CN114317598A - 病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法。所述基因沉默载体是基于柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆质粒而构建的。所述基因沉默载体是通过将目的基因片段整合到CLBV侵染性克隆质粒pCLBV201构建得到的重组质粒载体，目的基因片段优选反向连接在所述质粒载体pCLBV201中CLBV基因组cp基因终止子与3’UTR之间。本发明提供的靶向柑橘lob基因的基因沉默载体阻断柑橘溃疡病菌与靶标基因结合，可以达到良好的溃疡病防控效果，并且成本低廉，环境友好。本发明构建的靶向CYVCV基因组不同ORF的基因沉默载体能够有效抑制CYVCV在植株内转录表达，进而实现对柑橘黄脉病的预防和控制。

Description

病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法。

背景技术

柑橘是世界上种植最广泛的水果之一。柑橘溃疡病和柑橘黄脉病是常见的柑橘病害。

柑橘溃疡病是由柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citri ssp.citri，Xcc)引起的一种破坏性极强的细菌病害。感染该菌的柑橘叶片、枝条、果实等出现溃疡病斑症状，导致树势衰退、落叶落果等，严重影响柑橘产业发展。目前柑橘溃疡病主要依靠大量、多次的铜制剂等农药进行防控，造成农民种植成本升高，环境污染，严重制约柑橘产业的健康发展。

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow clearing vein virus，CYVCV)引发，感染该病后的树木出现枯死、果实畸形、颜色差、种子败育、叶脉发黄等症状，对光看有典型叶片脉明症状，通常还伴随着叶片卷曲。柑橘黄化脉明病毒可通过柑橘粉虱(Dialeurodes citri)、绣线菊蚜(Aphis spiraecola)以及污染的刀具在柑橘之间进行高效传播，对柑橘产业具有重大威胁，目前尚无有效药剂防治该病毒。

发明内容

本发明采用基于柑橘叶斑驳病毒(Citrus leaves blothing virus，CLBV)诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)体系，开发出用于防控柑橘病害的基因沉默载体。

一方面，本发明的目的在于提供一种病毒诱导的基因沉默载体，该基因沉默载体是基于柑橘叶斑驳病毒的质粒载体而构建的。

优选地，所述基因沉默载体是通过将目的基因片段整合到基于柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆质粒载体pCLBV201构建得到的重组质粒载体，所述质粒载体pCLBV201具有SEQID No.1所示的DNA序列。所述目的基因片段优选通过反向连接在所述质粒载体pCLBV201中CLBV基因组cp基因终止子与3’UTR之间的方式被整合到所述质粒载体pCLBV201中。

优选地，柑橘lob基因片段作为所述目的基因片段被整合到所述质粒载体pCLBV201中。所述柑橘lob基因片段优选具有如SEQ ID No.2所示的序列。

优选地，来源于柑橘黄化脉明病毒的基因片段作为所述目的基因片段被整合到所述质粒载体pCLBV201中。

进一步优选地，所述来源于柑橘黄化脉明病毒的基因片段选自以下任一种核酸片段：具有SEQ ID No.3所示序列的核酸片段或其变体，具有SEQ ID No.4所示序列的核酸片段或其变体，具有SEQ ID No.5所示序列的核酸片段或其变体，或者具有SEQ ID No.6所示序列的核酸片段或其变体。

本发明另一方面还提供上述病毒诱导的基因沉默载体的应用，所述基因沉默载体用于防控柑橘病害，包括以下步骤：1)将所述基因沉默载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；2)通过利用所述重组农杆菌侵染柑橘来将所述基因沉默载体引入到柑橘植株中。

根据上述病毒诱导的基因沉默载体的应用，优选还包括将引入了所述基因沉默载体的柑橘植株进一步繁殖，获得具有持续防控病害能力的柑橘植株。

根据上述病毒诱导的基因沉默载体的应用，所述柑橘病害包括柑橘溃疡病、柑橘黄脉病或其他病害。

本发明还提供一种通过进行病毒诱导的基因沉默来防控柑橘病害的方法，所述方法包括以下步骤：1)将包含能够沉默目标基因的沉默序列的核酸插入到包含柑橘叶斑驳病毒序列的质粒载体中，构建得到重组质粒；2)将所述重组质粒转化农杆菌，得到重组农杆菌；3)通过利用所述重组农杆菌侵染柑橘来将所述基因沉默载体引入到柑橘植株中。

根据本发明的防控柑橘病害的方法，所述柑橘病害包括柑橘溃疡病、柑橘黄脉病或其他病害。

本发明通过沉默尤力克柠檬(Citrus limon)中的侧生器官边界(Lateral organboundaries，LOB)基因(下文简称为lob基因)，阻断柑橘溃疡病菌与靶标基因结合，可以达到良好的溃疡病防控效果，并且成本低廉，环境友好。

本发明构建的靶向CYVCV基因组不同ORF的VIGS重组载体能够有效抑制CYVCV在植株内转录表达，进而实现对柑橘黄脉病的预防和控制。

附图说明

图1示出了质粒载体pCLBV201的图谱。

图2示出了本发明实施例所涉及的目的基因片段在质粒载体pCLBV201中插入位置。

图3是示出筛选鉴定lob基因沉默植株结果的图，其中A示出了通过RT-PCR检测验证尤力克柠檬植株中lob基因的结果，图中的M是DNA标准分子量，泳道1～3是重组质粒载体pCLBV201-lob376接种的植株，泳道4～6是质粒载体pCLBV201接种的植株；B示出了对尤力克柠檬lob mRNA定量分析的结果，图中标注*表示差异显著(P＜0.05)，**表示差异极显著(P＜0.01)。

图4是示出柑橘溃疡病菌抗性评价结果的图，其中A示出了叶片接种柑橘溃疡病菌后的发病情况，图中的数字1～9是接菌叶片研磨后的稀释倍数；B示出了接种柑橘溃疡病菌后的叶片病斑面积；C示出了叶片接种柑橘溃疡病菌后的病情指数；D示出了叶片接种柑橘溃疡病菌后的对含菌量定量分析的结果。

