JP2020534024A - インサイチュ生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年8月24日に出願された米国仮特許出願第62/549,644号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、EFS-Webを介して電子出願されており、.txt形式で電子提出された配列表を含む。この.txtファイルには、2018年8月23日に作成された「2018-08-23_6278-00007_ST25.txt」というタイトルの配列表が含まれ、そのサイズは15,296バイトである。この.txtファイルに含まれる配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームリピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質(CRISPR associated protein)(Cas)を使用したゲノム編集の最近の進歩により、遺伝子改変動物が簡単かつ迅速に作製できるようになった[1, 2, 3]。CRISPR動物ゲノムエンジニアリングの方法には、3つの大まかな工程が含まれる:雌の交配および接合子の単離;ゲノム編集コンポーネントの接合子への顕微注入;ならびに顕微注入された接合子の雌の卵管への移植[1, 2]。これらの工程は、(1)この手順を実施する技術者による非常に高度な技術的専門知識と、(2)マイクロマニピュレーターなどの高価な機器、を必要とする。そのプロトコルの複雑性のため、動物ゲノムエンジニアリング実験は個々の研究室で実施することが困難であり、一般的にはコアとなる中心施設で実施され、そこでは高度な訓練を受けた技術者が日々ゲノムエンジニアリングサービスを提供している。そのような複雑な工程を回避する方法の開発は、動物ゲノムエンジニアリング技術を、コアだけでなく、より多くの研究室で実施することを可能にする。一部のグループは、顕微注入に代わる方法として、接合子のインビトロのエレクトロポレーションの使用を研究し、このアプローチを使用してゲノム編集された胎仔と仔の作製に成功している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。接合子のエレクトロポレーションは顕微注入工程を取り除くものの、この戦略は他の2つの困難な工程:エクスビボの操作(handling)のための接合子の単離、および偽妊娠雌への接合子の移植、をまだ必要とする。したがって、当技術分野では、遺伝子改変動物の作製を簡素化できる新しいゲノムエンジニアリング方法の必要性が依然として存在する。
本発明の一局面では、受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象において、生殖細胞系列(germline)ゲノムエンジニアリングを実施するための方法が提供される。この方法は、対象の媒精(insemination)からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程;該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程;および該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程を含むことができる。
本明細書において、本発明者らは、非限定的な実施例において、卵管核酸送達を介した改良型ゲノム編集(improved-Genome editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery:i-GONAD)と呼ばれるロバストな方法を開示する。この方法により、単一塩基の変化、キロベースサイズの欠失、およびノックインを含むマウスモデルが作製される。i-GONADの効率は従来の顕微注入法の効率に匹敵しているが、顕微注入法は接合子のエクスビボの操作に依存しており、また、胚移植用のレシピエント動物を必要とする。対照的に、i-GONADは、これらの技術的に困難な工程を回避するものであり、簡便な機器と技術的専門知識が備わったどのような研究室でも実施することができる。さらに、i-GONADで処置された雌は生殖機能を保持しており、生殖細胞系列遺伝子治療に向けた該方法の将来の使用が示唆される。
本発明の一局面では、受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法が提供される。この方法は、対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程;該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程;および該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程を含むことができる。
別の局面では、本発明は、生殖器組成物に関する。この組成物は、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器を含むことができ、この生殖器には、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物が含まれる。
さらに別の局面では、本発明は、エレクトロポレーターの使用に関する。この使用は、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用を含み得る。
要約
