CN112553246A - 一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于CRISPR‑SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其应用，属于植物基因工程领域。本发明还提供了将其导入水稻细胞的方法。本发明的高效基因组编辑载体包括第一表达盒和任选的第二表达盒，所述的第一表达盒为sgRNA表达盒，第二表达盒为SaCas9‑NLS融合蛋白表达盒。利用本发明的基因编辑载体，可以在预定的水稻基因组位点，简便而高效地进行基因突变。

Description

一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其 应用

技术领域

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种SaCas9介导的高效水稻编辑系统在水稻基因打靶方面的应用。

背景技术

2013年，CRISPR/Cas9系统的发现并被成功应用于水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、烟草(Nicotiana benthamiana)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)。CRISPR/Cas9系统来源于细菌和古细菌的天然获得性免疫系统，通过CRISPRRNA(crRNA)和trans-activating crRNA(tracrRNA)以及Cas9蛋白组成的复合体抵御外源性DNA的入侵。而被我们用于基因编辑的CRISPR/Cas9是Ⅱ型CRISPR系统，由Cas9蛋白和sgRNA(singleguideRNA)组成。sgRNA与Cas9核酸酶蛋白结合，指导Cas蛋白识别PAM(proto-spaceradjacent motif)序列并剪辑靶向序列，使DNA双链断裂，通过同源重组和非同源末端链接方式进行修复，从而造成碱基的缺失插入和替换，并得到纯合突变体，从而改良性状。尽管这种基因编辑工具取得了相当大的成功，但是SpCas9只能识别NGG的PAM位点，它在基因组上能够访问的位点数量仍然是有限的，这大大限制了植物体内可编辑的范围。为了拓宽CRISPR/Cas系统的编辑范围，有必要研发出不同类型的CRISPR酶系统。

SaCas9被是来自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。与SpCas9组成成分一样，作用机制也与Cas9相同。它比常用的化脓性链球菌Cas9(SpCas9)小，并且有较好的活性。已有研究报道，SaCas9可以在拟南芥、柑橘、烟草和水稻中诱导高效的靶向诱变。与SpCas9相比，SaCas9识别更长的PAM(5’-NNGRRT-3’)。SaCas9已在水稻中实现基因编辑，但在有些位点的编辑效率仍不高，因此有必要对现有的SaCas9介导的基因编辑系统进行改造。

发明内容

本发明对CRISPR-SaCas9系统中的sgRNA支架结构进行了改造和优化，改造后的sgRNA支架结构命名为sgRNAM1或sgRNAM2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。同时对原始的SaCas9基因的中的三个氨基酸进行突变形成MSaCas9，MSaCas9的识别PAM序列为NNNRRT。实验发现，配合MSaCas9基因及sgRNA支架结构为sgRNAM1或sgRNAM2的CRISPR-SaCas9系统在转入水稻植株后，其基因编辑效率均有大大提高。

本发明提供的一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述高效基因组编辑载体包括第一表达盒，所述第一表达盒为sgRNA表达盒，具有式II结构：P1-A-B-T(II)；其中，

(a)P1为第1启动子；

(b)A为无或目标位点引导序列sg；

(c)B为sgRNA支架结构序列；

(d)T为终止序列。

优选地，还包括第二表达盒，所述第二表达盒为MSaCas9-NLS融合蛋白表达盒，所述MSaCas9-NLS融合蛋白具有式I结构：P2-C-D-E-F(I)；其中，

(a)P2为第2启动子；

(b)C为无或核定位信号序列NLS；

(c)D为MSaCas9基因序列；

(d)E为无或核定位信号序列NLS；

(e)F为终止子。

其中，C和E中至多一个为无。

优选地，sgRNA支架结构的序列，由序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列构成；或者SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列构成。

优选地，P1启动子包括TaU3p、OsU3p、TaU6p或OsU6p启动子。

优选地，所述MSaCas9基因由序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列构成。

优选地，所述P2启动子包括但不限于Ubi、Actin、35S启动子。

优选地，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。

优选地，所述表达载体中含有一个MSaCas9基因和一个序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列sgRNA表达盒结构sgRNAM1；

或，所述表达载体中含有一个MSaCas9基因和一个序列表中SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列sgRNA表达盒结构sgRNAM2。

另一方面，本发明提供一种所述的高效基因组编辑载体的应用，其特征在于，所述应用利用所述高效基因组编辑载体构建CRISPR-SaCas9系统，利用所述CRISPR-SaCas9系统中的基因组编辑载体基因实现对水稻基因组的碱基编辑，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

