此外,该实验不导致产生成熟生物体,更不用说可以表现出表型改变。
Gordon等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,77:7380-7384,1980年12月)首先报道了他们已经成功将TK基因(其被引入到嵌合SV40病毒载体中)显微注射到小鼠胚胎中,并已经在从显微注射的胚胎发育的小鼠中观察到这样的TK基因。然而,这些小鼠不表达TK基因产物。换言之,在这些实验中,没有实现测试动物的表型改变。Gordon等报道的结果似乎与Jaenisch等人早期的研究(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,71:1250-1254,1974)一致,其中SV40病毒先前已经被证明在引入小鼠胚胎时在功能和遗传上无活性。
随后,在1981年6月,Wagner和Hoppe提交了针对通过显微注射将外源遗传材料引入胚胎的美国实用新型申请,该申请最终导致美国专利号4,873,191的授权,其是在显微注射领域中广泛许可的基础专利,描述并广泛要求保护获得具有含有并能够表达外源遗传材料的细胞的哺乳动物的显微注射方法。
尽管自80年代初以来已有许多改进,显微注射仍然在技术上苛刻、劳动密集并且耗时。成功的显微注射在很大程度上取决于操作员的技术熟练程度、培训和经验等主观因素。由于它需要在昂贵的显微注射设备和具有多年培训和经验的操作者方面进行大量的前期投资,即使在世界上最优秀和资金最充分的学术机构中,生产遗传修饰小鼠模型的能力也经常受到限制。
此外,显微注射在通量方面固有地低,需要一次操纵一个合子,从而限制基因组工程化实验的大小和规模。
电穿孔或电渗透是通过使用外部施加的电场显著地增加细胞质膜渗透性和导电性的方法。电穿孔已经在分子生物学中用作将某些物质引入细胞的方式,例如用分子探针、可改变细胞功能的药物、或DNA分子加载它。
在分子生物学中,电穿孔方法通常用于细菌、酵母和植物原生质体的转化。除了脂质膜外,细菌还具有与脂质膜不同并且由肽聚糖及其衍生物构成的细胞壁。然而,细胞壁是天然多孔的,并且只用作保护细菌免受严重环境影响的硬壳。如果细菌和质粒混合在一起,则质粒可以在电穿孔后转移到细胞中。在这个方法中通常在若干毫米的距离上使用数百伏。
该程序也可以用于组织培养细胞,例如培养的哺乳动物细胞。与细菌中的转化相反,将外源DNA引入真核细胞的过程通常称为转染。电穿孔已经用于使用电击杯(electroporation cuvette)转染悬浮体中的细胞。
尽管有着克服上述显微注射的许多障碍,包括低效率/低通量和技术困难的巨大和明显需要,电穿孔尚未被本领域技术人员看做可行的替代方法,并且尚未有报道使用电穿孔将遗传材料引入哺乳动物胚胎,其随后发育成遗传修饰动物。
具体而言,电穿孔以前主要用于小鼠中的组织培养细胞和植入后胚胎(参见Mellitzer等.,Mech.Dev.,118:57-63(2002);Akamatsu等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,96:9885-9890(1999);Potter等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81:7161-7165(1984);Osumi和Inoue,Methods,24:35-42(2001);Fukuchi-Shimogori和Grove,Science 294:1071-1074(2001)以及Tabata和Nakajima,Neuroscience,103:865-872(2001))。
在一项研究中,Nemec等(Theriogenology 31:233,1989)描述了通过电穿孔将新霉素抗性基因(pSVNEO)引入小鼠1-细胞胚胎(即,合子)中的尝试。然而,首先将包含新霉素基因的DNA注射到合子的质膜和透明带之间的卵周隙中,以据作者所言在合子经受电穿孔之前,在暴露于电流时减少外源DNA和原核之间的距离。作者报道在一个实验中,DNA印迹分析显示从转移到假孕ICR受体的226个胚胎产生的55只幼仔中没有引入新霉素基因。在使用旨在在电穿孔的脉冲期间增加传递的总能量的高盐介质的后续实验中,作者再次报道初步数据表明种系传递未成功。
最近,电穿孔已经成功用于将dsRNA、siRNA、编码它们的DNA载体和吗啉基化合物递送到小鼠植入前胚胎中(Grabarek等.,Genesis,32:269-276(2002);Wang等.,Dev.Biol.,318:112-125(2008);和Peng等.,PLoS ONE,7(8):e43748.doi:10.1371/journal.pone.0043748(2012))。然而,这些试剂在细胞溶质中起作用,而不是在细胞核中,如实现可以通过种系传递的遗传修饰所需要的。更具体地,这些试剂通过降解靶基因的mRNA或通过阻断mRNA的翻译或通过两者,抑制其各自的靶基因的表达而起作用。
因此,尽管有着克服用于通过种系传递将外源生物或遗传材料引入早期胚胎以产生遗传修饰动物的显微注射的许多缺点(例如低效率)的长期需要,该流行技术似乎教导远离看似更简单的技术,如电穿孔。
发明内容
本文描述的发明提供了用于有效地将生物分子引入合子和早期(即植入前)胚胎的方法和试剂。这样的技术在分子生物学中具有广泛的应用。例如,当使用本发明的方法引入某些定点核酸酶(例如II型CRISPR-Cas9系统)时,可以将精确的核苷酸变化、大片段缺失和靶向短片段插入高效地引入靶向基因座中。
本发明的一个方面提供了产生遗传修饰的哺乳动物(例如,非人哺乳动物)的方法,所述方法包括通过电穿孔将材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)引入哺乳动物的配子(例如,卵(egg)或卵子(ovum))或植入前期胚胎(例如,合子)中以修饰所述哺乳动物的基因组,其中所述材料包括II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN),其各自对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性。在某些优选的实施方式中,所述材料包括II型Cas9蛋白。
在相关方面中,本发明提供了产生遗传修饰的哺乳动物(例如,非人哺乳动物)的方法,所述方法包括通过电穿孔将材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)引入哺乳动物的配子(例如,卵或卵子)或植入前期胚胎(例如合子)以修饰所述哺乳动物的基因组,其中:(1)所述材料包括II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN),其各自对所述哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性;和(2)所述电穿孔包括多于一个循环(例如,4、5、6、7、8、9、10个循环,或4-10个循环,优选4-8个循环,或6个循环)。尽管本发明的方法可用于配子(特别是雌性配子,例如未受精的卵或卵子),但在优选的实施方式中,该方法应用于作为合子的植入前期胚胎。
在又一个相关方面中,本发明提供了产生遗传修饰的哺乳动物(例如,非人哺乳动物)的方法,所述方法包括通过电穿孔将材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)引入哺乳动物的配子(例如,卵或卵子)或植入前期胚胎(例如合子)以修饰所述哺乳动物的基因组,其中所述电穿孔包括多于一个循环(例如,4、5、6、7、8、9、10个循环,或4-10个循环)。
在某些实施方式中,电穿孔包括4-8个循环,或6个循环。
在某些实施方式中,电穿孔的一些或全部循环独立地在20-40伏(例如,25-35伏、或30伏、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35伏)下进行。
在某些实施方式中,电穿孔的一些或全部循环独立地使用1-2ms(例如,1.0或1.5ms)的脉冲持续时间进行。
在某些实施方式中,电穿孔的一些或全部循环独立地使用1-3个脉冲(例如,2个脉冲)进行。
在某些实施方式中,电穿孔的一些或全部循环独立地使用100-1000ms(例如,100ms或125-130ms)的脉冲间隔进行。
在某些实施方式中,电穿孔由6个循环组成,并且所述电穿孔的一些或全部循环使用以下设置进行:30伏,1.0ms的脉冲持续时间,2个脉冲和100ms的脉冲间隔。
在某些实施方式中,将材料引入到配子中。例如,配子可以是雌性配子如卵子或卵。在某些实施方式中,所述方法还包括将电穿孔的(雌性)配子与相反性别的配子(例如,雄性配子)融合,并允许发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。
在某些实施方式中,植入前期胚胎是1-细胞胚胎(即,合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。
在某些实施方式中,所述方法还包括允许(电穿孔的)植入前期胚胎(例如,合子)发育成活胎产的遗传修饰哺乳动物。
在某些实施方式中,材料包含多核苷酸、多肽(例如蛋白)或多核苷酸和多肽两者。例如,待电穿孔的材料可包含II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN),其各自对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性。待电穿孔的材料可包含II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列(例如mRNA)。待电穿孔的材料可包含CRISPR-Cas系统指导RNA(例如sgRNA),其与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。材料还可包含供体多核苷酸。材料可包含以上任意多核苷酸和多肽的组合。然而,在一个优选的实施方式中,材料包含II型Cas9蛋白和至少一种(例如,1、2、3种或更多种)sgRNA,其各自对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性。
在某些实施方式中,材料包含含有II型Cas9蛋白的多肽。例如,可以以250ng/μL的终浓度,或者150ng/μL、200ng/μL、300ng/μL或350ng/μL的终浓度将Cas9蛋白添加至电穿孔混合物中。在某些实施方式中,可以以300ng/μL的终浓度,或者200ng/μL、250ng/μL、350ng/μL或400ng/μL的终浓度将sgRNA添加至电穿孔混合物中。在某些实施方式中,可以以250ng/μL的终浓度将Cas9蛋白添加至电穿孔混合物中,并且可以以300ng/μL的终浓度将sgRNA添加至电穿孔混合物中。
在某些实施方式中,材料还包含供体多核苷酸。例如,供体多核苷酸可以是线性或环状双链或单链DNA分子。
在某些优选的实施方式中,将Cas9蛋白与供体多核苷酸一起电穿孔入配子(例如卵或卵子)或植入前期胚胎(例如合子)中。在某些实施方式中,供体多核苷酸是线性或环状双链DNA分子。
在某些实施方式中,基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如,供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位、或其组合而修饰。
在某些实施方式中,通过非同源末端连接(NHEJ)、同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)来修饰基因组。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔实现至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高(例如,100%)的敲入(KI)效率。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环(优选4-10个循环,例如6个循环)的电穿孔,实现该KI效率。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔实现至少80%、85%、90%、95%、97%或100%的NHEJ效率。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环(优选4-10个循环,例如6个循环)的电穿孔,实现该KI效率。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔以至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或更高的比率在IVF(体外受精)产生的胚胎中实现大靶位点基因组缺失(例如,至少1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb或更多的基因组区域的缺失)。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环的电穿孔,实现该比率。在某些实施方式中,胚胎是来自近交小鼠品系的胚胎,例如C57BL/6NJ。
本发明部分地是基于以下令人惊奇的发现:当通过电穿孔递送Cas9蛋白而不是Cas9编码序列(例如mRNA)时,来自囊胚样品分析的结果表明,NHEJ和KI效率两者相比于电穿孔Cas9编码序列均非常高。
在某些实施方式中,多核苷酸包含II型Cas9蛋白的编码序列。
在某些实施方式中,多核苷酸包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)(CRISPR-Cas)系统指导RNA,其与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。
在某些实施方式中,II型Cas9蛋白的编码序列和CRISPR-Cas系统指导RNA的浓度比为至少1:1、至少1.5:1、至少2:1、至少2.5:1、至少3:1或更高。
在某些实施方式中,II型Cas9蛋白的编码序列的浓度为至少40ng/μL、至少50ng/μL、至少100ng/μL、至少150ng/μL、至少200ng/μL、至少300ng/μL、至少400ng/μL、至少500ng/μL、至少600ng/μL、至少800ng/μL、或至少1000ng/μL或更高。
在某些实施方式中,多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列。
在某些实施方式中,多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(ZFN)的编码序列。
在某些实施方式中,多核苷酸包含对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性的BuD衍生核酸酶(BuDN)的编码序列。
在某些实施方式中,多核苷酸包含随机整合到哺乳动物的基因组中的DNA。
在某些实施方式中,多核苷酸包含DNA载体。在某些实施方式中,多核苷酸包含RNA。
在某些实施方式中,多核苷酸包含将DNA片段随机或特定整合到哺乳动物的基因组中的转座酶的编码序列。在某些实施方式中,多核苷酸包含转座酶。
在某些实施方式中,哺乳动物是非人灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物及其远系繁殖或随机繁殖群体。在某些实施方式中,哺乳动物是小鼠或大鼠。
在某些实施方式中,将配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎(例如合子)在电穿孔后移植到能够承载胚胎到分娩期的假孕宿主哺乳动物中。
在某些实施方式中,将配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎(例如合子)在移植到假孕宿主哺乳动物之前从在其中进行电穿孔的培养基移出。
在某些实施方式中,同时电穿孔多于一个,例如2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多个配子或植入前期胚胎。
在某些实施方式中,电穿孔的植入前期胚胎中的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多发育成囊胚期胚胎,或发育成活胎产的转基因哺乳动物。
在某些实施方式中,所有的配子和植入前期胚胎都在同一电击杯(例如1-mm电击杯)中电穿孔。
在某些实施方式中,在电穿孔之前对配子或植入前期胚胎进行预处理以弱化透明带。
在某些实施方式中,在酸性台氏溶液(AT)中预处理配子或植入前期胚胎,例如5-15秒或10秒
在某些实施方式中,电穿孔使用ECM830方波电穿孔系统(BTX830型电穿孔器)进行。
在某些实施方式中,在电穿孔后,将配子或植入前期胚胎(例如合子)冷冻储存。将冷冻的配子或植入前期胚胎解冻并在之后时间使用。
在某些实施方式中,所述方法还包括将电穿孔的合子转移至假孕宿主哺乳动物并使电穿孔的合子发育成活胎产的遗传修饰的哺乳动物。
本发明的另一方面提供了通过本发明的方法中的任一种产生的遗传修饰的非人哺乳动物。
应理解上文和下文中描述的任何实施方式均设想能够与本发明的任何其他实施方式组合,包括仅在实施例中描述的那些具体实施方式(通过引用并入本文)。
附图说明
图1A和1B显示了使用本发明方法在小鼠胚胎中的CRISPR介导的基因破坏。具体地,图1A显示了在Tet1基因座处被靶向的胚胎的基因分型。RFLP分析显示在上方小图中,且测序结果显示在下方小图中。用于RFLP分析的靶区域处的限制性位点加粗并加上下划线。原型间隔子邻近基序(PAM)序列以红色着色。显示了来自两个胚胎的突变等位基因,并且突变的碱基以蓝色着色。图1B显示了在Tet2基因座处被靶向的胚胎的基因分型。
图2A-2D显示了使用本发明方法在活小鼠中的CRISPR介导的基因破坏。具体地,在图2A中:分别以400ng/μL和200ng/μL使用的靶向Tet2基因座的Cas9 mRNA和sgRNA(单指导RNA)通过电穿孔递送至小鼠胚胎。然后将电穿孔的胚胎转移到假孕雌性小鼠中。从新生小鼠采集尾部活检样品,并使用采用EcoRV酶的RFLP方法进行基因分型。来自小鼠85C3的PCR产物对EcoRV消化具有抗性,并且来自小鼠85C10的PCR产物对EcoRV消化具有部分抗性。在图2B中:分别以600ng/μL和300ng/μL使用靶向Tet2基因座的Cas9 mRNA和sgRNA。来自小鼠86C3和86C9的PCR产物对EcoRV消化具有抗性,并且来自小鼠86C5、86C7和86C8的那些对EcoRV消化具有部分抗性。在图2C中:来自小鼠85C3、85C10、86C3、86C5、86C7、86C8和86C9的PCR产物通过Sanger测序进行处理,并且显示与来自野生型样品的谱图相比的谱图。图2D:将来自小鼠85C3、86C3和86C9的PCR产物克隆到pCR2.1-Topo载体中,并对个体克隆体进行测序。在来自所有3只首建者(founder)小鼠的等位基因中容易地检测到INDEL突变。
图3A显示了来自实验15的11只首建者小鼠的基因分型结果。上方小图显示无RFLP分析的PCR产物。中间小图显示使用EcoRV的RFLP分析。下方小图显示使用EcoRI的RFLP分析。
图3B显示了所选首建者小鼠和对照小鼠的Sanger测序结果。已经对相对于对照小鼠中的野生型序列改变的序列(通过CRISPR/Cas介导的HDR)加上了下划线。
图4A-4D显示通过多个循环的电穿孔将GFP mRNA有效地递送到小鼠胚胎中。在图4A中,在通过一系列电穿孔将GFP mRNA递送到小鼠胚胎中后评估GFP信号的强度。分别将1、4、6和8个循环的电穿孔用于组a、b、c和d。图4B显示了用于这四组的电穿孔器的设置。在图4C中,通过在两个细胞阶段或囊胚阶段中计数胚胎,在一系列电穿孔后评估胚胎存活率。在图4D中,在电穿孔后的两细胞阶段定量GFP信号。
图5A-5C显示通过电穿孔递送Cas9蛋白明显增加了HDR效率。图5A显示Aicda靶序列和供体寡核苷酸的示意图。原型间隔子序列加下划线且PAM序列用绿色着色。DNA寡核苷酸供体中改变的寡核苷酸是大写的。在DNA寡核苷酸供体中,BamH1识别位点用红色着色,EcoRV识别位点用蓝色着色。图5B显示电穿孔后来自组A、B、C和D的28只小鼠的RFLP分析。分别在A、B、C和D组中使用1、4、6和8个循环的电穿孔。EcoRV消化或BamH1消化后的切割条带用黑色箭头表示。图5C显示了含有Aicda靶区域的PCR产物的测序迹线。清晰的测序迹线表明,如B3、C3和D3中所示,在靶基因座中主要存在一个等位基因(确定的突变),而在A3小鼠中存在WT和突变等位基因二者。WT,野生型。