本発明者らは、CRISPRリボ核タンパク質をインサイチュエレクトロポレーションによりE0.7胚に送達する、卵管核酸送達による改良型ゲノム編集(i-GONAD)と呼ばれるロバストな方法を提供する。この方法により、単一塩基の変化、キロベースサイズの欠失、およびノックインを含むマウスモデルが作製される。i-GONADの効率は、従来の顕微注入法の効率に匹敵するが、その顕微注入法は接合子のエクスビボの操作に依存しており、かつ胚移植用のレシピエント動物が必要である。対照的に、i-GONADは、これらの技術的に困難な工程を回避しており、簡便な機器と技術的専門知識が備わったどのような研究室でも実施することができる。さらに、i-GONAD処理された雌は生殖機能を保持しており、生殖細胞系列遺伝子治療に向けた該方法の将来の使用が示唆される。
クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドロームリピート(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質9(Cas9)を用いたゲノム編集の最近の進歩により、遺伝子ノックアウト動物が簡単かつ迅速に作製できるようになった[1, 2, 3]。CRISPR動物ゲノムエンジニアリングの方法には、3つの大まかな工程が含まれる:過剰排卵処理した雌の交配と接合子の単離;ゲノム編集コンポーネントの接合子への顕微注入;および顕微注入された接合子の偽妊娠雌の卵管への移植[1, 2]。これらの工程は、(1)この手法を実施する技術者による非常に高度な技術的専門知識と、(2)マイクロマニピュレーターなどの高価な機器を必要とする。そのプロトコルの複雑性のため、動物ゲノムエンジニアリング実験は個々の研究室で実施することが困難であり、一般的にはコアとなる中心施設で実施され、そこでは高度な訓練を受けた技術者が日々ゲノムエンジニアリングサービスを提供している。そのような複雑な工程を回避する方法の開発は、動物ゲノムエンジニアリング技術を、コアだけでなく、より多くの研究室で実施できるようにする。一部のグループは、顕微注入に代わる方法として、接合子のインビトロのエレクトロポレーションの使用を研究し、このアプローチを用いてゲノム編集された胎仔と仔の作製に成功している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。接合子のエレクトロポレーションは顕微注入工程を取り除いたものの、この戦略は他の2つの困難な工程:エクスビボの操作のための接合子の単離、および偽妊娠雌へのそれらの移植、をまだ必要とする。本発明者らは最近、接合子のインサイチュエレクトロポレーションを実施することにより、3つ全ての工程を迂回できることを実証した。
0.7日目でのGONAD
GONAD法に関する最初の報告では、実験を交配後約1.5〜1.7日に行った。この妊娠時期には、胚は2細胞期にある。この時期にゲノム編集試薬を送達すると、モザイク胚またはモザイク胎仔が高頻度で発生する[10]。遺伝子編集コンポーネントを送達するための理想的な時期は1細胞期に相当する時期であるが、それは、その時期が遺伝的モザイク現象を低減すると考えられるためである。編集コンポーネント送達の最も早い時期を検討するために、GONADを0.4日目と0.7日目の2つの異なる時点で試験した。高感度緑色蛍光タンパク質(eGFP)メッセンジャーRNA(mRNA)(1μg/μl)とトリパンブルーを含む溶液1.0〜1.5μlを卵管内腔に注入し(図1Aに示した概略図)、次に、以前[10]に記載された条件下でBTX T820機器を用いてインビボのエレクトロポレーションを実施した。mRNA送達の2日後、処理した雌から8細胞期の胚を単離して、eGFP蛍光の存在を観察した。0.4日の時点で処理した胚のいずれにも感知できるeGFPは観察されなかったが、0.7日の時点で処理した31個の胚のうち13個で均一なeGFP蛍光が観察された(図1B)。0.4日目で成功しなかった理由の1つは、卵丘細胞がこの時期の接合子を強固に取り囲んでいるためであると考えられ(図1C、左)、これは接合子への核酸の効率的な電気泳動送達を妨げる可能性がある。対照的に、0.7日目の大部分の接合子は厚い卵丘細胞がなくなっており(図1C、右)、接合子へのインジェクションミックスの接近を可能にするはずである。これらの結果から、交配後0.7日(約16時間)がGONADを実施するのに最適な時期であろうと示唆された。
次に、遺伝子破壊動物モデルを作製するためにGONAD法を使用できるかどうかを検討した。遺伝子ターゲティングのためにFoxe3遺伝子座を選択したが(図2A)、それは、Foxe3遺伝子の不活性化がマウスにおいて眼の発達異常と白内障を引き起こすためである[11, 12]。GONADは、Cas9 mRNAおよびFoxe3遺伝子を標的とするシングルガイド(sg)RNAを使用して、妊娠0.7日のJcl:MCH(ICR)雌に対して実施した。用いたエレクトロポレーション条件は50Vで波長5msのパルスを8回であった。GONAD処理された8匹の雌のうち7匹が仔を産んだ。G0子孫の耳から単離されたゲノムDNAの配列決定により、36匹のG0仔マウスのうち11匹(31%)は標的遺伝子座に変異したアレルを有することが実証された(図2Bおよび2C、表1)。注目すべきことに、モザイクのアレルを持つ仔マウスの頻度は依然として高く(82%[9/11])、モザイク現象が見られなかった仔は2匹だけだった(18%[2/11];図2BのG0-#26および-#32)。G0創始マウスの交配によりG1子孫を得た;そのうちの一部は予想された白内障表現型を示した(図2Dおよび2E)。白内障を有するG1マウスから単離されたゲノムDNAの配列決定により、変異アレルの生殖細胞系列伝達が明らかになった。まとめると、これらの結果は、GONADを用いて遺伝子破壊マウスモデルを作製できることを示している。
