CN108486145A - 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株。其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。本发明将靶标供体片段和基因编辑元件分别构建在两个载体上，减少了复制子的负荷，有效增加了靶标同源片段的拷贝数，在有效地对染色体进行编辑的基础上，增加了靶标序列的拷贝数，将极大地提高同源重组的效率。

Description

基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法。

背景技术

菜豆黄矮病毒(BeYDV)最早从菜豆中分离，隶属于双生病毒科的玉米线条病毒属(Liu et al.,1997,Journal/J Gen Virol,78(Pt 8):2113-2117)，其可以侵染菜豆、鹰嘴豆、烟草、番茄、马铃薯、拟南芥等植物(Halley-Stott et al.,2007,Journal/Arch Virol,152:1237-1240；Liu et al.,1999,Journal/Virology,256:270-279；Liu et al.,1997,Journal/J Gen Virol,78(Pt 8):2113-2117)。利用其复制子元件，通过农杆菌介导侵染植物如烟草、番茄和生菜，可在植物细胞中产生高拷贝靶标DNA片段(Collens et al.,2007,Journal/Biotechnol Prog,23:570-576；Hefferon and Dugdale,2003,Journal/J GenVirol,84:3465-3472；Hefferon and Fan,2004,Journal/Vaccine,23:404-410；Hefferonet al.,2004,Journal/J Mol Microbiol Biotechnol,7:109-114；Huang et al.,2009,Journal/Biotechnol Bioeng,103:706-714；Mor et al.,2003,Journal/BiotechnolBioeng,81:430-437；Zhang and Mason,2006,Journal/Biotechnol Bioeng,93:271-279)。

CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)之后出现的第三代基因组定点编辑技术。与前两代技术相比，其具有成本低、制作简便、快捷高效的优点，可用于靶标基因的敲除或敲入、表观基因组编辑、定向控制转录水平及其他类型的基因工程(Doudna and Charpentier,2014,Journal/Science,346:1258096)。

DNA双链断裂(DSB)后，细胞内有两种机制来修复，即非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)，NHEJ易引起片段在断裂位点的缺失或插入(Symington and Gautier,2011,Journal/Annu Rev Genet,45:247-271)。而同源重组是利用外源核酸片段来精确修复DNA，但与NHEJ相比，同源重组的效率极低(一般低于1％)。DNA同源重组的实现取决于两个关键因子，即DNA的有效切割及靶标同源片段的有效数量。因此，在核酸酶Cas9的作用下，靶标同源片段是否充足成为决定同源重组能否实现的关键。而植物双生病毒的Rep复制子可以借助植物的酶系统进行高效的复制靶标序列，这为植物细胞内同源修复提供了大量的同源重组模板。在番茄利用菜豆黄矮病毒(BeYDV)(Cermak et al.,2015,Journal/Genome Biol,16:232)及在小麦(Gil-Humanes et al.,2017,Journal/Plant J,89:1251-1262)和水稻中利用小麦矮缩病毒(WDV)(Wang et al.,2017,Journal/Mol Plant,10:1007-1010)的DNA复制元件，在CRISPR/Cas9介导下实现了番茄、小麦和水稻的同源重组。

发明内容

本发明的目的是提供基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体。

本发明的另一目的是提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法。

为了实现本发明目的，本发明基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体，包括基因编辑载体和基因同源重组载体；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。

所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；

其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。

本发明还提供上述基因编辑载体和基因同源重组载体在植物基因编辑中的应用。

本发明还提供一种基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株。

其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。

优选地，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR。其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。其中，LIR-RepA-SIR和LIR的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

更优选地，所述基因编辑载体和基因同源重组载体的骨架载体分别为pGreen0029和pKSE401。

本发明还提供上述方法在植物基因编辑中的应用。

所述植物包括但不限于油菜、小麦、拟南芥、烟草、玉米、棉花、水稻、番茄、大白菜、圆白菜、甘蓝、辣椒、胡萝卜、白萝卜、黄瓜、香蕉、棕榈、木瓜、苹果、梨、桃。

本发明还提供上述方法在GUS基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)pHR04a载体的构建：根据NCBI中公开的菜豆黄矮病毒序列(NO.DQ458791)合成其复制子元件LIR-RepA-SIR，构建到pGreen0029载体的SphI和StuI位点之间，得到中间载体I；然后用SphI酶切中间载体I，通过In-fusion克隆，将LIR片段构建到中间载体I上，即得载体pHR04a；

2)pHR04a-AsRed载体的构建：将表达框CasMV35S-AsRed-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间，即得载体pHR04a-AsRed；其中，CasMV35S-AsRed-Nos的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

3)pHR03载体的构建：以pKSE401为骨架载体，将由CasMV35S启动子驱动的Cas9表达系统替换成YAO启动子驱动，得到载体pKSE401-YAO；然后将LIR片段构建到载体pKSE401-YAO的EcoRI位点，得到中间载体II；然后用PmeI酶切中间载体II，通过In-fusion克隆，将LIR-RepA-SIR片段构建到中间载体II上，即得载体pHR03；

4)GUS基因编辑载体的构建：gRNA识别GUS基因上的核酸序列为5’-GACCGGATGCCGACGCGAAG-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGGACCGGATGCCGACGCGAAG-3’和5’-aaacCTTCGCGTCGGCATCCGGTC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得GUS基因编辑载体(pKG-crRNA-Gus)；

其中，所述载体pKSE401-GFP-YAO是以pKSE401-YAO为骨架，在SpeI和KpnI之间插入Pnos-萝卜伸展蛋白的信号肽-GFP-Tnos片段得到的；萝卜伸展蛋白(X02873)信号肽的核酸序列为：5’-ATGGGAAGAATTGCTAGAGGCTCAAAAATGAGTTCTCTCATTGTGTCTTTGCTTGTAGTATTGGTGTCACTCAATTTGGCTTCCGAAACCACAGCT-3’；Pnos为Nos启动子；Tnos为Nos终止子；Pnos-萝卜伸展蛋白的信号肽-GFP-Tnos的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

5)GUS基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别GUS基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游500-1200bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-AsRed的AscI和NcoI位点之间，得到中间载体III；然后用XhoI酶切中间载体III，通过in-fusion克隆，将同源右臂构建到中间载体III上，即得GUS基因同源重组载体；

