CN111655861A - 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物 - Google Patents
用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111655861A CN111655861A CN201880068136.2A CN201880068136A CN111655861A CN 111655861 A CN111655861 A CN 111655861A CN 201880068136 A CN201880068136 A CN 201880068136A CN 111655861 A CN111655861 A CN 111655861A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reproductive organ
- subject
- gonad
- dna
- mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 123
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 45
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 24
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title abstract description 69
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 title abstract description 12
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 65
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 44
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 230000009027 insemination Effects 0.000 claims abstract description 23
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 16
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 130
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 47
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 41
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 40
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 claims description 40
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 32
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 24
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 23
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 20
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims description 11
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 91
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 71
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 71
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 35
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 34
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 33
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 29
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 28
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 21
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 21
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 18
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 17
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 17
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 17
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 15
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 15
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 101150072467 Foxe3 gene Proteins 0.000 description 13
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 101150093695 pitx3 gene Proteins 0.000 description 12
- 101000860090 Acidaminococcus sp. (strain BV3L6) CRISPR-associated endonuclease Cas12a Proteins 0.000 description 11
- 206010068052 Mosaicism Diseases 0.000 description 11
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 10
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 10
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 9
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- 101150022728 tyr gene Proteins 0.000 description 9
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 8
- 101100272806 Mus musculus Btg2 gene Proteins 0.000 description 8
- 230000006870 function Effects 0.000 description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 7
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 7
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 description 7
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 7
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 7
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 7
- 101150041972 CDKN2A gene Proteins 0.000 description 6
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 6
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 6
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 6
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 6
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 6
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 5
- 240000003864 Ulex europaeus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 5
- 208000002177 Cataract Diseases 0.000 description 4
- 101150003028 Hprt1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102100033254 Tumor suppressor ARF Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- -1 rRNA Proteins 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 3
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 206010001557 Albinism Diseases 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 101150068332 KIT gene Proteins 0.000 description 2
- 241000289581 Macropus sp. Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 2
- 102000003425 Tyrosinase Human genes 0.000 description 2
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 2
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 230000000270 postfertilization Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000001177 vas deferen Anatomy 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O VWEWCZSUWOEEFM-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 229940123611 Genome editing Drugs 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000607560 Homo sapiens Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Proteins 0.000 description 1
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000012330 Integrases Human genes 0.000 description 1
- 108010061833 Integrases Proteins 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 1
- 241000218213 Morus <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 244000182022 Salvia sclarea Species 0.000 description 1
- 235000002911 Salvia sclarea Nutrition 0.000 description 1
- 241000242583 Scyphozoa Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010052160 Site-specific recombinase Proteins 0.000 description 1
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 102100039936 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091029474 Y RNA Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 244000144987 brood Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 1
- 230000004373 eye development Effects 0.000 description 1
- 230000011512 eye pigmentation Effects 0.000 description 1
- 230000008175 fetal development Effects 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000009126 molecular therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000001821 nucleic acid purification Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 239000002924 silencing RNA Substances 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0604—Whole embryos; Culture medium therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明总的来说涉及用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物。更具体来说，本发明部分涉及在生殖器官含有受精合子的对象中进行生殖系基因组工程的方法，所述方法包括在所述对象授精后一定时间段后从所述对象分离或获得所述生殖器官；将试剂组合物引入到所述生殖器官中，所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸；以及对所述生殖器官进行电穿孔。
Description
与相关专利申请的交叉引用
本申请要求2017年8月24日提交的美国临时专利申请号62/549,644的优先权利益，所述临时专利申请的内容整体通过引用并入本文。
序列表
本申请通过EFS-Web电子提交，并包括采取.txt格式的电子提交的序列表。所述.txt文件含有2018年8月23日生成的题为“2018-08-23_6278-00007_ST25.txt”的序列表，大小为15,296字节。该.txt文件中包含的序列表是本说明书的一部分，并整体通过引用并入本文。
背景技术