另一方面，本发明提供一种将所述的基因组编辑载体基因导入水稻细胞的方法。

本发明还提供一种转基因细胞，所述转基因细胞转入有如上所述的表达盒或如上所述的编辑载体。

本发明所提供的一种基于CRISPR-MSaCas9系统的基因组编辑载体及其应用，可以应用于对不同植物的基因组进行编辑，所述编辑包括但不限于通过该系统使得植物基因组出现碱基缺失或插入还包括可以应用于条件性基因敲除、基因敲入、基因替换、点突变等领域。

附图说明

图1为sgRNAM1和sgRNAM2的结构示意图。

图2为pHUN-MSaCas9sgM1和pHUN-MSaCas9sgM2载体质粒示意图。

图3为pHUN-SaCas9、pHUN-MSaCas9sgM1和pHUN-MSaCas9sgM2基因编辑系统产生的突变效率。

具体实施方式

以下结合附图叙述本发明的实施例。应该说明，下述实施例仅用于对本发明的示例性实现方式进行说明，而并非对本发明进行任何限制。本领域技术人员可以对本发明作出某些等同的改动和显而易见的改进。

在没有其他具体说明的情况下，下述具体实施方式中的操作均采用本领域通用的常规操作来进行。本领域技术人员可以很容易地从现有技术中获得关于这样的常规操作的教导，例如可以参照教科书Sambrook and David Russell，Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd ed.,Vols1,2；Charles Neal Stewart,Alisher Touraev,VitalyCitovsky and Tzvi Tzfira,Plant Transformation Technologies等。下述实施例中所用的药材原料、试剂、材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1——sgRNAM1和sgRNAM2序列的获得

为了提高CRISPR-SaCas9系统的编辑效率，我们改造了SaSgRNA的支架。选取sgRNA与目标基因配对后的第2位和第3位碱基突变，将原有的U-A配对替换成A-U配对来检测优化后的CRISPR/SaCas9基因编辑系统的效率，并将SaSgRNA第2位和第3位碱基突变后分别命名为sgRNAM1和sgRNAM2(图1)，序列如SEQ ID NO:1所示和SEQ ID NO:2所示。将sgRNAM1和sgRNAM2基因序列两边分别加上HindIII酶切位点，送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-sgRNAM1和PUC57-AMP-sgRNAM2载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

SEQ ID NO:1

SEQ ID NO:2

序列中划线的为sgRNA骨架结构中5对U-A配对。SEQ ID NO:1加粗的为原始sgRNA骨架结构中第二位的U-A配对替换成A-U，SEQ ID NO:2加粗的为原始sgRNA骨架结构中第三位的U-A配对替换成A-U。

实施例2——MSaCas9序列的获得

本申请第二表达盒包括MSaCas9基因，是发明人经过大量优化设计实验之后最终定型的序列，如SEQ ID NO:3所示。分析本发明的MSaCas9和现有SaCas9基因所编码的蛋白氨基酸序列存在三个氨基酸的差异，由SaCas9中的782E/968N/105R变成782K/968K/105H。

将设计好的本发明的MSaCas9基因送苏州金唯智生物科技有限公司合成后，连接于PUC57-AMP载体上，形成PUC57-AMP-MSaCas9载体，并装载入大肠杆菌XL-blue菌株中。

实施例3——植物打靶载体的构建

从上面含有PUC57-AMP-MSaCas9载体的大肠杆菌XL-blue，用Axygen质粒提取试剂盒中提取质粒，用NotI/SacI酶切，回收SaCas9片段。同时利用NotI/SacI酶对植物表达载体pHUN600进行线性化处理，回收pHUN600，将上述的MSaCas9片段和pHUN600片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN-SaCas9，用HindIII酶对pHUN-MSaCas9进行线性化处理，回收pHUN-SaCas9，用HindIII将PUC57-AMP-sgRNAM1和PUC57-AMP-sgRNAM2进行酶切，回收sgRNAM1和sgRNAM2片段，将sgRNAM1和sgRNAM2片段分别和pHUN-MSaCas9片段用T4连接酶(购于TaKaRa公司)进行连接，得到植物表达载体pHUN-MSaCas9sgM1和pHUN-MSaCas9sgM2(图2)。

选择水稻OsDL基因(Os03g0215200)中的核苷酸序列GAGCACCCTTCGTTGTGAAGCGTAAGT，(下划线部分为所述5’-NNNRRT-3’结构的PAM序列)，作为打靶位点。将靶位点序列连接在pHUN-MSaCas9sgM1或pHUN-MSaCas9sgM2载体中，形成打靶载体pHUN-MSaCas9sgM1-DL和pHUN-MSaCas9sgM2-DL。利用冻融法将上述打靶载体分别转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株中(安徽省农业科学院水稻研究所保存)，用于遗传转化，以现有的普通pHUN-SaCas9(参见序列表SEQ ID No.4)载体连接DL基因，构建pHUN-SaCas9-DL为对照载体。