图5是示出通过RT-PCR筛选鉴定接种了重组质粒载体pCLBV201-CY297、pCLBV201-CY311、pCLBV201-CY310和pCLBV201-CY313的尤力克柠檬的结果的图，其中A是接种了重组质粒载体pCLBV201-CY297的尤力克柠檬，B是接种了重组质粒载体pCLBV201-CY311的尤力克柠檬，C是接种了重组质粒载体pCLBV201-CY310的尤力克柠檬，D是接种了重组质粒载体的pCLBV201-CY313的尤力克柠檬，E是接种了质粒载体pCLBV201的尤力克柠檬，各图中M是DNA标准分子量，泳道1～5是样品，泳道6是ddH₂O。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。

本发明所用的术语“病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing，VIGS)技术”是指通过在病毒载体中插入一段目标基因片段，将其侵染植株以激发植株防御机制，使得植株对病毒产生抑制，同时也抑制与插入片段同源或类似的内源基因表达的技术。

术语“柑橘lob基因”是指侧生器官边界(Lateral organ boundaries，LOB)基因，其是柑橘溃疡病菌主要致病因子PthA的靶标基因。

术语“柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus，CYVCV)”……

实施例1：构建重组质粒载体

以具有柑橘侵染性的质粒载体pCLBV201为基础分别构建重组质粒载体pCLBV201-lob376、pCLBV201-CY297、pCLBV201-CY311、pCLBV201-CY310和pCLBV201-CY313。

本实施例中所用的质粒载体pCLBV201是本发明申请人基于柑橘叶斑驳病毒构建的柑橘侵染性克隆，其具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。

以LOB376F/LOB376R(序列见表1)为扩增引物，以尤力克柠檬cDNA为模板，利用高保真试剂盒PrimeStar通过PCR扩增获取目的基因片段。该目的基因片段是柑橘lob基因中的部分片段，其具有SEQ ID No.2所示的DNA序列，为了便于描述，下文将其称为lob367基因片段。将该lob367基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，使得柑橘lob基因片段反向连接到质粒载体pCLBV201的cp与3’UTR之间，获得重组质粒载体pCLBV201-lob376，用于防控柑橘溃疡病。

以CYVCV 297-F/CYVCV 297-R(序列见表1)为扩增引物，以本发明申请人自行构建的CYVCV侵染性克隆CYVCV221为模板，利用高保真试剂盒PrimeStar通过PCR扩增获取目的基因片段，为了便于描述，将该目的基因片段称为CY297基因片段，其是CYVCV ORF1中的部分片段，具有SEQ ID No.3所示的DNA序列。将该CY297基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，使得CY297基因片段反向连接到质粒载体pCLBV201的cp与3’UTR之间，获得重组质粒载体pCLBV201-CY297，用于防控柑橘黄脉病。

以CYVCV 311-F/CYVCV 311-R(序列见表1)为扩增引物，以CYVCV侵染性克隆CYVCV221为模板，利用高保真试剂盒PrimeStar通过PCR扩增获取目的基因片段。为了便于描述，将该基因片段称为CY311基因片段，其是CYVCV ORF5中的部分片段，具有SEQ ID No.4所示的DNA序列。将该CY311基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，使得CY311基因片段反向连接到质粒载体pCLBV201的cp与3’UTR之间，获得重组质粒载体pCLBV201-CY311，用于防控柑橘黄脉病。

以CYVCV 310-F/CYVCV 310-R(序列见表1)为扩增引物，以CYVCV侵染性克隆CYVCV221为模板，利用高保真试剂盒PrimeStar通过PCR扩增获取目的基因片段。为了便于描述，将该基因片段称为CY310基因片段，其是CYVCV ORF6中的一部分片段，具有SEQ IDNo.5所示的DNA序列。将该CY310基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，使得CY310基因片段反向连接到质粒载体pCLBV201的cp与3’UTR之间，获得重组质粒载体pCLBV201-CY310，用于防控柑橘黄脉病。

以CYVCV 313-F/CYVCV 313-R(序列见表1)为扩增引物，以CYVCV侵染性克隆CYVCV221为模板，利用高保真试剂盒PrimeStar通过PCR扩增获取目的基因片段。为了便于描述，将该基因片段称为CY313基因片段，其是CYVCV三基因连锁模块TGB中的部分片段，具有SEQ ID No.6所示的DNA序列。将该CY313基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，使得CY313基因片段反向连接到质粒载体pCLBV201的cp与3’UTR之间，获得重组质粒载体pCLBV201-CY313，用于防控柑橘黄脉病。

表1

上述各目的基因片段的PCR扩增反应体系如表2所示。

表2

用于扩增上述各基因片段的PCR反应程序见表3。

表3

利用In-Fusion HD Cloning Kit试剂盒将各基因片段与线性化的质粒载体pCLBV201进行同源重组反应，于冰上配制反应体系。各基因片段对应的反应体系见表4。各目的基因片段在质粒载体中的插入位置如图2所示。

将各反应体系在50℃下反应30min后迅速置于冰上冷却，随后转化大肠杆菌感受态细胞DH10B并通过PCR反应筛选阳性克隆。将筛选出的阳性克隆进一步进行测序验证，将验证后的阳性克隆扩大培养并从中提取纯化重组质粒载体。

表4

试剂使用量(μL)	LOB376	CY297	CY311	CY310	CY313
						目的片段	3	1.3	1	2.5	2
线性化的质粒载体	1.2	1.2	1.2	1.2	1.2
						5×In-Fusion HD Enzyme Premix	2	2	2	2	2
Dnase&Rnase free water	3.8	5	5.8	4.3	4.8
						总体积	10	10	10	10	10