使用簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(Cas)进行基因组编辑的最新进展使得能够容易且快速地生产遗传修饰的动物[1,2,3]。CRISPR动物基因组工程方法包括三个大概步骤：雌性的交配和合子的分离，将基因组编辑组分微注射到所述合子中，以及将微注射的合子转移到雌性的输卵管中[1,2]。这些步骤需要(1)执行这些程序的技术人员具有非常高的技术专业水平，和(2)昂贵的装置，包括显微操作器。由于所述方案的复杂本质，动物基因组工程实验难以在各个实验室中进行，并且通常在其中高度训练有素的人员每天提供基因组工程服务的集中式核心实验室中进行。规避这些复杂步骤的方法的开发能够使动物基因组工程技术被更多实验室而不仅仅是核心实验室进行。一些研究组调查了使用合子的体外电穿孔作为微注射的替代方案，并且他们使用这种方法成功地生产了基因组编辑的胎鼠和幼崽[4,5,6,7,8,9]。合子的电穿孔克服了微注射步骤，但这个策略仍然需要另外两个困难步骤：用于离体操作的合子的分离和将它们转移回到假孕雌性中。因此在本领域中，对能够简化遗传修饰动物的生产的新的基因组工程方法，仍存在着需求。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了在生殖器官含有受精合子的对象中进行生殖系基因组工程的方法。所述方法可以包括在所述对象授精后一段时间后从所述对象分离或获得所述生殖器官；将试剂组合物引入到所述生殖器官中，所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸；以及对所述生殖器官进行电穿孔。
另一方面，本发明涉及生殖器官组合物。所述组合物可以包括在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官，所述生殖器官包含试剂组合物，并且所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸。
另一方面，本发明涉及电穿孔仪的用途。所述用途可以包括电穿孔仪用于将包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸的试剂组合物引入到在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官中的用途。
附图说明
图1A-1C示出了用于执行GONAD的较早时间点的评估。图1A示出了卵巢和输卵管的解剖学结构和用于GONAD程序的手术设备的图解说明。通过将玻璃微量移液管直接插入穿过位于壶腹部与漏斗部之间的区域处的输卵管壁，注射少量溶液。在注射后立即对整个输卵管进行体内电穿孔。图1B在通过GONAD程序递送eGFP mRNA后，在8细胞至桑椹胚胚胎中eGFP荧光的检测。在妊娠的0.7天时对自然交配的Jcl:MCH(ICR)雌性进行GONAD程序后2天分离的植入前胚胎的eGFP荧光。图1C在第0.4天(左图)和第0.7天(右图)解剖的输卵管和合子。注意在第0.4天解剖的输卵管表现出壶腹部的膨大(箭头)。从第0.4天的壶腹部分离的合子通常被厚厚一层卵丘细胞包围。这些细胞可能妨碍输卵管内注射并随后电穿孔的外源核酸/蛋白质的高效摄入。在第0.7天解剖的输卵管表现出壶腹部的收缩(箭头)，并且从第0.7天的壶腹部分离的合子具有较少的卵丘细胞，这将不太可能妨碍电穿孔后外源核酸/蛋白质的摄入。
图2A-2E示出了使用GONAD方法产生基因失活的动物模型。图2A使用Foxe3靶序列(SEQ ID NO：1)和用于基因分型的引物组失活Foxe3基因的靶向策略的示意图。图2B使用图2A中示出的引物组从创始(G0)小鼠扩增的聚合酶链反应(PCR)产物的直接测序结果。电泳图下方的红色箭头示出了具有插入缺失突变的区域。图2C G0小鼠中突变的Foxe3等位基因(SEQ ID NO：2-11)。核苷酸序列的变化用红色示出，并且变化的类型(插入+Xnt或缺失Δ)在序列的右侧注明。图2D和图2E G1小鼠中的白内障表型。
图3A-3D示出了使用i-GONAD方法产生小遗传变化动物模型。通过使用i-GONAD方法进行基于单链寡聚物供体(ssODN)的敲入来恢复白化病Jcl:MCH(ICR)小鼠的Tyr基因。图3A示出了Tyr基因突变的挽救的示意图。示出了含有向导序列和基因分型引物结合位点的靶区域(SEQ ID NO：12)。图3B示出了Tyr挽救的G0胎鼠的代表性E14.5同窝仔畜。胎鼠的色素沉着的眼用黄色箭头指明。图3C从表3中的#5雌性小鼠获得的代表性Tyr挽救的G0小鼠同窝仔畜。用#数字(用黄色显示)指明的G0小鼠被用于生殖系传递分析(参见图7A-7B中的详情)。图3D从图3B中的G0胎鼠扩增的PCR产物的直接测序结果。突变/校正的核苷酸的位置用红色箭头指示。
图4A-4E示出了使用i-GONAD方法产生大的缺失。图4A示出了C57BL/6JJcl小鼠基因组中缺失由反转录转座子构成的16.2-kb序列以恢复刺鼠色表型的示意图。示出了靶序列和基因分型引物(SEQ ID NO：13和68)。使用了在序列中部含有EcoRI位点的ssODN。图4B示出了挽救的刺鼠色表型(用黄色箭头指明)的代表性小鼠。这些小鼠通过剖腹产回收并由带有自己的幼崽的Jcl:MCH(ICR)保姆雌畜养育。图4C基因分型分析。预期片段大小：M943/M948＝290或295bp(ssODN敲入)，M943/M944＝337bp，M947/M948＝477bp。图4D从G0小鼠扩增的PCR产物的的直接测序结果。联结序列的位置由黄色矩形指示。图4E使用M943/M948引物组从G0小鼠(G0-#3和-#5)扩增的PCR产物的EcoRI消化。红色箭头指示被消化的片段。
图5A-5D示出了使用i-GONAD方法产生报告物敲入小鼠。图5A示出了T2A-mCitrine表达盒在Pitx3基因座中的插入的示意图。示出了靶序列和基因分型引物组(SEQ ID NO：14)。通过ivTRT方法合成的925个碱基长的ssDNA被用作供体DNA。图5B在E12.5时收集的胎鼠中的mCitrine荧光。所述胎鼠的眼被放大作为插入图。图5C敲入的G0胎鼠的基因分型分析的实例。预期片段大小：M1035/M390＝948bp，M389/M1036＝956bp，M389/PP226＝809bp。N阴性对照，M大小标志物。图5D代表性测序层析图，示出了插入的表达盒的5′和3′联结区。示出了显示出c中源自于G0-#1的插入的联结序列。红色箭头指示臂与基因组序列之间的联结部。
图6示出了从i-GONAD程序回收以编辑Tyr-基因的胎鼠。数据显示，使用来自于3个不同制造商的电穿孔仪，i-GONAD可以产生可比的基因组编辑水平。所述胎鼠的色素沉着的眼用黄色箭头指示。
图7A-7B示出了Tyr-基因校正的等位基因的生殖系传递。使G0小鼠(从表3中的雌性#5小鼠获得的G0-#8、-#9和-#10；也参见图3C)与Jcl:MCH(ICR)小鼠交配，并通过外皮颜色观察来检查修复的等位基因的生殖系传递。图7A使G0-#9和-#10小鼠(用黄色箭头示出)与Jcl:MCH(ICR)小鼠(用黑色箭头示出)交配，以获得G1后代。图7B从每只G0小鼠扩增的PCR产物的直接测序结果。红色箭头指示突变/校正的核苷酸的位置。
图8A-8D示出了使用i-GONAD方法在Tis21基因座处产生报告物敲入小鼠。图8A说明了“T2A-mCitrine”表达盒在Tis21基因座中的插入的示意图。示出了靶序列和用于基因分型的引物组(SEQ ID NO：15)。通过ivTRT方法合成的922个碱基长的ssDNA被用作供体DNA。图8B在第14.5天收集的G0-#2胎鼠中的mCitrine荧光(右)，而在胎鼠G0-#1中没有检测到荧光(左)。图8C G0胎鼠中敲入等位基因的基因分型分析。预期片段大小：M1037/M390＝964-bp，M389/M1038＝1005-bp，M389/PP227＝802-bp。N：阴性对照，M：尺寸标志物。用红色箭头示出的PCR条带指示表达盒的正确插入，用蓝色箭头示出的条带指示部分插入。图8D测序层析图，示出了插入的表达盒的5′和3′联结区。示出了显示出图8B中的G0-#2胎鼠中的插入的联结序列。红色箭头指示臂与基因组序列之间的联结部。
图9A-9C示出了使用I GONAD在各种不同小鼠品系的Tyr基因座中产生插入缺失突变。图9A Tyr基因靶向策略和用于基因分型的引物组(SEQ ID NO：16)的示意图。图9B示出了Tyr敲除表型(缺少眼色素沉着)的代表性胎鼠。图9C从每个G0胎鼠扩增的PCR产物的直接测序结果。红色箭头指示突变的核苷酸的位置。
图10A-10C示出了使用i-GONAD在C3H/HeSlc和C57BL/6NCrSlc小鼠品系的Kit基因座中产生插入缺失突变。图10A Kit基因靶向策略和用于基因分型的引物组(SEQ ID NO：17)的示意图。图10B示出了Kit敲除表型(身体颜色表型)的代表性胎鼠。图10C从每个G0胎鼠扩增的PCR产物的直接测序结果。红色箭头指示突变的核苷酸的位置。
图11A-11B示出了使用i-GONAD在C57BL/6NCrl小鼠品系中的Cdkn1a和Cdkn2a基因座中ssODN的敲入。图11A用于失活Cdkn1a或Cdkn2a基因的靶向策略和用于基因分型的引物组(SEQ ID NO：18和19)的示意图。图11B从每个G0胎鼠扩增的克隆PCR产物的测序结果。红色箭头指示臂与基因组序列之间的联结部。
图12A-12C示出了使用i-GONAD和AsCpf1通过基于ssODN的敲入来恢复白化病Jcl:MCH(ICR)小鼠的Tyr突变。图12A示出了Tyr基因突变的挽救的示意图。示出了含有用于AsCpf1的向导序列和基因分型引物结合位点的靶区域(SEQ ID NO：20)。图12B示出了Tyr挽救的G0胎鼠的代表性E14.5同窝仔畜。所述胎鼠的色素沉着的眼用黄色箭头指明。图12C从G0胎鼠(图12B中)扩增的PCR产物的直接测序结果。突变/校正核苷酸的位置用红色箭头指明。
图13示出了使用i-GONAD的雌性保留生殖能力。将使用i-GONAD的雌性小鼠(表3中的#3、#5和#11)在下一个循环中与Jcl:MCH(ICR)雄性交配。代表性的使用i-GONAD的雌性小鼠#3与它的9只同窝幼崽。
详细描述
在这里，在非限制性实例中，本发明人公开了一种被称为通过输卵管核酸递送的改良基因组编辑(i-GONAD)的鲁棒方法。所述方法产生含有单碱基变化、千碱基尺寸的缺失和敲入的小鼠模型。i-GONAD的效率与依赖于合子的离体操作并需要受体动物进行胚胎转移的传统微注射方法的效率相当。相反，i-GONAD避免了这些技术上困难的步骤，并且它可以在具有简单设备和技术专长的任何实验室进行。此外，i-GONAD处理的雌性保持生殖功能，提示了所述方法将来用于生殖系基因疗法的用途。
方法
在本发明的一个方面，提供了在生殖器官含有受精合子的对象中进行生殖系基因组工程的方法。所述方法可以包括在对象授精后一段时间后从所述对象分离或获得所述生殖器官；将试剂组合物引入到所述生殖器官中，所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸；以及对所述生殖器官进行电穿孔。
当在本文中使用时，术语“对象”或“生殖器官含有受精合子的对象”在本文中可互换使用，并且是指具有至少一个含有受精合子的生殖器官的人类和非人类动物两者。本公开的术语“非人类动物”可以包括但不限于脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物如非人类灵长动物、绵羊、山羊、狗、猫、马、奶牛、猪、小鼠、大鼠、鸡、两栖动物、爬行动物等，或无脊椎动物例如昆虫。在某些实施方式中，所述对象是人类患者。所述对象可以是在所述对象带有的胚胎中需要遗传修饰的合子或遗传修饰的细胞的人类患者。在某些实施方式中，所述对象是小鼠或大鼠。
所述“生殖器官”或“含有受精合子的生殖器官”可以是对象的生殖道中可能包括受精合子的任何器官或组织，包括但不限于输卵管、子宫或卵巢。
在某些实施方式中，所述生殖器官是输卵管。“输卵管”是来自于卵巢的卵或蛋经过的管。在某些对象中，输卵管也可以被称为“输卵管”(即雌性哺乳动物)、“法娄皮欧氏管”(即雌性哺乳动物)或“纤毛管”(即两栖动物)。
为了从所述对象分离或获得所述生殖器官，可以使用适合的手术程序来暴露出所述对象的生殖器官。所述生殖器官可以从所述对象的身体暂时取出或保留在所述对象的身体内。例如，在非限制性实例中，本发明人对麻醉的雌性小鼠进行手术程序。在背部皮肤处制造切口后，从所述小鼠暴露出卵巢/输卵管/子宫。
当在本文中使用时，术语“授精”是指将精子引入到对象中用于使所述对象怀孕(即，使所述对象中的卵受精)。所述对象可以通过自然或人工方式授精。自然授精可以包括性交。在某些实施方式中，所述对象通过使所述对象与另一个对象交配来授精。人工授精可以包括将精子引入到所述对象中的非性交方法，例如但不限于宫颈内授精或子宫内授精。
所述对象的生殖器官可以在所述对象授精后的一定“时间段”后分离或获得。本发明人以前使用授精后～1.5至1.7天的生殖器官执行他们的GONAD方法。在这个妊娠阶段时，胚胎处于2细胞阶段，并且本发明人发现在这个阶段递送基因组编辑试剂产生高频的镶嵌胚胎或胎鼠[10]。在这里，为了调查对应于单细胞阶段并因此减少遗传镶嵌现象的递送基因编辑组分的理想时间，本发明人在两个分开的时间点即第0.4天和第0.7天执行本文中公开的方法。本发明人发现，尽管在授精后0.7天执行的本文中公开的方法对基因组编辑和减少镶嵌现象有效，但他们也观察到在授精后0.4天不引发有效的基因组编辑。
部分基于这一发现，所述对象授精后的时间段可以在0.5天(12小时)至1.4天(33.6小时)、0.6天(14.4小时)至1.3天(31.2小时)、0.7天(16.8小时)至1.2天(28.8小时)、0.8天(19.2小时)至1.1天(26.4小时)之间或其中的任何范围。在某些实施方式中，所述对象授精后的时间段可以在0.6天(14.4小时)至0.8天(19.2小时)之间。
在某些实施方式中，所述对象授精后的时间段可以为约0.5天(12小时)、约0.6天(14.4小时)、约0.7天(16.8小时)、约0.8天(19.2小时)、约0.9天(21.6小时)、约1.0天(24小时)、约1.1天(26.4小时)、约1.2天(28.8小时)、约1.3天(31.2小时)或约1.4天(33.6小时)。
所述授精后的时间段可以如本发明人在非限制性实施例中所做来测量。简单来说，使雌性小鼠对象与雄性交配。交配被设定在16:00–17:00，并在第二天早晨(9:00–10:00)通过目测检查来确认阴道塞。他们根据《小鼠胚胎的操作实验指南》(Manipulating theMouse Embryo:A Laboratory Manual)[30]将孕期的第0天指定为0:00时(午夜)，并且具有阴道塞的雌性在10:00时被指定为孕期的第0.4天，在16:00时被指定为孕期的第0.7天。相应的程序可以由本领域技术人员改编以适用于小鼠之外的对象。
所述试剂组合物可以使用多种方法包括但不限于注射或微注射“引入”到所述生殖器官中。适合情况下，在某些实施方式中，通过将所述试剂组合物注射到所述输卵管的腔内，将所述试剂组合物引入到输卵管中。
本文中公开的试剂组合物可以包括“核酸酶系统”。当在本文中使用时，“核酸酶系统”可以包括能够切割细胞内的基因组或其他DNA中的靶DNA序列的任何稀有切点的内切核酸酶系统。所述核酸酶系统可以包括通常能够与可以在基因组中的几个位置处切割的其他内切核酸酶(例如限制性酶)区分开的稀有切点的内切核酸酶。所述核酸酶系统也可以包括将所述内切核酸酶引导到特定多核苷酸序列的向导多核苷酸。所述核酸酶系统可以在所述靶DNA序列处产生双链断裂，或者可以在所述靶DNA序列上造成缺口。核酸酶系统例如工程化的大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统，在本领域中是已知的。适合情况下，本发明的核酸酶系统选自锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。ZFN和TALEN是人工内切核酸酶蛋白，其可以在特定序列处结合并切割DNA。ZFN和TALEN的结构和功能在本领域中是已知的。参见例如Carlson等，Molecular Therapy Nucleic Acids 1(1):e3(2012)。
CRISPR表示“簇状规则间隔短回文重复序列”。Cas蛋白例如Cas9或Cpf1是可以利用单一向导RNA(sgRNA)在特定序列处结合并切割DNA的核酸酶。几种CRISPR/Cas系统在本领域中是已知的(参见例如美国专利公布号20140170753、20140234972；Mali等，Science339(6121):823-826(2013)；Cong等，Science 339(6121):819-823；Shmakov等，MolecularCell 60:1-13(2015))。
适合情况下，本发明的核酸酶系统包括CRISPR/Cas系统。在某些实施方式中，所述CRISPR/Cas系统的RNA可编程核酸酶可以包括Cas9多肽或Cpf1多肽。示例性的Cas9和Cpf1多肽公开在实施例中并且在本领域中是公知的。
所述核酸酶系统的内切核酸酶可以是蛋白质或多肽或者由多核苷酸(例如DNA或RNA)编码。所述核酸酶系统的向导多核苷酸可以是多核苷酸(例如DNA或RNA)。
在包括CRISPR-Cas核酸酶系统的实施方式中，所述Cas内切核酸酶可以是蛋白质或在多核苷酸(例如DNA或RNA)中编码。所述向导RNA可以由单链RNA构成或在DNA多核苷酸中编码。所述向导RNA可以包括单一向导RNA或包括crRNA和tracrRNA分子(参见例如Alt-RTMCRISPR向导RNA，Integrated DNA Technologies)。
在某些实施方式中，所述核酸酶系统可以包括RNA可编程核酸酶多肽和向导RNA多核苷酸。在某些实施方式中，所述RNA可编程核酸酶多肽可以包括Cas9或Cpf1多肽，并且所述向导RNA可以包括crRNA和tracrRNA。
本文中公开的试剂组合物还可以包括单链DNA(ssDNA)或双链DNA(dsDNA)修复模板。所述ssDNA修复模板可以是相对短的寡核苷酸(即10-150个核苷酸)，或者可以是相对较长的核苷酸序列，例如长度为200-10,000个核苷酸。使用较长ssDNA修复模板的方法以前公开在WO 2016/196887中，其内容整体并入本文。使用和制备较短ssDNA修复模板和较长dsDNA修复模板的方法在本领域中是公知的。