图6A-6C显示Cas9 mRNA的递送在活小鼠中较不有效地产生Aicda基因组KI。图6A显示电穿孔后来自组A、B和C的小鼠组织样品的RFLP分析。在A、B和C组中分别使用1、4和6次电穿孔。EcoRV消化后的切割条带用黑色箭头表示。图6B显示含有Aicda靶区域的PCR产物的测序迹线。重叠的测序迹线表明这些小鼠中存在多个等位基因,如C2中所示。在图6C中,将C2的PCR产物克隆并对个体克隆体进行测序。显示来自克隆体C2-8的测序迹线。
图7A-7C显示通过电穿孔递送Cas9蛋白明显增加了囊胚中的HDR效率。图7A显示在电穿孔后递送Cas9 mRNA或Cas9蛋白后囊胚期胚胎的RFLP分析。进行1、4、6和8次电穿孔以用于递送。EcoRV或BamH1消化后的切割条带用黑色箭头表示。图7B显示了含有Aicda靶区域的PCR产物的测序迹线。重叠的测序迹线表明这些样品中存在多个等位基因,如E55和E67中所示。在图7C中,将PCR产物克隆并对个体克隆体进行测序。显示了来自克隆体E55-1和E67-1的序列迹线。WT:野生型。T:尾部样品。B:囊胚。
图8A-8C显示通过电穿孔递送Cas9蛋白在近交品系中实现了高效的基因组缺失。图8A是自Smc1b基因座缺失DNA片段的策略的示意图。自基因组中缺失包括外显子2、外显子3和外显子4的DNA区段。图8B显示通过DNA电泳分析PCR产物的大小。在A、B和C组中分别使用1、4和6次电穿孔。B4、C1、C5和C6中约518bp长的小条带表示成功缺失。图8C,上图是Smc1b靶序列。两个gRNA的两个原型间隔子序列用蓝色标记,PAM序列用红色标记。下图是含有Smc1b靶区域的PCR产物的测序迹线。WT测序迹线下的蓝线和红线分别表示上游gRNA序列和PAM序列。B4、C1、C5和C6的测序迹线下的两条蓝线表示剩余的上游和下游gRNA。清晰的测序迹线表明靶基因座中主要存在一个等位基因,如B4、C1和C5中所示。WT:野生型。
图9A和9B显示通过电穿孔递送Cas9蛋白实现了杂交品系中高效率的大DNA片段缺失。图9A显示通过DNA电泳分析PCR产物的大小。在A、B和C组中分别使用1、4和6次电穿孔。A3、A4、A5、B3、C3和C4中约518bp长的小条带表示成功缺失。图9B,上图,Smc1b靶序列。两个gRNA的两个原型间隔子序列用蓝色标记,PAM序列用红色标记。下图,含有Smc1b靶区域的PCR产物的测序迹线。重叠的测序迹线表明这些小鼠中存在多个等位基因,如A5中所示。清晰的测序迹线表明靶基因座中主要存在一个等位基因,如A3、A4、C3和C4中所示。WT:野生型。
图10A-10C显示通过电穿孔递送Cas9蛋白实现了高效率的靶向小DNA片段插入。图10A是Rosa26靶序列和供体寡核苷酸的示意图。原型间隔子序列用蓝色着色,PAM序列用红色着色。DNA寡核苷酸中的LoxP位点标有下划线。图10B是显示使用TIDE的PCR产物大小分析的结果的代表性图像。34bp插入处的红色条表示可能插入了LoxP位点。显示了采用一次电穿孔的幼仔之一的结果(A3)。在图10C中,将PCR产物克隆并对个体克隆体进行测序。显示了来自克隆体A3-1的测序迹线。成功插入的LoxP位点标有下划线。
具体实施方式
1.概述
为了克服在产生遗传修饰动物(例如转基因或其他遗传修饰哺乳动物)的背景下与显微注射有关的固有局限性,申请人已经开发了基于电穿孔的方法,以在使该方法可以高效率、高通量产生高存活率的遗传修饰动物的特定条件下,将生物/遗传材料递送到动物(例如哺乳动物)配子或植入前胚胎(包括合子)中。所得遗传修饰可以容易地通过种系传递。
具体地,在示例性实施方式中,本发明的方法用于将CRISPR/Cas系统递送至小鼠胚胎(例如合子),从而在所得遗传修饰/转基因小鼠的基因组中实现靶向遗传修饰。本发明的方法,包括本文优化的实施方式或方案,可以使用市售的电穿孔机进行,同时需要很少的训练或以往经验,并且因此能够在单一步骤中并行处理大量的胚胎和多个基因靶向项目。使用本文所述的本发明的方法,可以将多种生物、遗传或其他材料(包括但不限于CRISPR/Cas、TALEN和ZFN或其组合等)中的任一种递送至配子和早期胚胎(例如哺乳动物植入前胚胎,包括合子)。因此本文描述的技术使得具有前所未有的容易度和规模的动物基因组工程成为可能。
本文所述的发明部分基于以下发现:电穿孔可用于将相对高浓度(例如先前认为是毒性水平)的生物/遗传材料递送入配子和植入前胚胎(包括合子)中,该高浓度可以是在电穿孔的配子和早期胚胎的核中实现期望的最终结果(例如配子或胚胎的基因组的遗传修饰,该修饰可以通过种系传递而传递)所需要的。
具体地,基于先前的显微注射实验,其中相对低浓度的Cas9 mRNA(50或100ng/μL)和sgRNA(25或50ng/μL)成功地用于原核或细胞质显微注射实验,申请人尝试使用报告的基因编码质粒对合子进行电穿孔(参见实施例1)。令人惊讶的是,在自电穿孔的合子发育的3.5天胚胎中没有观察到荧光。使用其他浓度的DNA的类似实验(其预处理透明带以使之弱化;或使用其他报道体或荧光素标记寡核苷酸)也遭到失败。参见实施例1中提到的实验2-6。
广泛认为用于电穿孔实验的试剂,包括Cas9 mRNA和指导RNA,在以较高浓度使用时可能对胚胎有毒。
申请人已经在本文中证明早期胚胎(如合子)可以使用相对高浓度的生物材料(例如包含CRISPR/Cas mRNA和指导RNA的多核苷酸)进行电穿孔,以实现自电穿孔的胚胎发育的胚胎或动物中的期望的遗传修饰。参见实施例2。
本文所述的发明还部分基于以下发现:电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)通常表现出延迟或停止发育,或以其他方式未存活成活胎产的动物,除非电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)被释放到生理溶液或培养基。例如,溶液或培养基尤其是等渗的。此外,通过将电穿孔的配子和植入前胚胎(包括合子)释放到生理溶液或培养基中,除去了通常的电穿孔培养基(例如,用于溶解多核苷酸如TE的缓冲液),从而进一步减少其中的任何有害物质可以延缓后续胚胎发育的可能性。
例如,在用于电穿孔的缓冲液或培养基不是生理溶液或培养基时,例如含有用于溶解待电穿孔的材料的过量(例如多于40%或50%)缓冲液,在电穿孔后很快就除去这样的缓冲液可能是有帮助的。
在某些实施方式中,在常用于溶解核酸试剂的TE或其他类似缓冲液在电穿孔介质中以显著量(例如>40%或50%)存在时,可以使用若干方法以减轻任何潜在的有害影响。例如,在一个实施方式中,通过在电穿孔后立即在生理溶液中洗涤电穿孔的配子或胚胎可以使配子或胚胎在TE缓冲液中洗浴的时间最小化。在其他实施方式中,溶解在TE缓冲液中的核酸试剂(例如CRISPR/Cas试剂)可以与生理溶液以适当比例混合,使得整体渗量(osmolarity)更接近生理。在又一个实施方式中,核酸试剂(例如CRISPR/Cas试剂)可以在生理溶液中直接重建,以避免或最小化任何复杂化。即,配子和植入前胚胎(包括合子)可以在生理溶液或培养基(例如等渗的溶液或培养基)中进行电穿孔。生理溶液或培养基可以是盐组成和渗透压类似于血浆的人工制备溶液。
虽然电穿孔确实可以在本文所述的条件下将生物材料引入合子,但产生活胎产的动物需要合子在后续发育中生存。培养电穿孔的合子的初步失败似乎表明不管期望的遗传修饰是否在电穿孔的合子中发生,合子可能无法幸存于电穿孔过程和继续发育成活胎产的动物。认识到AT处理可能过度损伤合子以减缓胚胎发育,并且所递送的试剂如Cas9 mRNA和指导RNA可能对合子及其后续发育有毒,这进一步教导远离使用电穿孔作为在动物中永久引入种系可传递的遗传修饰的可行手段。
申请人已经在本文中证明,使用本发明的方法可以将电穿孔的合子的存活率,例如,如通过成功发育成囊胚期胚胎所测量的,明显地提高到令人惊讶的高水平(例如接近或甚至达到100%)。
本文描述的发明还部分地基于以下发现:直接在电穿孔混合物中使用位点特异性工程化核酸酶,例如II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(而不是使用编码序列,例如其mRNA),可以明显增加所得基因编辑的成功率。
本文描述的发明还部分地基于以下发现:进行多轮/循环的电穿孔可以显著增加整体效率。
因此,本发明的一个方面提供了产生遗传修饰的哺乳动物(例如,非人哺乳动物)的方法,所述方法包括通过电穿孔将材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)引入动物(例如,非人哺乳动物)的配子(例如,卵或卵子)或植入前期胚胎(例如合子)以修饰动物(例如,非人哺乳动物)的基因组,其中:(1)所述材料包括II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)或BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN),其对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性;和/或(2)所述电穿孔包括多于一个循环(例如,4、5、6、7、8、9、10个循环,优选4-10个循环)。在优选的实施方式中,所述材料包含含有II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统,和/或所述电穿孔包括多于一个循环(例如,4-10个循环,或4个循环,或6个循环)。
在相关的方面中,本发明还提供了产生遗传修饰的动物(例如,非人哺乳动物)的方法,所述方法包括通过多于一个循环的电穿孔(例如,4-10个循环,4-8个循环,或6个循环)将材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)引入动物(例如,非人哺乳动物)的去核卵母细胞中以修饰动物(例如,非人哺乳动物)的基因组,其中体细胞同时通过电穿孔休克与去核卵母细胞融合。融合体细胞与去核卵母细胞是用于猪克隆的方法。
在某些实施方式中,本发明中电穿孔的一些或全部循环可以独立地在相同或不同的条件下进行。在某些实施方式中,可以使用略微不同的电穿孔条件。例如,可以使用以下设置来执行一些或全部循环:(1)20-40伏(例如,25-35伏,或30伏,或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35伏),(2)脉冲持续时间为1-2ms(例如,1.0或1.5ms),(3)1-3个脉冲(例如,2个脉冲),和/或(4)脉冲间隔为100-1000ms(例如,100ms,或125-130ms)。在某些实施方式中,电穿孔在1-mm电击杯中进行。在某些实施方式中,也可以在适当调节的类似参数下使用2-mm电击杯。
在某些实施方式中,电穿孔在4、5、6、7、8、9或10个循环(例如,4-10个循环,或6-8个循环,或6个循环)中进行,并且每个循环是在30V、2个脉冲、每个脉冲持续时间为1或1.5ms、脉冲间隔为100ms的条件下进行。
在某些实施方式中,将材料引入到配子中。例如,配子可以是精子(例如成熟精子)、极体、或者卵子或卵。如果使用成熟精子,可以首先诱导精子以经历解凝。用于精子解凝的技术是本领域已知的。参见例如Mahi等.,J.Reprod.Fert.,44:293-296(1975);Hendricks等.,Exptl.Cell Res.,40:402-412(1965)和Wagner等.,Archives ofAndrology,1:31-41(1978)(均通过引用并入)。通过使用二硫化物还原剂进行解凝是优选的。如果使用卵,卵可以处于通过例如孤雌生殖产生的受精或活化状态。也可以使用电穿孔的极体使单倍体卵二倍体化。
当使用配子时,本发明的方法还包括将电穿孔的配子与另一个配子例如相反性别的配子融合(例如将电穿孔的卵与精子融合),并允许融合的配子发育成活胎产的遗传修饰动物(例如非人哺乳动物)。例如,如果精子被电穿孔,则将在其中实现遗传修饰的精子细胞在之后置于卵中以使合子能够形成。反之亦然。精子和卵两者可以在合子形成之前均进行电穿孔。
电穿孔之后,与相反性别的配子或植入前胚胎融合之后,电穿孔的配子可以移植到假孕宿主动物/哺乳动物中,优选为相同物种或品系,该动物(例如哺乳动物)能够承载胚胎到分娩期。在某些实施方式中,植入到假孕宿主动物/哺乳动物中在发育的桑椹胚或囊胚期发生。在其他实施方式中,植入在胚胎电穿孔后立即发生,或在电穿孔的配子与另一个配子融合后立即发生。
在其他实施方式中,材料(例如,包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统)被引入早期胚胎,例如植入前期胚胎。植入前期胚胎可以是1-细胞胚胎(即,合子)、2-细胞胚胎、4-细胞胚胎、8-细胞胚胎、早期桑椹胚或晚期桑椹胚。由于胚胎发育有时可能涉及非对称分裂,至少短暂地,早期胚胎是3-、5-、6-、7-细胞胚胎或其他不是对称胚胎分裂的结果的胚胎是可能的。本发明的方法也适用于这样的早期胚胎。然而,在一个优选实施方式中,植入前期胚胎是1-细胞胚胎(即,合子)。
在某些实施方式中,该方法还包括允许(电穿孔的)植入前期胚胎(例如,合子)发育成活胎产的遗传修饰动物(例如非人哺乳动物)。例如,植入前胚胎在电穿孔之后可以移植到假孕宿主动物(例如非人哺乳动物)中,优选具有相同物种或品系,该动物(例如非人哺乳动物)能够承载胚胎到分娩期。
在某些实施方式中,配子(在与相反性别的配子融合之后)或植入前胚胎在移植到假孕宿主动物(例如非人哺乳动物)之前先从在其中进行电穿孔的培养基中移除。例如,电穿孔的配子或植入前胚胎可以在适合或相容于胚胎发育的培养基(例如等渗生理溶液或培养基)中洗涤一次或多次。这样的洗涤还除去电穿孔培养基或缓冲液中可能有害或以其他方式不利于体外或体内进一步胚胎发育的任何物质。
用于该目的的适合的培养基包括但不限于M2培养基或OPTI-或任何其他生理溶液(具有适当的离子强度和pH)。在某些实施方式中,将用于洗涤的培养基或缓冲液预加温至动物(例如非人哺乳动物)胚胎发育的最佳温度(例如约37℃),以减少或最小化任何潜在的温度冲击。
在某些实施方式中,电穿孔培养基是等渗的。
在某些实施方式中,洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎以除去用于溶解多核苷酸的一种或多种缓冲液,例如TE缓冲液或含有金属螯合剂例如EDTA的等效缓冲液。
在某些实施方式中,洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎以除去可以用作电穿孔培养基的基础或低血清培养基,例如OPTI-培养基(INVITROGEN,Carlsbad,CA)、siPORTTM(AM8990或AM8990G;Ambion,Austin,TX)、或其混合物或等同物。
使用本发明的方法可以将许多试剂或材料引入配子或植入前胚胎,以产生可通过种系传递的遗传修饰。
在某些实施方式中,材料可包含多核苷酸、多肽、或两者。在一个优选的实施方式中,材料包含含有II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统。例如,待电穿孔的材料可包含II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN),其各自对哺乳动物的基因组中的靶序列具有特异性。待电穿孔的材料可包含II型Cas9蛋白、锌指核酸酶(ZFN)、BuD衍生核酸酶(BuDN)或转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列(例如mRNA)。待电穿孔的材料可包含CRISPR-Cas系统指导RNA(例如sgRNA),其与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。材料还可包含供体多核苷酸。材料可包含任意上述多核苷酸和多肽的组合。
在某些实施方式中,材料包含含有II型Cas9蛋白的多肽。例如,可以以250ng/μL的终浓度,或者150ng/μL、200ng/μL、300ng/μL或350ng/μL的终浓度将Cas9蛋白添加至电穿孔混合物中。在某些实施方式中,可以以300ng/μL的终浓度,或者200ng/μL、250ng/μL、350ng/μL或400ng/μL的终浓度将sgRNA添加至电穿孔混合物中。在某些实施方式中,可以以250ng/μL的终浓度将Cas9蛋白添加至电穿孔混合物中,并且可以以300ng/μL的终浓度将sgRNA添加至电穿孔混合物中。
如本文所用,“终浓度”是指在电击杯中孵育的配子或植入前期胚胎(例如合子)的混合物中Cas9蛋白或sgRNA的浓度(视情况而定)。
本发明部分地是基于以下令人惊奇的发现:当通过电穿孔递送Cas9蛋白而不是Cas9编码序列(例如mRNA)时,来自囊胚样品分析的结果表明,NHEJ和KI效率两者相比于电穿孔Cas9编码序列均非常高。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔实现至少50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高(例如,100%)的敲入(KI)效率。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环(例如4-10个循环,或4-8个循环,或6个循环)的电穿孔,实现该KI效率。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔实现至少80%、85%、90%、95%、97%或100%的NHEJ效率。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环(例如4-10个循环,或4-8个循环,或6个循环)的电穿孔,实现该NHEJ效率。
在某些实施方式中,采用Cas9蛋白(例如250ng/μL)的电穿孔以至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或更高的比率在IVF(体外受精)产生的胚胎中实现大靶位点基因组缺失(例如,至少1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb或更多的基因组区域的缺失)。在某些实施方式中,采用一个循环的电穿孔,或者4、5、6、7、8、9或10个循环(例如4-10个循环,或4-8个循环,或6个循环)的电穿孔,实现该比率。在某些实施方式中,胚胎是来自近交小鼠品系的胚胎,例如C57BL/6NJ。
在其他实施方式中,还可以通过电穿孔引入另外的材料,例如那些天然或合成的化学品,使得它们促进或抑制NHEJ、HDR或HR过程。例如,可以包括某些化学试剂以促进或增强CRISPR/Cas系统的功能(见下文)。
在某些实施方式中,多聚核苷酸包含II型Cas9蛋白的编码序列。在示例性实施方式中,Cas9蛋白的编码序列是mRNA,例如适于在真核细胞中表达的密码子优化的mRNA。
在某些实施方式中,多核苷酸可以包含规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)-CRISPR相关(Cas)系统指导RNA,其能够与哺乳动物的基因组中的靶序列杂交。指导RNA仅需要序列与靶序列足够相似,使得它们可以在细胞内生理条件下杂交。然而,在某些实施方式中,指导RNA与靶序列完全互补(或100%相同)。
在某些实施方式中,指导RNA可以是与反式激活cr(tracr)序列融合的指导序列。
在某些实施方式中,II型Cas9蛋白与CRISPR-Cas系统指导RNA的编码序列的浓度比可以变化。例如,适合的比率可以是至少1:1、至少1.5:1、至少2:1、至少2.5:1、至少3:1或更高。
在其他实施方式中,II型Cas9蛋白与CRISPR-Cas系统指导RNA的编码序列的浓度比可以是至多1:1、至多1:2、至多1:4、至多1:5、至多1:10或更低。
在某些实施方式中,II型Cas9蛋白的编码序列的浓度是至少约40ng/μL、至少50ng/μL、至少100ng/μL、至少150ng/μL、至少200ng/μL、至少300ng/μL、至少400ng/μL、至少500ng/μL、至少600ng/μL、至少800ng/μL、或至少1000ng/μL或更高。