实施例2：重组质粒载体转化农杆菌以及接种柑橘

将实施例1构建得到的各重组质粒载体分别转化农杆菌，随后用转化后的农杆菌接种尤力克柠檬。

1、重组质粒转化农杆菌，具体操作过程如下：

1)在超净工作台中，将电转杯冰上预冷5min，同时将农杆菌感受态细胞GV3101置于冰上5min；

2)待感受态细胞融合后加入3uL重组质粒载体，轻柔吸打混匀后，转入电击杯中，注意不要产生气泡，冰上放置30-60min；

3)将电转杯放入电转仪中，调节为Agr模式电击转化；

4)电击完成后，立即加入800uL的液体LB(不含抗生素)培养基，轻轻吸打混匀菌体与培养基，将混合液转入1.5mL离心管中，180rpm，培养2h；

5)5000rpm离心1min，吸弃800uL培养基，用剩下的培养基吸打重悬菌体并涂布到固体LB(Rif⁺/Kan⁺)培养基上；

6)28℃倒置培养2d，待长出单菌落后挑取单菌落于液体LB(Rif⁺/Kan⁺)培养基中，28℃、180rpm振荡过夜；

7)吸取650uL菌液，加等体积50％的甘油充分吸打混匀(甘油终浓度为25％)，液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

2、接种材料准备

柑橘：将尤力克柠檬鲜果种子在超净工作台内剥去种皮后播种于MS固体培养基(购自Basio公司)上，26℃、黑暗下培养8d，选取上胚轴萌发约3cm左右的柠檬嫩苗。

接种菌液配制：(i)菌株活化：从-80℃取出相应的农杆菌菌液，在固定的LB(Rif⁺/Kan⁺)培养基上划线，在28℃倒置培养2d，待长出单菌落后挑取单菌落到5mL液体LB(Rif⁺/Kan⁺)培养基中，28℃、200rpm，振荡培养24h；(ii)菌液扩繁：取活化后的500uL农杆菌菌液接种到500mL农杆菌扩繁培养基中同过夜培养至菌液OD₆₀₀＝1.0；(iii)菌液重悬：将扩繁菌液4℃、6000rpm离心8min，吸净培养基，加接种缓冲液吸打重悬菌体，并调整OD₆₀₀＝1.0，将接种菌液26℃避光孵育3h。

3、接种

在超净工作台内将柑橘嫩苗浸在转化了重组质粒载体的农杆菌菌悬液中，真空浸润后，迅速用无菌水冲洗，然后小心将其移栽回新的MS固体培养基中，以pCLBV201菌液浸润的柑橘为对照。接种后26℃避光培养2d，转入光照培养箱继续培养。

4、VIGS植株的柑橘病害病原体离体抗性评价

本部分实验在西南大学柑桔研究所脱毒中心隔离实验室内进行。在本部分的说明中，为了便于描述，将接种有重组质粒载体的柑橘称为VIGS植株。

(1)VIGS植株的柑橘溃疡病菌离体抗性评价

将接种农杆菌后的柑橘苗光照培养30d后，通过一步法RT-PCR筛选出有lob367基因片段稳定表达的VIGS植株。沉默实验组植株通过使用交叉引物对CLBV-F/LOB376-F扩增pCLBV201载体的部分序列和插入的部分目的基因序列来进行检测，反应体系如表5所示。

表5

对照组植株使用引物对CLBV-F/CLBV-R进行检测，反应体系如表6所示。

表6

一步法RT-PCR的反应程序如下：

结果如图3中的A所示，结果显示在接种了转化有重组质粒载体pCLBV201-lob376的农杆菌的柑橘植株中能检测到lob376基因片段的表达，而对照组未检测到lob376基因片段的表达，表明pCLBV201-lob376成功侵染柑橘体并且能稳定表达。

接下来，针对能检测到lob376基因片段表达的植株，使用实时荧光定量PCR检测植株中lob基因的相对表达水平。提取样品总RNA，利用

Plus All-in-one 1stStrand cDNA Synthesis SuperMix(gDNA Purge)进行反转录合成cDNA，然后通过实时荧光定量PCR检测柑橘植株中lob基因的表达水平。以Actin作为内参基因，检测lob基因的相对表达量，每个样品设定3个技术重复。针对lob基因的实时荧光定量PCR体系如表7所示。

表7

针对内参基因的实时荧光定量PCR反应体系如表8所示。

表8

实时荧光定量PCR反应程序如下：

通过实时荧光定量PCR计算Ct值，采用2^-△△Ct法计算相对表达量，使用Excel进行数据统计并绘图，使用SPSS进行独立样本T检验，分析其显著性(显著水平：P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著)。结果如图3中的B所示，其相对表达量显著降低76.91％(显著水平：P＜0.01)，表明在接种了转化有重组质粒载体pCLBV201-lob376的农杆菌的尤力克柠檬植株内lob基因的表达受到了抑制，将筛选出的阳性植株进一步培养后进行下一步试验。

接下来，针对柑橘溃疡病菌离体抗性进行评价。

取上述检测有VIGS载体携带的lob367基因片段稳定表达并且检测lob基因相对表达量下降的三月龄植株叶片，用于柑橘溃疡病菌离体抗性评价。

将保存在-80℃超低温冰箱柑橘溃疡病菌接种到1mL液体LB培养基(不含抗生素)中，28℃、200rpm下振荡培养24h后，蘸取活化后的菌液在固体LB平板(不含抗生素)上划线，在28℃培养箱中倒置进行复苏培养，培养2d后将培养基上长出菌落进行刮取，置于干净的1.5mL离心管中用灭菌ddH2O进行重悬，调整为OD₆₀₀＝0.5，进行下一步实验。

将柑橘叶片用75％酒精进行表面杀菌后，用灭菌ddH2O清洗2～3次，晾干后，用接种针在每片叶片的背面刺4孔，每组6个，每个针孔接种重悬的柑橘溃疡病菌菌液1uL，置于光照培养箱内28℃培养10d，湿度40％～60％下光照16h。观察发病情况，拍照记录病斑，使用Image J V1.47测量并计算病斑面积(lesion area，LA，mm²)。根据病斑面积大小按照以下分级进行统计：0级(LA＝0)，1级(0＜LA≤1.5)，3级(1.5＜LA≤3)，5级(LA≥3)。基于病斑数量和分级情况测定病情指数(disease index，DI)，病情指数计算公式为：

图4中的A示出了接种溃疡病菌后叶片的发病情况，结果显示接种溃疡病菌的叶片在10d后表现出不同程度发病，病斑大小存在一定的差异。图4中的B示出了病斑面积统计的结果，结果显示试验组病斑面积显著小于对照组，较对照组下降了63.85％，发病情况明显减轻。图4中的C示出了病情指数分析的结果，结果显示试验组的病情指数较对照组显著下降了14.25％。