Cas9 mRNA [7, 13, 14]の代わりにCas9タンパク質を、シングルガイドRNA(sgRNA)の代わりのcrRNA+tracrRNA(2部ガイドRNA)と一緒に使用すると、より高いゲノム編集効率が得られることが、今ではますます明らかになりつつある[13]。そこで、GONADを介したゲノム編集のために、これらのコンポーネント(crRNA+tracrRNA+Cas9タンパク質:ctRNP)を組み合わせて使用することを検討した。例として、Foxe3遺伝子を標的とし、以前の実験と同じガイド配列を使用したが、sgRNAの代わりにアニールされたcrRNA+tracrRNAを使用し、かつCas9 mRNAの代わりにCas9タンパク質を使用した。ctRNP複合体の混合物を0.7日目に7匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)雌の卵管内腔に注入した。その卵管に、前と同じエレクトロポレーターを使用して、またはCUY21Edit IIエレクトロポレーターを使用して、インビボのエレクトロポレーションを行った。胚をE13.5またはE17.5に単離した。7匹全ての雌が胎仔を抱えていた(合計36個体)。驚くべきことに、ほぼ全てがFoxe3標的配列内にインデル変異を有していた(35/36、97%);これは、Cas9 mRNAを使用したときの頻度(31%、p<0.001)よりはるかに高かった(表1;表2)。胎仔の57%(20/35)がモザイク現象を示したことに留意されたい。これは、Cas9 mRNAを使用したときに得られた頻度(82%)よりも低かったものの、統計的に有意ではなかった(p=0.139)。これらの結果は、crRNAとtracrRNAsとCas9タンパク質(ctRNP)を組み合わせて使用することが、GONADによるゲノム編集の最高効率を与えることを示唆している。このRNPベースのGONADを改良型GONAD(improved GONAD)(i-GONAD)と命名した。
使用したCRISPRコンポーネントは、Cas9 mRNA/sgRNAまたはCas9タンパク質/CRISPR RNA(crRNA)/トランス活性化型crRNA(tracrRNA)のいずれかであった(詳細については表1を参照)
次に、小さな遺伝的変化を作製するためにi-GONADを使用できるかどうかを検討した。例として、チロシナーゼ(Tyr)遺伝子のコドン103を選択した。この位置にコドンTGT(システイン)を含むマウスは、毛および目に正常な色素を有し(野生型表現型と見なされる、例えばC3H/He系統マウス)、また、TCT(セリン)を含むマウスは、チロシナーゼ酵素活性の低下により、アルビノの毛色と透明な目をした無色素の表現型を有する(変異型表現型と見なされる、例えばJcl:MCH(ICR)系統)[15]。Jcl:MCH(ICR)系統(色素なし)の変異型表現型を野生型(色素あり)表現型へレスキューするために、点変異にまたがる領域のgRNAをデザインし、かつTyrの野生型配列に対応する一本鎖オリゴドナー(ssODN)を構築した(図3A)。
i-GONADのゲノム編集効率を顕微注入ベースのアプローチの該効率と比較した。この研究では、上記のi-GONADデータセットを使用し、それを単離された接合子の顕微注入と比較した。35匹の過剰排卵処理したJcl:MCH(ICR)雌からの卵母細胞を対外受精(IVF)させて、顕微注入用の接合子を作成した。339個のそのような接合子にCRISPR試薬を注入して、それらを培養した。これらのうち242個(71%)が2細胞期に進み、次に、それらを12匹のレシピエント雌に移植した(表6)。それらの雌をE14.5またはE15.5で安楽死させた。回収された62個の胎仔のうち、32個体(52%)が有色素の目を持っていた。塩基配列解析により、目に色素がある胎仔は標的部位に修正された配列を持つことが示された。遺伝子修正とインデルを一緒にすると、G0胎仔の合計79%(49/62)がゲノム編集されていた。i-GONADを用いたゲノム編集と標準的な顕微注入ベースの技法を直接比較したこれらのデータは、ゲノム編集効率が2つの戦略間で同等であることを明確に示している(p=0.103)。顕微注入からのゲノム編集胎仔におけるモザイク現象(21/49、43%;表6)は、i-GONADアプローチ(40/66、61%;表3)と比較してやや低かったが、その差は統計的に有意でなかった(p=0.059)。とりわけ、標準的な顕微注入ベースのアプローチでは、Jcl:MCH(ICR)系統を使用した場合に約2.5倍の動物が必要であった;すなわち、10匹の正確にゲノム編集されたマウスを得るために、20匹のマウス(卵子ドナーとしての雌11匹+IVF用の精子ドナーとしての雄1匹+偽妊娠雌4匹+精管切除雄4匹)を必要とした。一方、i-GONADで使用したマウスは8匹だけであった(4匹の胚ドナーを4匹の種付け雄と交配させた)。