在某些实施方式中,材料还包含供体多核苷酸(例如以促进CRISPR介导的NHEJ、HDR或HR)。例如,供体多核苷酸可以是线性或环状双链或单链DNA分子。可以包括这样的供体多核苷酸以促进可以是引入的CRISPR-Cas系统的靶标的靶序列的位点特异性修饰或其周围的位点特异性修饰。
除了CRISPR/Cas系统,其他材料也可以使用本发明的方法引入配子或植入前胚胎。例如,在某些实施方式中,多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)的编码序列。在其他实施方式中,多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的锌指核酸酶(ZFN)的编码序列。又在其它实施方式中,多核苷酸可以包含对动物(例如哺乳动物)的基因组中的靶序列具有特异性的BuD衍生核酸酶(BuDN)或模块化碱基-每-碱基特异性核酸结合结构域(modular base-per-base specific nucleic acid binding domains,MBBBD)衍生核酸酶的编码序列。在又一个实施方式中,多核苷酸包含随机整合到动物(例如非人哺乳动物)的基因组中的DNA。
多核苷酸可以包含DNA载体或RNA(例如mRNA和/或CRISPR指导RNA)。
在某些实施方式中,多核苷酸包含将DNA片段随机或特定整合到哺乳动物的基因组中的转座酶。
本发明在进行配子配合(即通过配子细胞的结合进行的有性生殖)的多细胞真核动物的遗传修饰中具有应用。这样的动物的实例包括两栖动物、爬行动物、鸟类、哺乳动物、硬骨鱼类、软骨鱼类、圆口纲动物、节肢动物、昆虫、软体动物和叶状植物。示例性动物包括哺乳动物(例如非人哺乳动物)、鸟类和鱼类。
在某些实施方式中,动物是哺乳动物(见下文)。例如,哺乳动物可以是非人灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物或来自其近系繁殖(例如小鼠或大鼠近系繁殖)、远系繁殖或随机繁殖群体的个体。
本发明的方法可用于将许多可种系传递修饰引入到相关动物物种的基因组,其包括但不限于:小插入或缺失(例如一个或多个碱基对的那些)、异源DNA片段的插入、内源DNA片段的缺失(包括至少1、1.5、2、2.5或3kb的大缺失)、内源DNA片段的倒位或易位,或其组合。同样,在产生修饰方面可能涉及许多不同机制,其包括但不限于非同源末端连接(NHEJ)、同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)。
同源定向修复(HDR)是细胞中修复双链DNA损伤的机制。这种修复机制只有在DNA同源物片段存在于细胞核中时才可以被细胞使用,主要在细胞周期的G2和S期。
当同源DNA片段不存在时,可以发生另一个过程,称为非同源末端连接(NHEJ)。非同源末端连接(NHEJ)是修复DNA中的双链断裂的另一个途径。NHEJ称为是“非同源的”,是因为与需要同源序列以指导修复的同源重组相反,直接连接断裂末端而不需要同源模板。NHEJ通常利用短的同源DNA序列(例如微同源)以指导修复。这些微同源通常存在于双链断裂的末端的单链突出端上。在突出端完全相容时,NHEJ通常精确地修复断裂。导致核苷酸损失的不精确修复也可能发生,但是是在突出端不相容时更为常见。不适当的NHEJ可以导致易位和端粒融合。NHEJ在所有生命界都在进化上保守,并且在哺乳动物细胞中是主要的双链断裂修复途径。
当NHEJ途径失活时,双链断裂可以被称为微同源介导末端连接(MMEJ)的更容易出错的途径修复。在这个途径中,末端切除显示在断裂的任一侧的短微同源,其然后与指导修复对齐。这与通常使用已经暴露在DSB末端上的单链突出端中的微同源的经典NHEJ形成对比。因此,MMEJ进行的修复导致微同源之间的DNA序列的缺失。
同源重组是基因重组的一种类型,其中核酸序列在同源DNA的两个相似或相同分子之间交换。它被细胞最广泛地用于精确地修复发生在DNA双链两者上的有害断裂,称为双链断裂(DSB)。同源重组也是在减数分裂期间产生DNA序列的新组合的过程,真核生物通过该过程产生配子细胞,如动物中的精子和卵细胞。同源重组在生命的所有三个域以及病毒中都是保守的。
本发明的方法适用于单个配子或植入前胚胎(例如合子),并且也适用于2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300或更多个配子或植入前期胚胎(例如合子)的多重和同时使用,例如均可以在相同或不同的条件下,在同一电击杯中或者在多个相似或相同电击杯中同时电穿孔。在一个优选实施方式中,在1-mm电击杯中进行电穿孔。
本发明的方法在许多方面优于显微注射。与显微注射相比,本发明的方法不仅效率高得多且技术要求低很多并且适合标准化,而且胚胎存活率和种系传递率两者都高得多。例如,显微注射通常可以实现注射的小鼠胚胎20-25%的存活率(例如,20-25%的注射的小鼠胚胎存活以产生活胎产的小鼠幼仔)。相比之下,电穿孔的植入前期胚胎(或电穿孔的、然后融合的配子)中的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或更多发育成囊胚期胚胎,优选以与匹配对照可比的速率,例如在合子电穿孔后3.5天,或者发育成活胎产的转基因哺乳动物。例如,该匹配对照可以是伪电穿孔的配子或胚胎,其可以通过空载体、CRISPR/Cas的加扰mRNA和/或指导序列、或仅缓冲液电穿孔。
在某些实施方式中,电穿孔的植入前期胚胎(或电穿孔的、然后融合的配子)中的至少70%、75%、80%、85%、90%或更多发育成活胎产的转基因哺乳动物。
在某些实施方式中,如通过含有设计的遗传修饰的活胎产的哺乳动物的百分比所测量的,宿主基因组的靶向效率为至少80%、85%、90%、95%、97%、99%或接近100%。
虽然不希望受到任何特定理论的约束,但是本发明方法的高靶向效率可能是由于胚胎浸没在同质CRISPR/Cas溶液中并且在电穿孔时类似地暴露于CRISPR/Cas试剂。这与相应显微注射实验形成直接对比,在显微注射实验中技术能力水平和特定实验周围的因素都可能有助于靶向效率相对大的变化。
在某些实施方式中,配子或植入前期胚胎(例如合子)在电穿孔之前预处理以弱化透明带。例如,为此目的,配子或植入前期胚胎可以在酸性台氏液(AT)中预处理例如5-15或10秒。
台氏液由美国药理学家Maurice Vejux Tyrode发明,是林格-洛克氏溶液的改良。它与间质液大致等渗,并且主要用于生理实验和组织培养。它含有镁、糖(通常是葡萄糖)作为能量来源,并使用碳酸氢盐和/或HEPES作为缓冲液。一些变化还包括磷酸根和硫酸根离子。在用于细胞培养应用和生理实验时,其通常用95%氧5%二氧化碳进行气体处理。
酸性台氏液通常可以通过在室温下在100ml水中溶解NaCl 0.8g、KCl 0.02g、CaCl2·2H2O 0.024g、MgCl2·6H2O 0.01g、葡萄糖0.1g、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)0.4g,并用Analar HCl(BDH)调节至pH 2.5而制备。添加PVP以增加粘度并降低胚胎粘性。溶液可以过滤灭菌并以等分试样储存在-20℃下。AT可以从例如Sigma-Aldrich的供应商商购获得(例如100mL包装的SKU T1788)。
在某些实施方式中,配子或植入前胚胎(例如合子)在AT中预处理5-30秒、5-20秒或5-10秒。如果AT被稀释,也可以使用更长的处理时间。可以通过在不同时间段内处理配子或植入前胚胎,然后测量活力、处理后受损或凋亡配子/胚胎的百分比或在后续发育期间胚胎的存活率,经验主义地确定适合的AT处理时间。
在某些实施方式中,电穿孔的配子或胚胎可以在电穿孔后立即使用,例如分别与另一个配子融合或移植到假孕雌性中。在其他实施方式中,电穿孔后,配子或植入前期胚胎冷冻储存,然后解冻用于下一步骤,例如分别与另一个配子融合或移植到假孕雌性中。在又一个实施方式中,可以使电穿孔的配子或胚胎在冷冻保存之前先发育成后期胚胎,例如早期或晚期桑椹胚,或囊胚期胚胎(在电穿孔的配子的情况下,在先与另一个配子融合之后)。
可以使用标准技术,例如玻璃化或慢速可编程冷冻(SPF),进行冷冻保存。
在某些实施方式中,用于电穿孔的植入前胚胎、合子或配子通过体外受精(IVF)获得、从冷冻保存恢复。
本发明的另一方面提供了通过本发明的任一种方法产生的遗传修饰动物(例如非人哺乳动物)。
尽管有上文概述的发明,下文部分还提供了关于本发明的具体方面的额外细节,其应结合概述并在其背景下阅读。
本文所描述的具体实施方式中的任一个均设想可与本发明的其他实施方式中的任一个或多个组合,包括仅在实施例部分中描述的那些。
2.电穿孔和电穿孔器
电穿孔是一种动态现象,其取决于细胞膜上每个点处的局部跨膜电压。对于给定的脉冲持续时间和形状,存在针对电穿孔现象的表现的特定跨膜电压阈值(例如0.5V至1V)。这导致定义电穿孔的电场大小阈值(Eth)。只有在E≧Eth的区域内的细胞才被电穿孔。如果达到或超过第二阈值(Eir),电穿孔将损害细胞活力,导致不可逆的电穿孔(IRE)。
电穿孔允许细胞引入大的、高度带电的分子,例如DNA、RNA或蛋白,其可能不被动扩散穿过疏水双层核。虽然不希望受到任何特定理论的约束,但是据信电穿孔的机制涉及在细胞膜中产生nm级充水孔。据信在电穿孔过程中,膜中的脂质分子未化学改变,而仅仅是移动位置,打开在其充满水时充当穿过双层的导电通路的孔。
电穿孔通常是具有若干不同阶段的多步骤过程。首先,必须施加短的电脉冲。典型的参数会是300-400Mv对于<1ms跨膜。在细胞实验中使用的电压通常大得多,因为它们被施加跨越长距离到主体溶液,所以跨越实际膜的所得场仅仅是施加的偏压的一小部分。在施加该电位时,膜通过来自周围溶液的离子的迁移而像电容器一样充电。一旦达到临界场,脂质形态快速局部重排。所得结构据信是“前孔(pre-pore)”,因为它不导电,但迅速导致产生导电孔。这样的前孔存在的证据主要来自孔的“闪烁”,其表明导电和绝缘状态之间的转变。已经提出这些前孔是小的疏水性缺陷。如果这个理论是正确的,则转变到导电状态可以通过在孔边缘处的重排解释,其中脂质头部折叠以产生亲水界面。最后,这些导电孔可以愈合、再密封双层,或者膨胀、最终使其破裂。该结果命运取决于是否超过临界缺陷尺寸,其进而取决于所施加的场、局部机械应力和双层边缘能量。
根据本发明,配子和植入前胚胎的电穿孔可以用市售的电穿孔器(在细胞溶液中产生电磁场的装置)进行。电穿孔器的示例性但非限制的商业型号包括:来自BTX(SanDiego,CA)的ECMTM830方波电穿孔器(Square Wave Electroporator)或2001电细胞操作仪(Electro Cell Manipulator)(ECM 2001)。
在典型设置中,将配子或植入前胚胎悬浮液移液到玻璃或塑料电击杯中,其在其侧面具有两个铝电极。在电穿孔之前,将配子或植入前胚胎与要引入至配子或植入前胚胎中的(生物)材料(例如DNA、RNA或蛋白或其混合物)轻轻混合。混合物可以在其移液到电击杯(例如,1mm或2mm宽的电击杯)之前制成,或在电击杯中制成。通常,使用约20μL总体积的悬浮液混合物,虽然也可以使用10-200μL、20-100μL、25-75μL总体积。然后设置电压和电容(见下文),并将电击杯插入电穿孔器中。在电穿孔后立即将对胚胎存活最优的给定量(例如,与整个电击杯容量等体积、20-200μL、或100μL)的液体培养基加入到电击杯中以洗出电穿孔的混合物,并将整个内容物收集在适合的容器中(例如组织培养皿)。
电穿孔的配子或植入前胚胎的存活及其发育成培养物或活胎产的动物在一定程度上取决于仔细洗涤和除去电穿孔培养基,如果电穿孔培养基不是生理溶液的话。生理溶液不仅为胚胎发育提供了适当的等渗环境,而且还可以除去可能不利于胚胎发育/存活的任何潜在有害物质。
配子或植入前胚胎,优选地在洗涤后,转移到假孕雌性或者在最佳温度和/或气氛条件(例如在37℃、5%CO2或5%O2/5%CO2/氮气下)下孵育所需时间段,然后发育中胚胎,例如3.5天的囊胚期胚胎,转移到代孕母亲/假孕雌性以发育至足月并作为活的动物出生。
如可以在ECM 830或ECM 2001型中使用的典型电穿孔条件可以包括在1mm电击杯中进行电穿孔,使用以下设置:20-40伏(例如25-35伏、或30伏、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35伏)、脉冲持续时间为1-2ms(例如1.0或1.5ms)、1-3个脉冲(例如2个脉冲)、脉冲间隔为100-1000ms(例如100ms或125-130ms)。在某些实施方式中,电穿孔在4、5、6、7、8、9或10个循环(或6-8个循环)中进行,并且每个循环是在30V、2个脉冲、每个脉冲持续时间为1或1.5ms、脉冲间隔为100ms的条件下进行。
然而,应理解本文公开的条件是出于说明目的而不是限制性的。本领域技术人员可以基于例如要引入的分子的大小和量、配子或胚胎的类型等容易地调整参数。
电穿孔可以在市售的台式电穿孔器中进行,例如来自BTX的ECM830或ECM 2001型以及装置(Lonza Group Ltd.)。一些元件用适合多孔细胞培养皿的特殊电极组件提供同时电穿孔多个样品的可能性。台式电穿孔器也可以设置为不同的操作参数,允许操作员探索或优化特定参数,例如场强。
3.哺乳动物
除了如上所述进行配子配合的多细胞真核动物之外,本发明的方法特别适用于任何哺乳动物,包括人、非人灵长类(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、动物园哺乳动物、有袋类动物、濒危哺乳动物及其所有远亲繁殖或随机繁殖群体。
在某些实施方式中,哺乳动物是小鼠,例如近交小鼠。
示例性的近交小鼠系包括但不限于近交小鼠系C3H,例如CBA、DBA、FVB、NOD、BALB/c、129、C57BL,并且C57BL小鼠包括C57BL/6J、C57BL/6NTac、C57BL/6NCrl、C57BL/10等。
包括重组近交系的其他近交小鼠系包括(但不限于):129S1/SvImJ,129T2/SvEmsJ,129X1/SvJ,129P3/J,A/J,AKR/J,BALB/cBy,BALB/cByJ,BALB/c BALB/cJ,C3H/HeJ,C3H/HeOuJ,C3HeB/FeJ,C57BL/10J,C58,CBA/CaHN-Btkxid/J,CBA/J,DBA/1J,DBA/1LacJ,DBA/2J,FVB/NJ,MRL/MpJ,NOD/LtJ,SJL/J,SWR/J,NOR/LtJ,NZB/BlNJ,NZW/LacJ,RBF/DnJ,129S6/SvEvTac,AJTAC,BALB/cAnNTac,BALB/cJBomTac,BALB/cABomTac,C57BL/6NTac,C57BL/6JBomTac,C57BL/10SgAiTac,C3H/HeNTac,CBA/JBomTac,DBA/1JBomTac,DBA/2NTac,DBA/2JBomTac,FVB/NTac,NOD/MrkTac,NZM/AegTac,SJL/JcrNTac,BALB/cAnNCrlBR,C3H/HeNCrlBR,C57BL/6NCrlBR,DBA/2NCrlBR,FVB/NCrlBR,C.B-17/IcrCrlBR,129/SvPasIcoCrlBR,SJL/JorlIcoCrlBR,A/JolaHsd,BALB/cAnNHsd,C3H/HeNHsd,C57BL/10ScNHsd,C57BL/6NHsd,CBA/JCrHsd,DBA/2NHsd,FVB/NHsd,SAMP1/KaHsd,SAMP6/TaHsd,SAMP8/TaHsd,SAMP10/TaHsd,SJL/JCrHsd,AKR/OlaHsd,BiozziABH/RijHsd,C57BL/6JOlaHsd,FVB/NhanHsd,MRL/MpOlaHsd,NZB/OlaHsd,NZW/OlaHsd,SWR/OlaHsd,129P2/OlaHsd,and 129S2/SvHsd,B6.129P2-Apoetm1Unc/J,NOD.CB17-Prkdcscid/J,129S1/SvImJ,129X1/SvJ,B10.A-H2a H2-T18a/SgSnJ,B10.D2-Hc0 H2d H2-T18c/oSnJ,B10.D2-Hc1 H2d H2-T18c/nSnJ,B10.RIII-H2r H2-T18b/(71NS)SnJ,B6(C)-H2-Ab1bm12/KhEgJ,B6.129P2-Il10tm1Cgn/J,B6.129P2-Nos2tm1Lau/J,B6.129P2-Nos3tm1Unc/J,B6.129S2-Cd8atm1Mak/J,B6.129S2-Igh-6tm1Cgn/J,B6.129S7-Ifngtm1Ts/J,B6.129S7-Rag1tm1Mom/J,B6.CB17-Prkdcscid/SzJ,B6.MRL-Faslpr/J,B6.V-Lepob/J,BKS.Cg-m+/+Leprdb/J,C3HeB/FeJ,C57BL/10J C57BL/10SnJ,C57BL/6-Tg(APOA1)1Rub/J,C57BL/6J-Tyrc-2J/J,CBA/CaHN-Btkxid/J,CBA/CaJ,CBySmn.CB17-Prkdcscid/J,FVB/N-Tg(MMTVneu)202Mul/J,KK.Cg-Ay/J,MRL/MpJ,MRL/MpJ-Faslpr/J,SJL/J,SWR/J,B10.PL-H2u H2-T18a/(73NS)SnJ,NONcNZO5/LtJ,WR,BPH/2,BPL/1,FS,P/J,P/A和PRO。
在某些实施方式中,小鼠也包括具有全遗传工程化(例如转基因的、敲除、敲入、敲低、逆转录病毒的、病毒的)或化学诱导突变(例如ENU、EMS,还包括突变体存档(archivesof mutants));辐射诱导突变;小鼠系上保持的自发突变/修饰的变体,特别是衍生自例如C57BL/6、129、FVB、C3H、NOD、DBA/2、BALB/c和CD-1的突变体,包括同类系和重组同类系。具体实例包括:B6.129P2-Apoetm1Unc/J、B6.129S4-Pdyntm1Ute/J、B6;129P2-Pemttm1J/J、NOD.Cg Prkdcscid-B2mb/Dvs等。
在某些实施方式中,小鼠是通过杂交两个近交系(包括混合的近交系)产生的小鼠杂交系。示例性杂交系包括:NZBWF1/J、B6CBAF1/J、B6SJLF1/J、CB6F1/J、CByB6F1/J、PLSJLF1/J、WBB6F1/J-KitW/KitW-v、B6129PF1/J、CAF1/J、B6129PF2/J、B6129SF1/J、B6129SF2/J、B6AF1/J、B6C3F1/J、B6CBAF1/J和B6SJLF1/J。
在任一杂交系中,比例可以自50:50F1至99:1F1变化。
在某些实施方式中,小鼠是远交系小鼠,例如CD-1、ICR、Black Swiss、SwissWebster、NIH Swiss、CF-1和Nude小鼠。
在某些实施方式中,大鼠是近交系大鼠,例如ACI、Brown Norway(BN)、BCIX、Copenhagen(COP)、MWF、D Agouti(DA)、Goto-Kakizaki(GK)、Lewis、Fischer 344(F344)、Wistar Furth(WF)、Wistar Kyoto(WKY;WKYN1)或ZDF。
在某些实施方式中,大鼠也包括具有全遗传工程化(例如转基因的、敲除、敲入、敲低、逆转录病毒的、病毒的)或化学诱导突变(例如ENU,还包括突变体存档);辐射诱导突变;包括同类系的大鼠系上保持的自发突变/修饰的变体。具体实例包括:F344/NTac-Tg(HLA-B27)-Tg(2M)33-3Trg;HsdAmc:TR-Abcc2;HsdHlr:ZUCKER-Leprfa和NIH Nude。
在某些实施方式中,大鼠是通过杂交两个近交系产生的大鼠杂交系。示例性杂交系包括:BHR、FBNF1/Hsd和LBNF1/Hsd。
在某些实施方式中,大鼠是远交系大鼠,例如Holtzman、Sprague Dawley、LongEvans、Wistar、Wistar Han、WH、WKY、Zucker、JCR(Russel Rat)和OFA。
4.使用CRISPR/Cas、TALEN、ZFN或BuD进行基因组修饰或编辑
本文所述的发明提供了修饰或“编辑”感兴趣的动物基因组的强大工具,使得修饰或编辑的动物基因组可以通过种系传递来传递。