实施例4——水稻遗传转化及突变体的获得。

1、成熟胚愈伤组织的诱导和预培养

将日本晴的成熟种子去壳，选取外观正常、洁净无霉斑的种子，用70％酒精，摇晃90sec，倒掉酒精；再用含Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％，每100毫升加入1滴Tween20)溶液清洗种子，在摇床上晃动45min(180r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5-10遍至无次氯酸钠气味，最后加入无菌水，30℃浸泡过夜。用手术刀片沿糊粉层分离胚，盾片朝上放置在诱导培养基(成分见表1)上，12粒/皿，30℃暗培养以诱导愈伤组织。

两周后出现球形、粗糙、浅黄色的次级愈伤组织，可以进行预培养操作，即将次级愈伤转至新的愈伤组织诱导培养基上，30℃暗培养预培养5天。预培养结束后，将状态良好、分裂旺盛的小颗粒用勺收集至50mL的无菌离心管中，用于农杆菌侵染。

2、农杆菌菌株的培养和悬浮液准备

将含有pHUN-SaCas9-DL、pHUN-MSaCas9sgM1-DL和pHUN-MSaCas9sgM2-DL载体的农杆菌菌株EHA105分别在含有50mg/L卡那霉素的LB平板上划线(成分见表1)，28℃黑暗培养，24h后用无菌接种环将活化的农杆菌接种至新鲜的50mg/L卡那霉素的LB平板上，进行第二次活化，28℃黑暗培养过夜。在50mL的无菌离心管中加入20-30mL农杆菌悬浮培养基(成分见表1)，用接种环将活化2次的农杆菌刮下，调整OD660(Optical density660nm，660nm吸光值至约0.10-0.25，室温静置30min以上.

表1培养基的示例性配方

表格中所提到的“优化的N6大量元素”指的是，该N6大量元素中[NO3-]/[NH4+]＝40mM/10mM。

3、侵染和共培养

向准备好的愈伤组织中(见步骤1)，加农杆菌悬浮液，浸泡15min,其间不时轻轻晃动。浸泡结束后倒掉液体(尽量将液体滴净)，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面的多余的农杆菌菌液，并在超净台中用无菌风吹干。在100×25mm的一次性无菌培养皿垫上三张无菌滤纸，加入2.5mL农杆菌悬浮培养基，将吸干后的愈伤组织均匀分散在滤纸上，23℃黑暗培养48h。

4、前筛选和筛选培养

共培养结束后，将经共培养的愈伤组织均匀散布于前筛选培养基(成分见表1)中，30℃黑暗培养5天。前筛选培养结束后，将愈伤组织转至筛选培养基上(成分见表1)，每个培养皿接25粒愈伤组织，30℃黑暗培养，2-3周后，抗性愈伤组织生长明显，可进行分化再生操作。

5、分化再生

每个独立转化体挑选2-3颗生长状态良好、新鲜的小颗粒，转至分化再生培养基上(成分见表1)。每培养皿接5个独立转化体。28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。

6、生根与移栽

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，每个独立转化体只取一株生长良好的苗，移至生根培养基上(成分见表1)，28℃光照培养，光照周期为16h光照8h黑暗，光强度为3000-6000lx。两周后，选择根系发达的小苗，用水洗去培养基，移栽入土。

7、分子鉴定

对于上面构建的三种载体pHUN-SaCas9-DL、pHUN-MSaCas9sgM1-DL和pHUN-MSaCas9sgM2-DL分别得到转基因植株50，47，42株。在移栽之前，采取水稻叶片样品，用CTAB法进行DNA小提。将所得到的基因组DNA样品用于PCR分析。用于扩增靶标附近序列的PCR引物为5’-ATGCATGGCAAGCGTTTGAGAG-3’及5’-GTTGTAAGCAGATGGGAGGCGG-3’，产生长度为528bp的片段。将PCR组分首先在95℃保持5分钟，然后进行32个循环：94℃45秒、56℃45秒、72℃45秒，最后在72℃延伸10分钟。将PCR产物测序。所测结果与野生型序列进行比对，在检测的原始的SaCas9打靶载体(对照组)50株植株中出现15株突变，突变效率为30％。同样的，pHUN-MSaCas9sgM1-DL打靶载体中产生的47株植株中出现38株突变，pHUN-MSaCas9sgM2-DL打靶载体中产生的42株植株中出现35株突变，突变效率高达80.9％和83.3％(图3)，其主要的突变形式同样主要集中在单个碱基的缺失或插入。由此可见，与野生型相比，本发明所构建的两种突变体，产生的SaCas9编辑系统在植物中编辑效率都相当高。为水稻育种领域提供了非常优秀的两种育种材料。