次に、i-GONAD法を用いて、C57BL/6JJclマウスのagouti遺伝子座の第1イントロンに存在するレトロトランスポゾン配列を標的とすることにより、大きなゲノム欠失を含むマウスを作製できるかどうかを検討した[16]。レトロトランスポゾン配列を含む16.2kbにわたるゲノム領域を、レトロトランスポゾン挿入部位に隣接する2箇所の切断部を作ることにより欠失の標的とした(図4A)。この領域の欠失は、マウスの毛色を黒からアグーチ色に変化させるはずである(図4B)。ゲノム末端の正確な結合を助けるために、2つの切断端に短い相同配列を含むssODNドナーを得た。このssODNには、制限酵素断片長多型(RFLP)アッセイで使用するためのEcoRI部位も含まれていた。8匹のE0.7妊娠C57BL/6JJcl雌の卵管内腔にCas9タンパク質、2種類のcrRNA/tracrRNA、およびssODNを含む溶液を注入して、インビボのエレクトロポレーションを施した。これらのうち、妊娠しているのは4匹のみであり、それらから6匹のG0仔を帝王切開により回収した。仔のジェノタイピングにより、3個体(50%)がagouti遺伝子座での大きな欠失(G0-#3および-#5)および/またはアグーチの毛色(G0-#4および-#5)を示したことが明らかになった(図4B〜4D;表7)。特に、1匹の仔(G0-#3;1/6 [17%])は標的部位にssODNが正確に挿入されていたが、アグーチの毛色を示す別の仔(G0-#5)はssODNの挿入がなかった(図4Dおよび4E)。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、G0-#4アグーチ仔からアンプリコンを生成せず、プライマー結合部位の一方または両方が欠失された可能性があることを示唆した。興味深いことに、G0-#6仔は、標的遺伝子座での大きな欠失もアグーチの毛色も示さなかった個体であるが、両方の切断部位にインデル変異を有していた(表7;表8)。(大きな欠失と短いインデルを一緒にすると)ゲノム編集された仔個体の割合は67%(4/6)であった(表8)。これらのデータは、i-GONADが大きなゲノム欠失を作製できることを示唆している。
本発明者らは、長いDNA配列のノックインがssDNAドナーを使用することで効率的に達成できることを以前に実証した[17, 18, 19]。長いssDNAドナーをi-GONADで使用してノックインアレルを作製できるかどうかを検討した。T2A-mCitrine融合カセットを含むレポーターモデルを作製することを目的として、これらのノックイン実験のためにPitx3およびTis21遺伝子を選択した。図5A〜5Dおよび図8A〜8D;表9を参照されたい。
次に、いくつかの近交系およびハイブリッドマウス系統での、また追加の遺伝子座でのi-GONADの性能を評価した(表12)。C3H/HeSlc、C57BL/6NCrSlc、DBA/2CrSlc、B6D2F1/Slc系統、およびB6D2F1/SlcとC57BL/6NCrSlcのハイブリッド系統のTyr遺伝子にインデル変異を導入するためにi-GONADを実施した(図9A〜9C)。また、C3H/HeSlcおよびC57BL/6NCrSlc系統ではKit遺伝子へのインデル導入も標的にした(図10A〜10C)。C57BL/6NCrl系統のCdkn1aとCdkn2a(図11A〜11B)およびBALB/cAJcl系統のTyrにssODNを介して小さな遺伝的変化を挿入した。結果は、試験した全ての遺伝子座で、また全てのマウス系統においてi-GONADがゲノム編集を行うことを示したが、C57BL/6NCrSlcマウスのTyr遺伝子座を標的とする場合は除外された。この結果は、C57BL/6NCrSlcコロニーでは妊娠した雌を得ることが難しいためであり得る。近交系の雌の全体的な妊娠率は低かった。非近交系とは異なり、膣栓の存在によって交配が確認された多くの近交系の動物は、着床した胚を含んでいなかった。まとめると、これらの結果は、i-GONADが多くのマウス系統で使用できるものの、その成功率は系統に依存し、特定の近交系ではさらなる最適化が必要であり得ることを示している。
最近、アシダミノコッカス属菌種(Acidaminococcus sp.)由来のCpf1(AsCpf1)がゲノム編集ツールとして加わった[22, 23]。AsCpf1タンパク質をi-GONADで使用できるかどうかを検討した;6.3μMのAsCpf1タンパク質を、Hprt遺伝子座を標的とする30μMのcrRNAと共に、5匹の妊娠Jcl:MCH(ICR)マウスの卵管内腔に注入することにより実施した。E13.5で合計40個の胚を単離し、PCRと配列解析によりインデルの有無を分析した。1個体の胎仔からのDNAは、おそらくプライマー結合部位の欠失のため、PCRアンプリコンを生じなかった。25個体の胎仔からのDNAはインデル変異を含んでいた。その結果は、AsCpf1を用いたi-GONADの後に回収されたG0子孫の65%(26/40)がゲノム編集されていて、これらのサンプルの約65%(17/26)がモザイクであったことを示している(表13)。
接合子を単離するために雌胚ドナーを犠牲にする従来のゲノム編集アプローチとは異なり、i-GONAD法はドナー雌の安楽死を必要としない。したがって、i-GONADを受けた雌マウスが生殖機能を保持するかどうかを検討した。i-GONADを受けてゲノム編集された仔(表3のマウス-#3、-#5、および-#11)を出産した3匹の雌マウスを、繁殖力のある雄マウスと自然交配させた。これらのうち2匹(67%;マウス-#3および-#11)は妊娠し、それぞれ9匹および12匹の仔を出産するのに成功した(図13および表16)。これらのデータは、これらのマウスの卵管が正常な機能を保持し、受精とその後の受精卵の子宮への卵管内輸送を可能にすることを示唆している。
i-GONADの開発