更具体地,基因组修饰或编辑可以用于通过例如引入异源转基因或通过抑制靶标内源基因的表达而改变感兴趣的动物(例如哺乳动物)的基因组序列。这样的遗传修饰动物可用于例如建立与特定遗传疾病或失调相对应的相关动物模型。这样的动物模型可用于探索或研究疾病机制、进程、预防和治疗(例如药物筛选和临床前测试)。
可以在动物模型中表现的说明性(非限制性)人类疾病或失调包括:各种类型的癌症、心脏病、高血压、代谢和激素失调、糖尿病、肥胖症、骨质疏松症、青光眼、皮肤色素沉着疾病、失明、耳聋、神经退行性失调(例如亨廷顿舞蹈症或阿尔兹海默病)、精神紊乱(包括焦虑和抑郁)和出生缺陷(例如腭裂和无脑儿)。
大多数目前可用的动物模型都是在小鼠中形成,它们重新产生任何特定人类疾病的一些但可能不是全部方面。对于可能难以使用小鼠模型模拟的某些疾病,例如许多神经退行性疾病(其中大部分涉及认知缺陷),本发明的方法可用于在非人灵长类中产生动物模型。例如,最近开发了使用恒河猴的亨廷顿舞蹈病转基因模型,该模型复制了该失调的特征性病理中的一些,就像该失调在人类中发生一样(Yang等.,2008)。
可以使用任何本领域公认的技术进行基因组编辑,例如ZFN/TALEN或CRISPR技术(参见Gaj等人的综述,Trends in Biotech.,31(7):397-405(2013),整个文本和其中所有引用的参考文献都通过引用并入本文)。在优选的实施方式中,使用CRISPR/Cas技术,通过将包含Cas9蛋白的CRISPR/Cas系统电穿孔入非人哺乳动物的配子或植入前胚胎(例如合子)中来进行基因组编辑。
这样的技术使得人们几乎能够操纵广泛的细胞类型和生物体中的任何基因,从而使得能够通过在特定基因组位置处诱导刺激易错非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)的DNA双链断裂(DSB)而进行广泛的遗传修饰。
锌指核酸酶(ZFN)和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)是由与非特异性DNA切割结构域连接的可编程的、序列特异性DNA结合模块组成的嵌合核酸酶。它们是通过将锌指或TAL效应子DNA结合结构域融合到DNA切割结构域而产生的人造限制性酶(RE)。可以工程化锌指(ZF)或转录激活子样效应子(TALE)以结合任何期望的靶DNA序列,并融合到RE的DNA切割结构域,从而产生对期望的靶DNA序列具有特异性的工程限制性酶(ZFN或TALEN)。在将ZFN/TALEN引入到细胞中时,例如植入前胚胎的细胞(例如合子),它可以用于原位基因组编辑。实际上,ZFN和TALEN的多功能性可以扩展到除核酸酶以外的效应子结构域,例如转录激活子和抑制子、重组酶、转座酶、DNA和组蛋白甲基转移酶以及组蛋白乙酰转移酶,以影响基因组结构和功能。
Cys2-His2锌指结构域是真核生物中发现的DNA结合基序的最常见类型之一,代表人类基因组中第二经常编码的蛋白质结构域。个体锌指具有保守ββα构型的约30个氨基酸。锌指蛋白应用于特异性DNA识别的关键是开发含有多于三个锌指结构域的非天然阵列。这一进步通过基于结构发现高度保守的接头序列而得以促进,该接头序列使得能够构建识别长度为9-18bp的DNA序列的合成锌指蛋白。这种设计已经被证明是构建识别在复杂基因组中具有特异性的连续DNA序列的锌指蛋白的最佳策略。适合的锌指可以通过模块化装配方法获得(例如使用通过选择大型组合文库或通过合理设计产生的锌指模块的预选文库)。已经开发了识别几乎所有64种可能的核苷酸三联体的锌指结构域,预选的锌指模块可以串联在一起以靶向含有一系列这些DNA三联体的DNA序列。或者,基于选择的方法,例如寡聚体库工程(oligomerized pool engineering,OPEN),可用于从考虑到相邻指之间的环境依赖性相互作用的随机化文库中选择新的锌指阵列。还使用了两种方法的组合。
工程化锌指是可商购的。Sangamo Biosciences(Richmond,CA,USA)与Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)合作开发了一种用于锌指构建的专有平台(CompoZr),该平台允许研究人员一并绕过锌指构建和验证,并且已经有数千种蛋白可用。广泛地,锌指蛋白技术使得能够靶向几乎任何序列。
TAL效应子是由植物致病性黄单胞菌属细菌分泌的蛋白,DNA结合结构域含有重复的高度保守的33-34氨基酸序列,第12和第13位氨基酸除外。这两个位置是高度可变的(重复可变双残基或RVD)并且显示与特异性核苷酸识别的强相关性。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系已经允许通过选择含有适合RVD的重复区段的组合而对特定DNA结合结构域进行工程化。像锌指那样,模块化TALE重复连接在一起以识别连续DNA序列。已经使众多效应子结构域可用于融合到TALE重复用于靶向遗传修饰,包括核酸酶、转录激活子和位点特异性重组酶。定制的TALE阵列的快速组装可以通过使用包括“金门”分子克隆、高通量固相组装和连接非依赖性克隆技术的策略实现,其均可用于本发明中对克隆的干细胞进行基因组编辑。
TALE重复可以使用本领域中可用的众多工具容易地组装,例如靶向18,740个人类蛋白编码基因的TALEN文库(Kim等.,Nat.Biotechnol.,31:251–258(2013))。定制设计的TALE阵列也可通过例如Cellectis Bioresearch(Paris,France)、TransposagenBiopharmaceuticals(Lexington,KY,USA)和Life Technologies(Grand Island,NY,USA)商购。
来自RE(例如FokI内切核酸酶(或FokI切割结构域变体,例如Sharkey,具有旨在改善切割特异性和/或切割活性的突变))的末端的非特异性DNA切割结构域可用于构建在酵母试验中有活性(在植物细胞和动物细胞中也有活性)的杂交核酸酶。为了提高ZFN活性,可以使用瞬时低温培养条件以增加核酸酶表达水平;也可以使用位点特异性核酸酶与DNA末端加工酶的共递送,和允许ZFN和TALEN修饰细胞富集的荧光替代报告体载体的使用。ZFN介导的基因组编辑的特异性也可以通过使用锌指切口酶(ZFNickase)改善,这利用了切口DNA的诱导刺激HDR而不激活易错NHEJ修复途径的发现。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的简单关系允许可设计的蛋白。可以使用可公开获得的软件程序(DNAWorks)计算适合在两步PCR中组装的寡核苷酸。本领域还已经报道和已知用于产生工程化TALE构造体的许多模块化组装方案。这两种方法都提供了对DNA结合结构域进行工程化的系统途径,其在概念上类似于用于产生锌指DNA识别结构域的模块化组装方法。
一旦已经组装了TALEN基因,使用任何本领域公认的方法,例如使用阳离子脂质基试剂,使用质粒载体,各种病毒载体如腺病毒、AAV以及整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)的电穿孔或转染,将它们引入至载体上的靶细胞中。或者,TALEN可以作为mRNA递送至细胞,这消除了TALEN表达蛋白的基因组整合的可能性。它也可以明显增加基因编辑过程中同源定向修复(HDR)的水平和基因渗入的成功。最后,还可以直接递送纯化ZFN/TALEN蛋白到细胞中。该方法不具有插入诱变的风险,并且导致比依赖从核酸表达的递送系统更少的脱靶效应,并且因此可以最佳地用于需要细胞中的精确基因组工程的研究,例如即时干细胞。在本文所述实施方式中的任一项中,根据本发明的电穿孔方法可以将TALEN基因、mRNA或蛋白引入至配子和植入前胚胎。
TALEN可用于通过诱导双链断裂(DSB)而编辑基因组,其细胞响应于修复机制。非同源末端连接(NHEJ)重新连接来自双链断裂的每一侧的DNA,在那里很少有或没有序列重叠用于退火。可以运行简单的异源双链体切割试验,其检测通过PCR扩增的两个等位基因之间的任何差异。切割产物可以在简单的琼脂糖凝胶或平板凝胶系统上显现。或者,可以通过NHEJ在外源双链DNA片段的存在下将DNA引入基因组。同源定向修复也可以在DSB处引入外源DNA,因为转染的双链序列可用作修复酶的模板。已经使用TALEN以产生稳定修饰的人胚胎干细胞和诱导多能干细胞(iPSC)克隆体以产生敲除的秀丽隐杆线虫、大鼠和斑马鱼。
ZFN和TALEN能够纠正疾病的根本原因,从而用精准的基因组修饰永久地消除症状。例如,ZFN诱导的HDR已经用于通过修复缺陷靶基因或通过敲除靶基因,直接纠正与X连锁重度联合免疫缺陷(SCID)、血友病B、镰状细胞病、α1-抗胰蛋白酶缺陷和许多其他遗传疾病相关的致病突变。此外,这些位点特异性核酸酶还可用于在靶动物基因组中的特定“安全港”位置处将治疗性转基因安全地插入受试者配子或植入前胚胎。这样的技术可用于基因疗法以“纠正”给定动物基因组中的特定遗传缺陷。
或者,在一个优选实施方式中,CRISPR/Csa系统可用于有效地将靶向遗传改变诱导到受试者配子和植入前胚胎中。CRISPR/Cas(CRISPR相关)系统或“规律成簇的间隔短回文重复“是包含多个短的直接重复的基因座,并为细菌和古菌提供获得性免疫。CRISPR系统依赖crRNA和tracrRNA对入侵的外源DNA进行序列特异性沉默。术语“tracrRNA”表示反式激活嵌合RNA,其是促进crRNA加工的非编码RNA,并且是激活通过Cas9进行RNA指导切割所需要的。CRISPR RNA或crRNA与tracrRNA碱基配对以形成引导Cas9内切酶至互补DNA位点进行切割的双RNA结构。
存在三种类型的CRISPR/Cas系统:在II型系统中,Cas9作为RNA指导的DNA核酸内切酶,其在crRNA-tracrRNA靶标识别时切割DNA。在细菌中,CRISPR系统通过RNA指导的DNA切割提供对抗侵入的外源DNA的获得性免疫。可以通过重新设计crRNA而使CRISPR/Cas系统重新靶向以切割几乎任何DNA序列。实际上,已经显示CRISPR/Cas系统通过共递送表达Cas9核酸内切酶和必需crRNA组分的质粒而可直接移植到人细胞。这些可编程的RNA指导的DNA核酸内切酶已经展示了在iPS细胞中的多重基因破坏能力和靶向整合,因此可以在本发明方法中类似地使用。
任何CRISPR/Cas系统,包括相关Cas蛋白和RNA指导序列,以及它们的编码序列(例如Cas9的mRNA或指导RNA的编码序列)或包含这样的编码序列的载体可与本发明的方法一起使用。参见US 2014-0068797 A1和美国专利号8,697,359中描述的那些(均通过引用并入本文)。
在下面的描述中,RNA指导序列也称为“DNA靶向RNA”,其包含靶向序列,并与修饰多肽(例如Cas9)一起提供靶DNA和/或与靶DNA相关的多肽的位点特异性修饰。
在下面的描述中,CRISPR/Cas系统中的Cas9型蛋白也称为“位点特异性修饰多肽”。
DNA靶向RNA将相关多肽(例如定点修饰多肽)的活性引导至靶DNA内的特异性靶序列。本发明的DNA靶向RNA包含:第一区段(本文中也称为“DNA靶向区段”或“DNA靶向序列”)和第二区段(本文中也称为“蛋白结合区段”或“蛋白结合序列”)。
DNA靶向RNA的DNA靶向区段包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列。本发明的DNA靶向RNA的DNA靶向区段通过杂交(例如碱基配对)以序列特异性方式与靶DNA相互作用。因此,DNA靶向区段的核苷酸序列可以变化并且确定在靶DNA内DNA靶向RNA将与靶DNA相互作用的位置。可以修改DNA靶向RNA的DNA靶向区段(例如通过基因工程)以与靶DNA内任何期望的序列杂交。
DNA靶向区段可以具有12个核苷酸至100个核苷酸的长度。例如,DNA靶向区段可以具有12个核苷酸(nt)至80nt、12nt至50nt、12nt至40nt、12nt至30nt、12nt至25nt、12nt至20nt或12nt至19nt的长度。例如,DNA靶向区段可以具有19nt至20nt、19nt至25nt、19nt至30nt、19nt至35nt、19nt至40nt、19nt至45nt、19nt至50nt、19nt至60nt、19nt至70nt、19nt至80nt、19nt至90nt、19nt至100nt、20nt至25nt、20nt至30nt、20nt至35nt、20nt至40nt、20nt至45nt、20nt至50nt、20nt至60nt、20nt至70nt、20nt至80nt、20nt至90nt或20nt至100nt的长度。与靶DNA的核苷酸序列(靶序列)互补的DNA靶向区段的核苷酸序列(DNA靶向序列)可以具有至少12nt的长度。例如,与靶DNA的靶序列互补的DNA靶向区段的DNA靶向序列可以具有至少12nt、至少15nt、至少18nt、至少19nt、至少20nt、至少25nt、至少30nt、至少35nt或至少40nt的长度。例如,与靶DNA的靶序列互补的DNA靶向区段的DNA靶向序列可以具有12个核苷酸(nt)至80nt、12nt至50nt、12nt至45nt、12nt至40nt、12nt至35nt、12nt至30nt、12nt至25nt、12nt至20nt、12nt至19nt、19nt至20nt、19nt至25nt、19nt至30nt、19nt至35nt、19nt至40nt、19nt至45nt、19nt至50nt、19nt至60nt、20nt至25nt、20nt至30nt、20nt至35nt、20nt至40nt、20nt至45nt、20nt至50nt或20nt至60nt的长度。与靶DNA的核苷酸序列(靶序列)互补的DNA靶向区段的核苷酸序列(DNA靶向序列)可以具有至少12nt的长度。
在一些实施方式中,与靶DNA的靶序列互补的DNA靶向区段的DNA靶向序列的长度为20个核苷酸。在一些实施方式中,与靶DNA的靶序列互补的DNA靶向区段的DNA靶向序列的长度为19个核苷酸。
DNA靶向区段的DNA靶向序列与靶DNA的靶序列之间的互补性百分比可以为至少60%(例如至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%)。在一些实施方式中,DNA靶向区段的DNA靶向序列与靶DNA的靶序列之间的互补性百分比在靶DNA的互补链的靶序列的七个连续最5’(contiguous5’-most)核苷酸上为100%。在一些实施方式中,DNA靶向区段的DNA靶向序列与靶DNA的靶序列之间的互补性百分比在约20个连续核苷酸上为至少60%。在一些实施方式中,DNA靶向区段的DNA靶向序列与靶DNA的靶序列之间的互补性百分比在靶DNA的互补链的靶序列的十四个连续最5’核苷酸上为100%,并且在其余部分上为低至0%。在这样的实施方式中,DNA靶向序列可被认为是长度为14个核苷酸。在一些实施方式中,DNA靶向区段的DNA靶向序列与靶DNA的靶序列之间的互补性百分比在靶DNA的互补链的靶序列的七个连续最5’核苷酸上为100%,并且在其余部分上为低至0%。在这种情况下,DNA靶向序列可被认为是长度为7个核苷酸。
本发明的DNA靶向RNA的蛋白结合区段与定点修饰多肽相互作用。本发明的DNA靶向RNA通过上述DNA靶向区段将结合的多肽引导到靶DNA内的特定核苷酸序列。本发明的DNA靶向RNA的蛋白结合区段包含彼此互补的两段核苷酸。蛋白结合区段的互补核苷酸杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA)。
本发明的双分子DNA靶向RNA包含两个单独的RNA分子。本发明的双分子DNA靶向RNA的两个RNA分子中的每一个包含彼此互补的核苷酸段,使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白结合区段的双链RNA双链体。
在一些实施方式中,激活子-RNA的双链体形成区段与激活子-RNA(tracrRNA)分子之一(例如US 2014-0068797A1的SEQ ID NO:431-562中所述之一,通过引用并入)或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少60%相同。例如,激活子-RNA的双链体形成区段(或编码激活子-RNA的双链体形成区段的DNA)与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-562中所述的tracrRNA序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少60%相同、至少65%相同、至少70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。
在一些实施方式中,靶向体-RNA的双链体形成区段与US 2014-0068797 A1的SEQID NO:563-679(通过引用并入)中所述的靶向体-RNA(crRNA)序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少60%相同。例如,靶向体-RNA的双链体形成区段(或编码靶向体-RNA的双链体形成区段的DNA)与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:563-679中所述的crRNA序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少65%相同、至少70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同、至少99%相同、或100%相同。
可以设计两分子DNA靶向RNA以允许靶向体-RNA与激活子-RNA受控(即,有条件)结合。因为除非激活子-RNA和靶向体-RNA两者与dCas9结合成功能性复合物,否则两分子DNA靶向RNA不起作用,所以可以通过使激活子-RNA与靶向体-RNA之间的结合可诱导而使两分子DNA靶向RNA可诱导(例如,可药物诱导)。作为一个非限制性实例,RNA适体可用于调节(即控制)激活子-RNA与靶向体-RNA的结合。因此,激活子-RNA和/或靶向体-RNA可以包含RNA适体序列。
RNA适体是本领域已知的并且通常是核糖开关的合成版本。术语“RNA适体”和“核糖开关”在本文中可互换使用以涵盖合成和天然核酸序列两者,其提供RNA分子(合成和天然核酸序列是其的一部分)的结构的可诱导性调节(并因此提供特定序列的可用性)。RNA适体通常包含折叠成特定结构(例如发夹)的序列,其特异性结合特定药物(例如小分子)。药物的结合导致RNA折叠的结构变化,其改变核酸(适体是其的一部分)的特征。作为非限制性实例:(i)具有适体的激活子-RNA可能不能结合到关联靶向体-RNA,除非适体被适合的药物结合;(ii)具有适体的靶向体-RNA可能不能结合到关联激活子-RNA,除非适体被适合的药物结合;和(iii)各自包含结合不同药物的不同适体的靶向体-RNA和激活子-RNA可能不能彼此结合,除非这两种药物都存在。如这些实例所说明的,可以将两分子DNA靶向RNA设计为可诱导的。
可以例如在Nakamura等.,Genes Cells,2012年5月,17(5):344-364;Vavalle等.,Future Cardiol.,2012年5月,8(3):371-382;Citartan等.,Biosens.Bioelectron.,2012年4月15日,34(1):1-11以及Liberman等.,Wiley Interdiscip.Rev.RNA,2012年5月至6月,3(3):369-384中发现适体和核糖开关的实例;其均通过引用整体并入本文。
可以包含在两分子DNA靶向RNA中的核苷酸序列的非限制性实例包括US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-562所述的序列,或其与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:563-679中所述的任何序列配对的补体,或其可以杂交以形成蛋白结合区段的补体。
单分子DNA靶向RNA包含两段核苷酸(靶向体-RNA和激活子-RNA),其彼此互补、通过中间核苷酸(“接头”或“接头核苷酸”)共价连接、并且杂交以形成蛋白结合区段的双链RNA双链体(dsRNA双链体),从而产生茎环结构。靶向体-RNA和激活子-RNA可以经由靶向体-RNA的3’端和激活子-RNA的5’端共价连接。或者,靶向体-RNA和激活子-RNA可以经由靶向体-RNA的5’端和激活子-RNA的3’端共价连接。