本文中公开的试剂组合物可以包括“外源多核苷酸”。当在本文中使用时，“外源多核苷酸”可以包括但不限于DNA(双链或单链)或RNA多核苷酸。所述外源多核苷酸可以编码蛋白质产物、RNA产物、DNA调控元件、变体DNA序列或其任何组合。
蛋白质产物可以是全长蛋白质、蛋白质的片段例如外显子、融合蛋白、多肽或肽。当所述外源多核苷酸被引入到细胞中时，所述蛋白质产物可以被表达(例如外源序列被转录并翻译，以产生蛋白质产物)。所述蛋白质产物可以变成当所述外源序列被引入到靶DNA序列中时在细胞中表达的融合蛋白的一部分，或者可以作为单个蛋白表达。
所述外源多核苷酸可以是RNA产物。所述RNA产物可以包括参与蛋白质合成的RNA、参与翻译后修饰或DNA复制的RNA或调控性RNA。参与蛋白质合成的RNA可以包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA或SRP RNA。参与翻译后修饰的RNA可以包括但不限于snRNA、snoRNA或YRNA。调控性RNA可以包括但不限于反义RNA、CRISPR RNA、向导RNA、长非编码RNA、microRNA、siRNA、piRNA、tasiRNA、5’UTR序列、3’UTR序列、RNA拼接调控性序列、IRES序列或polyA信号序列。
所述外源多核苷酸可以编码DNA调控元件。DNA调控元件可以是调控基因转录或充当用于蛋白质产物或RNA产物的识别序列的非编码DNA序列。示例性的DNA调控元件可以包括但不限于启动子、增强子、沉默子、绝缘子、组织特异性调控元件或用于蛋白质产物或RNA产物的识别序列。用于蛋白质产物或RNA产物的识别序列可以包括但不限于用于位点特异性重组酶或整合酶的识别序列例如FRT、loxP、rox和attB/attP序列。在本发明的实践中有用的启动子包括但不限于组成型、诱导型、时间调控型、发育调控型、化学调控型、物理调控型(例如光调控型或温度调控型)、组织偏好型和组织特异性启动子。启动子可以包括polI、pol II或pol III启动子。适合于植物中表达的启动子包括但不限于花椰菜花叶病毒的35S启动子、遍在蛋白启动子、tCUP隐蔽组成型启动子、Rsyn7启动子、病原体诱导型启动子、玉米In2-2启动子、烟草PR-1a启动子、糖皮质激素诱导型启动子、雌激素诱导型启动子和四环素诱导型和四环素阻遏型启动子。本领域技术人员熟知广范围的用于各种不同细胞类型中的其他启动子。
所述外源多核苷酸可以编码“变体DNA序列”。当在本文中使用时，“变体DNA序列”是指具有与参比DNA序列不同的序列的DNA分子。变体DNA序列可以包括一个或多个拷贝的DNA序列，其在所述变体DNA序列被插入在靶DNA序列处时产生重复序列或拷贝数花斑。相对于参比分子例如靶DNA序列，变体DNA序列可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核苷酸碱基的插入、缺失或替换。
所述外源多核苷酸可以编码本文中描述的蛋白质产物、RNA产物或DNA调控元件的任何组合。
所述外源多核苷酸也可以是病毒载体。所述病毒载体可以是病毒粒子，或者可以在多核苷酸例如质粒上编码。某些病毒载体高效感染或进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定表达病毒基因的能力，导致大量不同的病毒载体系统的开发和应用(Robbins等，1998)。病毒系统目前正被开发用作离体和体内基因转移的载体。例如，可以使用腺病毒、单纯性疱疹病毒、反转录病毒和腺相关病毒载体。可以按照本发明使用的适合的病毒载体可以包括但不限于反转录病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、腺病毒载体或单纯性疱疹病毒载体。反转录病毒载体可以包括例如慢病毒载体。
当在本文中使用时，“电穿孔”是指使用一个或多个电脉冲在细胞膜中开孔以将材料(即DNA、RNA或蛋白质)引入到细胞中的过程。本发明人已发现，几种不同类型的电穿孔仪(T820、NEPA21或CUY21EDIT II)和电穿孔仪参数可以与本发明相结合使用。所述电穿孔仪可以包括镊子类型的电极，其可用于包围所述对象的生殖器官。
可以使用T820电穿孔仪对所述生殖器官进行电穿孔。在这样的实施方式中，电穿孔参数可以包括：8个方波脉冲，脉冲持续时间为5ms，脉冲间隔时间为1s，并且电场强度可以在10V至100V范围内的任一点(即10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V或100V)。在某些实施方式中，电穿孔参数可以包括：8个方波脉冲，脉冲持续时间为5ms，脉冲间隔时间为1s，并且电场强度为50V。
可以使用NEPA21电穿孔仪对所述生殖器官进行电穿孔。在这样的实施方式中，电穿孔参数可以包括：穿孔脉冲：10V–100V(即10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V或100V)，5-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，10％衰减(±脉冲方向)，以及转移脉冲：5V–100V(即5V、10V、15V、20V、25V、30V、35V、40V、45V、50V、55V、60V、65V、70V、75V、80V、85V、90V、95V或100V)，50-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，40％衰减(±脉冲方向)。在某些实施方式中，电穿孔参数可以包括：穿孔脉冲：50V，5-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，10％衰减(±脉冲方向)，以及转移脉冲：10V，50-m脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，40％衰减(±脉冲方向)。
可以使用CUY21EDIT II电穿孔仪对所述生殖器官进行电穿孔。在这样的实施方式中，电穿孔参数可以包括：方波(mA)，(+/-)，Pd V：60V或80V，Pd A：50mA–300mA(即50mA、75mA、100mA、125mA、150mA、175mA、200mA、225mA、250mA、275mA或300mA)，Pd开：5.00ms，Pd关：50ms，Pd N：3，衰减：10％，衰减类型：对数。在某些实施方式中，电穿孔参数可以包括：方波(mA)，(+/-)，Pd V：60V或80V，Pd A：150mA，Pd开：5.00ms，Pd关：50ms，Pd N：3，衰减：10％，衰减类型：对数。
生殖器官组合物
另一方面，本发明涉及生殖器官组合物。所述组合物可以包括在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官，所述生殖器官包含试剂组合物，并且所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸。
电穿孔仪的用途
另一方面，本发明涉及电穿孔仪的用途。所述用途可以包括所述电穿孔仪用于将包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸的试剂组合物引入到在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官中的用途。
本公开不限于本文阐述的构造、部件的布置或方法步骤的具体细节。根据下文的公开内容，本文公开的组合物和方法能够以对本领域技术人员来说显而易见的各种不同方式制造、实践、使用、进行和/或形成。本文中使用的措词和术语仅出于描述的目的，并且不应被视为限制权利要求书的范围。在说明书和权利要求书中使用的诸如第一、第二和第三的顺序指示符是指各种不同的结构或方法步骤，并不意味着被解释为指示任何特定的结构或步骤，或这些结果或步骤的任何特定的顺序或配置。除非本文中另有指明或除非与上下文明显冲突，否则本文中描述的所有方法可以以任何适合的顺序执行。除非另有要求，否则本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“诸如”)的使用仅仅旨在便于本公开，并不暗示对本公开范围的任何限制。本说明书中的语言以及附图中示出的结构均不应被解释为表明任何未要求保护的要素对于本公开的主题内容的实践来说是必不可少的。本文中术语“包括”、“包含”或“具有”及其变化形式的使用意在涵盖其后列出的要素及其等同物以及另外的要素。被叙述为“包括”、“包含”或“具有”某些要素的实施方式也被设想为“基本上由这些要素构成”和“由这些要素构成”。
除非在本文中另有指明，否则本文中数值范围的叙述仅仅打算用作单个地指称落入所述范围内的每个单独的值的简写方法，并且每个单独的值都被并入本说明书中，如同其在本文中被单个地叙述一样。例如，如果浓度范围被陈述为1％至50％，则打算在本说明书中明确地列举诸如2％至40％、10％至30％或1％至3％等的值。这些仅仅是具体所打算的实例，并且在所列举的最小值和最大值之间并包括所列举的最小值和最大值的数值的所有可能的组合应该被认为在本公开中被明确地陈述。使用单词“约”来描述特定的叙述的量或量的范围，意味着表明非常接近于所叙述的量的值被包括在该量中，例如由于制造公差、在形成测量值中的仪器和人为误差等而可以或自然应该考虑的值。除非另有指明，否则所有涉及量的百分率均以重量计。
不承认本说明书中引用的包括任何非专利或专利文件在内的任何参考文献构成现有技术。具体来说，应该理解，除非另有陈述，否则本文中对任何文件的参考并不构成对任何这些文件在美国或任何其他国家构成本领域公知常识的一部分的承认。对参考文献的任何讨论均陈述了其作者的主张，并且本申请人保留对本文引用的任何文件的准确性和相关性提出质疑的权利。除非另有明确指出，否则本文引用的所有参考文献被整体通过引用并入本文。在引用的参考文献中发现的任何定义和/或描述之间存在任何差异的情况下，以本公开为准。
除非另有规定或上下文另有指明，否则没有具体数目的指称意味着“一个或多个”。例如，“蛋白质”或“RNA”应该被解释为分别意味着“一种或多种蛋白质”或“一种或多种RNA”。
下面的实施例仅仅意味着说明，而不是意味着对本发明或随附的权利要求书的范围的限制。
实施例
实施例1–i-GONAD：一种使用CRISPR核酸酶进行原位生殖系基因组工程的鲁棒的
方法
摘要
我们提出了一种被称为通过输卵管核酸递送的改良基因组编辑(i-GONAD)的鲁棒的方法，其通过原位电转化将CRISPR核糖核蛋白递送到E0.7胚胎中。所述方法产生含有单碱基变化、千碱基尺寸的缺失和敲入的小鼠模型。i-GONAD的效率与依赖于合子的离体操作并需要受体动物进行胚胎转移的传统微注射方法的效率相当。相反，i-GONAD避免了这些技术困难的步骤，并且它可以在具有简单设备和技术专长的任何实验室进行。此外，i-GONAD处理过的雌性保留生殖功能，提示了所述方法将来用于生殖系基因疗法的用途。
背景
使用簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)进行基因组编辑的最新进展使得能够容易且快速地生产基因敲除的动物[1,2,3]。CRISPR动物基因组工程方法包括三个大概步骤：超数排卵雌性的交配和合子的分离，将基因组编辑组分微注射到所述合子中，以及将微注射的合子转移到假孕雌性的输卵管中[1,2]。这些步骤需要(1)执行这些程序的技术人员具有非常高的技术专业水平，和(2)昂贵的装置，包括显微操作器。由于所述方案的复杂本质，动物基因组工程实验难以在各个实验室中进行，并且通常在其中高度训练有素的人员每天提供基因组工程服务的集中式核心实验室中进行。规避这些复杂步骤的方法的开发能够使动物基因组工程技术被更多实验室而不仅仅是核心实验室进行。一些研究组调查了使用合子的体外电穿孔作为微注射的替代方案，并且他们使用这种方法成功地生产了基因组编辑的胎鼠和幼崽[4,5,6,7,8,9]。合子的电穿孔克服了微注射步骤，但这个策略仍然需要另外两个困难步骤：用于离体操作的合子的分离和将它们转移回到假孕雌性中。我们最近证实了通过进行合子的原位电穿孔，可以避开所有三个步骤。
为了简化生殖系基因组编辑，我们开发了一种被称为通过输卵管核酸递送的基因组编辑(GONAD)的方法，所述方法不需要合子的分离或它们用于微注射和随后向受体雌性转移的离体操作[10]。GONAD在带有E1.5(2-细胞阶段)胚胎的雌性妊娠小鼠上进行。将卵巢和输卵管通过背外侧位置处的切口手术暴露，并使用玻璃毛细移液管将基因组编辑试剂注射到输卵管腔内。在溶液注射后，立即使用镊子型电极对整个输卵管进行电穿孔。在电穿孔后，将卵巢和输卵管放回到它们的原始位置并将切口缝合。所述原位基因组编辑过的胚胎随后发育成型，并对后代的靶向突变进行基因分型。我们证实了可以以28％(7/25)的效率在某些胎鼠中的靶基因座处产生插入缺失突变[10]。在开发这种策略时，我们意识到所述方法可以通过系统性地测试各种不同参数而显著改进，使所述方法能够实现精确基因组编辑。需要实现的改进包括用于下述目的的方法：(1)小的点突变敲入和大的表达盒敲入(不仅仅是插入缺失)；(2)创始(G0)突变的生殖系传递；(3)镶嵌现象的减少，如果基因组编辑在2-细胞阶段及之后发生，所述镶嵌现象常常出现；(4)另外的可商购电穿孔仪的测试(在我们的初始研究中使用的型号不再可获得)；(5)确定GONAD程序后雌性的生育能力；和(6)确定所述GONAD方法是否可以使用AsCpf1这种第二常用的CRISPR家族核酸酶来工作。
在本研究中，我们做出了大量修改以改进GONAD。我们将所述新的方法称为改良GONAD(i-GONAD)，因为它提供了高得多的基因组编辑效率。我们证实了i-GONAD方法可用于产生具有包括大的缺失和敲入在内的遗传变化的生殖系修饰的G1后代。此外，我们证实了i-GONAD是鲁棒的，因此许多常用的电穿孔仪均可使用。这些特点使得i-GONAD可以被容易地改编以适应于所有实验室人员，包括不具有操作专用设备例如显微操作器所需的技巧的新手或学生。
结果
在第0.7天进行的GONAD
在我们关于GONAD方法的第一份报告中，实验在交配后～1.5至1.7天进行。在妊娠的这个阶段，胚胎处于2-细胞阶段。在这个阶段递送基因组编辑试剂产生高频率的镶嵌胚胎或胎鼠[10]。递送基因编辑组分的理想时间应该是对应于单细胞阶段的时间，因为它将减少遗传镶嵌现象。为了调查编辑组分递送的最早时间，我们在两个分开的时间点即第0.4天和第0.7天测试了GONAD。我们将1.0–1.5μl含有增强绿色荧光蛋白(eGFP)信使RNA(mRNA)(1μg/μl)和锥虫蓝的溶液注射到输卵管腔内(示意显示在图1A中)，然后使用BTX T820仪器在以前描述的条件下进行体内电穿孔[10]。在mRNA递送后两天，从处理的雌性分离8-细胞阶段的胚胎并观察eGFP荧光的存在。我们没有在0.4天时间点时处理的任何胚胎中观察到可感知的eGFP，而在0.7天时间点时处理的31个胚胎中的13个胚胎中观察到均匀的eGFP荧光(图1B)。在第0.4天时不成功的原因之一可能是在这个阶段卵丘细胞紧密包围合子(图1C，左)，并且这可能妨碍了核酸向合子的高效电泳递送。相反，在第0.7天时大多数合子应该没有浓密的卵丘细胞(图1C，右)，允许注射混合物接近所述合子。这些结果提示，交配后0.7天(～16h)将是进行GONAD的最佳时间。
通过改良GONAD方案产生Foxe3敲除品系
接下来，我们想知道所述GONAD方法是否可用于产生基因破坏的动物模型。我们选择Foxe3基因座用于基因靶向(图2A)，因为它的失活在小鼠中引起眼的异常发育和白内障[11,12]。使用Cas9 mRNA和靶向Foxe3基因的单一向导(sg)RNA在0.7-天的妊娠Jcl:MCH(ICR)雌性上进行GONAD。使用的电穿孔条件是8次50V的脉冲，波长度为5ms。8只GONAD处理过的雌性中的7只生产幼崽。从G0后代的耳分离的基因组DNA的测序证实36只G0幼崽中的11只(31％)在靶基因座中具有突变的等位基因(图2B和2C，表1)。值得注意的是，仍存在高频率的具有镶嵌等位基因的幼崽(82％[9/11])，并且仅在两只幼崽中不存在镶嵌现象(18％[2/11]；图2B中的G0-#26和-#32)。G0创始者的互交产生G1后代，其中一些表现出预期的白内障表型(图2D和2E)。从具有白内障的G1小鼠分离的基因组DNA的测序揭示出所述突变的等位基因的生殖系传递。合在一起，这些结果表明GONAD可用于产生基因破坏的小鼠模型。
表1.使用常规GONAD和i-GONAD方法产生Foxe3敲除小鼠
使用CRISPR RNA(crRNA)+反式激活crRNA(tracrRNA)+Cas9蛋白(ctRNP)复合物的更高的基因组编辑效率