本発明者らは、以前に、GONADと呼ばれる原理証明(proof-of-principle)ゲノム編集法を示した[10]。GONADは、インサイチュで接合子に対して行われるため、接合子の単離、そのエクスビボでの操作、その後のレシピエント雌へのその移植の工程を迂回することができる;動物ゲノム編集のこれらの工程は、開発されてから30年以上にわたって実施されてきた。本研究では、我々は、GONAD法にいくつかの改良を加えて、この方法をゲノム編集動物モデルの日常的な作製に高度に適するものにした。まず最初に、最適な妊娠時期を評価し、0.7日目がGONADに適しており、この時期は膨大部への溶液の導入を容易にすることを示した。第二に、i-GONADと命名したアプローチにおいてCas9 mRNAをCas9タンパク質に置き換え、かつインビトロで転写されたsgRNAを合成コンポーネント(例えば、crRNA+tracrRNA)に置き換えると、ゲノム編集効率が顕微注入ベースのアプローチのレベルにまで向上した。第三に、i-GONADは大きな欠失、点変異、および大きなカセットノックインのモデルの作製に使用できる。第四に、i-GONADは多くのマウス系統で機能する。第五に、i-GONADに使用した雌は、完全に機能的な生殖能力を保持する。第六に、i-GONAD法ではAsCpf1ヌクレアーゼを使用することもできる。最後に、市販の様々なタイプのエレクトロポレーターを使用してi-GONADを実施できることが分かった。エレクトロポレーターは顕微注入のセットアップの10分の1の費用ですみ、また専門の技術者を必要としないため、i-GONAD法は、一方または両方を備えていない多くの研究室で容易に適合され得る。
0.7日目(1細胞期後期に相当する)に実施したGONADは、ゲノム編集に効果的であることが分かった。この時期にGONADを実施することにはいくつかの利点がある。第一に、E0.7接合子は、より少ない卵丘細胞に取り囲まれており(図1C)、したがって、ゲノム編集コンポーネント(CRISPR関連核酸/タンパク質)の送達のためにより容易に近づきやすい。0.4日目に行った実験では、エレクトロポレーションを介したコンポーネントの効果的な送達が起こらないことが分かったが、それはおそらく、この時期の接合子が卵丘細胞のクラスターに囲まれているためである。第二に、0.7日目の卵管には、多くの場合にはっきりと見える膨大部があり、これは解剖顕微鏡下でのマイクロピペットによる溶液の導入を容易にする。第三に、1.5日目に実施された、以前に報告したGONAD法と比較して、0.7日目に導入される溶液の量を卵管あたり1.0〜1.5μlに減らすことができ、これは試薬の節約になる[10, 24]。第四に、E0.7接合子は卵管膨大部内のよりコンパクトな空間に存在するため、ゲノム編集コンポーネントが1.5日目よりも効率よく接合子に到達できると考えられる。
接合子注入およびエクスビボのエレクトロポレーションベースのゲノム編集から蓄積されたデータは、RNPが、mRNA/sgRNAを用いて達成されたゲノム編集効率よりも優れた効率を引き出すことを示している[7, 13]。この研究において、本発明者らは、RNPコンポーネントが最大で約97%のゲノム編集効率へ向かわせたのに対し、sgRNA/Cas9 mRNAコンポーネントを用いて達成された効率は最大でも31%にすぎなかったことを見出した(図2f)。RNPプラットフォームの別の利点は、全てのコンポーネントを商業的に作ることができる点である。これにより、個々の研究室で調製された試薬に起因するばらつきが減るであろう。市販のRNA試薬はRNAコンポーネントの凍結乾燥形態で受け取ることができ、Cas9タンパク質は高濃度で購入可能である。これらの特徴により、所望の濃度のエレクトロポレーションミックスを調製することができる。GONADの場合、エレクトロポレーションミックスで必要とされる試薬の濃度は、通常、接合子への直接注入に用いられる該ミックスよりもはるかに高くなる。一部の雌では100%の接合子がゲノム編集されたという事実は、エレクトロポレーション時に、注入されたエレクトロポレーションミックスが卵管内の全ての接合子を取り囲むのに成功した、ことを示している。
i-GONAD処理されたサンプルにおけるssODNドナーのノックイン効率は49%であった(図3E)。遺伝子座と遺伝的改変の同じ組み合わせを用いることによって、この効率を顕微注入ゲノム編集法と直接比較し、その効率は52%であった(表6)。i-GONADに必要な動物の数は、顕微注入ベースのアプローチに必要な数の2.5分の1である。i-GONADの制限の1つは、顕微注入よりも高い濃度の試薬を必要とする点である。我々のデータは、i-GONADの効率が顕微注入の効率に匹敵することを示唆しているが、これら2つの方法の同等の効率を評価するには、より多くの遺伝子座と系統を試験する必要がある。
いくつかのグループは、ゲノム編集されたげっ歯類を接合子のインビトロのエレクトロポレーションにより作製できることを実証している[4, 5, 6, 7, 8, 9]。GONAD法は、ゲノム編集用の核酸とCRISPRコンポーネントをインサイチュで胚に直接送達するということを考慮すると、インビトロのエレクトロポレーションより一歩先を行く。GONAD法は、インビトロのエレクトロポレーションベースのゲノム編集法よりもさらに多くの利点を提供する。それらは次のとおりである:(1)GONADは胚のエクスビボの操作を必要としない;(2)単離された胚のインビトロの培養を必要としない;(3)エクスビボで処理した胚の着床に偽妊娠雌マウスを必要としない;(4)偽妊娠雌を生産するために精管切除雄を必要としない(これは、接合子のエクスビボの操作方法および/または代理母を準備する方法などの生殖補助技術が確立されていない種では特に有利である);および(5)GONAD処理された雌を接合子の単離のために犠牲にする必要がない。別の非常に重要な利点は、GONAD処理を受けた雌が生殖機能を保持しており、GONAD処置からの仔を出産した後で再び妊娠できることである。これは、2回目のGONAD法のために雌を再利用できることを示唆している。このことは、例えば、(1)GONAD実験に使用した動物が貴重である場合、および(2)新たに開発された遺伝子改変マウス株において別の遺伝子操作をすぐに実施する場合に、非常に重要な特徴である。これにより、顕微注入またはエクスビボのエレクトロポレーションのアプローチを使用する場合に生じるような、2番目の遺伝的変化を行うための何百もの接合子を生産するために該マウス株を増やすという面倒な要件が回避される。