单分子DNA靶向RNA的接头可以具有3个核苷酸至100个核苷酸的长度。例如,接头可以具有3个核苷酸(nt)至90nt、3个核苷酸(nt)至80nt、3个核苷酸(nt)至70nt、3个核苷酸(nt)至60nt、3个核苷酸(nt)至50nt、3个核苷酸(nt)至40nt、3个核苷酸(nt)至30nt、3个核苷酸(nt)至20nt或3个核苷酸(nt)至10nt的长度。例如,接头可以具有3nt至5nt、5nt至10nt、10nt至15nt、15nt至20nt、20nt至25nt、25nt至30nt、30nt至35nt、35nt至40nt、40nt至50nt、50nt至60nt、60nt至70nt、70nt至80nt、80nt至90nt、或90nt至100nt的长度。在一些实施方式中,单分子DNA靶向RNA的接头是4nt。
示例性单分子DNA靶向RNA包含杂交以形成dsRNA双链体的两个互补段的核苷酸。在一些实施方式中,单分子DNA靶向RNA的两个互补段的核苷酸之一(或编码该段的DNA)与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-562中所述的激活子-RNA(tracrRNA)分子之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少60%相同。例如,单分子DNA靶向RNA的两个互补段的核苷酸之一(或编码该段的DNA)与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-562中所述的tracrRNA序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少65%相同、至少70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同、至少99%相同、或100%相同。
在一些实施方式中,单分子DNA靶向RNA的两个互补段的核苷酸之一(或编码该段的DNA)与SEQ ID NO:563-679中所述的靶向体-RNA(crRNA)序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少60%相同。例如,单分子DNA靶向RNA的两个互补段的核苷酸之一(或编码该段的DNA)与US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:563-679中所述的crRNA序列之一或其补体在一段至少8个连续核苷酸上至少65%相同、至少70%相同、至少75%相同、至少80%相同、至少85%相同、至少90%相同、至少95%相同、至少98%相同、至少99%相同或100%相同。
在确定适当的关联对时,通过考虑到物种名称和碱基配对(对于蛋白结合结构域的dsRNA双链体),对于US 2014-0068797A1的SEQ ID NO:431-679可以常规地确定crRNA和tracrRNA的适当的天然存在的关联对。
关于单分子DNA靶向RNA和双分子DNA靶向RNA两者,与天然存在的tracrRNA和crRNA很少共有(约50%同一性)的人工序列可以与Cas9一起起作用以切割靶DNA,只要DNA靶向RNA的蛋白结合结构域的结构是保守的。因此,为了设计人工蛋白结合结构域(双分子或单分子版本),可以将DNA靶向RNA的天然存在的蛋白结合结构域的RNA折叠结构纳入考虑。作为非限制性实例,可以基于天然存在的DNA靶向的蛋白结合区段的结构(例如包括相同数量的沿着RNA双链体的碱基对,并且包括与天然存在的RNA中存在的相同的“凸起”区域),设计功能性人工DNA靶向RNA。由于本领域普通技术人员可以容易地为来自任何物种的任何天然存在的crRNA:tracrRNA对(参见US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-679,来自广泛物种的crRNA和tracrRNA序列)产生结构,在使用来自那些物种的Cas9(或相关的Cas9)时,可以设计人工DNA靶向RNA以模拟给定物种的天然结构。因此,适合的DNA靶向RNA可以是人工设计的RNA(非天然存在的),其包含设计为模拟天然存在的DNA靶向RNA(参见US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:431-679,在确定适当的关联对时考虑到物种名称)的蛋白结合结构域的结构的蛋白结合结构域。
蛋白结合区段可以具有10个核苷酸至100个核苷酸的长度。例如,蛋白结合区段可以具有15个核苷酸(nt)至80nt、15nt至50nt、15nt至40nt、15nt至30nt或15nt至25nt的长度。
同样关于单分子DNA靶向RNA和双分子DNA靶向RNA两者,蛋白结合区段的dsRNA双链体可以具有6个碱基对(bp)至50bp的长度。例如,蛋白结合区段的dsRNA双链体可以具有6bp至40bp、6bp至30bp、6bp至25bp、6bp至20bp、6bp至15bp、8bp至40bp、8bp至30bp、8bp至25bp、8bp至20bp或8bp至15bp的长度。例如,蛋白结合区段的dsRNA双链体可以具有8bp至10bp、10bp至15bp、15bp至18bp、18bp至20bp、20bp至25bp、25bp至30bp、30bp至35bp、35bp至40bp或40bp至50bp的长度。在一些实施方式中,蛋白结合区段的dsRNA双链体具有36个碱基对的长度。杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以为至少60%。例如,杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比可以为至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%。在一些情况下,杂交以形成蛋白结合区段的dsRNA双链体的核苷酸序列之间的互补性百分比为100%。
DNA靶向RNA和定点修饰多肽形成复合物。DNA靶向RNA通过包含与靶DNA的序列互补的核苷酸序列为复合物提供靶特异性(如上所述)。复合物的定点修饰多肽提供位点特异性活性。换言之,定点修饰多肽通过其与DNA靶向RNA的至少蛋白结合区段的关联而被引导到DNA序列(例如染色体序列或染色体外序列,例如附加体序列、微环序列、线粒体序列、叶绿体序列等)。
定点修饰多肽修饰靶DNA(例如靶DNA的切割或甲基化)和/或与靶DNA相关的多肽(例如组蛋白尾的甲基化或乙酰化)。定点修饰多肽在本文中也称为“定点多肽”或“RNA结合定点修饰多肽”。
在一些实施方式中,定点修饰多肽是天然存在的修饰多肽。在其他情况下,定点修饰多肽不是天然存在的多肽(例如,如下所述的嵌合多肽,或者经修饰(如突变、缺失、插入)的天然存在的多肽)。
示例性天然存在的定点修饰多肽在US 2014-0068797 A1的SEQ ID NO:1-255(通过引用并入)中作为天然存在的Cas9/Csn1内切核酸酶的非限制性和非穷尽性列表列出。如本文公开的这些天然存在的多肽与DNA靶向RNA结合,从而指向靶DNA内的特定序列,并切割靶DNA以产生双链断裂。
定点修饰多肽包含两部分:RNA结合部分和活性部分。在一些实施方式中,定点修饰多肽包含:(i)与DNA靶向RNA相互作用的RNA结合部分,其中DNA靶向RNA包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列;和(ii)显示定点酶活性(例如用于DNA甲基化的活性、用于DNA切割的活性、用于组蛋白乙酰化的活性、用于组蛋白甲基化的活性等)的活性部分,其中酶活性的位点由DNA靶向RNA确定。
在其他实施方式中,定点修饰多肽包含:(i)与DNA靶向RNA相互作用的RNA结合部分,其中DNA靶向RNA包含与靶DNA中的序列互补的核苷酸序列;和(ii)调节靶DNA内的转录(例如增加或减少转录)的活性部分,其中靶DNA内调节的转录的位点由DNA靶向RNA确定。
在一些实施方式中,定点修饰多肽具有修饰靶DNA的酶活性(例如核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)。
在其他情况下,本发明定点修饰多肽具有修饰与靶DNA相关的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷化活性、SUMO化活性、去SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基活性、豆蔻酰化活性或脱豆蔻酰化活性)。
下文进一步提供示例性定点修饰多肽。
具体地,在一些实施方式中,定点修饰多肽包含氨基酸序列,其与US 2014-0068797 A1的图3中所示的Cas9/Csn1氨基酸序列的氨基酸7-166或731-1003,或与US2014-0068797 A1的SEQ ID NO:1-256和795-1346所述的氨基酸序列中的任一个的相应部分(均通过引用并入本文),具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少99%、或100%的氨基酸序列同一性。
在一些实施方式中,核酸(例如DNA靶向RNA)包含一个或多个修饰,例如碱基修饰、主链修饰等,以为核酸提供新的或增强的特征(例如改进的稳定性)。如本领域已知的,核苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含戊呋喃糖的那些核苷,磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成寡核苷酸时,磷酸基团将相邻的核苷酸彼此共价连接以形成线性聚合化合物。进而,该线性聚合化合物的各自末端可以进一步连接以形成环状化合物,然而,线性化合物通常是适合的。此外,线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性,并且因此可以以产生完整或部分双链化合物的方式折叠。在寡核苷酸内,磷酸基团通常涉及形成寡核苷酸的核苷间主链。RNA和DNA的正常连接或主链是3’至5’磷酸二酯键。
含有修饰的适合核酸的实例包括含有修饰主链或非天然核苷间键的核酸。具有修饰主链的核酸包括在主链中保留磷原子的那些和在主链中不具有磷原子的那些。
其中含有磷原子的适合的修饰寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯、5'-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酰酯)、二氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、具有正3’-5’键的硒代磷酸酯和硼代三磷酸酯、这些的2’-5’连接的类似物、以及具有反向极性的那些,其中一个或多个核苷酸间键是3’至3’、5’至5’或2’至2’键。具有反向极性的适合的寡核苷酸包含在最3’-端核苷酸间键处的单个3’至3’键,即单个倒置核苷残基,其可以是基本单元(核碱基缺失或具有代替其的羟基)。还包括各种盐(例如钾或钠)、混合盐和游离酸形式。
在一些实施方式中,本发明核酸包含一个或多个硫代磷酸酯和/或杂原子核苷间键,特别是-CH2-NH-O-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链)、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯核苷酸间键表示为-O-P(=O)(OH)-O-CH2-)。MMI型核苷间键在上述美国专利号5,489,677中公开。适合的酰胺核苷间键在美国专利号5,602,240中公开。两者均通过引用并入。
还适合的是具有吗啉代主链结构的核酸,如例如美国专利号5,034,506中所述(通过引用并入)。例如,在一些实施方式中,本发明核酸包含代替核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方式的一些中,二氨基磷酸酯或其他非磷酸二酯核苷间键代替磷酸二酯键。
其中不含磷原子的适合的修饰聚核苷酸主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成);硅氧烷主链;硫化物、亚砜和砜主链;甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链;亚甲基甲酰乙酰和硫代甲酰乙酰主链;核糖乙酰主链;含烯烃的主链;氨基磺酸盐主链;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链;磺酸酯和磺酰胺主链;酰胺主链的那些;和具有混合的N、O、S和CH2组分部分的其他。
本发明的核酸也可以是核酸模拟物。术语“模拟物”在其应用于聚核苷酸时旨在包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间键两者均被非呋喃糖基团替换的聚核苷酸,仅替换呋喃糖环在本领域也称为糖代替。杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分保持与适合的靶核酸杂交。一种这样的核酸,已经显示具有优异杂交性质的聚核苷酸模拟物,称为肽核酸(PNA)。PNA化合物中的主链是两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元,其给予PNA含酰胺的主链。杂环碱基部分直接或间接地结合到主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。描述PNA化合物制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。全部通过引用并入。
已经研究的另一类聚核苷酸模拟物是基于具有连接到吗啉代环的杂环碱基的连接的吗啉代单元(吗啉代核酸)。已经报道了连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元的许多连接基团。已经选择一类连接基团以提供非离子低聚化合物。非离子吗啉代基低聚化合物不太可能具有与细胞蛋白质不期望的相互作用。吗啉代基聚核苷酸是寡核苷酸的非离子模拟物,其不太可能与细胞蛋白质形成不期望的相互作用(Dwaine A.Braasch和DavidR.Corey,Biochemistry,41(14):4503-4510(2002))。吗啉代基聚核苷酸在美国专利号5,034,506(通过引用并入)中公开。已经制备了吗啉类的聚核苷酸中的各种化合物,其具有连接单体亚基的多种不同连接基团。
另一类聚核苷酸模拟物称为环己烯基核酸(CeNA)。通常存在于DNA/RNA分子中的呋喃糖环被环己烯基环代替。已经制备了CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体,并将其用于根据经典亚磷酰胺化学的低聚化合物合成。已经制备并研究了完全修饰的CeNA低聚化合物和具有用CeNA修饰的特定位置的寡核苷酸(参见Wang等,J.Am.Chem.Soc.,122:8595-8602(2000),通过引用并入)。通常将CeNA单体引入DNA链增加其DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸化物与RNA和DNA互补物形成复合物,具有与天然复合物相似的稳定性。通过NMR和圆二色性显示将CeNA结构引入天然核酸结构的研究以容易的构象适应发生。
另外的修饰包括锁核酸(LAN),其中2’-羟基基团连接到糖环的4’碳原子上,从而形成2’-C,4’-C-氧亚甲基连接,从而形成双环糖部分。连接可以是桥连2’氧原子和4’碳原子的亚甲基(-CH2-)基团,其中n是1或2(Singh等,Chem.Commun.,4:455-456(1998))。LNA和LNA类似物显示出与互补DNA和RNA非常高的双链体热稳定性(Tm=+3至+10℃)、对于3’-核酸外切降解的稳定性和良好的溶解性。已经描述了含有LNA的有效且无毒的反义寡核苷酸(Wahlestedt等,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97:5633-5638(2000),通过引用并入)。
已经描述了LNA单体腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的合成和制备,及其低聚以及核酸识别性质(Koshkin等,Tetrahedron,54:3607-3630(1998),通过引用并入)。LNA及其制备也在WO 98/39352和WO 99/14226中描述,其均通过引用并入。
核酸也可以包含一个或多个取代的糖部分。适合的聚核苷酸包含选自以下的糖取代基团:OH;F;O-、S-或N-烷基;O-、S-或N-烯基;O-、S-或N-炔基;或O-烷基-O烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1-10烷基或C2-10烯基和炔基。特别适合的是O((CH2)nO)mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON((CH2)nCH3)2,其中n和m为1至约10。其他适合的聚核苷酸包含选自以下的糖取代基团:C1-10低级烷基、取代的低级烷基、烯基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、多烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报道体基团、嵌入体、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学的基团、以及具有相似性质的其他取代基。适合的修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3,也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin等,Helv.Chim.Acta,78:486-504(1995)),即烷氧基烷氧基基团。另外的适合修饰包括2’-二甲基氨基氧乙氧基,即O(CH2)2ON(CH3)2基团,也称为2’-DMAOE,如在下文实施例中所述,以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中也称为2’-O-二甲基-氨基-乙氧基-乙基或2’-DMAEOE),即2’-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。
其他适合的糖取代基团包括甲氧基(-O-CH3)、氨基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)、烯丙基(-CH2-CH=CH2)、-O-烯丙基(-O-CH2CH=CH2)和氟(F)。2’-糖取代基团可以在阿拉伯糖(上)位置或核糖(下)位置。适合的2’-阿拉伯糖修饰是2’-F。也可以在低聚化合物的其他位置,特别是3’端核苷上或在2’-5’连接的寡核苷酸中的糖的3’位和5’端核苷酸的5’位进行类似的修饰。低聚化合物也可以具有代替戊呋喃糖的糖模拟物,例如环丁基部分。
本发明的核酸还可以包含核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基(-C=C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶以及嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶;8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤;5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶;7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。另外的修饰核碱基包括三环嘧啶,例如酚噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮);G-钳夹(G-clamps),如取代的吩噁嗪胞苷(例如,9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3’,’:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。