接下来对上述柑橘叶片上病斑中的菌群数变化检测。将柑橘叶片用75％酒精进行表面杀菌后，用灭菌ddH2O漂洗2～3次，晾干后，用打孔器取两组病斑，保持叶片大小相同，于干净的1.5mL离心管内，加入500uL灭菌ddH₂O研磨，将研磨液用灭菌ddH₂O进行5倍梯度稀释，并用移液器取5uL研磨液和稀释研磨液按稀释顺序滴于LB平板(不含抗生素)上，28℃倒置培养2d。

此外，通过实时荧光定量PCR检测叶片病斑中的含菌量。用打孔器收集剩余的两组病斑，采用DNA提取试剂盒从病斑中提取DNA，进行实时定量PCR检测溃疡病菌的含量，实时定量PCR检测溃疡病菌的含量并利用SPSS软件进行后续的数据分析。实时荧光定量PCR体系如下表9所示。

表9

反应程序如下：

图4中的A示出了菌群数检测结果，显示试验组叶片上细菌数低于对照组相同稀释倍数下的细菌数。图4中的D示出了实时荧光PCR检测试验组叶片含菌量的结果，结果显示试验组较对照组显著下降了66.67％(显著水平：P＜0.01)

上述结果表明，本发明构建的病毒诱导的基因沉默载体，即重组质粒载体pCLBV201-lob376在柑橘植株体内能够顺利地沉默lob基因的表达，进而实现对柑橘溃疡病的预防和控制。

(2)VIGS植株的柑橘黄化脉明病毒抗性评价

参照前述过程，使用RT-PCR检测CYVCV相关基因片段在柑橘植株中的表达情况。结果如图5所示，结果显示本发明所涉及的各CYVCV相关基因片段均能在柑橘植株中成功表达。

进一步筛选CYVCV相关基因片段稳定表达的VIGS阳性植株，用CYVCV阳性的柑橘粉虱对它们进行攻毒试验。将CYVCV阳性的柑橘粉虱投放于植株的隔离网中进行传毒，每隔5d投放一次，每次约300头，持续一个月。之后对植株进行杀虫处理，清理粉虱，再置于隔离网室培养，三个月后检测植株中柑橘黄化脉明病毒的传毒情况。所有试验组的植株中均未检测到CYVCV，这表明，本发明构建的靶向CYVCV基因组不同ORF的VIGS重组载体能够有效抑制CYVCV在植株内转录表达，进而实现对柑橘黄脉病的预防和控制。

申请人结合说明书附图对本发明的实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 病毒诱导的基因沉默载体及其应用和柑橘病害防控的方法

<130> SWU2021-01

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 18397

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attaatgcat gcctgcagtc aacatggtgg agcacgacac tctcgtctac tccaagaata 60

tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg ctattgagac ttttcaacaa agggtaatat 120

cgggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca cttcatcgaa aggacagtag 180

aaaaggaaga tggcttctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggct atcgttcaaa 240

gaatgcctct accgacagtg gtcccaaaga tggacccccc acccacgagg aacatcgtgg 300

aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat aacatggtgg 360

agcacgacac tctcgtctac tccaagaata tcaaagatac agtctcagaa gaccagaggg 420

ctattgagac tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc 480

tatctgtcac ttcatcgaaa ggacagtaga aaaggaagat ggcttctaca aatgccatca 540

ttgcgataaa ggaaaggcta tcgttcaaga atgcctctac cgacagtggt cccaaagatg 600

gacccccacc cacgaggaac atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc 660

aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 720

cgcaagaccc ttcctctata taaggaagtt catttcattt ggagagggaa aagcaacgaa 780

agcaacctac acaacccaaa attaacatat tgcaataact gttatcactc aatataagcc 840

atggctttga tgagcaacaa aactgcaatt gaatccattt tgggtaactt tgaaaagaaa 900

cacgtcgatg caatctacaa tgctgccgca caaactatcc tctctcactc tgaatttagg 960

aataagcatt ttgcttattc actcaattct tatcaaaaga agatagcctc aaaggtgggt 1020

attgaattgt atccaaatgg ttatttacca cattcccatc cattgtcaaa aatttttgag 1080

aaccatttgc tttttgatgt acttcctggc gtagtaaata ctagcagatt agttatgtgt 1140

agcataaagg agtccaaagt tctggttttt aaaggaattc gcgacaaatc cagaagacag 1200

gtttcagacc tcaatgccct caattcctta aataatagtc atacatcatt cattaatagg 1260

ttagttgcat ccaaagacgt gagtagatat acagaggaag ctgatgcttt ttttcaatcc 1320

aagaaaggga gtccggagct attttcaagg aatttcatca aaagcttgga aaataaagag 1380

gctgtttttt ttcatgatga agttcatcac tggactaagg cccaaatgtt ctcatttctt 1440

aaaagtacga aggtcaaaag gttcattttc actgtggtct atccaccaga aattctcaaa 1500

aaatttgcca attcccagaa cccaaaggtt tatgatttca aagttgataa gggtcggctt 1560

tttttttttt ccggatgggg ttaagacaga ggcctatgag cagaaattaa atatggagtg 1620

gctcttttca gcatcacatc ttcgcagtgg agactgtgtg tggactgtaa caagacacaa 1680

gagtatttat gctcatcacc tctttgagat atccattggc gaactagtca cggactcaaa 1740

actttttttt tccgattata actccattga catgtctaaa atatttcttg atcgttttcg 1800

gagttatgag gtattcccca tttcgattga gcacctttat aaggtctact cttatctgct 1860

ttgcctcaaa aagcctgact tggagagtgg cctagccaaa ttaaggcaaa ttattggaga 1920

tgatgtcgaa atcaaagaat tcctcttctt tgaacaattt tgtaagcgct taattgaacg 1980

tcaaacctct tgggggctat ttgggcactc tttctttgaa aaattaaccg atatggcatt 2040

gtcatccttg cccaactcta tagcccgaat tttccctcaa tggaaaaaaa aaaacacatt 2100

tgagtttctt ttcttacttg ggactcttgt tgtggatgtg gagagaaagg tgtgttttga 2160

acatgtgctt gaggaatggg gatttgaagt cgttatcact gatgaaaatg cctatcttga 2220

tccactatct atctttgcta ttaatgaaaa ttttaatgag gatagagtgg acgatggcta 2280

tttggaaaga atccgtcttc ccttctggaa tctgaatgac tatgacttga aaaggaagag 2340

ggtaaatgcg tataacatcc tctcttatcg atttgaagag gagcgaaaaa ttgaatcagc 2400

gcaaaaaggt ccaaacaaga tgctccagat tgagtggtac gggattaaag agtttgaagt 2460

tgaccctttt atcagcaact ccataactga atttactctt ttagaagtat tgctgggaaa 2520

gaggatagat ccaaaaaaat actcatattc aaagcaagcc tgcactcttt ccaactatct 2580

cacatttttg tgtgctgagg gtttggatgg attcaatttg gaagagcacc ttgaacaaag 2640

gttgaaagcg gccggtcatg acatttcaga tgacgaggag gaagaattga cttcagctgg 2700

acaagcagga cccatcagga tattggctga tccacttggt tttatgaaag agtgtttgga 2760

ggagatccca atcgaaaccg aaccatcact ggaagaaagg ggacagtttt ccactgatca 2820

tcattttggg aaatttgaaa tcaattacaa tgacattttc aatcctcaca attgcatgaa 2880

cactcacggc gatgaaattc ccacaccatc agatggcaat tgtttttttt cagcatttac 2940

tgaaactttt gaagttgaaa gacctgacac cttaaggtct gatttctcag actggcttat 3000

ggaatttaat gggggatcct atgtttcact tgcagaaatg atcaggccgg atggagtttt 3060

tatggaggcg gaactaatat acctgttttg tgtatttaga ggagtcacat tgattattca 3120

tgatagaact catgaaaaag agaatgttta tgctgtacac cgcgggtttg aagagggcca 3180

tatggtgcat agaggcaatc attttgtcgg gattgaaact tataatatta gcactttaac 3240

ctcagacccc ttacttggtg acatcccatg cggtttttca gaggaaatta caaaattcca 3300

ttttcggcct gatcatttca attgtgccca gttcatagga aggaaggcgg cttttatcac 3360

caaagttgat gcagattacg ggcacaacgg tatggtttac ccccacaatt catgggtacc 3420

ttctttagac gagatcattc aaatctgtgg tcagggggat gatttcaatt gtgcattaat 3480

aaatttctat gaggcaaact catctcttgg gttccataga gataatgaac gggtgtacaa 3540

tgatgatccc attttaaccg tctgcacatt cggtgaaggt acattcacca tcgaatttaa 3600

ggatcaggta acctcttttc taatgactgc tggctctttc tttttaatgc ctaaagggtt 3660

ccagaagaag gcaagacact ctgtttcaaa tgggatgtcg agagtctcga ttactttcag 3720

gaagcatgtt agaaggttga atgggtcacc gattgctata agggaagaaa attacaaaaa 3780

tacatgcctc attaatgcat tttcaaaagc aatgaaaagg agtaaacagg caatcattgc 3840

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ctccattgag gattgccaat cggcctgtga ggcactagat gttactgtcg accttaatgt 3960

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caaccatttt tcagttatca atgctgcaca actgatggag aggacttttg ttagccactt 4080

acttgaaaaa ggaaatgtca atgtgttaga aggatttgac gaaatgctaa gtggtgatgt 4140

gggcgcagca ggtgtcaaca aaattcaatt tgcagccaat ttcgaatttg ccagaatttt 4200

ggcaaattca tttctaaata tgacaactgg catctgcctg ggcaaggcat tggacaatgg 4260

ggaaaagtat tttctccaca ttttgaaaga tagagtaaaa cagattggca tagatgtcac 4320

aatggtgtgc gggtttgccg gatcggggaa aagtcgcaaa ctgcagtcct ggctgcattc 4380

aaaaaaaaaa gggaacttct gcgtggtttc cccaagaaca aacttagccg ctgactgggc 4440

attcaagtta gaattagagc ccaatgaaca gagaaagatt tcaacatttg aaaaattcat 4500

caaaactgat aaaagcaaat tagatctcat agttattgat gaattgacat tgtttccaaa 4560

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atttgaacat gacgtggata ggcttattgg tggacagagc attgagtata tttacagtac 4740

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ctccgaccgt caggaaccat gtgatgttct tttggttgaa tctgaccttg aaaagaaggc 4920