動物ゲノムエンジニアリング実験には、3つの主要な、しかし重要な、工程が含まれる:犠牲にした雌からの接合子の単離;それらのエクスビボの顕微操作;その後の、処理した接合子の別の組の雌への移植。これらの工程は、過去40年間、ほとんど変わっていない。本明細書で、本発明者らは、i-GONADと呼ばれる新しい編集方法について説明し、そのような複雑で重要な工程を使用せずに、ポピュラーなマウスモデルを日常的に作製できることを示した。i-GONADはこれまで可能でなかったいくつかの有利な状況を提供する。第一に、i-GONADは高度な精密機器または専門的なスキルセットを必要としない。この特徴は、専門の研究室以外では実施できない従来の方法からの大きな脱却である。学生や初心者の技術者でもi-GONADを実施することができる。第二に、i-GONADは従来の方法で必要とされる動物の40%以下しか使用しない。第三に、現在使用されている方法で用いられた雌は必然的に安楽死させられるが、i-GONADに用いられた雌は再利用が可能である;したがって、ゲノム編集動物の作製を雌の損失なしに行うことができる。後者の2つのポイントは、動物福祉の観点から大きな恩恵をもたらす。第四に、本研究で確立されたi-GONAD法は、ラット、他のげっ歯類、霊長類、大型動物などの他の哺乳類でのゲノム編集に容易に適合させることができる。この方法は、接合子の回収のために犠牲にできない希少で貴重な動物および/または接合子のエクスビボの操作が確立されていない動物に対して特に力強い方法である。最後に、i-GONAD処理した雌は生殖機能を完全に保持している;したがって、このアプローチは、生殖細胞系列遺伝子修正のためのインビボの遺伝子治療ツールとして非常に有望である。
CRISPR試薬
CRISPRガイドRNAは、CRISPR.mit.eduまたはCHOPCHOPを用いてデザインした(表17)。Foxe3のsgRNAは、プライマーセット(M1055/M939)とテンプレートとしてのpUC57-sgRNAベクター(Addgeneプラスミド番号:#51132)を使用して、以前[10]に記載されるように合成した。eGFPおよびCas9のmRNAは、以前[10, 24]に記載されるようにインビトロで転写された。合成crRNAおよびtracrRNAは、米国イリノイ州Skokie所在のIntegrated DNA Technologies(IDT)からAlt-R(商標)CRISPRガイドRNAとして市販されているか、Cas9タンパク質(Alt-R(商標)S.p. CAS9 Nuclease 3NLS)と一緒に神奈川県のファスマック(FASMAC)から購入した。ssODNドナーは、IDTでカスタム合成された(Ultramer:Tyr-レスキュー実験[Tyr-レスキュー]およびagouti-レスキュー実験[agouti-レスキュー]の場合)か、または米国ケンタッキー州LouisvilleのEurofins Genomicsで合成された(Cdkn1aおよびCdkn2a遺伝子へのssODNノックインの場合)。長いssDNAドナー(Pitx3およびTis21レポーターの場合)は、以前[17]に記載されたivTRT法を使用し、若干の変更を加えて、二本鎖DNA(dsDNA)テンプレートから調製した。T2A-mCitrineカセットを、元のベクター(pP200)からプライマーセット(Pitx3ではM1051/M1052、Tis21ではM1053/M1054)を用いて増幅し、pUC119のSmaI部位に挿入すると、pP206(Pitx3の場合)およびpP209(Tis21の場合)が得られる。RNA合成用のテンプレートはこれらのベクターからプライマーセット(Pitx3ではPP226/M272、Tis21ではPP227/M272)を用いて増幅し、RNAはT7 RiboMax Express Large Scale RNA Productionシステム(Promega,Madison,ウィスコンシン州,米国)を用いて合成した。そのRNAをMEGAclearキット(Ambion)により精製し、SuperScript III逆転写酵素(Pitx3の場合)またはSuperScript IV逆転写酵素(Tis21の場合;Life Technologies)を使用し、Pitx3ではプライマーPP226、Tis21ではPP227を用いてcDNAを作成した。顕微注入用のcDNAを精製するために行われるゲル抽出の最終工程は、十分に高い濃度の最終ssDNAを得るために除外した。代わりに、NucleoSpin GelおよびPCR Clean-up(Macherey-Nagel,Dueren,ドイツ)を用いたスピンカラムベースの核酸精製を実施した。エタノール沈殿後、DNAペレットをEmbryoMaxインジェクションバッファー(Millipore)に溶解した。プライマーおよびssODNの配列を表18に示す。