6)用GUS基因编辑载体和GUS基因同源重组载体共同转化过表达GUS的转基因植物(例如油菜)，或在烟草中共同注射过表达。

本发明中，Nos为终止子，即Nos terminator(Tnos)。

本发明还提供上述方法在小麦w-secalin基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)w-secalin基因编辑载体的构建：gRNA识别w-secalin基因上的核酸序列为5’-GGAATTGATGTTTCTGATCT-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-cttgGGAATTGATGTTTCTGATCT-3’和5’-aaacAGATCAGAAACATCAATTCC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得w-secalin基因编辑载体(pKG-crRNA-wp)；

2)w-secalin基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别w-secalin基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游400-800bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-AsRed的AscI和NcoI位点之间，将同源右臂构建到载体pHR04a-AsRed的BstxI和XhoI位点之间，即得w-secalin基因同源重组载体(pHM-wp)；

3)用w-secalin基因编辑载体和w-secalin基因同源重组载体共同转化小麦原生质体，获得转基因细胞系。

本发明还提供上述方法在拟南芥WRKY56基因编辑中的应用，包括以下步骤：

1)WRKY56基因编辑载体的构建：gRNA识别WRKY56基因上的核酸序列为5’-CTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGCTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’和5’-aaacACGTTAAC ACTTGAAGAAG-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得WRKY56基因编辑载体(pBY-WRKY56)；

2)WRKY56基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别WRKY56基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游900-1000bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-GUS的AscI和NcoI位点之间，将同源右臂构建到载体pHR04a-GUS的BstxI和XhoI位点之间，即得WRKY56基因同源重组载体(pHM-WRKY56)；

3)用WRKY56基因编辑载体和WRKY56基因同源重组载体共同转化拟南芥，获得转基因植株。

其中，所述载体pHR04a-GUS是将表达框CasMV35S-GUS-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间得到的。

本发明人工合成了BeYDV的复制元件LIR-RepA-SIR区间的核酸序列。以双元载体pGreen0029为载体骨架，将LIR-RepA-SIR重组到SphI和StuI之间，同时将LIR重组到SphI位点，载体命名为pHR04a(图1)。在pHR04a载体的多克隆位点处引入CaMV35S-AsRed-Nos和CaMV35S-GUS-Nos，分别命名为pHR04a-AsRed(图2)和pHR04a-GUS(图3)。以基因组编辑载体pKSE401为骨架，将CaMV35S驱动的Cas9基因替换YAO启动子驱动，并命名为pKSE401-YAO(图4)；将LIR-RepA-SIR引入到pKSE401-YAO，载体命名为pHR03(图5)。在烟草和油菜中，以GUS基因为靶标基因，将AsRed-Nos重组到GUS基因1,015bp之后，AsRed与GUS的N-端形成融合蛋白。构建GUS的基因编辑载体，将GUS的crRNA构建在pHR03上，命名为pHR03-gGus(图6)；将GUS的crRNA构建在不含有病毒复制元件的基因组编辑载体pKSE401-GFP-YAO上，命名为pKG-gGus(图7)。以pHR04a-AsRed为骨架，分别构建Gus基因上、下游同源臂为1000bp和500bp同源重组的供体载体，分别命名为pHM-GUS-1000(图8)和pHM-GUS-500(图9)。将pKG-gGus、pHR03-gGus、pHM-GUS-1000、pHM-GUS-500、pCAMBIA2301载体转化农杆菌后，根据实验目的，单独或等比例混合菌液，注射油菜或烟草的叶片，通过共聚焦显微镜下检测AsRed的荧光信号证实是否实现同源重组。在小麦中，以w-secicalin为靶标基因，其crRNA构建在pKSE401-GFP-YAO，命名为pKG-crRNA-wp(图14)；将该基因的同源臂构建在pHR04a-AsRed，命名为pHM-wp(图15)；通过PEG介导的转化，在小麦原生质体中转化pHM-wp和pKG-crRNA-wp检测是否有AsRed荧光信号，以证实在小麦中的同源重组。将通过实验发现，该系统可以在油菜、小麦及烟草实现同源重组。

利用BeYDV的复制元件Rep、SIR和LIR，直接构建在植物表达载体pGreen0029的LB和RB之间，且去除植物的筛选标记。在农杆菌介导下，可有效提高复制子在植物细胞中形成环形的能力，有效地提高了靶标序列在植物细胞的拷贝数。通过同时转化含有供体片段的载体及基因组编辑载体，在植物细胞内高效地实现同源重组。通过瞬时检测发现：在小麦中同源重组的效率为2.7％左右；在烟草中的同源重组效率为20％-70％；在油菜中的同源重组效率为15-35％。通过农杆菌介导的拟南芥的稳定遗传转化的效果来看，在拟南芥中同源重组比率为21％左右。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明将靶标供体片段和基因编辑元件分别构建在两个载体上，减少了复制子的负荷，有效增加了靶标同源片段的拷贝数，至少可达到2²⁰，在有效地对染色体进行编辑的基础上，增加了靶标序列的拷贝数，无疑会极大地提高同源重组的效率。基于本发明提供的油菜、小麦、拟南芥等植物中同源重组系统的构建策略，可实现在油菜、小麦和拟南芥中高效地同源重组，也可扩展应用于其他植物。

附图说明

图1为本发明pHR04a载体示意图。其中，LIR(Long intergenic region)长基因间隔区；SIR(Small Intergenic Region)短基因间隔区；RepA，BeYDV的复制子。其载体骨架为pGreen0029。

图2为本发明pHR04a-AsRed载体示意图。其中，35S，CaMV35S启动子；Tnos，Nos终止子；AsRed，红色荧光蛋白。其载体骨架为pHR04a。

图3为本发明pHR04a-GUS载体示意图。其中，GUS，β-葡萄糖苷酸酶基因。35S-GUS-Nos来源于pCMBIA2302。其载体骨架为pHR04a。

图4为本发明pKSE401-YAO载体示意图。其中，载体骨架来源于pKSE401；Cas9的表达框来源于pYAO:hSpCas9(Yan et al.,2015,Journal/Mol Plant,8:1820-1823)。

图5为本发明pHR03载体示意图。其中，载体骨架来源于pKSE401；Cas9的表达框来源于pYAO:hSpCas9。

图6为本发明pHR03-gGus载体示意图。其中，gGUS为GUS基因crRNA；载体骨架来源于pKSE401；Cas9的表达框来源于pYAO:hSpCas9。

图7为本发明pKG-gGus载体示意图。其中，载体骨架来源于pKSE401；Cas9的表达框来源于pYAO:hSpCas9。PNos，nos启动子；Tnos，Nos终止子；SP，分泌性信号肽来源于萝卜的伸展蛋白(X02873)。