attttcaccc atcatgaatg tcatgacatt tggtgaatcc cagggactca catttaatca 4980

tgtttgtatt ttgctgtcag agtccagtgc agcttcaaac gaatttagat ggatggtggc 5040

tctgacgaga tcaagaacca ggttttcact ctgttcgacc ttcttaggcg ggattgaaga 5100

atttaaagtc aaaaggaaag aaagtctcat cacatccata ctccaaggcg agaagatcac 5160

attcaacaga ttaaatatga tgctgaaatg caatttaatt aggagagaaa aagaaaatgg 5220

gtgcagagat gaggtcgata gggaggaaag gttggagggt gacccttttc tcaaaccatt 5280

catcttcttg ggacaaagag ttgagaagga tgaagatgag gtagaagaag tgaagatcag 5340

ggaaccaacc tgtcaaactc atctgtatat aacagagcct aattttggtt tgtgctacaa 5400

ttttgacttc attagggaaa aagaacagcg ggaatacaga gaggatatgc ttgtaactaa 5460

ccaattctgt gacagttatg ataaggttca tataaacggc aaaagagaaa cccctggtcc 5520

cctgcgattc aaagcgattt atccaaagca ctcagccgat gatgacatga cgttctggat 5580

ggctgtcaga aaaaggcttg tatttagaga ggaggaggag aattatcaaa ggttgtcaag 5640

ggcgcatttg gttgggggtt tgctatacac caacttcaaa aaaaaaatgg gcctggaatt 5700

tacgtttgac cagggtctac tggaggaaag cataaacgca tttgaaaaga aaaagctgga 5760

aaaatcatgt ggcacaatta aatctcatag cataaggtca gacattgatt gggcgctgaa 5820

tgatgtattt cttttcatga aaagccagtt atgcaccaag tacgaaaaac aatttgttga 5880

tgctaaagcg ggtcaaactc ttgcctgttt tcagcaccta attttggtac agttcgctcc 5940

atggtgtaga tatttagaaa cccagatcag aaatcagttg cctgaagaaa tttacattca 6000

ctcaaataaa aattttgatg atttgaatgt atgggtcaaa aaatttttcc agagggatat 6060

ctgtgttgag tctgattatg aagcatttga tgcaagccag gatgaataca tattgtcctt 6120

cgaggtccat ctgatgaaag atgcgcattt tccgcaggaa atcattgatg catacataga 6180

ccttaaatgc aaattgggat gcaaattggg ccatttttca ataatgagat ttacagggga 6240

attttgcacc ttcctattca acacactggc caatatggca ttcactatgt gcagatacga 6300

atggaggaga ggacaaccaa ttgcattcgc aggagatgat atgtgtgcat taaacaattt 6360

ggctgtttgt catgatttcg atgacctttt tgaactcatc agccttaaag ctaaggtaga 6420

aaggacagaa accccaatgt tttgtggatg gagactaact ccatatggga ttgtgaagga 6480

gcctgaatta gtctataatc gctttcaagt agccattgaa gagggaaagg tcttggagtg 6540

tctggaaaat tatgcaatcg aggtttctta tgcctacagt ttaagtgaga ggctgtatga 6600

agttttgaaa agtgaaaggc aagttcagta tcatcaagct gtggttagat ttatagtcac 6660

gcatattgac aaactcaaaa caaaagtgag ggaccttttc ttagaacaat cttctgacga 6720

agatatctga tggcatccct gatcaatgta agttcacttg taaatagggt gaagttggat 6780

caaagtataa taggtagtga tgaaataaat aaactgtatg gttccgatgc accattggta 6840

ttcaaagatg aagttaaaat ggttattcct gggaatgctg agggtgaggc aatcaaattg 6900

caagccaata ttctgactgc tgacagattg cagtcaataa ggaatgcaaa agtcaatggc 6960

aaagaagcgg cttatctgca tttgggattt gttccaattg caattagatc tctattacct 7020

tctggaaatg aacagatctg gggtagatgc gcactggtag atactagcag aactcgagcc 7080

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caggtgctgc tggagctcca tggtgttgat ctgagggaag aacgttctgt agcagcaatc 7260

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gaacagtggc ttgacgaagg taagcgaaca cctttgattg gcaacttggc aattaagggg 7500

tttggacgca aagtgatgcc tgttcgcaga cgaaacctca ccacgaaaaa cctcatgaag 7560

gattatgtgt ctcatgttaa gtcagagacg gcttcactga aaagaagtca aagtgggaga 7620

gattggggta atgatagatt gagaaaatat ctagaagagc aggctctgga gcaggccaga 7680

tcatcaactg atcagcagtt agttaaagca ccaaaattca aaaccatcga agtgactggt 7740

ttgaaaactg tgcatgatct aaaagataaa attgacaagg cagagtcttc aactgccagt 7800

gacactggga ccaagtgagt ataacgtgtg actagtgtaa atagttagta cttatctaaa 7860

ttaatctaga tagtgtacat ccatgaaaat caccaatgat aatgccgcaa ctatcaacta 7920

ttggttagcc atagttgaac cattcctcac atctgatgag gacagaaatt ctgatgacat 7980

cattcaaaaa ttcagagctg tagtggccga gcatggggac acagaggagg tggaccctga 8040

ggtcttcttc gccatctttt ccatcttggc cacaaagtac ggcagagttt attcaaaaaa 8100

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cagtggatct tctgaaccgg tgcatgctga atcagcacac gctccacagt tgcatgtggt 8340

gaatgatctg caacaattct acataccatt caatgaatac ccaagtctaa ctcagtcaat 8400

aggtacttct gacattgcaa atgatgagca cctcaagaga gtgcaactta cgctcaaaat 8460

tacagacacg aaggtctttt caagaactgg atttgaattt gcgataagtt gtggatcaag 8520

aagtacgtca gacaaggacc catatgatgg tataatcaag atcagcggga aaagtcatat 8580

gaggaaagat atagcatatg caataagaac ttcgggaatt actgtgaggc aattctgtgc 8640

agcctttgcg aatctatatt ggaatttcaa tttggccaga aatactcctc ctgaaaactg 8700

gaggaagaag ggattcacag agggaacaaa gtttgcagct tttgactttt tctatgcagt 8760

aggtagcaat gcagcaattc caactgaagc tgatgggagc gttagactga taaggcctcc 8820

aacaaatgaa gaaaatgagg ctaactctgc tatgaggtat gctgacatat acgagcaaaa 8880

ttcaaaaaca gctggacatg taacttcaag tccactgtac aatcgtggga gcagttatga 8940

gagcaaaaac aaagcaaaac tcttagaaat gtagcccggg tcccgaattc tggcatgggc 9000

ggatgggtgg gccaggactt tacactctta aagtataagt aaggggtaac tcagccgcac 9060

gggtgaagat tgtgcggagc ctcatgaatc tgaatccaag atgctaaagg ggataccgcg 9120

acctgagggg tcatgggggt tagcctgaaa aacagaacac tcattaagta tgtggtgacg 9180

caggtcccga caacccaaaa aggtgagctg aacctgatcc aattggagca gtacaggtaa 9240

agttatatcc tttctataaa ttgaaaggta gtttggacag atacatgtca ttcaattggt 9300

gtggaacgtt agtccaaatg aaccatttat gcttggatgg aaagtcaagc aaacgttgtc 9360

aatgtgtacg tgaaattgtc aaataaacct cagcaatttc tataccctct ttgtgctgag 9420

tattgtagag ggtgaaggtg tgttttccat tttacacgtc aataaaataa aatatgtatt 9480

acttaaatac acatagggat gtcttttaag aacttttaga caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 9540