マウスは、東海大学・医学部、浜松医科大学、または重井医学研究所の動物施設で飼育した。成体Jcl:MCH(ICR)(もともとはJcl:ICR系統に由来するハイブリッド系統:http://www.clea-japan.com/en/animals/animal_g/g_01.html)、C57BL/6JJcl(近交系)、およびBALB/cAJcl(近交系)マウスは、日本クレア(CLEA Japan, Inc.)(東京都,日本)から入手した;C3H/HeSlc(近交系)、C57BL/6NCrSlc(近交系)、DBA/2CrSlc(近交系)、およびB6D2F1/Slc(ハイブリッド系)マウスは、日本エスエルシー(Japan SLC, Inc.)(静岡県,日本)から入手した;C57BL/6NCrl(近交系)マウスは日本チャールス・リバー(Charles River Laboratories Japan, Inc.)(横浜市,日本)から入手した。全ての動物実験は施設のガイドラインに従って行われ、施設内動物管理使用委員会(Institutional Animal Care and Use Committee)によって承認された(許可番号は、東海大学での#154014、#165009、#171003、浜松医科大学での#2017062、重井医学研究所での#17008)。
この溶液は、インビトロで合成されたsgRNA(または商業的に調達されたcrRNA/tracrRNAミックス)および商業的に調達されたCas9タンパク質を含んでいた。エレクトロポレーション溶液にドナーDNAが含まれる場合、それらは商業的に合成されたssODNまたはivTRTで合成された長いssDNAのいずれかであった。Cas9 mRNA/sgRNA混合物は、我々が以前[10]に記載したとおりに調製した。eGFP mRNAを使用した場合、またはCas9をmRNAとして供給した場合にのみ、注入が成功したことのマーカーとして0.05%のトリパンブルー(ナカライテスク(Nacalai Tesque Inc.,),京都市,日本)を使用した。凍結乾燥ssODNは、ヌクレアーゼフリー水に10μg/μlの濃度で再懸濁した。凍結乾燥状態のcrRNAとtracrRNAは、最初にRNaseフリーDuplex Bufferに200μMの濃度で再懸濁した。等量のcrRNAとtracrRNAを1.5mlチューブ内で組み合わせて、サーモサイクラーで94℃、2分間加熱し、その後室温に約10分間置いた。アニールしたcrRNAとtracrRNAをCas9タンパク質および/またはssODN/ssDNAと混合して、コンポーネントの最終濃度が30μM(crRNA/tracrRNA)、1mg/ml(Cas9タンパク質)、1または2μg/μl(ssODN)、0.85〜1.4μg/μl(ssDNA)になるようにした。AsCpf1 crRNA
はIDTから好意で提供された。凍結乾燥crRNAを最初にRNaseフリー水に100μMの濃度で再懸濁し、その後サーモサイクラーで95℃、5分間加熱して、室温に約10分間置いた。AsCpf1タンパク質(IDT)をcrRNAと混合し、コンポーネントの最終濃度が30μM(crRNA)および6.3μM(AsCpf1タンパク質)になるようにした。エレクトロポレーション溶液は、その容量を1.5μl/卵管に調整するために、Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific)を用いて希釈することもあった。
この方法で使用した雌は、C57BL/6JJcl系統を除いて、過剰排卵処理を行わなかった。C57BL/6JJclを除く全ての系統では、発情期にある雌を種付けの雄と交配させた。交配を16:00〜17:00に設定し、膣栓を翌朝(9:00〜10:00)に目視検査で確認した。Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual [30]に従って、0:00(真夜中)に妊娠0日目を指定し、膣栓のある雌を10:00で妊娠0.4日目、16:00で妊娠0.7日目と指定し、この時間にそれらをエレクトロポレーション実験で使用した。
CRISPRコンポーネントをEmbryoMaxインジェクションバッファー中で混合した。Cas9タンパク質、crRNA/tracrRNA、およびssODN(Tyr-レスキュー用)の最終濃度は、それぞれ50ng/μl、0.61μM、および10ng/μlであった。過剰排卵処理した雌マウス(Jcl:MCH(ICR))から単離された未受精卵母細胞を、Jcl:MCH(ICR)雄マウスから新たに単離された精子との体外受精(IVF)に供した。体外受精卵の前核への混合物の顕微注入を行った。注入された胚を偽妊娠Jcl:MCH(ICR)雌の卵管に移植して、さらに発達させた。得られた胎仔(13.5日目または15.5日目)を回収して、ジェノタイピング解析にかけた。
回収された胎仔は、mCitrine蛍光を検出するためのGFPフィルター付き蛍光実体顕微鏡(SZX-MGFPAを備えたOlympus SZX7)を使用して観察した。
ゲノムDNAは、妊娠中期の胎仔の肢または生存マウスの耳片から、All-In-One Mouse Tail Lysis Buffer(ABP-PP-MT01500;クラボウ(Kurabo),大阪,日本)を用いて、55℃で3時間または一晩インキュベートし、続いて85℃で45分間不活性化することにより、単離した。標的遺伝子座Foxe3、Tyr、agouti、およびHprtの増幅のためのPCRは、5μlの2×GCバッファーI、0.2mMデオキシヌクレオチド(dNTP)、1μlの粗溶解物、プライマー対(表18)、および0.125UのTaKaRa r-Taq(タカラ(TaKaRa))を含む合計10μlの溶液中で、変性(95℃で5分)、95℃で45秒、58℃で30秒、72℃で1分を35サイクル、および伸長(72℃で5分)を用いて行った。標的遺伝子座Pitx3およびTis21の増幅では、PCR増幅は、PrimeSTAR HS DNAポリメラーゼ(タカラ)を使用して、2μlの5×PrimeSTARバッファーI、0.2mM dNTP、1μlの粗溶解物、プライマー対(追加ファイル1:表S9)、および0.25UのPrimeSTAR HS DNAポリメラーゼを含む合計10μlの溶液中で、変性(94℃で3分)、98℃で10秒、62℃または64℃で5秒、72℃で2分を35サイクル、および伸長(72℃で10分)を用いて行った。直接配列決定を、PCR産物と表18に示したプライマーを用いて行った。