图8为本发明pHM-GUS-1000载体示意图。其中，HM1-GUS1和2为GUS基因的1,000bp同源臂。

图9为本发明pHM-GUS-500载体示意图。其中，HM1-GUS1和2为GUS基因的500bp同源臂。

图10为本发明烟草中验证crRNA-GUS的编辑活性实验结果。其中，左侧为注射pHR04a-GUS；右侧为同时注射pHR04a-GUS和pKG-gGus。比例尺为1cm。

图11为本发明在转GUS基因的油菜转基因株系中检测crRNA-GUS的编辑活性实验结果。其中，左侧为注射pKG-gGus；右侧为对照。比例尺为1cm。

图12为本发明在烟草中同时注射pHR04a-AsRed和pCAMBIA1302的荧光检测实验结果。其中，GFP为注射pCAMBIA1302载体；AsRed为注射pHR04a-AsRed载体；该图为注射10天后的检测结果。

图13为本发明在野生型油菜子叶中注射pCMABIA2301和pHR04a-GUS的GUS检测实验结果。其中，上面为注射pCMABIA2301的子叶；下面为注射pHR04a-GUS的子叶。

图14为本发明pKG-crRNA-wp载体示意图。其中，载体骨架来源于pKSE401；Cas9的表达框来源于pYAO:hSpCas9。Pnos，Nos启动子；Tnos，Nos终止子；SP，分泌性信号肽来源于萝卜的伸展蛋白(X02873)。

图15为本发明pHM-wp载体示意图。

图16为本发明Gus基因1,000bp同源臂在烟草中的同源重组实验结果。其中，crRNA-GUS，为pKG-gGus载体的GFP的荧光；HM-GUS-AsRed，重组融合GUS基因N-端与AsRed的荧光。B为A的单个细胞放大图；Merged，为两种荧光场的重叠图。

图17为本发明Gus基因500bp同源臂的在烟草中的同源重组实验结果。其中，AsRed，重组融合GUS基因N-端与AsRed的荧光。Merged，为荧光场与明场的重叠图。

图18为本发明在烟草中增加Cas9和crRNA-GUS对同源重组的影响。其中，注射含有pHR04a-GUS、pHM-GUS-500和pHR03-gGus农杆菌混合液，AsRed，重组融合GUS基因N-端与AsRed的荧光。Merged，为荧光场与明场的重叠图。

图19为本发明在转基因油菜中与靶标基因GUS的同源重组检测结果。其中，A，为重组融合GUS基因N-端与AsRed的荧光；B，叶绿体场与重组AsRed荧光场的重叠；C，为明场；D为A、B和C的重叠。

图20为本发明在小麦原生质体中与靶标基因w-secalin的同源重组检测结果。其中，绿色荧光来自原生质体细胞内叶绿体的自发荧光，红色荧光来自重组后获得w-secalin启动子驱动而表达的AsRed。A：叶绿体场与重组AsRed荧光场的重叠；B：重组融合w-secalin基因启动子的AsRed荧光。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1靶标序列的PCR扩增及载体酶切

本发明中构建载体所用的PCR扩增程序如下：98℃2min预变性，35个PCR循环(98℃10s，55-60℃15s，72℃1-2min)。PCR反应体系为：DNA聚合酶(FastPfu DNAPolymerase，北京全式金生物技术有限公司)1μL，10×buffer 5μL，靶标模板(100ng/μL)1μL，上下游引物(10pM)各1μL，超纯水补至50μL。PCR结束后，用PCR纯化试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)纯化PCR产物，待用。

载体酶切体系：所需每种内切酶(New England Biolabs(NEB)公司)10U，质粒(200ng/μL)5μL，10×buffer 1μL，超纯水补至10μL，37℃2h左右，80℃灭火10min，待用。

In-fusion克隆(方法参照HD Cloning Kit User Manual-Clontech)：酶切后载体1.5μL，PCR产物1.5μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 1μL，混匀后，50℃40-50min，80℃灭火10min，待用。

实施例2 pHR04a载体的构建

根据BeYDV的参照序列(NCBI NO.DQ458791)合成其复制子元件LIR-RepA-SIR及多克隆位点(MCS)到pGH克隆载体(上海捷瑞生物科技有限公司)。首先设计引物对(forward：5-tatatcctgtcaaggcctgagggtcgtacgaataattcgtatccaacggaaatacc-3，reverse：5-aacgttatcag cttgcatgcgatatcaggtacttttgttctgcga-3)。按照实施例1中的PCR条件扩增目的片段LIR-RepA-SIR，SphI和StuI酶切pGreen0029载体，构建中间载体。测序正确后，并设计引物(forward：5-aacgttatcagcttgcatgcgagggtcgtacgaataattcgtatccaac-3，reverse：5-aagtacctgatatcgcatggttgttgtga ctccgagggg-3)。按照实施例1中的PCR条件扩增目的片段LIR，SphI酶切中间载体，通过In-fusion克隆，得到载体pHR04a(图1)。

实施例3 pHR04a-AsRed载体的构建

将表达框CasMV35S-AsRed-Nos重组到pHR04a的AscI和BstXI位点之间。设计引物对(forward：5-acgaccctcggcgcgcctgagacttttcaacaaagggtaatatccgga-3，reverse：5-acgtgacgtacccaaagctctgggatctagtaacatagatgacaccgcgc-3)。按照实施例1中的PCR条件扩增目的片段CasMV35S-AsRed-TNos，AscI和BstXI酶切pHR04a载体，通过In-fusion克隆，得到载体pHR04a-AsRed(图2)。

实施例4 pHR04a-GUS载体的构建

将表达框CasMV35S-GUS-TNos(来源于载体pCMBIA2301，CasMV35S-GUS-TNos的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)重组到pHR04a的AscI和BstXI位点之间。设计引物对(forward：5-acgaccctcggcgcgcctgagacttttcaacaaagggtaatatccgga-3，reverse：5-acgtgacgtaccca aagctctgggatctagtaacatagatgacaccgcgc-3)。按照实施例1中的PCR条件扩增来源于pCAMBIA2301载体的目的片段CasMV35S-GUS-Nos，AscI和BstXI酶切pHR04a载体，通过In-fusion克隆，得到载体pHR04a-GUS(图3)。