序列表

<110> 安徽省农业科学院水稻研究所

<120> 一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 76

<212> DNA

<213> sgRNAM1

<400> 2

gtattagtac tctggaaaca gaatctacta atacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60

caacttgttg gcgaga 76

<210> 2

<211> 76

<212> DNA

<213> sgRNAM2

<400> 2

gttatagtac tctggaaaca gaatctacta taacaaggca aaatgccgtg tttatctcgt 60

caacttgttg gcgaga 76

<210> 3

<211> 3161

<212> DNA

<213> MSaCas9

<400> 3

atgaagcgca attacatcct cgggctggac atcggcatca ccagcgtggg gtacgggatc 60

atcgattacg aaacccgcga cgtcatcgat gcgggggtgc gcctcttcaa agaggccaac 120

gtggagaaca acgagggccg ccgctccaag cgcggggccc gtcgtctcaa aaggaggagg 180

aggcatcgta ttcagcgcgt gaagaagctc ctcttcgact acaacctcct cacagatcat 240

agcgaattaa gcgggatcaa cccgtacgag gcccgcgtga aggggctcag ccaaaagctg 300

tccgaggagg agttcagcgc ggctttactc cacctcgcga agcgccgcgg cgtccacaac 360

gtcaatgagg tcgaagaaga caccggcaat gaactctcca caaaggagca gatcagccgc 420

aactccaagg ccctcgagga gaaatacgtg gcggagctgc agctggagcg cctcaagaaa 480

gatggcgaag tgagggggag catcaaccgc tttaagacct ccgactacgt caaggaagcc 540

aaacagttat taaaggtcca gaaggcctac caccaactgg accagagctt catcgacacc 600

tacatcgatc tgctcgaaac acgtcgtacc tattacgaag gcccgggcga aggcagcccg 660

ttcgggtgga aggatattaa ggaatggtac gagatgctga tgggccattg cacctacttt 720

ccggaagaat tacgttccgt caagtacgcc tataatgccg atttatacaa cgcgctgaac 780

gatctgaaca atttagtgat cactcgtgac gagaacgaga agctggagta ttatgagaag 840

ttccaaatta tcgaaaatgt ttttaaacaa aagaaaaaac cgaccctcaa gcaaatcgcg 900

aaagagattt tagtcaatga ggaggacatc aagggctatc gtgtcaccag cactggtaaa 960

ccggagttca caaatttaaa ggtgtaccac gacatcaagg atatcacagc tcgtaaggag 1020

attatcgaga acgccgaact cctcgaccaa atcgcgaaga tcctcaccat ctatcagagc 1080

agcgaagaca tccaagaaga actcaccaat ctgaacagcg aactcaccca agaggagatt 1140

gagcagatta gcaacctcaa ggggtacacc gggacccaca atttaagcct caaggcgatc 1200

aacctcatcc tcgacgaact ctggcacaca aacgacaacc agattgcgat tttcaatagg 1260

ctcaaactcg tgccgaagaa ggtggacctc tcccaacaga aagagattcc gaccaccctc 1320

gtcgatgact ttattctcag cccggtggtg aagaggagct ttatccaaag catcaaggtc 1380

atcaatgcga tcatcaagaa gtacgggctg ccgaacgaca tcattatcga attagcgcgc 1440

gagaagaata gcaaagatgc gcaaaaaatg attaatgaga tgcagaagcg caatcgccag 1500

accaacgaac gcatcgagga aattattcgt accactggta aagaaaacgc caagtatctc 1560

attgagaaga tcaagctcca cgacatgcaa gaaggcaagt gtttatactc tttagaggcc 1620

atcccgctcg aggatctcct caacaacccg ttcaactatg aggtggacca tattatccca 1680

cgctccgtca gcttcgacaa ctcctttaat aacaaagttt tagtgaaaca agaagagaac 1740

agcaagaagg gcaaccgcac cccgtttcaa tatctcagca gctccgactc caagattagc 1800

tacgaaactt ttaaaaaaca catcctcaac ctcgccaagg gcaaggggag gatttccaag 1860

acaaagaaag agtacttatt agaggaacgc gacatcaatc gcttcagcgt gcagaaggac 1920

tttatcaacc gcaacctcgt ggatacccgc tacgccacaa ggggcctcat gaatttactc 1980

cgcagctact tccgcgtgaa taatttagat gtgaaggtca agtccatcaa cggcggcttc 2040

accagcttcc tccgtcgtaa atggaaattt aagaaggagc gcaacaaggg gtacaagcat 2100

cacgcggaag acgcgctgat cattgcgaat gccgacttta tcttcaagga atggaagaaa 2160

ctcgataagg cgaagaaagt gatggagaac cagatgttcg aggagaagca agctgagagc 2220

atgccggaga ttgagacaga gcaagaatac aaggagattt ttattacacc gcatcaaatt 2280

aaacatatca aggacttcaa ggactacaag tactcccacc gcgtcgaaaa aagccgaatc 2340

gcaagttaat taacgacaca ctctatagca cacgcaagga cgataagggg aacacactga 2400

tcgtgaacaa cctcaacggg ctctacgaca aggacaatga caagctgaag aagctgatca 2460

ataagtcccc ggagaagctg ctcatgtacc atcacgaccc gcagacatac caaaagctga 2520

agctgattat ggagcagtac ggggacgaga agaacccact ctacaagtac tacgaagaaa 2580