现在变得越来越清楚，使用Cas9蛋白代替Cas9 mRNA[7,13,14]与crRNA+tracrRNA(双组分向导RNA)代替单一向导RNA(sgRNA)一起，产生更高的基因组编辑效率[13]。因此，我们检查了这些组分(crRNA+tracrRNA+Cas9蛋白：ctRNP)在GONAD介导的基因组编辑中的组合使用。作为实例，我们使用与以前的实验中相同的向导序列靶向Foxe3基因，区别在于使用退火的crRNA+tracrRNA代替sgRNA，并使用Cas9蛋白代替Cas9 mRNA。将ctRNP复合物的混合物在第0.7天注射到7只妊娠Jcl:MCH(ICR)雌性的输卵管腔内。使用与以前相同的电穿孔仪或使用CUY21Edit II电穿孔仪对输卵管进行体内电穿孔。在E13.5或E17.5分离胚胎。所有7只雌性都含有胎鼠(总共36只)。令人吃惊的是，几乎所有胎鼠都在Foxe3靶序列内具有插入缺失突变(35/36，97％)，这远高于使用Cas9 mRNA时的频率(31％，p<0.001)(表1；表2)。注意57％(20/35)的胎鼠表现出镶嵌现象。尽管这低于在使用Cas9 mRNA时获得的频率(82％)，但它不是统计显著的(p＝0.139)。这些结果表明，crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白(ctRNP)的组合使用提供了使用GONAD的最高基因组编辑效率。我们将这种基于RNP的GONAD称为改良GONAD(i-GONAD)。
表2.Foxe3基因编辑的效率。使用的CRISPR组分是Cas9 mRNA/sgRNA或Cas9蛋白/
CRISPR RNA(crRNA)/反式激活crRNA(tracrRNA)(详情参见表1)
使用i-GONAD产生基因校正的动物模型
接下来，我们想知道i-GONAD是否可用于制造小的遗传变化。我们选择酪氨酸酶(Tyr)基因的第103位密码子作为实例。在该位置处含有密码子TGT(半胱氨酸)的小鼠在外皮和眼中具有正常的色素沉着(被当作野生型表型，例如C3H/He品系小鼠)，并且具有TCT(丝氨酸)的小鼠由于酪氨酸酶活性降低将具有白化外皮颜色和透明眼的非色素沉着表型(被当作突变表型，例如Jcl:MCH(ICR)品系)[15]。我们设计了用于横跨所述点突变的区域的gRNA，并构建了对应于Tyr的野生型序列的单链寡聚物供体(ssODN)(图3A)，以将Jcl:MCH(ICR)品系中的突变表型(非色素沉着)挽救成野生型(色素沉着)表型。
在5只妊娠Jcl:MCH(ICR)雌性中进行i-GONAD。在孕期的不同阶段(从E14.5至E19.5)或生产后从这些雌性获得总共32个后代。这些样品中的15个(47％)表现出深色眼色素沉着(在胎鼠中)或刺鼠色外皮颜色(在新生幼崽中；图3B和3C)的预期表型。序列分析证实，在具有正常色素沉着表型的所有后代中，在靶位点处至少一个等位基因具有校正的序列(C到G)(图3D；表3)。
表3.使用i-GONAD方法通过ssODN敲入来校正Tyr突变
原始实验使用BTX T820电穿孔仪来进行，这种型号不再制造。因此，我们测试了两种更新的电穿孔仪NEPA21(Nepa Gene Co)和CUY21EDIT II(BEX Co)。使用NEPA21对6只雌性进行i-GONAD。这产生32个后代，其中16个(50％)显示出预期的遗传变化和眼色素沉着或外皮颜色的表型变化(表3；表4)。使用CUY21EDIT II电穿孔仪对两只雌性进行i-GONAD，并在E14.5时分析胎鼠。在获得的10只胎鼠中，5只(50％)显示出预期的遗传变化以及表型变化(眼色素沉着或外皮颜色)(表3；表4)。因此，从三种不同的电穿孔仪获得高度一致的基因组编辑效率(47％、50％和50％)(图6)，证实了i-GONAD的鲁棒性和可重复性。这些结果提示，通过ssODN修复供体的共同递送，i-GONAD可用于高效基因校正。
表4.使用i-GONAD方法的Tis21基因座的基因组编辑效率
在三个实验中发现，具有色素沉着表型的后代中的83％(30/36))在它们的第二个等位基因的靶区域附近具有插入缺失突变(图3D)。值得注意的是，79％(30/38)的据认为未修复的无色素沉着的后代具有插入缺失突变。将基因校正和插入缺失放在一起考虑，总共89％(66/74)的G0后代被基因组编辑(表3；表4)。这些结果进一步支持i-GONAD产生非常高的基因组编辑效率的结论。
将含有修复的等位基因的三只代表性创始小鼠(G0-#8：5％镶嵌，G0-#9：60％镶嵌，G0-#10：100％镶嵌[基于外皮颜色]；图3C)与Jcl:MCH(ICR)小鼠交配，以评估修复的等位基因的生殖系传递。尽管我们没有从G0-#8获得挽救的后代(0/43)，但从创始小鼠G0-#9和-#10获得了表现出刺鼠色外皮颜色的幼崽(#9[8/18]，#10[30/30])(图7A和表5)。
表5.生殖系传递率
i-GONAD和微注射方法之间基因组编辑效率的比较
我们将i-GONAD的基因组编辑效率与基于微注射的方法的效率进行比较。为了进行这项研究，我们使用了上文示出的i-GONAD数据集，并将它与分离的合子的微注射进行比较。将来自于35只超数排卵的Jcl:MCH(ICR)雌性的卵母细胞进行体外授精(IVF)，以产生用于微注射的合子。我们用CRISPR试剂注射339个这样的合子并培养它们。其中242个(71％)发展到2-细胞阶段，然后将它们转移到12只受体雌性(表6)。将所述雌性在E14.5或E15.5时安乐死。在取出的62只胎鼠中，32只(52％)具有色素沉着的眼。序列分析显示，具有色素沉着的眼的胎鼠在靶位点处具有校正的序列。将基因校正与插入缺失一起考虑，总共79％(49/62)的G0胎鼠被基因组编辑。将使用i-GONAD的基因组编辑与标准的基于微注射的技术直接比较，这些数据清楚地证实两种策略之间效率相当(p＝0.103)。在来自于微注射的基因组编辑的胎鼠中镶嵌现象(21/49，43％；表6)与i-GONAD方法(40/66，61％；表3)相比略微低些，但差异不是统计显著的(p＝0.059)。值得注意的是，当使用Jcl:MCH(ICR)品系时所述标准的基于微注射的方法需要约2.5倍多的动物：为了获得10个正确地基因组编辑的小鼠需要20只小鼠(11只雌性作为卵供体+1只雄性作为用于IVF的精子供体+4只假孕雌性+4只切除输精管的雄性)，而i-GONAD仅使用8只小鼠(4只胚胎供体与4只雄性种鼠交配)。
表6.通过CRISPR/Cas9组分的合子微注射来校正Tyr突变
使用i-GONAD产生大的基因组缺失动物模型
接下来我们想知道i-GONAD方法是否可通过靶向C57BL/6JJcl小鼠中刺鼠色基因座的第一内含子中存在的反转录转座子序列，用于产生具有大的基因组缺失的小鼠[16]。靶向横跨16.2kb的含有所述反转录转座子序列的基因组区域，以通过在所述反转录转座子插入位点侧翼制造两个切割进行缺失(图4A)。这个区域的缺失将导致外皮颜色从黑色变为刺鼠色小鼠(图4B)。为了帮助基因组末端的精确联结，我们提供了含有与所述两个被切割末端同源的短序列的ssODN供体。所述ssODN还包括在限制性片段长度多态性(RFLP)测定中使用的EcoRI位点。我们将含有Cas9蛋白、两种crRNA/tracrRNA和ssODN的溶液注射到8只E0.7妊娠C57BL/6JJcl雌性的输卵管腔内，并进行体内电穿孔。其中，只有4只雌性仍然妊娠，从它们通过剖腹产回收6只G0幼崽。所述幼崽的基因分型揭示，3只(50％)表现出它们的刺鼠色基因座中的大的缺失(G0-#3和-#5)和/或刺鼠色外皮颜色(G0-#4和-#5)(图4B-4D；表7)。值得注意的是，一只幼崽(G0-#3；1/6[17％])在靶位点处具有正确插入的ssODN，而显示出刺鼠色外皮颜色的另一只幼崽(G0-#5)不具有所述插入(图4D和4E)。聚合酶链反应(PCR)没有从所述G0-#4刺鼠色幼崽产生扩增子，表明一个或两个引物结合位点可能已被缺失。有趣的是，既没有在靶基因座处显示出大的缺失也没有刺鼠色外皮颜色的幼崽即G0-#6幼崽，在两个切割位点处具有插入缺失突变(表7；表8)。被基因组编辑(大的缺失和短的插入缺失合在一起)的个体幼崽的百分率为67％(4/6)(表8)。这些数据表明i-GONAD可以产生大的基因组缺失。
表7.使用i-GONAD方法通过消除反转录转座子序列来恢复刺鼠色基因表达
表8.刺鼠色基因编辑的效率(详情参见表7)
使用i-GONAD敲入长的ssDNA供体
我们以前证实了敲入长的DNA序列可以使用ssDNA供体来高效实现[17,18,19]。我们想知道长的ssDNA供体是否可以与i-GONAD一起使用以产生敲入等位基因。选择Pitx3和Tis21基因用于这些敲入实验，以便产生含有T2A-mCitrine融合表达盒的报告物模型。参见图5A-5D和图8A-8D；表9。
表9.使用i-GONAD方法的Tis21基因座的基因组编辑效率
我们将783-bp T2A-mCitrine表达盒插入到Pitx3基因的终止密码子的直接上游(图5A)。使用以前描述的体外转录和反转录(ivTRT)方法制备ssDNA供体[17]。Cas9蛋白(1mg/ml)和crRNA/tracrRNA(30μM)的浓度与以前实验中使用的相同。在i-GONAD程序中ssDNA供体以1.3或1.4μg/μl的浓度使用。G0胎鼠在E12.5时剖出，并在解剖显微镜下观察荧光。一些胎鼠的晶状体表现出荧光(图5B)，表明了融合表达盒的正确插入。这个观察与以前产生的敲入模型相似[20]。所述表达盒在靶位点处的正确插入通过靶区域的PCR扩增和测序来确认(图5C)，其揭示出15％(5/34)的样品含有所述敲入表达盒(图5D和表10)。值得注意的是，这5个样品的其他等位基因含有插入缺失突变。此外，不含T2A-mCitrine表达盒的插入的16只胎鼠含有插入缺失突变(表10；表11)。合在一起，已被基因组编辑(敲入和/或插入缺失突变)的G0个体的百分率为62％(21/34)(表10)。在不含靶插入等位基因的胎鼠中没有检测到随机插入。
表10：通过i-GONAD方法进行的Pitx3基因座的基因组编辑效率
表11.使用i-GONAD和作为供体的ssDNA产生报告基因敲入小鼠
*包括含有插入缺失突变、完整的敲入表达盒和部分敲入的胎鼠。
各种不同小鼠品系中的i-GONAD
接下来，我们评估了i-GONAD在某些近交和杂交小鼠品系中以及在其他基因座处的性能(表12)。进行i-GONAD以将插入缺失突变引入到C3H/HeSlc、C57BL/6NCrSlc、DBA/2CrSlc、B6D2F1/Slc以及B6D2F1/Slc与C57BL/6NCrSlc的杂交品系的Tyr基因中(图9A-9C)。我们还将插入缺失靶向到C3H/HeSlc和C57BL/6NCrSlc品系中的Kit基因中(图10A-10C)。我们通过ssODN将小的遗传变化插入到C57BL/6NCrl品系的Cdkn1a和Cdkn2a中(图11A-11B)以及BALB/cAJcl品系中的Tyr中。结果显示，i-GONAD在测试的所有基因座处和所有小鼠品系中产生基因组编辑，除了靶向C57BL/6NCrSlc小鼠中的Tyr基因座之外。这个结果可能是由于在我们的C57BL/6NCrSlc群体中获得妊娠雌性的困难性。在近交品系雌性中总体妊娠率较低。与远交品系不同，近交品系的许多通过阴道塞的存在确认交配的动物不含植入的胚胎。合在一起，这些结果表明i-GONAD可用于许多小鼠品系中，尽管它的成功率是品系依赖性的，并且对于某些近交品系来说可能需要进一步优化。
表12
使用AsCpf1核酸酶的i-GONAD
最近，已增添源自于氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)的Cpf1(AsCpf1)作为基因组编辑工具[22,23]。我们想知道AsCpf1蛋白是否可用于i-GONAD中，这通过将6.3μM AsCpf1蛋白与30μM靶向Hprt基因座的crRNA一起注射到5只妊娠Jcl:MCH(ICR)小鼠的输卵管腔内来进行。在E13.5时分离总共40个胚胎，并通过PCR和测序来分析插入缺失的存在或不存在。来自于一只胎鼠的DNA不产生PCR扩增子，可能是由于引物结合位点的缺失，并且来自于25只胎鼠的DNA含有插入缺失突变。结果显示，在使用AsCpf1的i-GONAD后回收的G0后代中65％(26/40)被基因组编辑，并且约65％的这些样品(17/26)是镶嵌的(表13)。
表13.使用i-GONAD和AsCpf1编辑Hprt基因座
我们还使用AsCpf1校正了Tyr基因中的G308C突变。为跨过所述点突变的区域设计了crRNA，并使用与为Cas9介导的靶向所描述的Tyr修复实验中使用的相同的ssODN(图12A)。对4只妊娠Jcl:MCH(ICR)雌性进行了i-GONAD。在E13.5时收获了总共19只胎鼠。这些样品中的11个(58％)表现出指示修复的眼色素沉着(图12B和表14，表15)。序列分析证实，在色素沉着的胎鼠中靶位点处的至少一个等位基因具有校正的序列(C至G)(图12C)，并且某些胎鼠具有插入缺失突变。当将基因校正和插入缺失相组合时，总共74％(14/19)的G0胎鼠被基因组编辑，并且镶嵌频率为36％(5/14)(图12A-12C)。这些研究表明当用AsCpf1核酸酶代替Cas9时i-GONAD可以产生高的基因组编辑效率(至少在检查的两个基因座中)。
表14.Tyr基因编辑的效率
表15.使用i-GONAD和AsCpf1来校正Tyr突变
用于i-GONAD的动物保留生殖功能
不同于其中将雌性胚胎供体处死以分离合子的传统的基因组编辑方法，i-GONAD方法不需要供体雌性的安乐死。因此，我们想知道经历i-GONAD的雌性小鼠是否保留它们的生殖功能。将三只经历i-GONAD并生产基因组编辑的幼崽的雌性小鼠(表3中的小鼠-#3、-#5和-#11)与有生育力的雄性小鼠自然交配。它们中的两只(67％；小鼠-#3和-#11)妊娠并分别成功产下9和12只幼崽(图13和表16)。这些数据表明在这些小鼠中输卵管保留正常功能，允许受精和随后受精卵向子宫的输卵管运输。
表16.所有三只使用i-GONAD的雌性的同窝仔畜数量
| 用于i-GONAD的雌性小鼠 | 产下的幼崽数目 |
| #3 | 9 |
| #5 | 0 |
| #11 | 12 |
讨论
i-GONAD的开发
我们以前证实了被称为GONAD的基因组编辑方法的原理验证[10]。GONAD可以在合子上原位进行，因此避开了分离合子、它们的离体操作和随后将它们转移到受体雌性的步骤，即已被开发并实践超过三十年的动物基因组编辑的步骤。在本研究中，我们对GONAD方法做出了几项改进，使其高度适用于基因组编辑的动物模型的日常产生。首先，我们评估了妊娠的最佳时间，并显示出第0.7天适合于GONAD，这促进了将溶液引入到壶腹部中。其次，在被称为i-GONAD的方法中用Cas9蛋白代替Cas9 mRNA并用合成的组分(例如crRNA+tracrRNA)代替体外转录的sgRNA，将基因组编辑的效率提高到高达基于微注射的方法的水平。第三，i-GONAD可用于产生大的缺失、点突变和大的表达盒敲入模型。第四，i-GONAD在许多小鼠品系中发挥作用。第五，用于i-GONAD的雌性保留功能完整的生殖能力。第六，AsCpf1核酸酶也可用于i-GONAD方法中。最后，我们发现i-GONAD可以使用不同类型的可商购电穿孔仪来进行。由于电穿孔仪花费的时间比微注射设置少10倍并且不需要特长人员，因此i-GONAD方法可以被缺少一者或两者的许多实验室容易地改编。
i-GONAD程序的时间安排的评估
已显示在第0.7天(对应于单细胞阶段晚期)进行的GONAD对基因组编辑来说是有效的。在这个阶段进行GONAD具有几个优点。首先，E0.7合子被更少的卵丘细胞包围(图1C)，因此可以更容易地接近以递送基因组编辑组分(CRISPR相关的核酸/蛋白质)。我们观察到我们在第0.4天的实验不引发组分通过电穿孔的有效递送，可能是因为在这个阶段合子被一群卵丘细胞包围。其次，第0.7天的输卵管在许多情况下具有明显可见的壶腹部，这促进了在解剖显微镜下微量移液管辅助的溶液引入。第三，与我们以前报告的在第1.5天进行的GONAD程序相比，在第0.7天引入的溶液的量可以减少到每个输卵管1.0–1.5μl，这节省了试剂[10,24]。第四，我们推测与第0.5天相比由于E0.7合子位于输卵管壶腹部内的更加紧凑的空间中，因此基因组编辑组分可以更有效地到达合子。
尽管我们预期在第0.7天使用GONAD出现更少的镶嵌现象，但镶嵌现象仍被观察到，特别是在使用Cas9 mRNA/sgRNA时(>82％)。当使用ctRNP时，镶嵌现象的水平相当大地降低(～36–65％)。通过在甚至更早的阶段(受精后～5h)递送CRISPR组分，有可能实现非常低的镶嵌现象或没有镶嵌现象[4]。然而，出于两个原因在这个阶段进行GONAD将是相当困难的：(1)在实验时间安排上存在挑战；对于自然交配的小鼠来说受精后5h通常在极早的清晨；并且(2)在这个妊娠的早期阶段时卵被卵丘细胞复合物紧密覆盖，这可以阻止试剂向合子的有效递送。然而，镶嵌现象不必然是主要限制，因为大多数基因组编辑的创始小鼠将靶向的等位基因传递到它们的后代。
不同类型的CRISPR试剂的评估
来自于基于合子注射和离体电穿孔的基因组编辑的积累数据显示，与使用mRNA/sgRNA获得的效率相比RNP引起优异的基因组编辑效率[7,13]。在本研究中，我们还发现RNP组分引起最高～97％的基因组编辑效率，而使用sgRNA/Cas9 mRNA组分达到的效率最高仅为31％(图2f)。RNP平台的另一个优点在于所有组分可以商业制造，这将减少由在各个实验室中制备的试剂所引起的变差。商业化RNA试剂对于RNA组分来说可以以冷冻干燥形式接收，并且Cas9蛋白可以以高浓度购买。这些特点允许以任何所需的浓度制备电穿孔混合物。对于GONAD来说，在电穿孔混合物中所需的试剂浓度通常远高于用于直接合子注射的混合物。在某些雌性中100％的合子被基因组编辑这一事实表明，注射的电穿孔混合物在电穿孔时成功地包围输卵管中的所有合子。
i-GONAD和Easi-CRISPR
在i-GONAD处理的样品中ssODN供体的敲入效率为49％(图3E)。通过使用基因座和遗传修饰的相同组合，我们将该效率与微注射基因组编辑方法进行了直接比较，并且效率为52％(表6)。i-GONAD所需的动物数目比基于微注射的方法所需的数目少2.5倍。i-GONAD的限制之一在于它需要比微注射更高的试剂浓度。尽管我们的数据表明i-GONAD的效率与微注射的效率相当，但必须测试更多的基因座和品系来评估这两种方法的可比效率。