实施例5 pHR03载体的构建

以pKSE401(Xing et al.,2014,Journal/BMC Plant Biol,14:327)为骨架，将35s启动子驱动的Cas9表达系统换成YAO启动子驱动的表达系统(Yan et al.,2015,Journal/Mol Plant,8:1820-1823)，命名为pKSE401-YAO(图4)。之后，将LIR重组到pKSE401-YAO的EcoRI位点，设计引物对(forward：5-acatgattacgaattttagcagaaggcatgttgttgtgact-3，reverse：5-actagatcgggaattgagggtcgtacgaataattcgtatccaacgg-3)，按照实施例1中的PCR条件扩增，EcoRI酶切pKSE401-YAO，通过In-fusion克隆，获得中间载体①。设计引物对(forward：5-ccttcggcgttaattcagtacat-3，reverse：5-ttttgaaaccgcggtgatcacaggcagcaac-3)，按照实施例1中的PCR条件扩增来源于中间载体①的StuI和ScaII之间的片段，通过In-fusion克隆，获得中间载体②。设计引物对(forward：5-aaacactgatagtttaaacgagggtcgtacgaataattcgtatccaac-3，reverse：5-tcccgccttcagtttacgcgtgagtgtacttcaagtcagtgggaaatcaataa aatg a-3)，按照实施例1中的PCR条件扩增LIR-RepA-SIR片段，PmeI酶切中间载体②，通过In-fusion克隆，获得载体pHR03(图5)。

实施例6 GUS基因编辑载体的构建

GUS基因全长为2,023bp，含有一个内含子。在GUS的1013-1032bp的反义链上设计crRNA(GACCGGATGCCGACGCGAAG)，合成引物attGGACCGGATGCCGACGCGAAG和aaacCTTCGCGTCGGCATCCGGTC(下划线为载体酶切后的互补序列)，分别溶解为10pM。将两条单链DNA等比例混合，95℃2min，之后缓慢降至室温(形成杂交双链)；用BsaI分别酶切载体pHR03和pKSE401-GFP-YAO，将双链DNA分别与酶切后载体片段连接。0.5μL T4DNA ligase,1μL 10×buffer，1μL复性的片段(双链DNA)，7.5μL超纯水，16℃连接过夜。经测序鉴定后，保存正确克隆，分别命名为pHR03-crRNA-Gus(图6)和pKG-gGus(图7)。

其中，载体pKSE401-GFP-YAO是以pKSE401-YAO为载体骨架，在SpeI和KpnI之间插入Nos-信号肽-GFP-Nos，本发明人工合成信号肽为：ATGGGAAGAATTGCTAGAGGCTCAAAAATGAGTTCTCTCATTGTGTCTTTGCTTGTAGTATTGGTGTCACTCAATTTGGCTTCCGAAACCACAGCT来源于萝卜伸展蛋白(X02873)的信号肽，该表达框中的GFP蛋白定位于内质网上。

实施例7 GUS同源重组载体的构建

1000-bp同源臂的构建：设计引物对(forward：5-acgaccctcggcgcgatggtagatctgagggtaaatttctagtttttct-3，reverse：5-agcaaagaggccatgggaagcgggtagatacacactctgt-3)扩增GUS基因的gRNA识别位置上下游1,000bp左右的片段，重组到pHR04a-AsRed载体上，命名为pHM-GUS-1000。利用上述引物对按照实施例1的PCR扩增条件扩增GUS上游1,015bp片段，用AscI和NcoI酶切pHR04a-AsRed载体，通过in-fusion技术获得中间载体；设计引物对(forward：5-cgtcacgtggctcgacgcgtcggcatccg-3，reverse：5-ggactacgcgctcgattgtttgcctccctgctgcg-3)，利用上述引物对按照实施例1的PCR扩增条件扩增GUS下游1,008bp片段，用XhoI酶切上述中间载体，通过in-fusion克隆，获得pHM-GUS-1000(图8)。

500-bp同源臂的构建：设计引物(forward：5-acgaccctcggcgcgccatcaggaagtgatggagcatcag-3，reverse：5-ggactacgcgctcgagtttacgcgttgcttccgcca-3)，以pHM-GUS-1000为模板，扩增产物包含gRNA位点上游500bp和下游512bp的GUS片段；按照实施例1的PCR扩增条件扩增pHM-GUS-1000中的目的片段，用XhoI和BstXI酶切pHR04a载体，通过In-fusion克隆，pHM-GUS-500(图9)。

实施例8 GUS基因的gRNA编辑活性检测

在3-5叶期的烟草(Nicotiana benthamiana)中，同时注射含有pHR04a-GUS和pKG-gGus或单独注射pHR04a-GUS的农杆菌(Sparkes et al.,2006,Journal/Nat Protoc,1:2019-2025)；3-5天后，取被注射的烟草叶片，浸泡于GUS染色液(10mM Na₂EDTA·2H₂O，50mM0.5M PBS，0.5mM K₃Fe(CN)₆，0.5mM K₄Fe(CN)₆·3H₂O，0.1％10％(w/v)Triton X-100，2mMX–Gluc)中，37℃10-12h。染色完毕后，将染色组织放入70％的酒精中脱去色素，至组织无色素颜色。进行观察。

结果发现单独注射pHR04a-GUS，在注射部位周围会均匀显蓝色；而同时注射pHR04a-GUS和pKG-gGus的，不能均匀显蓝色(图10)。这说明GUS基因的gRNA可以有效地编辑pHR04a-GUS上的GUS基因。

在过表达GUS的转基因油菜(Brassica napus，本实验室保存材料)中，将含有pKG-gGus的农杆菌(OD₆₀₀＝0.8-1.0)注射到出土3-4天的油菜子叶中，具体方法参考(谭小力etal.,2012,Journal/生物学杂志,93-96)，3-5天后，取被注射的子叶，参照上述实验进行GUS染色观察。

结果发现与对照(未注射含有pKG-gGus的农杆菌的油菜子叶)相比，GUS的活性明显降低(图11)。这说明GUS基因的crRNA可以有效地编辑油菜基因组中的GUS基因。

实施例9复制子复制能力的检测

在烟草中，同时注射含有pHR04a-AsRed和pCAMBIA1302农杆菌，注射10天后取叶片，利用激光共聚焦显微镜观察AsRed和GFP荧光强度；同时利用CTAB法提取总DNA，通过qPCR，分析AsRed(forward：5-CACCGAGATCGTGTACGAGG；reverse：5-GGTGGTCCTCGAAGTGGAAG-3)和GFP(forward：5-ACGACGGCAACTACAAGACC；reverse：5-TTGTACTCCAGCTTGTGCCC-3)的拷贝数。qPCR反应体系20μL(10μL EvaGreen 2×qPCR MasterMix，引物各0.5μL，DNA模板2μL，超纯水7μL)，其程序为95℃2min预变性，40个循环(95℃15s；60℃30s)。