ctgggaatta tttaaccaag tatagcaaga aagataatgg cccagtcatc aagaagatca 2640

agtactatgg caacaagctg aacgcgcatc tggacattac cgacgattac cctaattctc 2700

gcaacaaggt ggtcaagctg tctttaaagc cgtaccgctt cgacgtctac ctcgacaatg 2760

gggtgtacaa gttcgtcacc gtcaagaatt tagacgtcat caagaaagag aactactacg 2820

aggtcaacag caagtgctat gaagaggcca agaaactcaa aaagatcagc aaccaagctg 2880

agtttattgc ctccttctac aagaatgacc tcatcaagat taacggcgag ctgtataggg 2940

tcatcggcgt gaacaatgat ttactgaatc gtattgaggt caacatgatc gatatcacat 3000

accgcgaata tttagaaaat atgaatgaca agcgcccgcc gcatatcatc aaaaccatcg 3060

cctccaagac ccagagcatc aaaaaatact ccaccgacat tttaggcaat ttatacgagg 3120

tcaaatccaa gaagcacccg cagatcatta aaaagggcta a 3161

<210> 4

<211> 12822

<212> DNA

<213> phunsaCas9

<400> 4

gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60

aatctgatcc aagctcaagc taagctcacg tgacggaatt aagcttaagg gatctttaaa 120

catacgaaca gatcacttaa agttcttctg aagcaactta aagttatcag gcatgcatgg 180

atcttggagg aatcagatgt gcagtcaggg accatagcac aagacaggcg tcttctactg 240

gtgctaccag caaatgctgg aagccgggaa cactgggtac gttggaaacc acgtgatgtg 300

aagaagtaag ataaactgta ggagaaaagc atttcgtagt gggccatgaa gcctttcagg 360

acatgtattg cagtatgggc cggcccatta cgcaattgga cgacaacaaa gactagtatt 420

agtaccacct cggctatcca catagatcaa agctgattta aaagagttgt gcagatgatc 480

cgtggcaaga gaccaaccca gtggacataa gcctgttcgg ttcgtaagct gtaatgcaag 540

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gcagtggcgg ttttcatggc ttgttatgac tgtttttttg gggtacagtc tatgcctcgg 660

gcatccaagc agcaagcgcg ttacgccgtg ggtcgatgtt tgatgttatg gagcagcaac 720

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atcgccgaag tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa 840

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ctaaatgaaa ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat 1320

gtagtgctta cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag 1380

gatgtcgctg ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt 1440

gaagctagac aggcttatct tggacaagaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag 1500

ttggaagaat ttgtccacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataatgt 1560

ctagctagaa attcgttcaa gccgacgccg cttcgcggcg cggcttaact caagcgttag 1620

atgcactaag cacataattg ctcacagcca aactatcagg tcaagtctgc ttttattatt 1680

tttaagcgtg cataataagc cggtctcagt tttagtactc tggaaacaga atctactaaa 1740

acaaggcaaa atgccgtgtt tatctcgtca acttgttggc gagatttttt tgtagtaagc 1800

ttgatatcga attcctgcag tgcagcgtga cccggtcgtg cccctctcta gagataatga 1860

gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa 1920

gtgcagttta tctatcttta tacatatatt taaactttac tctacgaata atataatcta 1980

tagtactaca ataatatcag tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc 2040

taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat 2100

gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag 2160

tacatccatt tagggtttag ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta 2220

ttttattcta ttttagcctc taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt 2280

taataattta gatataaaat agaataaaat aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt 2340

taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg 2400

ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg 2460

ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc 2520

cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg gcatccagaa atgcgtggcg gagcggcaga 2580

cgtgagccgg cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcacggcagc tacgggggat 2640