正如上文讨论的，i-GONAD是一种产生基因组编辑的动物的简单方便的方法。我们通过使用Jcl:MCH(ICR)品系(生育力最强的小鼠品系之一，其产生大量同窝仔畜)优化了i-GONAD程序的各种不同参数。我们还证实了，通过i-GONAD的基因组编辑在各种不同的小鼠品系中发挥作用，尽管它的效率仍然是品系依赖性的，并且在某些近交品系中胎鼠/幼崽的回收率较低(特别是在C57BL/6中)，可能是由于这些品系中不良的生育力和/或较少的同窝仔畜数量。因此，对于某些近交品系来说可能需要参数的进一步优化。值得注意的是，我们最近使用i-GONAD产生了基因编辑的大鼠(Matsuyama等：通过rGONAD方法成功生产基因组编辑的大鼠(Successful production of genome-edited rats by the rGONAD method)，准备中；Takabayashi等：使用通过输卵管核酸递送的改良基因组编辑(i-GONAD)对大鼠植入前胚胎进行的成功原位基因组编辑(Successful in situ genome editing of ratpreimplantation embryos using the improved genome-editing via oviductalnucleic acids delivery(i-GONAD))，准备中)，这表明这里描述的实验条件可以充当将所述方法应用于其他哺乳动物的起点。
我们还使用i-GONAD成功地将长的ssDNA供体片段插入到靶基因座中。使用在我们的高效敲入方法“Easi-CRISPR”中使用的ivTRT方法来制备长的ssDNA供体[17,18,19]。由于i-GONAD需要大量的ssDNA，因此我们使用了基于离心柱的核酸纯化代替样品回收率不佳的凝胶纯化。由于微注射方法不需要高浓度，因此凝胶纯化通常用于合子微注射实验[17]。柱纯化的ssDNA(922–925个碱基)在琼脂糖凝胶电泳后表现出单一条带，并且它在用作i-GONAD供体时产生敲入小鼠(图5A-5D)。柱纯化的长ssDNA也可作为供体用于产生floxed小鼠(即，使用Easi-CRISPR获得的在基因的基因座两侧带有loxP的小鼠)。不同于ssODN敲入，使用i-GONAD方法插入长的供体片段的效率(最高15％)与微注射的效率(25～67％)相比更低[18]。然而，就使用的动物的数目而言，i-GONAD可能优于微注射，因为不同于合子微注射，不需要切除输精管的雄性的维持和假孕雌性的产生。因此，i-GONAD可作为合子微注射的替选方案用于产生敲入等位基因。
i-GONAD的优点和应用
几个研究组已证实，可以通过合子的体外电穿孔产生基因组编辑的啮齿动物[4,5,6,7,8,9]。GONAD方法超越了这种方法一步，因为它将基因组编辑核酸和CRISPR组分原位直接递送到胚胎中。GONAD方法与基于体外电穿孔的基因组编辑方法相比提供了甚至更多优点。它们是：(1)GONAD不需要胚胎的离体操作；(2)它不需要分离的胚胎的离体培养；(3)它不需要假孕雌性小鼠用于离体处理的胚胎的植入；(4)它不需要切除输精管的雄性来产生假孕雌性(这在辅助生殖技术例如合子的离体操作方法和/或制备代孕母亲的方法尚不完善的物种中特别有利)；和(5)GONAD处理的雌性不必被处死以分离合子。另一个非常重要的优点在于所述GONAD处理的雌性保留生殖功能，并且在从GONAD程序生产幼崽后可以再次妊娠，表明雌性可以重新用于第二个GONAD程序。这在例如(1)用于GONAD实验的动物有价值，和(2)在新开发的遗传工程小鼠株系中可以立即进行另一个遗传操作时是非常重要的特点。这避免了在使用微注射或离体电穿孔方法时发生的扩增所述株系以产生数百个合子用于执行第二个遗传改变的繁琐要求。
我们显示，分别通过校正Tyr基因中的点突变和消除刺鼠色基因中的反转录转座子序列，i-GONAD可用于在白化小鼠(Jcl:MCH(ICR)和BALB/cAJcl品系)和黑色小鼠(C57BL/6JJcl品系)中挽救色素沉着缺陷。这类遗传变化在许多人类遗传疾病中是相当常见的[25,26]，并且我们的策略可以应用于人类生殖系基因疗法，以校正引起疾病的突变。长序列的插入在基于有功能基因的添加的基因疗法策略中也是有用的[27]。考虑到人类生殖系基因疗法通常与胚胎的离体操作(包括可能引起基因表达的表观遗传变化和影响胎儿发育的体外细胞培养步骤)相偶联[28,29]，不需离体操作或GONAD处理的雌性的处死的i-GONAD为将来人类生殖系基因疗法提供了非常有希望的方法。
结论
动物基因组工程实验包括三个重要但关键的步骤：从处死的雌性分离合子，它们的离体显微操作，然后将处理过的合子转移到另一组雌性中。在过去四十年中，这些步骤大体上保持不变。在这里，我们描述了一种被称为i-GONAD的新的编辑方法，并且显示常用的小鼠模型可以在不使用这些复杂且关键的步骤的情况下日常地产生。i-GONAD提供了大量以前不可能的机会。首先，i-GONAD不需要高度精密复杂的设备或专业技能。这个特点与传统方法有很大不同，传统方法无法在专门实验室之外执行。即使是学生或新手技术员也可以进行i-GONAD。其次，i-GONAD仅仅使用常规方法所需的40％或更少的动物。第三，在当前使用的方法中使用的雌性不可避免地被安乐死，而用于i-GONAD的雌性可以重新使用；因此，可以在不失去雌性的情况下进行基因组编辑的动物的产生。后面这两点从动物福利的观点来看提供了显著益处。第四，在本研究中建立的i-GONAD方法可以被容易地改编以适应于在其他哺乳动物例如大鼠、其他啮齿动物、灵长动物和大型动物中的基因组编辑。所述方法对于不可因合子收集而被处死的稀有和有价值的动物和/或合子的离体操作尚未建立的动物来说是特别强有力的。最后，i-GONAD处理的雌性完全保留生殖功能；因此，所述方法有很大希望作为用于生殖系基因校正的体内基因疗法工具。
方法
CRISPR试剂
使用CRISPR.mit.edu或CHOPCHOP来设计CRISPR向导RNA(表17)。用于Foxe3的sgRNA如以前所述[10]，使用引物组(M1055/M939)和作为模板的pUC57-sgRNA载体(Addgene质粒编号：#51132)来合成。eGFP和Cas9的mRNA如以前所述被体外转录[10,24]。合成的crRNA和tracrRNA作为Alt-RTM CRISPR向导RNA从Integrated DNA Technologies(IDT),Skokie,IL,USA商业化获得，或者与Cas9蛋白(Alt-RTM S.p.CAS9核酸酶3NLS)一起从FASMAC,Kanagawa,Japan购买。ssODN供体从IDT定制合成(Ultramer：用于Tyr挽救实验[Tyr-挽救]和刺鼠色基因挽救实验[刺鼠色-挽救])，或者从Eurofins Genomics,Louisville,KY,USA合成(用于将ssODN敲入到Cdkn1a和Cdkn2a基因中)。长ssDNA供体(用于Pitx3和Tis21报告物)从双链DNA(dsDNA)模板，使用以前描述的ivTRT方法[17]并进行略微修改来制备。T2A-mCitrine表达盒从原始载体(pP200)使用引物组(对于Pitx3来说M1051/M1052，对于Tis21来说M1053/M1054)来扩增，并插入到pUC119的SmaI位点中，产生pP206(对于Pitx3来说)和pP209(对于Tis21来说)。用于RNA合成的模板从这些载体使用引物组(对于Pitx3来说PP226/M272，对于Tis21来说PP227/M272)来扩增，并且使用T7 RiboMax Express大规模RNA生产系统(Promega,Madison,WI,USA)来合成RNA。使用MEGAclear试剂盒(Ambion)纯化RNA，并且使用SuperScript III反转录酶(用于Pitx3)或SuperScript IV反转录酶(用于Tis21；Life Technologies)，对于Pitx3来说使用引物PP226并且对于Tis21来说使用引物PP227来产生cDNA。为了获得足够高浓度的最终ssDNA，如纯化用于微注射的cDNA所做的最后的凝胶提取步骤被排除。相反，进行使用NucleoSpin凝胶和PCR清理试剂盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany)的基于离心柱的核酸纯化。在乙醇沉淀后，将DNA沉淀物溶解在EmbryoMax注射缓冲液(Millipore)中。引物和ssODN的序列示出在表18中。
表17.CRISPR靶序列和使用的gRNA的类型
| 靶基因座 | 靶序列(5′-3′) | PAM | 使用的gRNA的类型 |
| Foxe3 | GAGACAGCCGGGCTTCGCGC | CGG | crRNA/tracrRNA or sgRNA |
| Tyr(ICR) | GGAAACTCTAAGTTTGGATT | TGG | crRNA/tracrRNA |
| 刺鼠色(1) | AATGGACATTTAGTCGAACT | GGG | crRNA/tracrRNA |
| 刺鼠色(2) | AGGGTTTAACCACCTATCGA | AGG | crRNA/tracrRNA |
| Pitx3 | CGGTGTGAGCCGCAGGTCTG | TGG | crRNA/tracrRNA |
| Tis21 | GGCTCCTATCTAGCTGGAGA | CGG | crRNA/tracrRNA |
| Tyr(野生型) | AACTTCATGGGTTTCAACTG | CGG | crRNA/tracrRNA |
| Kit | CTGTTCACGCCGCTGCTCAT | TGG | crRNA/tracrRNA |
| p21(Cdkn1a) | TGATTGCGATGCGCTCATGG | CGG | crRNA/tracrRNA |
| p16/p19(Cdkn2a) | CGGTGCAGATTCGAACTGCG | AGG | crRNA/tracrRNA |
*表17中的序列分别为SEQ ID NO：21-30。
表18.在本研究中使用的寡核苷酸的序列
*同源性区域带有下划线。表18中的序列分别为SEQ ID NO：31-67。
动物
小鼠在东海大学医学院(Tokai University School of Medicine)、滨松大学医学院(Hamamatsu University School of Medicine)或茂井医学研究所(Shigei MedicalResearch Institute)的动物设施处维持。成年Jcl:MCH(ICR)(最初源自于Jcl:ICR品系的杂交品系：http://www.clea-japan.com/en/animals/animal_g/g_01.html)、C57BL/6JJcl(近交品系)和BALB/cAJcl(近交品系)小鼠从CLEA Japan,Inc.(Tokyo,Japan)获得；C3H/HeSlc(近交品系)、C57BL/6NCrSlc(近交品系)、DBA/2CrSlc(近交品系)和B6D2F1/Slc(杂交品系)小鼠从Japan SLC,Inc.(Shizuoka,Japan)获得；C57BL/6NCrl(近交品系)小鼠从Charles River Laboratories Japan,Inc.(Yokohama,Japan)获得。所有动物实验均按照学术管理指南进行，并得到动物护理和使用学术委员会(Institutional Animal Care andUse Committee)的批准(在东海大学许可号为#154014、#165009、#171003，在滨松大学许可号为#2017062，在茂井医学研究所许可号为#17008)。
CRISPR电穿孔溶液的制备
所述溶液含有体外合成的sgRNA(或商业化获得的crRNA/tracrRNA混合物)和商业化获得的Cas9蛋白。当供体DNA被包含在电穿孔溶液中时，它们是商业化合成的ssODN或ivTRT合成的长ssDNA。Cas9 mRNA/sgRNA混合物如我们以前所描述的来制备[10]。只在使用eGFP mRNA或者Cas9作为mRNA供应时，我们使用0.05％锥虫蓝(Nacalai Tesque Inc.,Kyoto,Japan)作为成功注射的标志物。将冷冻干燥的ssODN重悬浮在无核酸酶的水中至浓度为10μg/μl。冷冻干燥的crRNA和tracrRNA首先被重悬浮在无RNA酶的Duplex缓冲液中至浓度为200μM。将等体积的crRNA和tracrRNA合并在1.5-ml管中，在热循环仪中加热到94℃2min，然后在室温放置约10min。将退火的crRNA和tracrRNA与Cas9蛋白和/或ssODN/ssDNA混合，使得组分的终浓度为30μM(对于crRNA/tracrRNA来说)、1mg/ml(对于Cas9蛋白来说)、1或2μg/μl(对于ssODN来说)和0.85～1.4μg/μl(对于ssDNA来说)。AsCpf1 crRNA(MmHPRT-273-S：5’-GTGCCCTCTTCTGGCCTGCCA-3′)(SEQ ID NO：69)由IDT善意馈赠。将冷冻干燥的crRNA首先重悬浮在无RNA酶的水中至浓度为100μM，然后在热循环仪中加热至95℃5min，并在室温放置约10min。将AsCpf1蛋白(IDT)与crRNA混合，使得组分的终浓度为30μM(对于crRNA来说)和6.3μM(对于AsCpf1蛋白来说)。所述电穿孔溶液有时用Opti-MEM(ThermoFisher Scientific)稀释，以将体积调整到1.5μl/输卵管。
GONAD程序
除了C57BL/6JJcl品系之外，用于所述程序的雌性不是超数排卵的。对于除了C57BL/6JJcl之外的所有品系来说，将发情期中的雌性与雄性种鼠交配。交配设定在16:00–17:00，并在第二天早晨(9:00–10:00)通过目测检查来确认阴道塞。我们根据《小鼠胚胎的操作实验指南》(Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual)[30]将孕期的第0天指定为0:00时(午夜)，并且具有阴道塞的雌性在10:00时被指定为孕期的第0.4天，在16:00时被指定为孕期的第0.7天，在这些时间将它们用于电穿孔实验。
在妊娠的第0.7天时(对应于单细胞阶段晚期的合子，在阴道塞被确认的当天的16:00时)，在使用解剖显微镜(SZ11；Olympus,Tokyo,Japan)的观察下在麻醉的雌性上，如以前所描述[10,24]并做出轻微修改来进行手术程序。在背部皮肤处制造切口后将卵巢/输卵管/子宫暴露。使用微量移液管将大约1.0–1.5μl电穿孔溶液(在37℃预加温10min)从壶腹部上游注射到输卵管腔内。所述微量移液管装置由玻璃毛细针头(使用P-97/IVF电动牵拉器拉出；Sutter Instrument Co.,Novato,CA,USA)和附连到所述针头的吸嘴构成。在溶液注射后，立即将输卵管区用一张在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中浸泡的湿纸巾(Kimwipe；Jujo-Kimberly Co.Ltd.,Tokyo,Japan)覆盖，然后夹在钳型电极中(对于T820和NEPA21来说CUY652–3[NEPA GENE Co.Ltd.,Ichikawa,Chiba,Japan]，对于CUY21EDIT II来说LF650P3[BEX Co.Ltd.,Tokyo,Japan])。使用方波脉冲发生器T820(BTX GenetronicsInc.)或NEPA21(NEPA GENE)或CUY21EDIT II(BEX)来进行电穿孔。电穿孔参数如下：对于T820来说，8个方波脉冲，脉冲持续时间为5ms，脉冲间隔时间为1s，电场强度为50V；对于NEPA21来说，穿孔脉冲：50V，5-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，10％衰减(±脉冲方向)，以及转移脉冲：10V，50-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，40％衰减(±脉冲方向)；并且对于CUY21EDIT II来说，方波(mA)，(+/-)，Pd V：60V或80V，Pd A：200mA，Pd开：5.00ms，Pd关：50ms，Pd N：3，衰减：10％，衰减类型：对数。在电穿孔后，将输卵管放回到它们的原始位置并将切口缝合。监测所述动物的麻醉恢复并将其饲养，用于进一步分析。
微注射
将CRISPR组分混合在EmbryoMax注射缓冲液中。Cas9蛋白、crRNA/tracrRNA和ssODN(对于Tyr挽救来说)的终浓度分别为50ng/μl、0.61μM和10ng/μl。将从超数排卵的雌性小鼠(Jcl:MCH(ICR))分离的未授精的卵母细胞，用从Jcl:MCH(ICR)雄性小鼠新鲜分离的精子进行体外授精(IVF)。所述混合物的微注射在体外授精的卵的原核中进行。将注射过的胚胎转移到假孕Jcl:MCH(ICR)雌性的输卵管中以允许进一步发育。回收得到的胎鼠(第13.5或15.5天)并进行基因分型分析。
mCitrine荧光的观察
使用带有用于GFP的滤光片的荧光立体显微镜(Olympus SZX7，带有SZX-MGFPA)观察回收的胎鼠，以检测mCitrine荧光。
CRISPR/Cas9诱导的突变和插入的分析