将pHR04a-AsRed的DNA稀释成不同浓度梯度，如10、1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6ng/μL，做DNA浓度与Ct值的标准曲线，之后对注射烟草后10天叶片中的AsRed拷贝数做绝对定量。

从实验结果来看，注射10天后，AsRed的荧光强度远高于GFP荧光强度(图12)；从qPCR的定量来看，AsRed的拷贝数在相同条件下是对照GFP的拷贝数的2²⁰，其含量在0.01-0.1ng/μL。由此可见，该复制子具有很强的DNA复制能力。

在油菜子叶中，分别注射含有pHR04a-GUS和pCMABIA2301的农杆菌，分别取注射后2和5天的子叶，参照上述实验，进行GUS染色观察。

结果表明，相同时间点，与注射对照质粒pCMABIA2301相比，注射pHR04a-GUS的处理在油菜子叶中的GUS活性显著增强(图13)。由此可见，该载体可以在油菜中具有活性。

实施例10小麦中w-secalin基因编辑载体的构建

在小麦(Triticum aestivum)中w-secalin基因的启动子和开放阅读框ATG之间设计crRNA(5’-GGAATTGATGTTTCTGATCT-3’)，合成5’-cttgGGAATTGATGTTTCTGATCT-3’和5’-aaacAGATCAGAAACATCAATTCC-3’(下划线为载体酶切后的互补序列)，分别溶解为10pM。将两条单链DNA等比例混合，95℃2min，之后缓慢降至室温；用BsaI酶切pKSE401-GFP-YAO，将双链DNA与酶切后载体片段连接。0.5μL T4DNA ligase,1μL 10×buffer，1μL复性的片段，7.5μL超纯水，16℃连接过夜。经测序鉴定后，保存正确克隆，命名为pKG-crRNA-wp(图14)。

实施例11小麦中w-secalin基因同源重组载体的构建

428-bp和872-bp同源臂的构建：设计引物对(forward:5-ggcgcgcctctagaacaatattc-3,reverse:5-gtccatggtggtgcgtgaagtttgg-3)扩增w-secalin基因的gRNA位置上游428bp的片段，连接到pHR04a-AsRed载体上AscI和NcoI两个限制性酶切位点中间。设计引物对(forward:5-tcccagagctttggagatcagaaacatcaattc-3,reverse:5-gctcgagtagagctcttggggtcgctgaga)扩增w-secalin基因的gRNA位置下游872bp的片段，连接到pHR04a-AsRed载体上BstxI和XhoI两个限制性酶切位点中间。最后获得pHM-wp(图15)。

实施例12拟南芥中WRKY56基因组编辑载体的构建

选择拟南芥WRKY56(基因组中编号AT1G64000)为靶标基因，设计其基因crRNA(5’-CTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’)。合成5’-attGCTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’和5’-aaacACGTTAACACTTGAAGAAG-3’(下划线为载体酶切后的互补序列)分别溶解为10pM。将两条单链DNA等比例混合，95℃2min，之后缓慢降至室温；用BsaI酶切pBSE401-YAO，将双链DNA与酶切后载体片段连接。0.5μL T4DNA ligase,1μL 10×buffer，1μL复性的片段，7.5μL超纯水，16℃连接过夜。经测序鉴定后，保存正确克隆，命名为pBY-WRKY56。

实施例13拟南芥中WRKY56重组载体的构建

WRKY56基因的ATG上游969bp(Forward：5’-acgaccctcGGCGCGCGCAGAATTCTTATGGTATCGAGAAAAAAAAATCT-3’和reverse：5’-CTCAGATCTACCATGCACTATCTTGCTAGATCTCTCTCTCTCTCTCTT-3’)和下游923bp(Forward：5’-CCAGAGCTTTGGGACCAACAATCCTTTTTCTTCCTTAGATGACAAAACAT-3’和reverse：5’-GGACTACGCGCTCGACATATGGGCTGGACGAACAG-3’)为同源重组臂。分别利用上述引物对按照实施例1的PCR扩增条件扩增WRKY56的上下游同源臂，以pHR04a-GUS为骨架，用AscI和NcoI(上游同源臂)BstXI和XhoI(下游同源臂)分步酶切，通过in-fusion克隆，获得pHM-WRKY56。

实施例14在烟草中同源重组能力的检测

1,000bp同源臂的同源重组：将含有pHR04a-GU、pHM-GUS-1000和pKG-gGus农杆菌混合液，按等比例混合后，注射烟草叶片，4天左右检测AsRed的荧光信号。利用激光共聚焦显微镜(Leica SP5)观察到了红色荧光信号(图16)。由此可知1000bp的同源臂可以通过烟草的瞬时表达系统在CRISPR/cas9的作用下将AsRed基因重组到GUS基因内部，并形成了融合蛋白。

将含有pHR04a-GUS、pHM-GUS-500和pKG-gGus农杆菌混合液，按等比例混合后，注射烟草叶片，4天左右检测AsRed的荧光信号。结果表明，500bp的同源臂在CRISPR/cas9的作用下也可以将AsRed基因重组到GUS基因内部，并形成了融合蛋白(图17)，有荧光信号的细胞数目占视野中细胞数目的20-30％。

将含有pHR04a-GUS、pHM-GUS-500和pHR03-gGus农杆菌混合液，按等比例混合后，注射烟草叶片，4天左右检测AsRed的荧光信号。结果表明检测到具有荧光信号的细胞数目显著增加(图18)，有荧光信号的细胞数目占视野中细胞数目的50-70％。由此可见，CRISPR/cas9的模板量充足对重组的发生有着直接的影响。

实施例15在油菜中同源重组能力的检测

在烟草实验的基础上，本发明还检测了在油菜中的同源重组：将含有pHM-GUS-500和pHR03-crRNA-Gus农杆菌混合液，按等比例混合后，注射转GUS基因油菜的子叶中(注射方法参照实施例8进行)，4天左右检测AsRed的荧光信号。利用激光共聚焦显微镜观察到了转基因油菜中产生了红色荧光信号(图19)，有荧光信号的细胞数目占视野中细胞数目的15-35％。由此可知500bp的同源臂可以在CRISPR/cas9的作用下将AsRed基因重组到含有GUS基因的染色体上，实现GUS基因的同源重组，并形成了融合蛋白。