杂环碱基部分还可以包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环代替的那些,例如7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808(通过引用并入)中公开的那些,在The Concise Encyclopedia of PolymerScience and Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.编,John Wiley&Sons,1990中公开的那些;由Englisch等,Angewandte Chemie,国际版,1991,30:613公开的那些;以及由Sanghvi,Y.S.,第15章,Antisense Research and Applications,第289-302页,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,ed.,CRCPress,1993中公开的那些。这些核碱基中的某些可用于增加低聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经显示5-甲基胞嘧啶置换使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi等编,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页),并且是适合的碱基置换,例如在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
本发明的核酸的另一个可能修饰涉及使增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物化学连接至聚核苷酸。这些部分或缀合物可以包括与官能团如伯或仲羟基共价结合的缀合物基团。缀合物基团包括但不限于嵌入体、报告分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强低聚物的药效学性质的基团、以及增强低聚物的药代动力学性质的基团。适合的缀合物基团包括但不限于胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强抗降解性和/或加强与靶核酸的序列特异性杂交的基团。增强药代动力学性质的基团包括改善本发明的核酸的摄取、分布、代谢或排泄的基团。
缀合物部分包括但不限于脂质部分,例如胆固醇部分(Letsinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:6553-6556(1989));胆酸(Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,4:1053-1060(1994));硫醚,例如己基-5-三苯甲基硫醇(Manoharan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,660:306-309(1992);Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,3:2765-2770(1993));硫代胆固醇(Oberhauser等,Nucl.AcidsRes.,20:533-538(1992));脂肪链,例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,EMBO J.,10:1111-1118(1991);Kabanov等,FEBS Lett.,259:327-330(1990);Svinarchuk等,Biochimie,75:49-54(1993));磷脂,例如二十六烷基-外消旋-甘油或三乙铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油基-3-H-膦酸酯(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,36:3651-3654(1995);Shea等,Nucl.Acids Res.,18:3777-3783(1990));聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等,Nucleosides&Nucleotides,14:969-973(1995));或金刚烷乙酸(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,36:3651-3654(1995));棕榈基部分(Mishra等,Biochim.Biophys.Acta,1264:229-237(1995));或者十八胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,277:923-937(1996));这些全部通过引用并入。
缀合物可以包括“蛋白转导结构域”或PTD(也称为CPP细胞穿透肽),其可以指促进穿过脂质双层、胶束、细胞膜、细胞器膜或囊泡膜的多肽、聚核苷酸、碳水化合物或者有机或无机化合物。连接到范围可以从小极性分子到大的大分子和/或纳米颗粒的另一个分子的PTD促进分子穿过膜,例如从细胞外空间到细胞内空间,或从细胞质到细胞器内。在一些实施方式中,PTD共价地连接至外源多肽(例如定点修饰多肽)的氨基末端。在一些实施方式中,PTD共价地连接至外源多肽(例如定点修饰多肽)的羧基末端。在一些实施方式中,PTD共价地连接至核酸(例如DNA靶向RNA、编码DNA靶向RNA的聚核苷酸、编码定点修饰多肽的聚核苷酸等)。示例性的PTD包括但不限于最小十一肽的蛋白转导结构域(对应于包含YGRKKRRQRRR的HIV-1 TAT的残基47-57);包含足以引导进入细胞的大量精氨酸的聚精氨酸序列(例如3、4、5、6、7、8、9、10、或10-50个精氨酸);VP22结构域(Zender等,Cancer GeneTher.,9(6):489-496(2002));果蝇触角足(Antennapedia)蛋白转导结构域(Noguchi等,Diabetes,52(7):1732-1737(2003));截短的人降钙素肽(Trehin等,Pharm.Research,21:1248-1256(2004));聚赖氨酸(Wender等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:13003-13008(2000))RRQRRTSKLMKR;转运素(Transportan)GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL;KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA;和RQIKIWFQNRRMKWKK。示例性的PTD包括但不限于YGRKKRRQRRR、RKKRRQRRR;从3个精氨酸残基到50个精氨酸残基的精氨酸均聚物;示例性的PTD结构域氨基酸序列包括但不限于以下中的任一种:YGRKKRRQRRR;RKKRRQRR;YARAAARQARA;THRLPRRRRRR和GGRRARRRRRR。在一些实施方式中,PTD是可激活的CPP(ACPP)(Aguilera等,Integr.Biol.(Camb),1(5-6):371-381(2009年6月))。ACPP包含通过可切割接头连接至匹配的聚阴离子(例如,Glu9或“E9”)的聚阳离子CPP(例如,Arg9或“R9”),其使净电荷减少至接近零,从而抑制粘附和摄取到细胞中。在切割接头时,聚阴离子被释放,局部地暴露聚精氨酸及其固有粘性,从而“激活”ACPP以穿过膜。
示例性DNA靶向RNA在下文中进一步描述。
在一些实施方式中,适合的DNA靶向RNA包含两个单独的RNA聚核苷酸分子。两个单独RNA聚核苷酸分子中的第一个(激活子-RNA)包含核苷酸序列,其与SEQ ID NO:431-562所述核苷酸序列中的任一个或其补体在一段至少8个连续核苷酸上具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的核苷序列同一性。两个单独RNA聚核苷酸分子中的第二个(靶向子-RNA)包含核苷酸序列,其与US 2014-0068797的SEQ ID NO:563-679所述核苷酸序列中的任一个或其补体在一段至少8个连续核苷酸上具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的核苷酸序列同一性。
在一些实施方式中,适合的DNA靶向RNA是单RNA聚核苷酸并且包含第一核苷酸序列,其与US 2014-0068797的SEQ ID NO:431-562所述核苷酸序列中的任一个在一段至少8个连续核苷酸上具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的核苷酸序列同一性,以及第二核苷酸序列,其与US 2014-0068797的SEQ ID NO:463-679所述核苷酸序列中的任一个在一段至少8个连续核苷酸上具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或100%的核苷酸序列同一性。
在一些实施方式中,DNA靶向RNA是双分子DNA靶向RNA,并且靶向子-RNA包含在其5'端连接到与靶DNA互补的核苷酸段的序列5’GUUUUAGAGCUA-3’。在一些实施方式中,DNA靶向RNA是双分子DNA靶向RNA,并且激活子-RNA包含序列5’UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’。
在一些实施方式中,DNA靶向RNA是单分子DNA靶向RNA,并且包含在其5'端连接到与靶DNA互补的核苷酸段的序列5’-GUUUUAGAGCUA-接头-UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCG-3’(其中“接头”表示可以包含任何核苷酸序列的任何接头核苷酸序列)。其他示例性单分子DNA靶向RNA包括US 2014-0068797的SEQ ID NO:680-682中所述的那些(通过引用并入)。
在某些实施方式中,定点修饰多肽(例如Cas9)可以组成地或有条件地(例如组织或细胞型特异性地或可诱导地)表达为感兴趣的动物(如小鼠或大鼠)中的转基因,使得只有DNA靶向RNA或指导序列需要被引入至从这样的动物获得的配子或植入前胚胎中,以在配子或植入前胚胎中提供功能性CRISPR/Cas系统。例如,参见Platt等,RISPR-Cas9 KnockinMice for Genome Editing and Cancer Modeling,Cell http://dx dot doi dot orgslash 10.1016 slash j dot cell dot 2014.09.014(通过引用并入)中描述的Cre依赖型Cas9敲入小鼠,其中使用由腺相关病毒(AAB)、慢病毒或颗粒介导的递送方法递送的指导RNA,在神经元、免疫细胞和内皮细胞中展示了成功的基因组编辑。Cas9型转基因可以由例如普遍存在的启动子(例如CAG启动子)驱动,并且可以通过使用Cre-loxP系统(例如,具有细胞型或组织特异性Cre驱动子)或其本领域公知的等同物或变体而使得可诱导。
在某些实施方式中,Cas9表达动物是可生育的,具有正常产仔数,未表现出形态异常,和/或能够繁殖到纯合性。
这样的位点特异性修饰多肽表达动物(例如小鼠或大鼠)结合本发明的高效率、高通量电穿孔方法可用于体内高通量遗传筛选,以例如鉴定涉及众多重要生理过程(例如肿瘤抑制、干细胞更新、病毒复制的宿主决定因素和致癌生长的调节子)中的任一个的基因,并且可以直接结合全基因组或靶向的sgRNA文库以发现新的生物学。
实施例
本文描述的实施例仅出于说明目的,而不是限制性的。然而,实施例中描述的条件可以具有一般适用性,并构成所述发明的具体实施方式,其设想为可与本文所述发明的任何一个或多个其他实施方式组合。
遗传修饰小鼠用作研究基因功能和人类疾病的重要模型,并已经主要使用常规基因靶向或转基因技术产生。在典型的常规基因靶向实验中,首先通过同源重组将期望的遗传修饰引入小鼠胚胎干(ES)细胞,并分离携带预期突变的克隆衍生的ES细胞克隆体(Capecchi,2005)。随后将靶向的ES细胞注射入野生型囊胚中。靶向的ES细胞中的一些可以对所得嵌合动物的种系作出贡献,从而产生含有靶向的遗传修饰的小鼠(Capecchi,2005)。
虽然有效,但基因靶向是昂贵且耗时的,并且严重依赖于种系感受态ES细胞系的可用性和性能。
为了规避对种系感受态ES细胞系的需求,已经开发了使用位点特异性DNA内切核酸酶,包括锌指核酸酶(ZFN)(Urnov等,2010)和转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Bogdanove和Voytas,2011)的替代方法,其可以直接注射到单细胞胚胎中以产生具有特定基因破坏的动物(Carbery等,2010;Geurts等,2009;Sung等,2013;Tesson等,2011)。在提供在双链断裂位点(DSB)侧翼具有同源性的单链DNA(ssDNA)或质粒时,可以通过同源重组(HR)将限定修饰引入基因组中(Brown等,2013;Cui等,2011;Meyer等,2010)。
最近,使用RNA指导的规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR相关(Cas)核酸酶系统(Hsu等,2014),已经建立了在一个步骤中产生携带单个或多个基因中的突变的小鼠,以及携带报告体和有条件等位基因的小鼠的方法(Wang等.,2013;Yang等,2013)。
使用类似的方法,已经从各种物种产生了遗传修饰动物(Chang等,2013;Hai等,2014;Hwang等,2013;Li等,2013a;Li等,2013b;Niu等,2014)。与传统的产生转基因小鼠的方法类似,这些研究都使用显微注射以将核酸组分递送到单细胞合子中。
本文描述的方法使用电穿孔将生物/遗传材料例如CRISPR/Cas系统递送至哺乳动物(例如小鼠)合子,并且成功产生了携带靶向的基因修饰的活的转基因动物(例如小鼠)。
实施例1用报告体-编码多核苷酸对小鼠合子和假定合子进行电穿孔
本实验描述了用报告体-基因编码质粒对小鼠合子或假定合子(简称“合子”)进行电穿孔的结果。
本实验选择pMAXGFP载体(Lonza,USA),其携带CMV启动子和支持普遍存在的表达的SV40聚腺苷酸化信号。收集B6D2F2小鼠胚胎并在酸性台氏溶液(AT)(P/N T1788,SigmaAldrich)中处理5秒,在KOSMaa/BSA(P/N Zeks-050,Zenith Biotech)中洗涤两次,并放入25μL的Opti-MEM(P/N 31985,Life Technologies)中。然后将25μL中的胚胎在TE缓冲液(10mM Tris,0.1mM EDTA,pH7.5)中与80ng/μL的等体积(25μL)pMAXGFP混合,以达到40ng/μL的最终DNA浓度,并将该混合物装入1-mm电击杯中,并使用以下设置进行电穿孔:30伏、脉冲持续时间1毫秒、两个脉冲、脉冲间隔100毫秒(ECM830,BTX)。
电穿孔后,用100μL的预平衡的KOSMaa/BSA回收胚胎,随后在组织培养箱(37℃,5%CO2)中培养3.5天。培养3.5天后,在荧光显微镜下观察胚胎的GFP表达。在所检测的3个胚胎中未观察到荧光(实验1)。
由于透明带层在实验2和3中可能作为质粒进入合子的物理屏障,申请人寻求通过在带上戳洞、通过除去带或通过在AT中处理胚胎10秒,同时将pMAXGFP的浓度从20ng/μL变为40ng/μL、变为100ng/μL,而弱化或破坏透明带层。再次,所检测的胚胎中未观察到荧光。
其他报道体系统,包括用6-fluorescein amidite(6-FAM)(40、100和500ng/μL)、Turbo GFP mRNA(40ng/μL)、eGFP mRNA(25ng/μL)或mCherry mRNA(40和100ng/μL)标记的寡核苷酸,在所检测的胚胎中没有观察到荧光(实验4、5和6)。仅在一例中观察到具有GFP信号的一个胚胎,但该胚胎死亡或发育迟缓。
实施例2用CRISPR/Cas系统对小鼠合子和假定合子进行电穿孔
本实验展示使用本发明的方法将CRISPR/Cas系统递送至小鼠合子或假定合子(简称“合子”)用于CRISPR/Cas介导的靶向基因破坏。
为此目的,使用前述的指导RNA(Wang等,2013,通过引用并入本文),选择Tet1外显子4和Tet2外显子3作为靶标。Tet1和Tet2系统的便利之处在于Sac1(Tet1)或EcoRV(Tet2)限制性位点与PAM(原型间隔子邻近基序)近端序列重叠。因此,使用从胚胎扩增的包含靶位点的PCR产物(Wang等,2013),限制性片段长度多态性(RFLP)分析可以用于检测突变等位基因。
在实验6中,小鼠B6D2F2合子首先使用AT处理10秒,与40/20ng/μL或100/50ng/μL的Cas9 mRNA/Tet1 sgRNA混合,并如上所述进行电穿孔。然后将胚胎培养3.5天直至它们发育成囊胚。然后收获胚胎进行全基因组扩增和PCR分析。
使用Sac1限制酶通过RFLP分析包含靶位点的PCR产物。在使用Cas9 mRNA(40ng/μL)和Tet1 sgRNA(20ng/μL)的混合物时,在从电穿孔的合子发育的胚胎中没有检测到突变。在使用Cas9 mRNA(100ng/μL)和Tet1 sgRNA(50ng/μL)的混合物时,根据RFLP分析,发现16个AT处理的胚胎中的3个以及16个未经AT处理的胚胎中的1个在Tet1基因座处携带突变等位基因(图1A)。通过Sanger测序进一步证实突变(图1A)。
接下来,在实验7中,将甚至更高浓度的Cas9 mRNA(400ng/μL)+Tet2 sgRNA(200ng/μL)电穿孔到小鼠合子中,并且发现9个AT处理的胚胎中有4个在Tet2基因座处携带双等位基因突变(图1B)。
因此,可以使用电穿孔递送的CRISPR/Cas系统(例如Cas9 mRNA+sgRNA)在小鼠合子中有效地靶向Tet1和Tet2基因两者。
同时,使用不同的质粒浓度,即200ng/μL、400ng/μL和800ng/μL质粒DNA,尝试CRISPR/Cas编码质粒的电穿孔(作为以Cas mRNA和指导RNA形式递送CRISPR试剂的替代方法)。在200ng/μL组中,确定了12个总筛选中的一个突变胚胎。因此,也可以实现DNA电穿孔到合子中,虽然在CRISPR/Cas系统的情况下,mRNA/指导RNA组合似乎比DNA更有效。
在本实验和使用CRISPR/Cas系统的其他实验中,使用以下程序制备Cas9 mRNA和sgRNA。
简而言之,携带野生型Cas9基因的px330质粒(Cong等,2013)用作在聚合酶链反应(PCR)中扩增Cas9编码序列的DNA模板。将T7启动子序列加入在Cas9野生型基因的编码序列侧翼的正向引物中并与反向引物配对。使用Qiagen柱(Qiagen)纯化PCR产物,并使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒(Life Technologies)进行体外转录(IVT)。对于sgRNA合成,将T7启动子序列加入到sgRNA模板/正向引物中,并通过PCR扩增产生IVT模板。将T7-sgRNA PCR产物进行柱纯化,并用作使用MEGAshortscript T7试剂盒(LifeTechnologies)的IVT的模板。使用MEGAclear试剂盒(Life Technologies)对Cas9 mRNA和sgRNA两者进行纯化,并在试剂盒提供的洗脱缓冲液中洗脱。在琼脂糖凝胶上分离来自IVT反应的等分试样以评估来自反应的质量。
如所描述的进行Surveyor试验(Guschin等,2010)。从小鼠或胚胎提取基因组DNA,并在以下条件下使用基因特异性引物进行PCR:95℃5分钟;35×(95℃30秒,60℃30秒,68℃40秒);68℃2分钟;保持在4℃。然后将PCR产物变性,退火,用Surveyor核酸酶(Transgenomic)处理。然后将产物在10%丙烯酰胺Criterion TBE凝胶(BioRad)上分离,用溴化乙锭染色并显现。对于RFLP分析,用Sac1(Tet1)或EcoRV(Tet2)消化10μl的Tet1或Tet2PCR产物,并在GelRed(Biotium)染色的琼脂糖凝胶(2%)上分离。对于测序,将PCR产物直接测序或克隆到Topo克隆试剂盒(Invitrogen)中,并通过Sanger测序对个体克隆体进行测序。