从孕期中期胎鼠的四肢或活小鼠的耳，使用All-In-One小鼠尾裂解缓冲液(ABP-PP-MT01500；Kurabo,Osaka,Japan)通过在55℃温育3h或过夜，随后在85℃失活45min来分离基因组DNA。用于扩增靶基因座Foxe3、Tyr、刺鼠色和Hprt的PCR在含有5μl的2×GC缓冲液I、0.2mM脱氧核苷酸(dNTP)、1μl粗裂解物、引物对(表18)和0.125U TaKaRa r-Taq(TaKaRa)的总共10μl溶液中，使用变性(95℃5min)，35个循环的95℃45s、58℃30s和72℃1min，以及延伸(72℃5min)来进行。为了扩增靶基因座Pitx3和Tis21，使用PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa)，在含有2μl的5×PrimeSTAR缓冲液I、0.2mM dNTP、1μl粗裂解物、引物对(附加文件1：表S9)和0.25U PrimeSTAR HS DNA聚合酶的总共10μl溶液中，使用变性(94℃3min)，35个循环的98℃10s、62℃或64℃5s和72℃2min，以及延伸(72℃10min)来进行PCR扩增。使用PCR产物和列于表18中的引物来进行直接测序。
等位基因的镶嵌现象通过观察Sanger测序结果的电泳图来评估。镶嵌现象基于下述判据来评估：(1)存在由超过三个峰(或在雄性小鼠的Hprt基因中两个峰)构成的多个峰，和(2)两个重叠峰中的一者明显低于或高于另一者。性别的确定使用引物组Sry-F2和Sry-R2(表18)使用PCR来进行[31]。
参考文献
1.Harms DW,Quadros RM,Seruggia D,Ohtsuka M,Takahashi G,Montoliu L等，使用CRISPR/Cas系统的小鼠基因组编辑(Mouse genome editing using the CRISPR/Cassystem)，Curr Protoc Hum Genet.2014；83:15.7.1–15.7.27。
2.Wang H,Yang H,Shivalila CS,Dawlaty MM,Cheng AW,Zhang F等，通过CRISPR/Cas介导的基因组工程一步产生在多个基因中带有突变的小鼠(One-stepgeneration of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering)，Cell.2013；153:910–8。
3.Gurumurthy CB,Grati M,Ohtsuka M,Schilit SLP,Quadros RM,Liu XZ，CRISPR：用于正向和反向遗传学研究两者的多用途工具(CRISPR:a versatile tool forboth forward and reverse genetics research)，Hum Genet.2016；135:971–6。
4.Hashimoto M,Yamashita Y,Takemoto T，将Cas9蛋白/sgRNA电穿孔到早期原核合子中在小鼠中产生非镶嵌突变体(Electroporation of Cas9 protein/sgRNA intoearly pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse)，DevBiol.2016；418:1–9。
5.Kaneko T,Mashimo T，通过电穿孔进行的啮齿动物完整胚胎的简单的基因组编辑(Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation)，PLoSOne.2015；10:e0142755。
6.Kaneko T,Sakuma T,Yamamoto T,Mashimo T，通过将工程化的内切核酸酶电穿孔到完整大鼠胚胎中进行的简单的敲除(Simple knockout by electroporation ofengineered endonucleases into intact rat embryos)，Sci Rep.2014；4:6382。
7.Chen S,Lee B,Lee AYF,Modzelewski AJ,He L，通过合子的CRISPR核糖核蛋白电穿孔进行的高效小鼠基因组编辑(Highly efficient mouse genome editing byCRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes)，J Biol Chem.2016；291:14457–67。
8.Hashimoto M,Takemoto T，电穿孔能够将mRNA高效递送到小鼠合子中并促进基于CRISPR/Cas9的基因组编辑(Electroporation enables the efficient mRNA deliveryinto the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing)，SciRep.2015；5:11315。
9.Qin W,Dion SL,Kutny PM,Zhang Y,Cheng AW,Jillette NL等，通过核酸酶的合子电穿孔在小鼠中进行的高效的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑(Efficient CRISPR/Cas9-mediated genome editing in mice by zygote electroporation of nuclease)，Genetics.2015；200:423–30。
10.Takahashi G,Gurumurthy CB,Wada K,Miura H,Sato M,Ohtsuka M，GONAD：通过输卵管核酸递送系统的基因组编辑：小鼠中的一种新的不依赖于微注射的基因组工程方法(GONAD:Genome-editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery system:a novelmicroinjection independent genome engineering method in mice)，Sci Rep.2015；5:11406。
11.Wada K,Maeda YY,Watanabe K,Oshio T,Ueda T,Takahashi G等，Foxe3的顺式元件中的缺失在rct小鼠中引起白内障和小眼畸形(A deletion in a cis element ofFoxe3 causes cataracts and microphthalmia in rct mice)，Mamm Genome.2011；22:693–702。
12.Medina-Martinez O,Brownell I,Amaya-Manzanares F,Hu Q,Behringer RR,Jamrich M，在Foxe3裸小鼠中晶状体细胞的增殖和分化中的严重缺陷(Severe defects inproliferation and differentiation of lens cells in Foxe3 null mice)，Mol CellBiol.2005；25:8854–63。
13.Aida T,Chiyo K,Usami T,Ishikubo H,Imahashi R,Wada Y等，无克隆CRISPR/Cas系统促进有功能的表达盒在小鼠中的敲入(Cloning-free CRISPR/Cas systemfacilitates functional cassette knock-in in mice)，Genome Biol.2015；16:87。
14.Jacobi AM,Rettig GR,Turk R,Collingwood MA,Zeiner SA,Quadros RM等，用于高效基因组编辑的简化的CRISPR工具和用于它们在哺乳动物细胞和小鼠合子中的递送的流畅方案(Simplified CRISPR tools for efficient genome editing andstreamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mousezygotes)，Methods.2017；121–2:16–28。
15.Yokoyama T,Silversides DW,Waymire KG,Kwon BS,Takeuchi T,OverbeekPA，酪氨酸酶中半胱氨酸向丝氨酸的保守突变负责实验室小鼠中的经典白化突变(Conserved cysteine to serine mutation in tyrosinase is responsible for theclassical albino mutation in laboratory mice)，Nucleic Acids Res.1990；18:7293–8。
16.Pettitt SJ,Liang Q,Rairdan XY,Moran JL,Prosser HM,Beier DR等，用于小鼠遗传资源的刺鼠色C57BL/6N胚胎干细胞(Agouti C57BL/6N embryonic stem cellsfor mouse genetic resources)，Nat Methods.2009；6:493–5。
17.Miura H,Gurumurthy CB,Sato T,Sato M,Ohtsuka M，使用较长单链DNA通过人工microRNA的内含子插入进行的敲除小鼠的基于CRISPR/Cas9的产生(CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificialmicroRNA using longer single-stranded DNA)，Sci Rep.2015；5:12799。
18.Quadros RM,Miura H,Harms DW,Akatsuka H,Sato T,Aida T等，Easi-CRISPR：一种使用长ssDNA供体和CRISPR核糖核蛋白的用于带有条件性和插入等位基因的小鼠的一步产生的鲁棒方法(Easi-CRISPR:a robust method for one-step generationof mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donorsand CRISPR ribonucleoproteins)，Genome Biol.2017；18:92。
19.Miura H,Quadros RM,Gurumurthy CB,Ohtsuka M，使用长ssDNA供体用于产生敲入和条件性敲除小鼠模型的Easi-CRISPR(Easi-CRISPR for creating knock-in andconditional knockout mouse models using long ssDNA donors)，Nat Protoc.2018；13:195–215。
20.Grealish S,
ME,Li M,Kirik D,
A,Thompson LH，腹侧中脑移植物中的A9多巴胺神经元组分是帕金森氏病的大鼠模型中运动功能恢复的重要决定因素(The A9 dopamine neuron component in grafts of ventral mesencephalon is animportant determinant for recovery of motor function in a rat model ofParkinson’s disease)，Brain.2010；133:482–95。
21.Haubensak W,Attardo A,Denk W,Huttner WB，神经元出现在早期哺乳动物端脑的基底神经上皮中：神经发生的主要部位(Neurons arise in the basalneuroepithelium of the early mammalian telencephalon:a major site ofneurogenesis)，Proc Natl Acad Sci.2004；101:3196–201。
22.Zetsche B,Gootenberg JS,Abudayyeh OO,Slaymaker IM,Makarova KS,Essletzbichler P等，Cpf1是2类CRISPR-Cas系统的单一RNA向导的内切核酸酶(Cpf1 is asingle RNA-guided endonuclease of a class 2CRISPR-Cas system)，Cell.2015；163:759–71。
23.Hur JK,Kim K,Been KW,Baek G,Ye S,Hur JW等，通过Cpf1核糖核蛋白的电穿孔在小鼠中进行的靶向诱变(Targeted mutagenesis in mice by electroporation ofCpf1 ribonucleoproteins)，Nat Biotechnol.2016；34:807–8。
24.Gurumurthy CB,Takahashi G,Wada K,Miura H,Sato M,Ohtsuka M，GONAD：一种不需胚胎的离体操作的新的CRISPR/Cas9基因组编辑方法(GONAD:a novel CRISPR/Cas9genome editing method that does not require ex vivo handling of embryos)，CurrProtoc Hum Genet 2016；88:15.8.1–15.8.12。
25.Hancks DC,Kazazian HH,Koning A,Gu W,Castoe T,Batzer M等，反转录转座子插入在人类疾病中的作用(Roles for retrotransposon insertions in humandisease)，Mob DNA.2016；7:9。
26.Yu H,Zhang VW，用于人类遗传病的连续表型扩增的精准药物(Precisionmedicine for continuing phenotype expansion of Human Genetic diseases)，BiomedRes Int.2015；2015:745043。
27.Abe H,Kamimura K,Kobayashi Y,Ohtsuka M,Miura H,Ohashi R等，在大鼠肝纤维化模型中通过基质金属蛋白酶-13的肝定向流体动力学基因递送有效预防肝纤维化(Effective prevention of liver fibrosis by liver-targeted hydrodynamic genedelivery of matrix metalloproteinase-13in a rat liver fibrosis model)，MolTher Nucleic Acids.2016；5:e276。
28.Khosla S,Dean W,Reik W,Feil R，植入前胚胎的培养及其对基因表达和表型的长期影响(Culture of preimplantation embryos and its long-term effects ongene expression and phenotype)，Hum Reprod Update.2001；7:419–27。
29.Dumoulin JC,Land JA,Van Montfoort AP,Nelissen EC,Coonen E,DerhaagJG等，人类胚胎的体外培养对新生儿出生体重的影响(Effect of in vitro culture ofhuman embryos on birthweight of newborns)，Hum Reprod 2010；25:605–612。
30.Behringer R,Gertsenstein M,Nagy KV,Nagy A，《小鼠胚胎操作实验指南》(Manipulating the mouse embryo:a laboratory manual)，第4版，Cold Spring HarborLaboratory Press:Cold Spring Harbor；2014。
31.Kageyama S,Moriyasu S,Tabata T,Chikuni K，使用聚合酶链反应进行的驯养动物的SRY(性别决定区Y)保守区的扩增和序列分析(Amplification and sequenceanalysis of SRY(sex-determining region Y)conserved region of domestic animalsusing polymerase chain reaction)，Anim Sci Technol.1992；63:1059–65。
序列表
<110> 内布拉斯加大学董事委员会（BOARD OF REGENTS OF THE UNIVERSITY OFNEBRASKA）
学校法人东海大学（TOKAI UNIVERSITY EDUCATIONAL SYSTEM）
佐藤正彦（SATO, Masahiro）
<120> 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物
<130> 6278-00007
<150> US 62/549,644
<151> 2017-08-24
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Foxe3靶序列