实施例16在小麦中同源重组能力的检测

本发明检测了在小麦中的同源重组：按照Shan等人(Shan et al.,2014)的方法先制备小麦的原生质体，然后将含有pHM-wp和pKG-crRNA-wp质粒的混合液，用PEG介导的转化法转化原生质体。第2天用荧光显微镜(Olympus BX61)检测AsRed的荧光信号，并用流式细胞仪(BD LSRFortessa)检测具有红色荧光的细胞占全部原生质体有活力细胞总数的比值。结果检测到，与未转化质粒的空白对照组相比，转化质粒后的实验组部分细胞具有强烈红色荧光信号(图20)。流式细胞仪的结果显示，空白对照组有强烈红色荧光细胞所占比值为0.2％，而转化质粒的实验组有强烈红色荧光细胞所占比值为2.7％。可见，在小麦原生质体细胞中发生重组的比率大概为2.7％。

实施例17在拟南芥中同源重组能力的检测

pBY-WRKY56和pHM-WRKY56分别转化农杆菌菌株，待拟南芥开花后，用蘸花法对拟南芥进行遗传转化(Clough and Bent,1998,Journal/Plant J,16:735-743)。收种子后，利用Basta试剂，对种子进行筛选，并进行GUS染色。结果表明，在14棵有Basta抗性的转基因株系中有3棵具有GUS活性，即为同源重组的株系，其效率为21.43％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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谭小力,诸葛锐军,李冠英,卢长明,王政,张志燕,2012.农杆菌介导的油菜子叶瞬时表达.生物学杂志,93-96.

序列表

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法

<130> KHP181110363.4

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1627

<212> DNA

<213> 菜豆黄矮病毒(BeYDV)

<400> 1

gagtgtactt caagtcagtg ggaaatcaat aaaatgatta ttttatgaat atatttcatt 60

gtgcaagtag atagaaatta catatgttac ataacacacg aaataaacaa aaaaagacaa 120

tccaaaaaca aacaccccaa aaaaaataat cactttagat aaactcgtat gaggagaggc 180

acgttcagtg actcgacgat tcccgagcaa aaaaagtctc cccgtcacac atgtagtggg 240

tgacgcaatt atctttaaag taatccttct gttgacttgt cattgataac atccagtctt 300

cgtcaggatt gcaaagaatt atagaaggga tcccaccttt tattttcttc ttttttccat 360

atttagggtt gacagtgaaa tcagactggc aacctattaa ttgcttccac aatgggacga 420

acttgaaggg gatgtcgtcg atgatattat aggtggcgtg ttcatcgtag ttggtgaaat 480

cgatggtacc gttccaatag ttgtgtcgtc cgagacttct agcccaggtg gtctttccgg 540

tacgagttgg tccgcagatg tagaggctgg ggtgtcggat tccattcctt ccattgtcct 600

tgttaaatcg gccatccatt caaggtcaga ttgagcttgt tggtatgaga caggatgtat 660

gtaagtataa gcgtctatgc ttacatggta tagatgggtt tccctccagg agtgtagatc 720

ttcgtggcag cgaagatctg attctgtgaa gggcgacaca tacggttcag gttgtggagg 780

gaataatttg ttggctgaat attccagcca ttgaagcttt gttgcccatt catgagggaa 840

ttcttccttg atcatgtcaa gatattcctc cttagacgtt gcagtctgga taatagttct 900

ccatcgtgcg tcagatttgc gaggagaaac cttatgatct cggaaatctc ctctggtttt 960

aatatctccg tcctttgata tgtaatcaag gacttgttta gagtttctag ctggctggat 1020

attagggtga tttccttcaa aatcgaaaaa agaaggatcc ctaatacaag gttttttatc 1080

aagctggaga agagcatgat agtgggtagt gccatcttga tgaagctcag aagcaacacc 1140

aaggaagaaa ataagaaaag gtgtgagttt ctcccagaga aactggaata aatcatctct 1200

ttgagatgag cacttgggat aggtaaggaa aacatattta gattggagtc tgaagttctt 1260

actagcagaa ggcatgttgt tgtgactccg aggggttgcc tcaaactcta tcttataacc 1320

ggcgtggagg catggaggca ggggtatttt ggtcatttta atagatagtg gaaaatgacg 1380

tggaatttac ttaaagacga agtctttgcg acaagggggg gcccacgccg aatttaatat 1440

taccggcgtg gccccccctt atcgcgagtg ctttagcacg agcggtccag atttaaagta 1500

gaaaatttcc cgcccactag ggttaaaggt gttcacacta taaaagcata tacgatgtga 1560

tggtatttga tggagcgtat attgtatcag gtatttccgt tggatacgaa ttattcgtac 1620

gaccctc 1627

<210> 2

<211> 365

<212> DNA

<213> 菜豆黄矮病毒(BeYDV)