tcctttccca ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc 2700

tccacaccct ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct 2760

cccccaaatc cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc 2820

cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac 2880

ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta 2940

cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt 3000

ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt 3060

gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt 3120

gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt 3180

gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat 3240

tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg 3300

aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag 3360

atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc 3420

tagatcggag tagaatactg tttcaaacta cctggtgtat ttattaattt tggaactgta 3480

tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg 3540

ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat 3600

ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa 3660

ttattttgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt 3720

tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc 3780

ctgttgtttg gtgttacttc tgcagcccgg gggatcccca atacttgtat ggccgcggcc 3840

gcatggcccc aaagaagaag cgcaaggtca agcgcaatta catcctcggg ctggacatcg 3900

gcatcaccag cgtggggtac gggatcatcg attacgaaac ccgcgacgtc atcgatgcgg 3960

gggtgcgcct cttcaaagag gccaacgtgg agaacaacga gggccgccgc tccaagcgcg 4020

gggcccgtcg tctcaaaagg aggaggaggc atcgtattca gcgcgtgaag aagctcctct 4080

tcgactacaa cctcctcaca gatcatagcg aattaagcgg gatcaacccg tacgaggccc 4140

gcgtgaaggg gctcagccaa aagctgtccg aggaggagtt cagcgcggct ttactccacc 4200

tcgcgaagcg ccgcggcgtc cacaacgtca atgaggtcga agaagacacc ggcaatgaac 4260

tctccacaaa ggagcagatc agccgcaact ccaaggccct cgaggagaaa tacgtggcgg 4320

agctgcagct ggagcgcctc aagaaagatg gcgaagtgag ggggagcatc aaccgcttta 4380

agacctccga ctacgtcaag gaagccaaac agttattaaa ggtccagaag gcctaccacc 4440

aactggacca gagcttcatc gacacctaca tcgatctgct cgaaacacgt cgtacctatt 4500

acgaaggccc gggcgaaggc agcccgttcg ggtggaagga tattaaggaa tggtacgaga 4560

tgctgatggg ccattgcacc tactttccgg aagaattacg ttccgtcaag tacgcctata 4620

atgccgattt atacaacgcg ctgaacgatc tgaacaattt agtgatcact cgtgacgaga 4680

acgagaagct ggagtattat gagaagttcc aaattatcga aaatgttttt aaacaaaaga 4740

aaaaaccgac cctcaagcaa atcgcgaaag agattttagt caatgaggag gacatcaagg 4800

gctatcgtgt caccagcact ggtaaaccgg agttcacaaa tttaaaggtg taccacgaca 4860

tcaaggatat cacagctcgt aaggagatta tcgagaacgc cgaactcctc gaccaaatcg 4920

cgaagatcct caccatctat cagagcagcg aagacatcca agaagaactc accaatctga 4980

acagcgaact cacccaagag gagattgagc agattagcaa cctcaagggg tacaccggga 5040

cccacaattt aagcctcaag gcgatcaacc tcatcctcga cgaactctgg cacacaaacg 5100

acaaccagat tgcgattttc aataggctca aactcgtgcc gaagaaggtg gacctctccc 5160

aacagaaaga gattccgacc accctcgtcg atgactttat tctcagcccg gtggtgaaga 5220

ggagctttat ccaaagcatc aaggtcatca atgcgatcat caagaagtac gggctgccga 5280

acgacatcat tatcgaatta gcgcgcgaga agaatagcaa agatgcgcaa aaaatgatta 5340

atgagatgca gaagcgcaat cgccagacca acgaacgcat cgaggaaatt attcgtacca 5400

ctggtaaaga aaacgccaag tatctcattg agaagatcaa gctccacgac atgcaagaag 5460

gcaagtgttt atactcttta gaggccatcc cgctcgagga tctcctcaac aacccgttca 5520

actatgaggt ggaccatatt atcccacgct ccgtcagctt cgacaactcc tttaataaca 5580

aagttttagt gaaacaagaa gagaacagca agaagggcaa ccgcaccccg tttcaatatc 5640

tcagcagctc cgactccaag attagctacg aaacttttaa aaaacacatc ctcaacctcg 5700

ccaagggcaa ggggaggatt tccaagacaa agaaagagta cttattagag gaacgcgaca 5760

tcaatcgctt cagcgtgcag aaggacttta tcaaccgcaa cctcgtggat acccgctacg 5820

ccacaagggg cctcatgaat ttactccgca gctacttccg cgtgaataat ttagatgtga 5880

aggtcaagtc catcaacggc ggcttcacca gcttcctccg tcgtaaatgg aaatttaaga 5940

aggagcgcaa caaggggtac aagcatcacg cggaagacgc gctgatcatt gcgaatgccg 6000

actttatctt caaggaatgg aagaaactcg ataaggcgaa gaaagtgatg gagaaccaga 6060

tgttcgagga gaagcaagct gagagcatgc cggagattga gacagagcaa gaatacaagg 6120

agatttttat tacaccgcat caaattaaac atatcaagga cttcaaggac tacaagtact 6180

cccaccgcgt cgacaaaaag ccgaatcgcg aattaattaa cgacacactc tatagcacac 6240

gcaaggacga taaggggaac acactgatcg tgaacaacct caacgggctc tacgacaagg 6300