<400> 1
cctgagacag ccgggcttcg cgccggggc 29
<210> 2
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：WT
<400> 2
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgggcttcg cgccggggct ggagcgctac 60
ctgtgagtcg ctttccgct 79
<210> 3
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#1
<400> 3
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgagcgcta cctgtgagtc gctttccgct 60
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#3
<400> 4
ctcggaagct ggagcgctac ctgtgagtcg ctttccgct 39
<210> 5
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#5
<400> 5
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgggcttcg gcgccggggc tggagcgcta 60
cctgtgagtc gctttccgct 80
<210> 6
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#8
<400> 6
ctcggagccg gggaagccta cctgagactg agtcgctttc cgct 44
<210> 7
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#9
<400> 7
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgggcttcg cggggctgga gcgctacctg 60
tgagtcgctt tccgct 76
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#16
<400> 8
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgggcttcg cggggctgga gcgctacctg 60
tgagtcgctt tccgct 76
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#24
<400> 9
ctcggagccg gggaagccta cctgctttcc gct 33
<210> 10
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#26
<400> 10
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag ccgggcttcg agcgctacct gtgagtcgct 60
ttccgct 67
<210> 11
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：#32
<400> 11
ctcggagccg gggaagccta cctgagacag cctacctgtg agtcgctttc cgct 54
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图3靶
<400> 12
tgcggaaact ctaagtttgg atttggggg 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图4靶1
<400> 13
atacccagtt cgactaaatg tccattaga 29
<210> 14
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图5靶
<400> 14
ggccggtgtg agccgcaggt ctgtggatc 29
<210> 15
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图8靶
<400> 15
tggccgtctc cagctagata ggagccacc 29
<210> 16
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图9靶
<400> 16
ggcaacttca tgggtttcaa ctgcggaaa 29
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图10靶
<400> 17
actctgttca cgccgctgct cattggctt 29
<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图11靶1
<400> 18
ccgtgattgc gatgcgctca tggcgggct 29
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图11靶2
<400> 19
ctacggtgca gattcgaact gcgaggacc 29
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图12靶
<400> 20
gggtttcaac tgcggaaact ctaagtttgg att 33
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Foxe3靶序列
<400> 21
gagacagccg ggcttcgcgc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tyr(ICR)靶序列
<400> 22
ggaaactcta agtttggatt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：刺鼠色(1)靶序列
<400> 23
aatggacatt tagtcgaact 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：刺鼠色(2)靶序列
<400> 24
agggtttaac cacctatcga 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Pitx3靶序列
<400> 25
cggtgtgagc cgcaggtctg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tis21靶序列
<400> 26
ggctcctatc tagctggaga 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tyr(野生型)靶序列
<400> 27
aacttcatgg gtttcaactg 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Kit靶序列
<400> 28
ctgttcacgc cgctgctcat 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：p21(Cdkn1a)靶序列
<400> 29
tgattgcgat gcgctcatgg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：p16/p19(Cdkn2a)靶序列
<400> 30
cggtgcagat tcgaactgcg 20
<210> 31
<211> 131
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tyr-挽救
<220>
<221> misc_feature
<222> (45)..(45)
<223> n为肌苷
<400> 31
tgttttataa taggacctgc cagtgctcag gcaacttcat gggtntcaac tgcggaaact 60
gtaagtttgg atttgggggc ccaaattgta cagagaagcg agtcttgatt agaagaaaca 120
tttttgattt g 131
<210> 32
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：刺鼠色-挽救
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n为肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> n为肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(43)
<223> n为肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (124)..(124)
<223> n是a、c、g或t
<400> 32
tttattgcaa cctgcctntg cctntatatg tgttgaatat ttntagactt gatacccagt 60
gaattcgaag ggttttccca aacccctcct cagaactcag gagtatcatt aaggtactgc 120
ggtn 124
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1035
<400> 33
tcctccccct atgtataccg 20
<210> 34
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1036
<400> 34
tccctgttcc tggccttag 19
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1037
<400> 35
cctgtgggtt gatccctatg 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1038
<400> 36
caaacactgg ctcacagatg 20
<210> 37
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1051
<400> 37
gtaatacgac tcactatagg gcccgggccg ccgccggccg ctaaccttag cccctgccag 60
tacgccgtgg aacgccggtg ggcagtggag agggcagag 99
<210> 38
<211> 113
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1052
<400> 38
catgaattca agccagtcta ggcgacccct gtccggagag gctgtgaatt actgccccgc 60
cctcggggat ggatccacag acctgcggct cacttgtaca gctcgtccat gcc 113
<210> 39
<211> 104
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1053
<400> 39
gtaatacgac tcactatagg gcaagaacca gatgatgctg ggcaggagca gcccctcgaa 60
gaactatgtg atggccgtct ccagcggcag tggagagggc agag 104
<210> 40
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1054
<400> 40
catgaattct atacggtggc ctgttgtcag ggcagcatga gaacagtaga gtgccagggt 60
cgggtggctc ctatctactt gtacagctcg tccatgcc 98
<210> 41
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M1055
<400> 41
taatacgact cactataggg agacagccgg gcttcgcgcg ttttagagct agaaatagca 60
ag 62
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M272
<400> 42
caggaaacag ctatgacc 18
<210> 43
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M389
<400> 43
tcgccaccat ggtgagcaag ggcgag 26
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M390
<400> 44
ctctagactt tacttgtaca gctcgtccat 30
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M463
<400> 45
tccttctgtc cagtgcacca t 21
<210> 46
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M939
<400> 46
aaaaaaagca ccgactcgg 19
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M943
<400> 47
aggatctgtg ttcaacccat t 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M944
<400> 48
acaaagaaaa ccaagcgtga c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M947
<400> 49
cttgagaaag gccacagttt c 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M948
<400> 50
acgaacctct tcatctgctg t 21
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M992
<400> 51
cctggacagc ctgttggg 18
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M993
<400> 52
ttcagtctgg tggtgagaca g 21
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：M999
<400> 53
atgggtgttg acccattgtt 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：PP226
<400> 54
caagccagtc taggcgaccc 20
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：PP227
<400> 55
catgaattct atacggtggc c 21
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Mm HPRT FlS
<400> 56
aggtttcgag ccctgatatt cg 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Mm HPRTRlS
<400> 57
atgtggcaag gtcaaaaaca gt 22
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tyr-F
<400> 58
tctctgatgg ccattttcct c 21
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Tyr-R
<400> 59
aacatgggtg ttgacccatt 20
<210> 60
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Kit-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> n为肌苷
<400> 60
gagggaaatg gtttagtntg gg 22
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Kit-R
<400> 61