<400> 2

tagcagaagg catgttgttg tgactccgag gggttgcctc aaactctatc ttataaccgg 60

cgtggaggca tggaggcagg ggtattttgg tcattttaat agatagtgga aaatgacgtg 120

gaatttactt aaagacgaag tctttgcgac aagggggggc ccacgccgaa tttaatatta 180

ccggcgtggc ccccccttat cgcgagtgct ttagcacgag cggtccagat ttaaagtaga 240

aaatttcccg cccactaggg ttaaaggtgt tcacactata aaagcatata cgatgtgatg 300

gtatttgatg gagcgtatat tgtatcaggt atttccgttg gatacgaatt attcgtacga 360

ccctc 365

<210> 3

<211> 1342

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactgagct 360

ccgccaccat ggcctctttg ctgaagaaga ccatgccctt caggaccacc atcgagggca 420

ccgtgaacgg ccactacttc aagtgcaccg gcaagggcga gggcaacccc ctggagggca 480

cccaggagat gaagatcgag gtgatcgagg gcggccccct gcccttcgcc ttccacatcc 540

tgtccacctc ctgcatgtac ggctccaagg ccttcatcaa gtacgtgtcc ggcatccccg 600

actacttcaa gcagtccctc cccgagggct tcacctggga gcgcaccacc acctacgagg 660

acggcggctt cctgaccgcc caccaggaca cctccctgga cggcgactgc ctggtgtaca 720

aggtgaagat cctgggcaac aacttccccg ccgacggccc cgtgatgcag aacaaggccg 780

gccgctggga gccctccacc gagatcgtgt acgaggtgga cggcgtgctg cgcggccagt 840

ccctgatggc cctggagtgc cccggcggtc gccacctgac ctgccacctg cacaccacct 900

accgctccaa gaagcccgcc tccgccctga agatgcccgg cttccacttc gaggaccacc 960

gcatcgagat cctggaggag gtggagaagg gcaagtgcta caagcagtac gaggccgccg 1020

tgggccgcta ctgcgacgcc gccccctcca agctgggcca caactgaggt gaccagctcg 1080

aatttccccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa tcctgttgcc 1140

ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt aataattaac 1200

atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc gcaattatac 1260

atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt atcgcgcgcg 1320

gtgtcatcta tgttactaga tc 1342

<210> 4

<211> 1397

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcttgcatg ccggtcgatc tagtaacata gatgacaccg cgcgcgataa tttatcctag 60

tttgcgcgct atattttgtt ttctatcgcg tattaaatgt ataattgcgg gactctaatc 120

aaaaaaccca tctcataaat aacgtcatgc attacatgtt aattattaca tgcttaacgt 180

aattcaacag aaattatatg ataatcatcg caagaccggc aacaggattc aatcttaaga 240

aactttattg ccaaatgttt gaacgatctg cttgactcta gcccgggctt gtacagctcg 300

tccatgccga gagtgatccc ggcggcggtc acgaactcca gcaggaccat gtgatcgcgc 360

ttctcgttgg ggtctttgct cagggcggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc 420

agcacggggc cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg 480

ccgtcctcga tgttgtggcg gatcttgaag ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg 540

gccatgatat agacgttgtg gctgttgtag ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg 600

ccgtcctcct tgaagtcgat gcccttcagc tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg 660

aacttcacct cggcgcgggt cttgtagttg ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc 720

tggacgtagc cttcgggcat ggcggacttg aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg 780