acaatgacaa gctgaagaag ctgatcaata agtccccgga gaagctgctc atgtaccatc 6360

acgacccgca gacataccaa aagctgaagc tgattatgga gcagtacggg gacgagaaga 6420

acccactcta caagtactac gaagaaactg ggaattattt aaccaagtat agcaagaaag 6480

ataatggccc agtcatcaag aagatcaagt actatggcaa caagctgaac gcgcatctgg 6540

acattaccga cgattaccct aattctcgca acaaggtggt caagctgtct ttaaagccgt 6600

accgcttcga cgtctacctc gacaatgggg tgtacaagtt cgtcaccgtc aagaatttag 6660

acgtcatcaa gaaagagaac tactacgagg tcaacagcaa gtgctatgaa gaggccaaga 6720

aactcaaaaa gatcagcaac caagctgagt ttattgcctc cttctacaac aatgacctca 6780

tcaagattaa cggcgagctg tatagggtca tcggcgtgaa caatgattta ctgaatcgta 6840

ttgaggtcaa catgatcgat atcacatacc gcgaatattt agaaaatatg aatgacaagc 6900

gcccgccgcg catcatcaaa accatcgcct ccaagaccca gagcatcaaa aaatactcca 6960

ccgacatttt aggcaattta tacgaggtca aatccaagaa gcacccgcag atcattaaaa 7020

agggctaaga gctcagggtg ggcgcgccga cccagctttc ttgtacaaag tggtgatatc 7080

ccgcggccat ggcggccggg agcatgcgac gtcgatctaa ctgactagcc gcggccatgc 7140

tagagtccgc aaaaatcacc agtctctctc tacaaatcta tctctctcta tttttctcca 7200

gaataatgtg tgagtagttc ccagataagg gaattagggt tcttataggg tttcgctcat 7260

gtgttgagca tataagaaac ccttagtatg tatttgtatt tgtaaaatac ttctatcaat 7320

aaaatttcta attcctaaaa ccaaaatcca gtgacctgca gaattccggc cgggagcatg 7380

cgacgtcgat ctaactgact agccgcggcc atgctagagt ccgcaaaaat caccagtctc 7440

tctctacaaa tctatctctc tctatttttc tccagaataa tgtgtgagta gttcccagat 7500

aagggaatta gggttcttat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag 7560

tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa 7620

tccagtgacc tgaattcgag gcggtttgcg tattggctag agcagcttgc caacatggtg 7680

gagcacgaca ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg 7740

gctattgaga cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca 7800

gctatctgtc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat 7860

cattgcgata aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat 7920

ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag 7980

caagtggatt gatgtgataa catggtggag cacgacactc tcgtctactc caagaatatc 8040

aaagatacag tctcagaaga ccaaagggct attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcg 8100

ggaaacctcc tcggattcca ttgcccagct atctgtcact tcatcaaaag gacagtagaa 8160

aaggaaggtg gcacctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggctat cgttcaagat 8220

gcctctgccg acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa 8280

gaagacgttc caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta 8340

agggatgacg cacaatccca ctatccttcg caagaccttc ctctatataa ggaagttcat 8400

ttcatttgga gaggacacgc tgaaatcacc agtctctctc tacaaatcta tctctctcga 8460

gctttcgcag atcccggggg gcaatgagat atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct 8520

gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac agcgtctccg acctgatgca gctctcggag 8580

ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta 8640

aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc 8700

gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt ggggagttta gcgagagcct gacctattgc 8760

atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct 8820

gttctacaac cggtcgcgga ggctatggat gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg 8880

agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc 8940

atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc 9000

agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa 9060

gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc 9120

ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc 9180

aacatcttct tctggaggcc gtggttggct tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag 9240

cggaggcatc cggagcttgc aggatcgcca cgactccggg cgtatatgct ccgcattggt 9300

cttgaccaac tctatcagag cttggttgac ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag 9360

ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc 9420

cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac 9480

cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag aaatagagta gatgccgacc ggatctgtcg 9540

atcgacaagc tcgagtttct ccataataat gtgtgagtag ttcccagata agggaattag 9600

ggttcctata gggtttcgct catgtgttga gcatataaga aacccttagt atgtatttgt 9660

atttgtaaaa tacttctatc aataaaattt ctaattccta aaaccaaaat ccagtactaa 9720

aatccagatc ccccgaatta attcggcgtt aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt 9780