agggtcggca tggcatctcc acctcctcgc ggtccgacct gggcatccga aggaggacgt 9600

cgtccactcg gatggctaag ggagagctcg aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa 9660

taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg 9720

ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg 9780

gtttttatga ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag 9840

cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcgggaatta 9900

aactatcagt gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt 9960

agaataacgg atatttaaaa gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgtgc 10020

atgccaacca cagggttccc ctcgggatca aagtactttg atccaacccc tccgctgcta 10080

tagtgcagtc ggcttctgac gttcagtgca gccgtcttct gaaaacgaca tgtcgcacaa 10140

gtcctaagtt acgcgacagg ctgccgccct gcccttttcc tggcgttttc ttgtcgcgtg 10200

ttttagtcgc ataaagtaga atacttgcga ctagaaccgg agacattacg ccatgaacaa 10260

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caaccaacgg gccgaactgc acgcggccgg ctgcaccaag ctgttttccg agaagatcac 10380

cggcaccagg cgcgaccgcc cggagctggc caggatgctt gaccacctac gccctggcga 10440

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ccggccagct tggccgctga agaaaccgag cgccgccgtc taaaaaggtg atgtgtattt 11160

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cgaggtccag gcgctggccg ctgaaattaa atcaaaactc atttgagtta atgaggtaaa 11880

gagaaaatga gcaaaagcac aaacacgcta agtgccggcc gtccgagcgc acgcagcagc 11940

aaggctgcaa cgttggccag cctggcagac acgccagcca tgaagcgggt caactttcag 12000

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gagtagatga attttagcgg ctaaaggagg cggcatggaa aatcaagaac aaccaggcac 12180

cgacgccgtg gaatgcccca tgtgtggagg aacgggcggt tggccaggcg taagcggctg 12240

ggttgtctgc cggccctgca atggcactgg aacccccaag cccgaggaat cggcgtgacg 12300

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tgttgctgtc tcccaggtcg ccgtgggaaa agacaagttc ctcttcgggc ttttccgtct 15240

ttaaaaaatc atacagctcg cgcggatctt taaatggagt gtcttcttcc cagttttcgc 15300

aatccacatc ggccagatcg ttattcagta agtaatccaa ttcggctaag cggctgtcta 15360

agctattcgt atagggacaa tccgatatgt cgatggagtg aaagagcctg atgcactccg 15420

catacagctc gataatcttt tcagggcttt gttcatcttc atactcttcc gagcaaagga 15480

cgccatcggc ctcactcatg agcagattgc tccagccatc atgccgttca aagtgcagga 15540

cctttggaac aggcagcttt ccttccagcc atagcatcat gtccttttcc cgttccacat 15600

cataggtggt ccctttatac cggctgtccg tcatttttaa atataggttt tcattttctc 15660

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ctcttttcta cagtatttaa agatacccca agaagctaat tataacaaga cgaactccaa 15840

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agcgaggaag cgcgtaacta taacggtcct aaggtagcga atcctgatgc ggtattttct 16020

ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catagatcgg caagtgcaca aacaatactt 16080

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gttagagtct tttacaccat ttgtctccac acctccgctt acatcaacac caataacgcc 16200

atttaatcta agcgcatcac caacattttc tggcgtcagt ccaccagcta acataaaatg 16260

taagctttcg gggctctctt gccttccaac ccagtcagaa atcgagttcc aatccaaaag 16320

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agctgcactg agtagtatgt tgcagtcttt tggaaatacg agtcttttaa taactggcaa 16440

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gccgtaatca ttgaccagag ccaaaacatc ctccttaagt tgattacgaa acacgccaac 16560

caagtatttc ggagtgcctg aactattttt atatgctttt acaagacttg aaattttcct 16620

tgcaataacc gggtcaattg ttctctttct attgggcaca catataatac ccagcaagtc 16680

agcatcggaa tctagagcac attctgcggc ctctgtgctc tgcaagccgc aaactttcac 16740

caatggacca gaactacctg tgaaattaat aacagacata ctccaagctg cctttgtgtg 16800

cttaatcacg tatactcacg tgctcaatag tcaccaatgc cctccctctt ggccctctcc 16860

ttttcttttt tcgaccgaat taattcttaa tcggcaaaaa aagaaaagct ccggatcaag 16920

attgtacgta aggtgacaag ctatttttca ataaagaata tcttccacta ctgccatctg 16980

gcgtcataac tgcaaagtac acatatatta cgatgctgtt ctattaaatg cttcctatat 17040

tatatatata gtaatgtcgt gatctatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg 17100

catagttaag ccagccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc 17160

tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga 17220

ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt 17280

tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgga tcgcttgcct gtaacttaca 17340