实施例3电穿孔的小鼠合子的发育
合子的体外培养和分析是一个重要的方法,可以基于此以快速的周转时间和优选地较低操作成本测试和分析与基因编辑技术相关的大量参数。然而,在使用常规体外培养系统培养电穿孔的合子时,后续胚胎发育似乎被阻滞或中止。通常,在不同浓度范围(例如50/25ng/μL至1000/500ng/μL)的Cas9 mRNA/sgRNA的电穿孔后,在3.5天培养期结束时,胚胎进展到不同的发育阶段,包括1-细胞、2-细胞或4-细胞期、桑椹胚期和偶尔的囊胚期(实验8)的那些。相反,未经电穿孔的对照胚胎在相同时间段结束时达到囊胚期,无论对照胚胎是否用AT进行预处理。在一些实验中(实验10和11),实验中的所有组中的胚胎均未能达到囊胚期。
在培养电穿孔的合子中这样的初始失败似乎表明合子可能不在电穿孔过程中存活并继续发育成活胎产的动物,无论在电穿孔的合子中是否发生期望的遗传修饰。对于AT处理可能过度损伤合子以减缓胚胎发育,以及对于所递送的试剂(例如Cas9 mRNA和指导RNA)可能对合子及其后续发育具有毒性的认识,使得对使用电穿孔作为在动物中永久引入种系可传递的遗传修饰的可行手段进一步产生怀疑。
在试图解决电穿孔的合子的体外发育不良的问题时,申请人惊奇地通过改变体外培养条件(表1),更具体地,通过洗掉电穿孔培养基(其通常包括多核苷酸缓冲液(例如TE缓冲液)和低血清培养基(例如OPTI-培养基))中的任何潜在有害物质,确定了解决方案。这对于电穿孔的合子的生存和发育的显著效果在本文描述的实验中所证明。
特别地,使B6D2F1/J供体雌性小鼠超量排卵以使胚胎产量最大化。每只供体雌性接受5IU(腹腔注射)孕马血清促性腺激素(PMSG),并在47小时后接受5IU(腹腔注射)人绒毛膜促性腺激素(hCG)。
在施用hCG后,使雌性立即与B6D2F1/J种畜雄性1:1交配。约24小时后,检查雌性是否存在交配塞(copulation plug)。将显示交配塞的雌性安乐死,将其输卵管切除并置于M2培养基中。然后将输卵管置于含有以0.3mg/mL浓度加入的透明质酸酶的M2培养基中。通过裂解壶腹而移除卵母细胞窝(clutch),允许其在含有透明质酸酶的M2培养基中孵育,直到卵丘细胞脱落。收集合子并将其通过新鲜M2培养基的两次洗涤,然后放入已经在COOK MINC台式培养箱中在油下平衡24小时的RCVL培养基的微滴中。
将酸性台氏溶液解冻,并将100μL液滴置于皮氏培养皿中,每50个待处理的合子1滴。从RCVL培养基中移出确定进行EP(电穿孔)的合子,并将其放入(预加温的)M2培养基的100μL液滴中。以50个为一组,将合子置于酸性台氏溶液中10秒,然后移出并通过预加温的M2培养基的三个100μL液滴而洗涤。然后将经处理的合子放入OPTI-培养基的5-10μL液滴中准备电穿孔。每个OPTI-培养基液滴中的合子数量和液滴数量随进行的实验的参数而变化。
对于实验14和15两者,使用含有200/100、400/200和600/300ng/μL的Cas9 mRNA/Tet2 sgRNA的CRISPR混合物。此外,对于实验15,携带用于将EcoRV位点(GATATC)转化成EcoRI位点(GAATTC)的突变的供体寡核苷酸也以200、400或200ng/μL提供。使混合物在TE缓冲液(10mM Tris,0.1mM EDTA,pH 7.5)中达到每个实验组10μL,并加入到10μL OPTI-中的胚胎中。然后将20μL的总含量加载到1-mm电击杯中并进行电穿孔(30伏,脉冲持续时间1毫秒,2个脉冲,脉冲间隔100-1000毫秒)。
在电穿孔完成后,如果期望在下面的步骤(例如体外培养和/或转移到假孕雌性中)之前洗涤电穿孔的配子或植入前胚胎,则将胚胎从电击杯回收到100μL的预加温的KSOMaa/BSA培养基中,并连续通过预加温的M2培养基的三个100μL液滴以洗掉任何剩余电穿孔溶液(1:1的TE缓冲液和OPTI-培养基)。然后评估合子的生活力。将判断为健康的那些转移到含有950μL预加温的M2培养基的冷冻小瓶中以运送到无特定病原(SPF)的手术间。
在SPF设施中,使用p1000移液管将合子从冷冻小瓶中移出,并置于已经在COOKMINC台式培养箱中在油下平衡24小时的RCVL培养基的培养滴液中。在转移时,将胚胎从RCVL微滴中移出并置于M2培养基的预加温100μL液滴中,并依照标准方案(例如JacksonLaboratories LAH(实验室动物健康)常规程序94-09)转移到CBYB6F1/J假孕雌性中。
在出生时分析小鼠的子集。对于这些,在小鼠出生时采集尾部活检样品,并通过使用EcoRV消化的RFLP进行分析(图2A和2B)。筛选自Cas9 mRNA 400ng/μL和sgRNA 200ng/μL的组的13只小鼠中的两只小鼠的PCR产物对EcoRV消化具有抗性(首建者85C3)或部分抗性(85C10)(图2,小图A)。
在分别使用600ng/μL和300ng/μL的更高浓度的Cas9 mRNA和sgRNA时,如通过RFLP试验所分析的,5只小鼠是阳性的(首建者86C3、86C5、86C7、86C8和86C9),其中两只(86C3和86C9)对EcoRV消化具有完全的抗性,而3只(86C5、86C7和86C8)对EcoRV消化具有部分的抗性。PCR产物的Sanger测序确认了7只小鼠中的6只存在突变等位基因(图2C,85C3、85C10、86C3、86C7、86C8和86C9),而一只可携带低丰度的突变等位基因(86C5)。此外,在将来自首建者85C3、86C3和86C9的PCR产物克隆到pCR2.1-Topo载体中并测序个体克隆体时,检测到如所预期的精确位于Tet2靶位点的PAM近端区域的INDEL突变(图2D)。
在来自这两个实验的其余小鼠为一周龄时,对它们进行了分析。如前所述采集并通过RFLP分析尾部活检样品,并通过对从这些小鼠扩增的PCR产物进行Sanger测序而确认结果。如表1中所总结的,观察到这两个实验之间的首建者效率的浓度依赖性改善。在使用200ng/μL的Cas9 mRNA和100ng/μL的sgRNA时,在34个筛选中鉴定出1个首建者(3.2%)。在浓度增加到Cas9 mRNA为400ng/μL和sgRNA为200ng/μL时,首建者效率增加到48.3%(29个筛选中14只首建者小鼠)。在浓度进一步增加到Cas9 mRNA为600ng/μL和sgRNA为300ng/μL时,效率是45.5%(33个筛选中15只首建者小鼠)。值得注意的是,对于实验15,实现了100%的首建者效率,发现所有11只筛选小鼠都携带突变等位基因(图3)。
还在实验15中测试了CRISPR介导的HDR,其中将供体寡核苷酸引入实验设计中。
具体地,对合子进行电穿孔,并且使小鼠出生并基因分型。扩增466bp的PCR产物,该扩增产物包含靶位点,暴露于EcoRV消化以检测携带NHEJ突变的等位基因并暴露于EcoRI消化以检测HDR等位基因。虽然其他实验组中未检测到成功的HDR等位基因,检测到携带由EcoRI切割的等位基因的两只首建者小鼠(图3,小图A,87EP11和86EP14),并从采用400ng/μL的Cas9 mRNA、200ng/μL的靶向Tet2基因座的3’UTR的sgRNA和400ng/μL的ssDNA供体进行电穿孔的组中获得它们。在该组中,所有11只小鼠都携带耐EcoRV消化的等位基因。首建者86EP11至86EP15似乎没有携带可检测水平的可以由EcoRV切割的等位基因,表明来自所有11只首建者小鼠的NHEJ突变的存在。在11个样品暴露于EcoR1时,显示来自样品86EP11和86EP14的等位基因中的一些被EcoRI部分消化,表明来自这两个样品的HDR等位基因的存在。
然后将PCR产物从首建者86EP11和86EP14克隆到pCR2.1-TOPO载体中,并对个体克隆体进行测序。如图3,小图B中所示,样品86EP11-4和86EP14-4携带EcoRI位点,表明通过CRISPR/Cas介导从供体ssDNA成功引入该位点。
在一系列实验中进一步测试了各种不同的电穿孔设置参数,且其结果汇总如下:
1.20V、2个脉冲、100ms间隔、0次洗涤
a.Cas9 mRNA 200ng/uL+Tet2 sgRNA 100ng/μL
b.结果:12%达到囊胚期(2/17),未观察到基因靶向
2.20V、2个脉冲、100ms间隔、3次洗涤
a.Cas9/Tet 2:500/250、400/200、200/100ng/μL
b.结果:平均91%囊胚(50/55)
3.20V、2个脉冲、1s间隔、3次洗涤
a.Cas9/Tet2:800、600、400、300、200、100ng/μL
b.200ng/μL下的结果(批次1):100%囊胚(16/16),14.3%靶向(1/7)
c.200、300、400ng/μL下的结果(批次2):95.8%囊胚(46/48),结果未定
d.结果(批次3):多次洗涤,胚胎转移到假孕雌性小鼠,出生未定
4.20V、3个脉冲、1s间隔、1次洗涤
a.Cas9/Tet2:400、200ng/μL
b.200ng/μL下的结果(批次1):82.3%囊胚(14/17),无靶向
c.400和200ng/μL下的结果(批次2):93.8%囊胚(30/32),结果未定
5.20V、3个脉冲、1s间隔、3次洗涤
a.Cas9/Tet2:200ng/μL
b.结果:88.9%囊胚(16/18),无靶向
6.30V、2个脉冲、1s间隔、3次洗涤
a.Cas9/Tet2:400、300、200ng/μL
b.200ng/μL下的结果:94%囊胚(15/18),无靶向
c.300ng/μL下的结果:84%囊胚(16/19),16%靶向(3/19),400ng/μL下无靶向
总之,结果表明使用电穿孔的CRISPR/Cas系统的成功遗传修饰取决于所用CRISPR/Cas试剂的浓度。在电穿孔实验中,与传统显微注射实验相比,试剂浓度停止为限制因素,并且发现使用较高浓度的试剂(例如,对于Cas9 mRNA为400ng/μL以上,且对于sgRNA为200ng/μL以上)产生基因编辑小鼠。
数据还表明,弱化透明带(例如通过AT处理)可以有益于合子电穿孔。然而,应避免长时间处理。
最后但同样重要的是,使用本发明方法的CRISPR介导的基因靶向可以成功进行,并且在实验设置中具有某些参数变化。为了确保电穿孔的合子的成功发育,可能需要在电穿孔完成时用对胚胎发育而言最佳的生理溶液或培养基冲洗电穿孔的合子一次或多次(例如2、3、4次)。例如,电穿孔的合子可以连续通过预加温的M2培养基的(100μL)液滴,以在合子置入培养或转移到子宫环境之前洗掉任何剩余的电穿孔溶液(例如1:1的TE缓冲液和OPTI-)。
下文提供了本发明方法的详细说明的(但非限制性的)实施方式:
1.将补充有1mg/mL的BSA(P/N A2153,Sigma-Aldrich)的100μL KSOMaa Evolve(P/N Zeks-050,Zenith Biotech)的等分试样沉积在96孔平底组织培养板上并在HeraCell培养箱中在37℃/5%CO2下平衡,之后接受单细胞合子。
2.对B6D2F1雌性小鼠腹腔(i.p.)注射5个国际单位(IU)的孕马血清促性腺激素(PMSG,P/N HOR-272,ProSpec,Rehovot,Israel),随后在48小时后腹腔(i.p.)注射人绒毛膜促性腺激素(hCG,P/N HOR-250,ProSpec,Rehovot,Israel)。然后使雌性小鼠与B6D2F1雄性小鼠交配。对交配塞阳性的那些通过颈椎脱位(CD)进行安乐死。从切除的生殖系统冲出受精胚胎。
3.收集来自B6D2F2小鼠的单细胞合子,在酸性台氏溶液(例如,Sigma-Aldrich,目录号T1788;或等同物,如P/N MR-004-D,EMD Millipore)中处理10秒,用KSOMaa Evolve洗涤两次,并置入组织培养皿或板(35mm,P60,96孔)中的预加温的OPTI-培养基(P/N 31985,Gibco)的10μL液滴中。
4.用10mM Tris(pH 7.5)和0.1mM EDTA将“生物材料”(对于CRISPR,其基本上由Cas9 mRNA、sgRNA和任选的供体寡核苷酸组成;或者作为替代方案,由编码它们的DNA组成)重构成10μL体积,并加入到在OPTI-培养基中的合子的10μL液滴中。
5.将浸入“生物材料”中的合子移出并沉积到用于BTX 610型(P/N 450124,Harvard Apparatus)的2-mm电击杯的室中。轻敲电击杯以确保聚核苷酸/合子溶液或悬浮液移动到电击杯的两根导体之间,且没有气泡滞留在混合物中。
6.将电击杯放入BTX电击杯室(ECM 830)中,并使用以下设置(或其变化,例如本文公开的那些)进行电穿孔:
a.电压:30V
b.脉冲间隔:125-130ms
c.脉冲持续时间:1ms
d.#脉冲:2
7.使用从电击杯包装提供的塑料移液器,从96孔板的相应孔中移出80-100μL预加温的培养基(例如KSOMaa/BSA培养基),并将培养基轻轻加入到电击杯中。从电击杯中移出所有的内容物,并将混合物排到孔中。
8.使电穿孔的合子连续通过预加温的M2培养基的两至三个100μL液滴以洗掉任何剩余的电穿孔溶液。
9.立即将携带经洗涤的合子的96孔板放回培养箱中。
10.将胚胎在37℃/5%CO2下培养3.5天以达到发育的囊胚期,然后收获用于分析。
11.使用单细胞全基因组扩增试剂盒(P/N GA4,Sigma-Aldrich)扩增胚胎的基因组。然后将扩增的基因组用作使用包含靶位点的引物对的PCR反应中的模板(ACCUPRIMETMTaq DNA Polymerase System,P/N 12339-016,LifeTechnologies;或PrimeStar GXL,P/N R050B,Clontech)。清洁PCR产物,并通过Sanger测序分析核苷酸序列。
12.合成Cas9 mRNA、sgRNA和任选的DNA供体,并如前所述制备注射混合物(Wang等,2013;Yang等,2013)。
实施例4小鼠合子的改进的多循环电穿孔
上述实施例中描述的方法偶尔表现出针对不同靶基因的变化。例如,在Aicda和Rosa26基因座处的一些试验中,非同源末端连接(NHEJ)以相对低的效率发生(分别为约0%和17%)(数据未示出)。在显微注射和电穿孔之间的另一项平行比较研究中,基于上述实施例的方法似乎不能在Smc1b基因座中产生大片段缺失,而显微注射具有高效率(数据未示出)。尚不完全清楚这样的观察是否是由于基因座特异性影响。
然而,使用这些基因组基因座作为靶标,本实施例证明使用本文所述的改进方法可以实现增加的基因组编辑效率。此外,所述改进方法还可以将不同的遗传修饰(包括精确的核苷酸改变、大片段缺失和靶向短片段插入)引入靶基因座。
一种改进是使用一系列(例如,多个循环)的电穿孔而不是如上所述的仅一轮/循环的电穿孔。为了确定最佳系列的电穿孔循环,使用1、4、6和8个系列的电穿孔循环,采用与之前使用的相同或相似的设置(例如,30V;2个脉冲;1或1.5ms的脉冲持续时间;100ms间隔),并比较在两个细胞和囊胚阶段中观察到的电穿孔胚胎的存活率。
虽然存活率随着电穿孔次数的增加而降低,但六个循环的电穿孔导致了囊胚的体外发育的合理速率(图4C)。重要的是,当应用更多循环的电穿孔时,标记物-GFP mRNA的递送效率显著增加(图4D)。
接下来,将Aicda用作测试应用多个循环的电穿孔是否提高靶向效率的靶标。通过冲洗新鲜输卵管准备B6D2F2/J胚胎。首先用AT(酸性台氏液)处理受精胚胎10秒,然后在电穿孔前进行彻底洗涤。将小鼠合子加载入10μL的Opti-MEM中,然后与10μL的Cas9 mRNA(600ng/μL)、靶向Aicda的sgRNA(300ng/μL)、DNA寡聚物(600ng/μL)混合。DNA寡聚物含有位于靶区域侧翼的DNA序列和将原始靶序列(gagaccgatatgg)转化为包括BamH1位点(GGATCC)和EcoRV位点(GATATC)的序列的一些核苷酸变化(图5A)。然后在电击杯中以与如上所述相同的设置将合子电穿孔,进行1、4、6或8个系列/循环的电穿孔(图4B)。电穿孔后,立即将胚胎转移入假孕小鼠中。幼崽出生两周后,收集组织样本用于基因分型。
独立地采用EcoRV和BamHI消化包含靶位点的PCR产物,并进行测序。如图6A-6C和下表中所示,在6次/循环的电穿孔后,4只小鼠中有1只具有KI(敲入)。与此同时,所有其他组均不具有KI。
使用Cas9 mRNA(自制)以产生Aicda基因组敲入(KI)
然后将商业Cas9 mRNA用于采用相同设置的电穿孔。在多个循环的电穿孔后观察到更好的活胎产率。如下表中所示,尽管大多数组没有成功的KI,但在8个系列的电穿孔后,11只小鼠中有3只具有KI。
使用Cas9 mRNA(商业)以产生Aicda基因组敲入(KI)
这些数据表明,多次/循环的电穿孔可以提高效率,尽管该效率对于某些基因组基因座仍然低于显微注射的效率。
为了进一步提高效率,在与用于Cas9 mRNA的相同的设置下将Cas9蛋白连同其他CRISPR组分一起递送。在一些实验中,将250ng/μL的Cas9蛋白用于所有实验组。在电穿孔后立即将某些电穿孔的胚胎转移入假孕小鼠中,并得到活小鼠。将某些其他电穿孔胚胎培养至囊胚期,并将其收获用于使用RFLP(限制性片段长度多态性)的基因分型以及DNA测序。
令人惊奇的是,从囊胚样品的分析中获得的结果表明,在电穿孔中使用Cas9蛋白后,发现NHEJ和KI效率两者均非常高。值得注意的是,使用Cas9蛋白,即便一个循环的电穿孔也实现了约70%的KI效率(图7A-7C,以及下表)。
通过电穿孔递送Cas9蛋白明显增加了Aicda在囊胚中的HDR效率
为了确认正确的KI,随机选择一些样品用于TOPO克隆和DNA测序(图7C)。如图5B中所示,该结果通过活胎产小鼠的基因分型结果得到证实。使用一轮电穿孔实现了60.00%(6/10)的KI效率。将电穿孔的数量/循环增加至4次实现了非常相似的71.43%(5/7)的高效率。将电穿孔的数量进一步增加至6次/循环和8次/循环分别产生81.33%(5/6)和100%(5/5)的KI效率(图5A-5C和表1)。
表1通过Cas9蛋白的电穿孔对Aicda基因座进行的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑
*用BTX830电穿孔器电穿孔B6D2F2胚胎。电穿孔后,将胚胎洗涤并转移入假孕小鼠中。对于每只活胎产的小鼠,自基因组DNA扩增PCR产物并通过RFLP测定和Sanger测序进行分析。
上述实施例中描述的方法在Smc1b基因座处产生2.2kb缺失时具有不太理想的效率(数据未示出)。为了证明如本实施例中描述的直接在一系列电穿孔中使用Cas9蛋白在先前困难的基因座处有效产生大DNA片段缺失,将Cas9蛋白和靶向Smc1b基因座的不同区域的两种sgRNA共同电穿孔(图8A)。
简而言之,通过IVF(体外受精)制备B6D2F2/J胚胎,其中使用GSH(谷胱甘肽)以弱化透明带。对受精胚胎进行分级、选择和洗涤。然后用Cas9蛋白(250ng/μL)和两种sgRNA(300ng/μL)的混合物将胚胎电穿孔1、4或6次/循环。将电穿孔的胚胎转移入假孕小鼠中。自幼崽取出组织样品并用于基因组DNA纯化和PCR。通过DNA电泳和测序分析PCR产物。
如图9A中所示,仅采用一次/循环的电穿孔,3/9小鼠具有理想的缺失。从Smc1b基因座中缺失了约2200bp的DNA区段。4和6个系列的电穿孔分别产生20%(1/5)和33.34%(2/6)的缺失效率(图9A和9B,以及下表)。通过Sanger测序确认了正确的缺失。
通过在IVF产生的胚胎中电穿孔Cas9蛋白进行的CRISPR/Cas9介导的Smc1b的大片段缺失
用BTX830电穿孔器电穿孔B6D2F2胚胎。电穿孔后,将胚胎洗涤并转移入假孕小鼠中。对于每只活胎产的小鼠,自基因组DNA扩增PCR产物并通过DNA电泳和Sanger测序进行分析。
为了评估针对近交品系的修改方案,将来自C57BL/6NJ品系的IVF衍生的小鼠胚胎分离并用作胚胎供体。使用与上述B6D2F2杂交胚胎相同的方案进行电穿孔。每组进行两次转移。
来自PCR产物大小分析的基因分型结果显示,来自四次电穿孔的7只小鼠中的1只和来自6次电穿孔的10只小鼠中的3只具有大区段缺失(图8B,表2)。一个循环的电穿孔不产生大片段缺失,但它确实高效率产生了NHEJ突变(表2)。此外,一系列电穿孔未显著影响近交品系的活胎产率。
表2通过在近交品系中电穿孔Cas9蛋白进行的CRISPR/Cas9介导的Smc1b的大片段缺失
ag1,gRNA1.g2,gRNA2.