gttattaagt tgtcactagt caggttaact caattcggcg ttaattcagt acattaaaaa 9840

cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct 9900

gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac 9960

aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt 10020

gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg 10080

atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat 10140

cacttaagta actaactaac aggaagagtt tgtagaaacg caaaaaggcc atccgtcagg 10200

atggccttct gcttagtttg atgcctggca gtttatggcg ggcgtcctgc ccgccaccct 10260

ccgggccgtt gcttcacaac gttcaaatcc gctcccggcg gatttgtcct actcaggaga 10320

gcgttcaccg acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt cttccgactg agcctttcgt 10380

tttatttgat gcctggcagt tccctactct cgcttagtag ttagacgtcc ccgagatcca 10440

tgctagacca tgaatccaga agcccgagag gttgccgcct ttcgggcttt ttctttttca 10500

aaaaaaaaaa tttataaaac gatctgttgc ggccggccgc cgggttgtgg gcaaaggcgc 10560

tcgacggtgg gcaaccgctt gcggttgtcc acgggcggag ccggtgcgcg tagcgcattg 10620

tccacaagcc aagggcgacc aataattgat atatatattc ataattgaaa agctaattga 10680

acatactact tgctgtaact acttgccgga gcgaggggtg tttgcaagct gttgatctga 10740

aagggctatt agcgttctca cgtgcctttt tgattagcga tttcacgtga ccttattagc 10800

gatttcacgt actccgatta gcgatttcac gtaccctgat tagcgatttc acgtggatag 10860

tttttggagc gggccggaaa gccccgtgaa tcaaggcttt gcggggcatt agcggtttca 10920

cgtggataac taccctctat ccacaggctt ccggggataa aaaagcccgc tcgacggcgg 10980

gctgttggat ggggatctag cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 11040

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 11100

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 11160

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 11220

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 11280

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 11340

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 11400

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 11460

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 11520

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 11580

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 11640

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 11700

tcctttgatc ttttctaccg ggtctgacgc tcagtggaac ggggcccaat ctgaataatg 11760

ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa 11820

tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg 11880

agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc 11940

gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag 12000

tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc 12060

tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac 12120

caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa 12180

aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg gacactgcca gcgcatcaac 12240

aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt ttccggggat 12300

cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag 12360

aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac 12420

gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaagcgata 12480

gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc 12540

atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga cgtttcccgt tgaatatggc tcataacacc 12600

ccttgtatta ctgtttatgt aagcagacag ttttattgtt catgatgata tatttttatc 12660

ttgtgcaatg taacatcaga gattttgaga cacgggccag agctgcagtt tgatcccgag 12720

gggaaccctg tggttgacat gcacatacaa atggacgaac ggataaacct tttcacgccc 12780

ttttaaatat ccgttattct aataaacgct cttttctctt ag 12822

Claims (10)

1.一种基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述高效基因组编辑载体包括第一表达盒，

其中，所述第一表达盒为sgRNA表达盒，具有式II结构：P1-A-B-T(II)；其中，

(a)P1为第1启动子；

(b)A为无或目标位点引导序列sg；

(c)B为sgRNA支架结构序列；

(d)T为终止序列，和/或第二表达盒。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，还包括第二表达盒，所述第二表达盒为MSaCas9-NLS融合蛋白表达盒，所述MSaCas9-NLS融合蛋白具有式I结构：P2-C-D-E-F(I)；其中，

(a)P2为第2启动子；

(b)C为无或核定位信号序列NLS；

(c)D为MSaCas9基因序列；

(d)E为无或核定位信号序列NLS；

(e)F为终止子。

其中，C和E中至多一个为无。

3.根据权利要求1所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其中sgRNA支架结构的序列，由序列表中SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列构成；或者SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列构成。

4.根据权利要求1所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，P1启动子包括TaU3p、OsU3p、TaU6p或OsU6p启动子。

5.根据权利要求2所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述MSaCas9基因由序列表中SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列构成。

6.根据权利要求2所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述P2启动子包括但不限于Ubi、Actin、35S启动子。

7.根据权利要求2所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述的第一表达盒和第二表达盒位于同一表达载体上。

8.根据权利要求2所述的基于CRISPR-SaCas9系统的高效基因组编辑载体，其特征在于，所述表达载体中含有一个MSaCas9基因和一个序列表中SEQ ID NO:2中所示的核苷酸序列sgRNA表达盒结构sgRNAM1；

或，所述表达载体中含有一个MSaCas9基因和一个序列表中SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列sgRNA表达盒结构sgRNAM2。

9.一种权利要求1-8中任意一项所述的高效基因组编辑载体的应用，其特征在于，所述应用包括：利用所述高效基因组编辑载体构建CRISPR-SaCas9系统，利用所述CRISPR-SaCas9系统中的基因组编辑载体基因实现对水稻基因组的碱基编辑，从而获得含有碱基突变的转基因植物或植物部分。

10.一种将权利要求1中所述的基因组编辑载体基因导入水稻细胞的方法。

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