gggtttctgg aggagaaagg 20
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Cdknla-lw
<400> 62
cctgaagact gtgatggggt a 21
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Cdknla-rv
<400> 63
tctccgtgac gaagtcaaag t 21
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Cdkn2a-lw
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n为肌苷
<400> 64
gccgtgatcc ctctactttn t 21
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Cdkn2a-rv
<400> 65
tatcgcacga tgtcttgatg t 21
<210> 66
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Sry-F2
<400> 66
aagcgaccca tgaatgcatt catggtgtgg t 31
<210> 67
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：Sry-R2
<400> 67
gaggtcgata cttatagttc gggtatttct ctctgtg 37
<210> 68
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：图4靶2
<400> 68
tccagggttt aaccacctat cgaagggtt 29
<210> 69
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成：MmHPRT-273-S引物
<400> 69
gtgccctctt ctggcctgcc a 21
Claims (31)
1.一种在生殖器官含有受精合子的对象中进行生殖系基因组工程的方法，所述方法包括：
(a)在所述对象授精后一定时间段后从所述对象分离或获得所述生殖器官；
(b)将试剂组合物引入到所述生殖器官中，所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸，以及
(c)对所述生殖器官进行电穿孔。
2.权利要求1的方法，其中所述时间段在0.5天(12小时)至1.4天(33.6小时)之间。
3.权利要求2的方法，其中所述时间段为约0.7天(16.8小时)。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述核酸酶系统包含RNA可编程核酸酶多肽和向导RNA多核苷酸。
5.权利要求4的方法，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cas9多肽，并且所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA。
6.权利要求4的方法，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cpf1多肽。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述试剂组合物还包含单链(ssDNA)修复模板。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中使用NEPA21电穿孔仪，使用下述参数对所述生殖器官进行电穿孔：穿孔脉冲：50V，5-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，10％衰减(±脉冲方向)，以及转移脉冲：10V，50-ms脉冲，50-ms脉冲间隔时间，3次脉冲，40％衰减(±脉冲方向)。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中使用CUY21EDIT II电穿孔仪，使用下述参数对所述生殖器官进行电穿孔：方波(mA)，(+/-)，Pd V：60V或80V，Pd A：150mA，Pd开：5.00ms，Pd关：50ms，Pd N：3，衰减：10％，衰减类型：对数。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述对象通过使所述对象与另一个对象交配来授精。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述对象是小鼠或大鼠。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生殖器官是输卵管。
13.权利要求12的方法，其中通过将所述试剂组合物注射到所述输卵管的腔中，将所述试剂组合物引入到所述输卵管中。
14.一种在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官，所述生殖器官包含试剂组合物，并且所述试剂组合物包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸。
15.权利要求14的生殖器官，其中所述时间段在0.5天(12小时)至1.4天(33.6小时)之间。
16.权利要求15的生殖器官，其中所述时间段为约0.7天(16.8小时)。
17.权利要求14-16中任一项的生殖器官，其中所述核酸酶系统包含RNA可编程核酸酶多肽和向导RNA多核苷酸。
18.权利要求17的生殖器官，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cas9多肽，并且所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA。
19.权利要求17的生殖器官，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cpf1多肽。
20.权利要求14-19中任一项的生殖器官，其中所述试剂组合物还包含单链(ssDNA)修复模板。
21.权利要求14-20中任一项的生殖器官，其中所述对象是小鼠或大鼠。
22.权利要求14-21中任一项的生殖器官，其中所述生殖器官是输卵管。
23.电穿孔仪用于将包含核酸酶系统和/或外源多核苷酸的试剂组合物引入到在对象授精后一段时间后来自于所述对象的含有受精合子的生殖器官中的用途。
24.权利要求23的用途，其中所述时间段在0.5天(12小时)至1.4天(33.6小时)之间。
25.权利要求24的用途，其中所述时间段为约0.7天(16.8小时)。
26.权利要求23-25中任一项的用途，其中所述核酸酶系统包含RNA可编程核酸酶多肽和向导RNA多核苷酸。
27.权利要求26的用途，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cas9多肽，并且所述向导RNA包含crRNA和tracrRNA。
28.权利要求26的用途，其中所述RNA可编程核酸酶多肽包含Cpf1多肽。
29.权利要求23-28中任一项的用途，其中所述试剂组合物还包含单链(ssDNA)修复模板。
30.权利要求23-29中任一项的用途，其中所述对象是小鼠或大鼠。
31.权利要求23-30中任一项的用途，其中所述生殖器官是输卵管。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201762549644P | 2017-08-24 | 2017-08-24 | |
| US62/549,644 | 2017-08-24 | ||
| PCT/US2018/047748 WO2019040744A1 (en) | 2017-08-24 | 2018-08-23 | METHODS AND COMPOSITIONS FOR IN SITU GERMINAL GENOMIC GENE ENGINEERING |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111655861A true CN111655861A (zh) | 2020-09-11 |
Family
ID=65439258
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201880068136.2A Pending CN111655861A (zh) | 2017-08-24 | 2018-08-23 | 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11732273B2 (zh) |
| JP (1) | JP2020534024A (zh) |
| CN (1) | CN111655861A (zh) |
| WO (1) | WO2019040744A1 (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024087014A1 (zh) * | 2022-10-25 | 2024-05-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种癫痫动物模型的制备方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017124086A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | The Jackson Laboratory | Genetically modified non-human mammals by multi-cycle electroporation of cas9 protein |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI1005959A2 (pt) * | 2009-02-27 | 2015-08-25 | Genentech Inc | "vetor de direcionamento, método de produção de uma célula haste embriônica alterada in vitro, animal não humano, mamífero não humano, modelo animal, modelo animal/mamífero não humano, método de teste de terapia de alergia, linhagem celular, célula isolada de um modelo animal, processo de elaboração de um modelo animal não humano e camundongo recombinante |
| US8697359B1 (en) | 2012-12-12 | 2014-04-15 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products |
| WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
| EP3303585A4 (en) | 2015-06-03 | 2018-10-31 | Board of Regents of the University of Nebraska | Dna editing using single-stranded dna |
-
2018
- 2018-08-23 CN CN201880068136.2A patent/CN111655861A/zh active Pending
- 2018-08-23 JP JP2020532860A patent/JP2020534024A/ja active Pending
- 2018-08-23 WO PCT/US2018/047748 patent/WO2019040744A1/en active Application Filing
-
2020
- 2020-02-24 US US16/799,398 patent/US11732273B2/en active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017124086A1 (en) * | 2016-01-15 | 2017-07-20 | The Jackson Laboratory | Genetically modified non-human mammals by multi-cycle electroporation of cas9 protein |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MASAHIRO SATO 等: ""Intraociductal introduction of plasmid DNA and subsequent electroporation for efficient in vivo gene transfer to murine oviductal epithelium"" * |
| MASATO OHTSUKA 等: ""In situ genome editing method suitable for routine generation of germline modified animal models"" * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024087014A1 (zh) * | 2022-10-25 | 2024-05-02 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种癫痫动物模型的制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019040744A8 (en) | 2020-08-06 |
| JP2020534024A (ja) | 2020-11-26 |
| US20200263198A1 (en) | 2020-08-20 |
| US11732273B2 (en) | 2023-08-22 |
| WO2019040744A1 (en) | 2019-02-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ohtsuka et al. | i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases | |
| JP5774657B2 (ja) | エレクトロポレーションを利用した哺乳類の遺伝子改変方法 | |
| CA2946881A1 (en) | Multiplex gene editing in swine | |
| WO2017075261A1 (en) | Engineering of humanized car t-cells and platelets by genetic complementation | |
| WO2017075276A2 (en) | Compositions and methods for chimeric embryo-assisted organ production | |
| US20200253174A1 (en) | Nanos knock-out that ablates germline cells | |
| US20190223417A1 (en) | Genetically modified animals having increased heat tolerance | |
| Ohtsuka et al. | i‐GONAD: A method for generating genome‐edited animals without ex vivo handling of embryos | |
| US20210037797A1 (en) | Inducible disease models methods of making them and use in tissue complementation | |
| US20190254266A1 (en) | Engineering of Humanized Kidney by Genetic Complementation | |
| US20160160238A1 (en) | Heterozygous modifications of tumor suppressor genes | |
| CN111655861A (zh) | 用于原位生殖系基因组工程的方法和组合物 | |
| Ohtsuka et al. | In situ genome editing method suitable for routine generation of germline modified animal models |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200911 |