*用BTX830电穿孔器电穿孔C57BL/6NJ胚胎。电穿孔后,将胚胎洗涤并转移入假孕小鼠中。对于每只活胎产的小鼠,从分离自尾组织样品的基因组DNA扩增PCR产物并通过DNA电泳和Sanger测序进行分析。
总之,上述结果证明通过一系列电穿孔的Cas9蛋白递送在小鼠基因组中产生大DNA片段缺失的方面是高度有效的。
靶向基因组插入小DNA片段以产生条件性KO(敲除)小鼠模型或标记蛋白质或RNA靶标被广泛用于产生小鼠模型。为了测试用一系列电穿孔递送Cas9蛋白是否有效产生小DNA片段的基因组插入,自C57BL/6NJ品系制备IVF胚胎,并采用Cas9蛋白(250ng/μL)、靶向Rosa26基因座的sgRNA(300ng/μL)和具有LoxP位点的DNA寡聚物(1000ng/μL)的混合物进行电穿孔(图10A)。然后将胚胎转移并回收活小鼠。从幼崽取出组织样品并将其用于基因组DNA纯化和PCR分析。
包含靶位点的PCR产物的TIDE(通过分解追踪插入和缺失(Indel))分析显示1、4和6个系列的电穿孔分别导致10只小鼠中的4只、5只小鼠中的0只和3只小鼠中的2只可能携带在Rosa26基因座中的正确LoxP位点(表3)。选择那些样品并将其用于TOPO克隆和Sanger测序。测序结果证实正确的LoxP位点插入了Rosa26基因座。图10A-10C中的代表性图像显示了采用一次电穿孔的样品之一的TIDE分析和Sanger测序的结果。
表3通过在近交品系中电穿孔Cas9蛋白进行的CRISPR/Cas9介导的Rosa26的小片段缺失
abd,出生死亡。
*用BTX830电穿孔器电穿孔C57BL/6NJ胚胎。电穿孔后,将胚胎洗涤并转移入假孕小鼠中。对于每只活胎产的小鼠,从分离自尾组织样品的基因组DNA扩增PCR产物并通过DNA电泳和Sanger测序进行分析。bd:出生死亡。
这些结果表明,通过使用Cas9蛋白的电穿孔可以有效地将小DNA片段插入靶区域,包括在C57BL/6N近交系小鼠中。
实施例中呈现的数据表明,通过使用Cas9 mRNA、sgRNA和供体寡核苷酸施加一系列电穿孔,效率可以比上述实施例中描述的方法得到提高,尽管提高的效率仍然相对较低,例如,当与显微注射比较时。
为了进一步改进该方法,使用Cas9蛋白代替Cas9 mRNA进行电穿孔,并且令人惊奇地,KI效率明显提高。尽管使用一次电穿孔递送Cas9蛋白对基因组KI有效地起作用,但通过6个系列的电穿孔递送Cas9蛋白在基因组修饰(例如,大DNA片段缺失)方面以合理的活胎产率实现了高得多的效率,甚至是在近交品系中。对于所有三个基因组基因座中的各种遗传修饰(精确核苷酸变化、靶向短片段插入和大片段缺失),本文所述的改进方法相比于显微注射同样好或更好地进行。
CRISPR/Cas9系统广泛用于生成各种动物模型(Chapman等,2015;Chen等,2015;Ma等,2014;Niu等,2014;Ruan等,2015;Yin等,2014;Zou等,2015)。显微注射仍然是迄今为止用于将CRISPR/Cas9组分递送入大多数动物物种的胚胎中的主要方法。与显微注射相比,本文开发和描述的改进方法当由新手执行时,至少与由熟练工人执行的显微注射一样有效,如果不是更好的话。显微注射技术要求高且通量低。此外,它需要在设备和具有多年培训和经验的操作员方面进行大量投资。相比之下,本文描述的改进方法具有明显的优点,包括高效率、高通量和易于设置和操作。因此,该方法可用于在大多数合适的物种中以高效和容易的方式产生基因编辑的动物模型。
以下一般方法和某些试剂用于进行实施例4中的实验,其仅用于说明目的而非限制性的。
用于电穿孔的试剂的制备
将px330质粒用作模板以扩增Cas9编码序列。将T7启动子序列加入正向引物中。使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA转录试剂盒(Life Technologies)进行体外转录。
对于sgRNA合成,使用2种通用引物(参见下文)和一种具有各种gRNA序列的引物(参见下文)通过PCR扩增将T7启动子序列添加至sgRNA序列。
用于制备用于所有sgRNA的IVT DNA模板的两种通用引物
用于制备用于合成sgRNA的IVT DNA模板的正向引物
使用Qiagen PCR产物纯化试剂盒纯化T7-sgRNA PCR产物,并将其用作用于IVT的模板。使用MEGAshortscript T7试剂盒(Life Technologies)合成sgRNA并使用MEGAclear试剂盒(Life Technologies)进行纯化。
单链DNA寡核苷酸作为Ultramer DNA寡核苷酸定购自Integrated DNATechnologies(IDT)。DNA寡核苷酸序列在以下示出。
用作用于HDR介导的KI的DNA供体的DNA寡核苷酸
Cas9 mRNA定购自Trilink(L-6125)。Cas9蛋白定购自PAN(CP01-50)或ThermoFisher Scientific(B25641)。
为了制备用于电穿孔的试剂,将所需浓度的所有组分混合并冻干,如果总体积大于用于电穿孔的最终体积。将混合物在4℃下以20,000g离心15分钟。离心后,将上清液转移到新的无核酸酶管中。将最终溶液的体积调节至所需体积。
为了制备Cas9 RNP(与sgRNA复合的重组Cas9蛋白),将包含Cas9蛋白的电穿孔溶液和含或不含DNA寡聚物的sgRNA在37℃下温育15分钟。将样品置于冰上并立即用于电穿孔。
合子分离、培养和转移
所有动物工作均经Jackson实验室动物护理和使用委员会批准,并遵守NIH制定的实验动物护理和使用指南的标准。
当通过自然交配产生胚胎时,如前所述分离和培养小鼠胚胎(Qin等,2015)。IVF是按照具有一些微小变化的标准方案进行的(Byers等,2006)。简而言之,将Cook RVF培养基用作受精培养基。将卵丘卵母细胞块在1.0mM谷胱甘肽(GSH)中预孵育30分钟以改善受精率并弱化透明带。对胚胎按照受精和生活力进行分级,并将其沉积入COOK MINC台式培养箱中的预平衡的K-RVCL-50培养基的微滴中。PMSG购自Prospect或EMD Millipore。hCG购自Prospect或Sigma。
合子电穿孔
如前所述进行电穿孔(Qin等,2015,通过引用并入)。简而言之,用酸性台氏溶液(T1788,Sigma-Aldrich)处理合子10秒,并在预加温的M2培养基中充分洗涤。由IVF产生的胚胎未用酸性台氏溶液进行处理。为了弱化透明带,它们在改良的IVF方案中在受精前预先用GSH进行处理。
然后将合子置于Opti-MEM培养基(P/N 31985,Gibco)的10μL液滴中。将包含Cas9mRNA或Cas9蛋白/sgRNA/供体的10μL溶液与具有胚胎的Opti-MEM液滴混合并沉积到1mm电击杯(P/N 45-0124,Harvard Apparatus)中。
电穿孔在ECM830方波电穿孔系统(BTX Harvard Apparatus)中进行。对于在30V下使用1ms的脉冲持续时间和脉冲间隔为100ms的两个脉冲的所有实验,每个循环的电穿孔设置是相同的。电穿孔后,用无菌塑料移液管将预加温的M2培养基的100μL等份沉积到电击杯中以回收胚胎。将合子自电击杯中移出并在预加温的M2培养基中洗涤。然后将胚胎在MINC台式培养箱(COOK;37℃,5%CO2和5%O2/氮气)中体外培养至囊胚或转移至假孕雌性小鼠(CByB6F1/J)中。对于IVF胚胎,将它们培养至双细胞阶段然后转移。
RFLP分析和Sanger测序
如前所述,使用碱裂解提取来自组织或胚胎的基因组DNA(Qin等,2015)。采用特异性引物的PCR在以下条件下进行:98℃5分钟;34×(98℃30秒,58℃(或其他退火温度)30秒,68℃30秒);68℃2分钟;保持在4℃。用限制酶消化约4μL PCR产物,并在具有GelRed(Biotium)的琼脂糖凝胶(1.0%)上分离。对PCR产物进行测序并将其克隆到来自ZeroBluntPCR克隆试剂盒(Invitrogen)的pCR4平末端载体中以确定正确的单克隆。通过Sanger测序确定个体克隆体的序列。
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本文引用的所有参考文献均通过引用并入本文。
Claims (28)
1.一种产生遗传修饰的非人哺乳动物的方法,所述方法包括通过电穿孔将包含II型Cas9蛋白的CRISPR-Cas系统引入非人哺乳动物的合子中以修饰所述非人哺乳动物的基因组,其中所述电穿孔包括4-10个循环。
2.权利要求1所述的方法,其中所述电穿孔包括4-8个循环,或6个循环。
3.权利要求1或2所述的方法,其中所述电穿孔的每个循环独立地在20-40伏(例如,25-35伏、或30伏、或25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35伏)下进行。
4.权利要求1-3中任一项所述的方法,其中所述电穿孔的每个循环独立地使用1-2ms(例如,1.0或1.5ms)的脉冲持续时间进行。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述电穿孔的每个循环独立地使用1-3个脉冲(例如,2个脉冲)进行。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述电穿孔的每个循环独立地使用100-1000ms(例如,100ms或125-130ms)的脉冲间隔进行。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述电穿孔由6个循环组成,并且所述电穿孔的每个循环使用以下设置进行:30伏,1.0ms的脉冲持续时间,2个脉冲和100ms的脉冲间隔。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法,其中所述Cas9蛋白在150-350ng/μL(例如,150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL或350ng/μL)的最终浓度下进行电穿孔。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法,其中所述CRISPR-Cas系统包含与所述非人哺乳动物的基因组中的靶序列杂交的单指导RNA(sgRNA),并且其中所述sgRNA在300ng/μL(例如,200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL或400ng/μL)的最终浓度下进行电穿孔。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法,其中采用供体多核苷酸将所述Cas9蛋白电穿孔入所述合子中。
11.权利要求10所述的方法,其中所述供体多核苷酸是线性或环状双链DNA分子。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法,其中所述非人哺乳动物的基因组通过一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如,所述供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位、或其组合而修饰。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法,其中通过非同源末端连接(NHEJ)、同源定向修复(HDR)或同源重组(HR)来修饰所述非人哺乳动物的基因组。
14.权利要求12或13所述的方法,其中所述方法实现至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高(例如,100%)的敲入(KI)效率。
15.权利要求12或13所述的方法,其中所述方法实现至少80%、85%、90%、95%、97%或100%的NHEJ效率。
16.权利要求12或13所述的方法,其中所述方法以至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%或更高的比率在IVF(体外受精)产生的胚胎中实现至少1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb或更多的内源基因组区域的缺失。
17.权利要求1-16中任一项所述的方法,其中同时电穿孔多于一个合子。
18.权利要求17所述的方法,其中同时电穿孔2、3、5、10、20、30、40、50、100、125、150、200、250、300个合子。
19.权利要求17或18所述的方法,其中所有合子在同一电击杯中进行电穿孔。
20.权利要求1-19中任一项所述的方法,其中所述电穿孔在1-mm电击杯中进行。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法,其中在电穿孔之前对所述合子进行预处理以弱化透明带。
22.权利要求21所述的方法,其中所述合子在酸性台氏溶液(AT)中预处理5-15秒或10秒。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法,其中将电穿孔后的所述合子冷冻储存。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法,其中所述电穿孔使用ECM830方波电穿孔系统(BTX830型电穿孔器)进行。
25.权利要求1-24中任一项所述的方法,其还包括将所述电穿孔的合子转移至假孕宿主哺乳动物并使所述电穿孔的合子发育成活胎产的遗传修饰的哺乳动物。
26.权利要求1-25中任一项所述的方法,其中所述非人哺乳动物是灵长类动物(例如狨、猕猴、黑猩猩)、啮齿动物(例如小鼠、大鼠、沙鼠、豚鼠、仓鼠、棉鼠、裸鼹鼠)、兔、家畜哺乳动物(例如山羊、绵羊、猪、奶牛、牛、马、骆驼)、宠物哺乳动物(例如狗、猫)、有袋类动物、或其远系繁殖或随机繁殖群体。
27.权利要求26所述的方法,其中所述非人哺乳动物是小鼠或大鼠。
28.通过权利要求1-27中任一项所述的方法产生的遗传修饰的非人哺乳动物。
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Legal Events
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 40005338 Country of ref document: HK |
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20190301 |