Claims (31)
- 受精で生じた接合子を含む生殖器を有する対象における生殖細胞系列ゲノムエンジニアリングのための方法であって、
(a)対象の媒精からある期間後に、該対象から生殖器を分離または取得する工程;
(b)該生殖器にヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を導入する工程;および
(c)該生殖器にエレクトロポレーションを行う工程
を含む、前記方法。 - 前記期間が0.5日(12時間)〜1.4日(33.6時間)である、請求項1に記載の方法。
- 前記期間が約0.7日(16.8時間)である、請求項2に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項4に記載の方法。
- 前記試薬組成物が一本鎖(ssDNA)修復テンプレートをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生殖器に、NEPA21エレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ:ポアーリングパルス:50V、5msパルス、50msパルス間隔、3パルス、10%減衰(±パルス方向)、およびトランスファーパルス:10V、50msパルス、50msパルス間隔、3パルス、40%減衰(±パルス方向)のエレクトロポレーションを行う、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生殖器に、CUY21EDIT IIエレクトロポレーターを使用して、次のパラメータ:矩形(mA)、(+/−)、Pd V:60Vまたは80V、Pd A:150mA、Pdオン:5.00ms、Pdオフ:50ms、Pd N:3、減衰:10%、減衰タイプ:Logのエレクトロポレーションを行う、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象の媒精が該対象を別の対象と交配することによって行われる、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がマウスまたはラットである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生殖器が卵管である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
- 前記試薬組成物が、該試薬組成物を卵管の内腔に注入することによって卵管に導入される、請求項12に記載の方法。
- 対象の媒精後からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器であって、ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を含む生殖器。
- 前記期間が0.5日(12時間)〜1.4日(33.6時間)である、請求項14に記載の生殖器。
- 前記期間が約0.7日(16.8時間)である、請求項15に記載の生殖器。
- 前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項14〜16のいずれか一項に記載の生殖器。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項17に記載の生殖器。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項17に記載の生殖器。
- 前記試薬組成物が一本鎖(ssDNA)修復テンプレートをさらに含む、請求項14〜19のいずれか一項に記載の生殖器。
- 前記対象がマウスまたはラットである、請求項14〜20のいずれか一項に記載の生殖器。
- 前記生殖器が卵管である、請求項14〜21のいずれか一項に記載の生殖器。
- ヌクレアーゼ系および/または外因性ポリヌクレオチドを含む試薬組成物を、対象の媒精からある期間後の該対象に由来する受精で生じた接合子を含む生殖器に導入するための、エレクトロポレーターの使用。
- 前記期間が0.5日(12時間)〜1.4日(33.6時間)である、請求項23に記載の使用。
- 前記期間が約0.7日(16.8時間)である、請求項24に記載の使用。
- 前記ヌクレアーゼ系が、RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドとガイドRNAポリヌクレオチドを含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の使用。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCas9ポリペプチドを含み、かつ前記ガイドRNAがcrRNAとtracrRNAを含む、請求項26に記載の使用。
- 前記RNAプログラム可能なヌクレアーゼポリペプチドがCpf1ポリペプチドを含む、請求項26に記載の使用。
- 前記試薬組成物が一本鎖(ssDNA)修復テンプレートをさらに含む、請求項23〜28のいずれか一項に記載の使用。
- 前記対象がマウスまたはラットである、請求項23〜29のいずれか一項に記載の使用。
- 前記生殖器が卵管である、請求項23〜30のいずれか一項に記載の使用。
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