cgcgcctcgt atcttttaat gatggaataa tttgggaatt tactctgtgt ttatttattt 17400

ttatgttttg tatttggatt ttagaaagta aataaagaag gtagaagagt tacggaatga 17460

agaaaaaaaa ataaacaaag gtttaaaaaa tttcaacaaa aagcgtactt tacatatata 17520

tttattagac aagaaaagca gattaaatag atatacattc gattaacgat aagtaaaatg 17580

taaaatcaca ggattttcgt gtgtggtctt ctacacagac aaggtgaaac aattcggcat 17640

taatacctga gagcaggaag agcaagataa aaggtagtat ttgttggcga tccccctaga 17700

gtcttttaca tcttcggaaa acaaaaacta ttttttcttt aatttctttt tttactttct 17760

atttttaatt tatatattta tattaaaaaa tttaaattat aattattttt atagcacgtg 17820

atgaaaagga cccaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 17880

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 17940

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 18000

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 18060

atgccgcggt gatcacaggc agcaacgctc tgtcatcgtt acaatcaaca tgctaccctc 18120

cgcgagatca tccgtgtttc aaacccggca gcttagttgc cgttcttccg aatagcatcg 18180

gtaacatgag caaagtctgc cgccttacaa cggctctccc gctgacgccg tcccggactg 18240

atgggctgcc tgtatcgagt ggtgattttg tgccgagctg ccggtcgggg agctgttggc 18300

tggctggtgg caggatatat tgtggtgtaa acaaattgac gcttagacaa cttaataaca 18360

cattgcggac gtttttaatg tactgaatta acgccga 18397

<210> 2

<211> 269

<212> DNA

<213> Eureka lemon

<400> 2

gaatgcaaac acaaaattaa tgtagcaatc ccaatcacta atatgaagaa cactcaattc 60

tcatctccat ctactttctc tacttctcct ccttctcaat cttctccacg cttcccttct 120

cctaatcatc aacaattgtc ttctccagaa tcttctccaa gctttaaagc ttctccttca 180

caatcctctc caaatcttgc agctcccctc tctccgccgc ctatagttct tagcccttgt 240

gctgcttgca aaatcctccg ccgcagatg 269

<210> 3

<211> 297

<212> DNA

<213> 柑橘黄化脉明病毒

<400> 3

aaagagattc gtatgacaat taccgcccaa atgctcgaaa gcttaggtgc gaatcatctt 60

ttctgcttca aacgtgggaa actacacacc ccacgtgtac gcactttcgg ccgagatacc 120

caagtgctct tgcccaaaat cttccgcccg gccgacaaaa actttaacag ggcaatacca 180

ctaaccctag ctaacaaact actcctgtac gctaaatcca ttaacacagt gaccttccgc 240

gacgtcgttg ccaagacacg ccaacttatg aaggacaagg agcttgaaac atacacc 297

<210> 4

<211> 311

<212> DNA

<213> 柑橘黄化脉明病毒

<400> 4

gctcaacctc aacctaagat actcaccggt cactaactcc atagctaacc ctaaacagac 60

cgaggctatc gggaaagctt gggtccgcat cttgaacatc gatcctgcca acgtgttctt 120

atacgccatc gacctcgcca gagcttgcgc cgacgcgggc tcctcccctg aagctgatat 180

tattggagcg aacgaagatc tcaaccccgt tgttgaacga aacgcattgg ccctagtggt 240

tagggatttc tgcccgctgc gcgctttttg cgcttactac tctcgggtgg tatggaacct 300

catgatcaag g 311

<210> 5

<211> 310

<212> DNA

<213> 柑橘黄脉明病毒

<400> 5

agctatcatt tcgtgtgtgt gtgacttctt taattcctta cgctgtgcca gtagcaagta 60

ccagggcacc agccgctcag ctgtcaaacg tagagcggct cgcctgaact actgctacaa 120

gtgtgggcac cccttatatt taaataaacc tcacccctgc cgaccaggtc aattgtgctc 180

tgcatctatc tccgagcgcc tctgtttgct ccacacagga ccgattaggt ttctaaccga 240

aaatcctgtt agtgccagag cagctcactt cctagcgcac gagctccttg accccagatg 300

aaacataaat 310

<210> 6

<211> 339

<212> DNA

<213> 柑橘黄脉明病毒

<400> 6

gatacacgag aacgtcgagt acatctttgc tgaccccatc caatacctgg gtaacccaaa 60

ccttagaaaa ccccactaca tctgcgcgtc ttcccatcga tttggccatt ccaccgccgc 120

tctcctaaca aaacttggca ttgaaactta cgcacataaa gaagataccg tccgggtaga 180

caacatcttc caggctgaac cagacggcca aatcatcgcc tgcgaccgac ccactcaaga 240

gctcgctgcc agacacacac tagactacct gaggccctgc gaaagcatag gactaacttt 300

cccacgaacc acgatcctga tctctcacga acttactgc 339

Claims (10)

1.一种病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：所述基因沉默载体是基于柑橘叶斑驳病毒的质粒载体而构建的。

2.根据权利要求1所述的病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：所述基因沉默载体是通过将目的基因片段整合到基于柑橘叶斑驳病毒的侵染性克隆质粒载体pCLBV201构建得到的重组质粒载体，所述质粒载体pCLBV201具有SEQ ID No.1所示的DNA序列。

3.根据权利要求2所述的病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：柑橘lob基因片段作为所述目的基因片段被整合到所述质粒载体pCLBV201中。

4.根据权利要求2所述的病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：

来源于柑橘黄化脉明病毒的基因片段作为所述目的基因片段被整合到所述质粒载体pCLBV201中。

5.根据权利要求4所述的病毒诱导的基因沉默载体，其特征在于：所述来源于柑橘黄化脉明病毒的基因片段选自以下任一种核酸片段：具有SEQ ID No.3所示序列的核酸片段或其变体，具有SEQ ID No.4所示序列的核酸片段或其变体，具有SEQ ID No.5所示序列的核酸片段或其变体，或者具有SEQ ID No.6所示序列的核酸片段或其变体。

6.权利要求1～5中任一项所述的病毒诱导的基因沉默载体的应用，其特征在于：所述基因沉默载体用于防控柑橘病害，包括以下步骤：

1)将所述基因沉默载体转化农杆菌，得到重组农杆菌；

2)通过利用所述重组农杆菌侵染柑橘来将所述基因沉默载体引入到柑橘植株中。

7.根据权利要求6所述的病毒诱导的基因沉默载体的应用，其特征在于：

还包括将引入了所述基因沉默载体的柑橘植株进一步繁殖，获得具有持续防控病害能力的柑橘植株。

8.根据权利要求6所述的病毒诱导的基因沉默载体的应用，其特征在于：所述柑橘病害包括柑橘溃疡病、柑橘黄脉病或其他柑橘病害。

9.一种通过进行病毒诱导的基因沉默来防控柑橘病害的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)将包含能够沉默目标基因的沉默序列的核酸片段插入到包含柑橘叶斑驳病毒序列的质粒载体中，构建得到重组质粒；

2)将所述重组质粒转化农杆菌，得到重组农杆菌；

3)通过利用所述重组农杆菌侵染柑橘来将所述基因沉默载体引入到柑橘植株中。

10.根据权利要求8所述的通过进行病毒诱导的基因沉默来防控柑橘病害的方法，其特征在于：所述柑橘病害包括柑橘溃疡病、柑橘黄脉病或其他病害。

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