tagcggctga agcactgcac gccgtaggtc agggtggtca cgagggtggg ccagggcacg 840

ggcagcttgc cggtggtgca gatgaacttc agggtcagct tgccgtaggt ggcatcgccc 900

tcgccctcgc cggacacgct gaacttgtgg ccgtttacgt cgccgtccag ctcgaccagg 960

atgggcacca ccccggtgaa cagctcctcg cccttgctca ccatgtcgac agctgtggtt 1020

tcggaagcca aattgagtga caccaatact acaagcaaag acacaatgag agaactcatt 1080

tttgagcctc tagcaattct tcccataagc tttcgagttg agagtgaata tgagactcta 1140

attggatacc gaggggaatt tatggaacgt cagtggagca tttttgacaa gaaatatttg 1200

ctagctgata gtgaccttag gcgacttttg aacgcgcaat aatggtttct gacgtatgtg 1260

cttagctcat taaactccag aaacccgcgg ctgagtggct ccttcaacgt tgcggttctg 1320

tcagttccaa acgtaaaacg gcttgtcccg cgtcatcggc gggggtcata acgtgactcc 1380

cttaattctc atgtatc 1397

<210> 5

<211> 2696

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt gcccagctat 60

ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg 120

cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca aagatggacc 180

cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt caaagcaagt 240

ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact atccttcgca 300

agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg ggactcttga 360

ccatggtaga tctgagggta aatttctagt ttttctcctt cattttcttg gttaggaccc 420

ttttctcttt ttattttttt gagctttgat ctttctttaa actgatctat tttttaattg 480

attggttatg gtgtaaatat tacatagctt taactgataa tctgattact ttatttcgtg 540

tgtctatgat gatgatgata gttacagaac cgacgactcg tccgtcctgt agaaacccca 600

acccgtgaaa tcaaaaaact cgacggcctg tgggcattca gtctggatcg cgaaaactgt 660

ggaattgatc agcgttggtg ggaaagcgcg ttacaagaaa gccgggcaat tgctgtgcca 720

ggcagtttta acgatcagtt cgccgatgca gatattcgta attatgcggg caacgtctgg 780

tatcagcgcg aagtctttat accgaaaggt tgggcaggcc agcgtatcgt gctgcgtttc 840

gatgcggtca ctcattacgg caaagtgtgg gtcaataatc aggaagtgat ggagcatcag 900

ggcggctata cgccatttga agccgatgtc acgccgtatg ttattgccgg gaaaagtgta 960

cgtatcaccg tttgtgtgaa caacgaactg aactggcaga ctatcccgcc gggaatggtg 1020

attaccgacg aaaacggcaa gaaaaagcag tcttacttcc atgatttctt taactatgcc 1080

ggaatccatc gcagcgtaat gctctacacc acgccgaaca cctgggtgga cgatatcacc 1140

gtggtgacgc atgtcgcgca agactgtaac cacgcgtctg ttgactggca ggtggtggcc 1200

aatggtgatg tcagcgttga actgcgtgat gcggatcaac aggtggttgc aactggacaa 1260

ggcactagcg ggactttgca agtggtgaat ccgcacctct ggcaaccggg tgaaggttat 1320

ctctatgaac tgtgcgtcac agccaaaagc cagacagagt gtgatatcta cccgcttcgc 1380

gtcggcatcc ggtcagtggc agtgaagggc gaacagttcc tgattaacca caaaccgttc 1440

tactttactg gctttggtcg tcatgaagat gcggacttgc gtggcaaagg attcgataac 1500

gtgctgatgg tgcacgacca cgcattaatg gactggattg gggccaactc ctaccgtacc 1560

tcgcattacc cttacgctga agagatgctc gactgggcag atgaacatgg catcgtggtg 1620

attgatgaaa ctgctgctgt cggctttaac ctctctttag gcattggttt cgaagcgggc 1680

aacaagccga aagaactgta cagcgaagag gcagtcaacg gggaaactca gcaagcgcac 1740

ttacaggcga ttaaagagct gatagcgcgt gacaaaaacc acccaagcgt ggtgatgtgg 1800

agtattgcca acgaaccgga tacccgtccg caaggtgcac gggaatattt cgcgccactg 1860

gcggaagcaa cgcgtaaact cgacccgacg cgtccgatca cctgcgtcaa tgtaatgttc 1920

tgcgacgctc acaccgatac catcagcgat ctctttgatg tgctgtgcct gaaccgttat 1980

tacggatggt atgtccaaag cggcgatttg gaaacggcag agaaggtact ggaaaaagaa 2040

cttctggcct ggcaggagaa actgcatcag ccgattatca tcaccgaata cggcgtggat 2100

acgttagccg ggctgcactc aatgtacacc gacatgtgga gtgaagagta tcagtgtgca 2160

tggctggata tgtatcaccg cgtctttgat cgcgtcagcg ccgtcgtcgg tgaacaggta 2220

tggaatttcg ccgattttgc gacctcgcaa ggcatattgc gcgttggcgg taacaagaaa 2280

gggatcttca ctcgcgaccg caaaccgaag tcggcggctt ttctgctgca aaaacgctgg 2340

actggcatga acttcggtga aaaaccgcag cagggaggca aacaagctag ccaccaccac 2400

caccaccacg tgtgaattac aggtgaccag ctcgaatttc cccgatcgtt caaacatttg 2460

gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt 2520

tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag 2580

atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat 2640

atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatc 2696

Claims (10)

1.基于CRISPR/Cas9技术开发的一种用于植物基因编辑的载体，其特征在于，包括基因编辑载体和基因同源重组载体；其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；

其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。

3.基于CRISPR/Cas9的植物高效同源重组方法，其特征在于，根据待编辑的植物靶基因，分别构建基因编辑载体和基因同源重组载体，然后，用两种载体共同转化植物，获得转基因植株；

其中，所述基因编辑载体至少包含Cas9表达框和gRNA表达元件，所述基因同源重组载体至少包含来源于菜豆黄矮病毒的复制子元件、同源左臂、待敲入基因和同源右臂。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述基因同源重组载体中各元件之间的连接关系为：LIR-RepA-SIR-同源左臂-待敲入基因-同源右臂-LIR；

其中，LIR为长基因间隔区，SIR为短基因间隔区，RepA为菜豆黄矮病毒的复制子。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述基因编辑载体和基因同源重组载体的骨架载体分别为pGreen0029和pKSE401。

6.权利要求3-5任一项所述方法在植物基因编辑中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物选自油菜、小麦、拟南芥、烟草、玉米、棉花、水稻、番茄、大白菜、圆白菜、甘蓝、辣椒、胡萝卜、白萝卜、黄瓜、香蕉、棕榈、木瓜、苹果、梨、桃。

8.权利要求3-5任一项所述方法在GUS基因编辑中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)pHR04a载体的构建：根据NCBI中公开的菜豆黄矮病毒序列合成其复制子元件LIR-RepA-SIR，构建到pGreen0029载体的SphI和StuI位点之间，得到中间载体I；然后用SphI酶切中间载体I，通过In-fusion克隆，将LIR片段构建到中间载体I上，即得载体pHR04a；

2)pHR04a-AsRed载体的构建：将表达框CasMV35S-AsRed-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间，即得载体pHR04a-AsRed；

3)pHR03载体的构建：以pKSE401为骨架载体，将由CasMV35S启动子驱动的Cas9表达系统替换成YAO启动子驱动，得到载体pKSE401-YAO；然后将LIR片段构建到载体pKSE401-YAO的EcoRI位点，得到中间载体II；然后用PmeI酶切中间载体II，通过In-fusion克隆，将LIR-RepA-SIR片段构建到中间载体II上，即得载体pHR03；

4)GUS基因编辑载体的构建：gRNA识别GUS基因上的核酸序列为5’-GACCGGATGCCGACGCGAAG-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGGACCGGATGCCGACGCGAAG-3’和5’-aaacCTTCGCGTCGGCATCCGGTC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得GUS基因编辑载体；

其中，所述载体pKSE401-GFP-YAO是以pKSE401-YAO为骨架，在SpeI和KpnI之间插入Pnos-萝卜伸展蛋白的信号肽-GFP-Tnos片段得到的；Pnos为Nos启动子；Tnos为Nos终止子；

5)GUS基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别GUS基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游500-1200bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-AsRed的AscI和NcoI位点之间，得到中间载体III；然后用XhoI酶切中间载体III，通过in-fusion克隆，将同源右臂构建到中间载体III上，即得GUS基因同源重组载体；

6)用GUS基因编辑载体和GUS基因同源重组载体共同转化过表达GUS的转基因植物，获得转基因植株。

9.权利要求3-5任一项所述方法在小麦w-secalin基因编辑中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)w-secalin基因编辑载体的构建：gRNA识别w-secalin基因上的核酸序列为5’-GGAATTGATGTTTCTGATCT-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-cttgGGAATTGATGTTTCTGATCT-3’和5’-aaacAGATCAGAAACATCAATTCC-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得w-secalin基因编辑载体；

2)w-secalin基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别w-secalin基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游400-800bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-AsRed的AscI和NcoI位点之间，将同源右臂构建到载体pHR04a-AsRed的BstxI和XhoI位点之间，即得w-secalin基因同源重组载体；

3)用w-secalin基因编辑载体和w-secalin基因同源重组载体共同转化小麦原生质体，获得转基因细胞系；

其中，所述载体pKSE401-GFP-YAO和pHR04a-AsRed的定义同权利要求4所述。

10.权利要求3-5任一项所述方法在拟南芥WRKY56基因编辑中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)WRKY56基因编辑载体的构建：gRNA识别WRKY56基因上的核酸序列为5’-CTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’，据此设计两条单链DNA，分别为5’-attGCTTCTTCAAGTGTTAACGT-3’和5’-aaacACGTTAAC ACTTGAAGAAG-3’，将两条单链DNA进行杂交，所得双链DNA片段与BsaI酶切后的载体pKSE401-GFP-YAO连接，即得WRKY56基因编辑载体；

2)WRKY56基因同源重组载体的构建：根据gRNA识别WRKY56基因上的核酸序列，分别扩增其上游和下游900-1000bp大小的片段，分别作为同源左臂和同源右臂；将同源左臂构建到载体pHR04a-GUS的AscI和NcoI位点之间，将同源右臂构建到载体pHR04a-GUS的BstxI和XhoI位点之间，即得WRKY56基因同源重组载体；

3)用WRKY56基因编辑载体和WRKY56基因同源重组载体共同转化拟南芥，获得转基因植株；

其中，所述载体pHR04a-GUS是将表达框CasMV35S-GUS-Nos构建到载体pHR04a的AscI和BstXI位点之间得到的；

所述载体pKSE401-GFP-YAO和pHR04a的定义同权利要求5所述。