CN109880846A - 一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于对植物基因组进行精准编辑的载体，包括依次连接的两个双生病毒大间区LIR、sgRNA表达盒和Cas9D10A基因片段；在两个大间区LIR之间连接有复制相关蛋白Rep/RepA片段、双生病毒小间区SIR和用于DNA重组编辑的HR片段；sgRNA表达盒是依据基因组目标位点DNA序列设计构建。基因编辑载体的构建方法包括以下步骤：第一步，构建质粒PMF115；第二步，构建质粒PMF125；第三步，依据基因组目标位点DNA序列，设计sgRNA表达盒，将sgRNA表达盒克隆到质粒PMF125；第四步，将用于重组的DNA片段HR克隆到质粒PMF115；第五步，将第四步构建质粒中两个LIR之间的DNA片段克隆到第三步构建的质粒中，从而获得最终基因编辑载体。

Description

一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于对植物基因组的特定位点DNA进行精确编辑的载体、以及载体的构建方法和应用。

背景技术

基因定点突变与定点置换技术称为基因组编辑技术，也称为基因打靶技术，该技术能实现在生物体细胞基因组DNA的定点突变、定点整合及置换，从而人为定向改变基因的功能。利用这种技术能够实现对基因组DNA一个或多个碱基的变异，或者插入一段DNA，如一个基因，或者删除一段DNA，让基因的某些功能区域缺失。基因组编辑的方法包括：锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术、TALEN(Transcription activator-like effectornucleases)技术及CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated systems)技术等，其中CRISPR/Cas9构建简单，使用方便，从而得到了更广泛的运用。

CRISPR是细菌及古细菌基因组中存在的成串重复DNA，是降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的重要免疫机制。CRISPR系统分成三类，其中I类和III类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)才能发挥作用，而II类系统只需要一种Cas蛋白即可。例如，CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(crRNAs)来指导Cas9蛋白对同源DNA序列的降解。依据这种对付入侵细菌细胞病毒DNA的原理，设计出在高等生物中对基因进行编辑的系统，能够对细胞的基因组DNA进行原位修饰、改变，这不仅为研究基因功能提供了重要手段，而且在基因定向突变，改良农作物品种中，显示出广阔的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种用于植物基因组编辑的载体、以及载体的构建和应用方法，实现对植物基因组特定位点DNA的精确修饰、编辑，以及将外源DNA定点整合到植物基因组的目的，从而达到按照设计改变原基因组特定位置DNA遗传信息的目的，将本发明提供的种载体用于对水稻稻瘟病抗性位点DNA的编辑修饰获得良好效果。

本发明通过下述技术方案实现：

一种用于植物基因组编辑载体构建的质粒PMF115，所述质粒包含有双生病毒复制相关的小间区SIR、大间区LIR和复制相关蛋白Rep/RepA三个DNA片段，所述双生病毒小间区SIR为Seq No.1，双生病毒大间区LIR为Seq No.2，复制相关蛋白Rep/RepA片段为Seq No.3。所述质粒用于克隆重组的DNA片段HR。质粒PMF115结构示意图如图1所示。双生病毒是指双生病毒科植物病毒，如小麦矮缩病毒。

基于上述质粒PMF115的构建方法，包括以下步骤：

Setp 1，根据双生病毒基因组序列设计并合成小间区SIR、大间区LIR和复制相关蛋白Rep/RepA三个DNA片段；其中，小间区SIR片段如Seq No.1所示，大间区LIR片段如SeqNo.2所示，复制相关蛋白Rep/RepA片段如Seq No.3所示，具体操作过程中，将合成的三个DNA片段分别克隆在PJWR质粒、pMV质粒和pMV质粒上；

Setp 2，将小间区SIR的DNA片段克隆到pGreenII0179的EcoRI和PstI双酶切位点，得到质粒0179-SIR。具体地，将含小间区SIR的质粒PJWR经EcoRI和PstI双酶切后，与经EcoRI和PstI双酶切后的pGreenII0179片段进行连接，得到质粒0179-SIR；

Setp 3，将大间区LIR的DNA片段克隆到质粒0179-SIR的KpnI和XhoI酶切位点，得到质粒0179-LIR-SIR。具体地，将含有大间区LIR的质粒pMV经KpnI和XhoI酶切后，与经KpnI和XhoI酶切后的0179-SIR片段进行连接，得到质粒0179-LIR-SIR；

Setp 4，将大间区LIR的DNA片段克隆到质粒0179-LIR-SIR的SacII和SacI酶切位点，得到质粒PMF096；具体地，采用F-LIR-SacII和R-LIR-SacI作为引物，以质粒0179-LIR-SIR为模板进行PCR扩增，得到的PCR片段克隆到质粒0179-LIR-SIR的SacII和SacI酶切位点，得到质粒0179-LIR-SIR-LIR，命名为PMF096；其中，F-LIR-SacII和R-LIR-SacI引物如下：

F-LIR-SacII：5’-TACCGCGGGGTAGTGAACAGAAGTCCG-3’；

R-LIR-SacI：5’-TAGAGCTCCGAGATGGGCTCCCACGC-3’；

Setp 5，在质粒PMF096的大间区LIR和小间区SIR中间克隆一个多克隆位点区，得到质粒PMF114，所述多克隆位点区包括XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、HindIII、EcoRV；具体地，合成序列如下所示的F-PC和R-PC片段，将这两个单链DNA片段经变性后复性得到双链DNA的片段，再将其克隆到质粒PMF096的SalI和HindIII双酶切位点，获得在大间区LIR和小间区SIR中间含有多克隆位点区XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、HindIII、EcoRV的质粒，即PMF114；

F-PC：5’-TCGACCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGC-3’；

R-PC：5’-AGCTTGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGG-3’；

Setp 6，将Rep/RepA的DNA片段克隆到质粒PMF114的SacII和PstI双酶切位点，得到质粒PMF115，序列为Seq No.4；具体地，将含有复制相关蛋白Rep/RepA片段的质粒pMV经SacII和PstI双酶切后，与PMF114质粒经同样酶切后DNA片段连接即可。

一种与上述质粒PMF115配合使用构建植物基因组编辑载体的质粒PMF125，所述质粒PMF125是将质粒pYLCRISPR/Cas9pUbi-H中编码Cas9蛋白的氨基酸突变，使得Cas9由核酸酶变为切口酶。由于Cas9核酸酶含有两个功能域：RuvC和HNH，D10A突变使得RuvC丧失功能Cas9成为切口酶；同样地，突变在HNH功能域H840A，第840位氨基酸由组氨酸突变成丙氨酸，也可以使Cas9由核酸酶变为切口酶。所述质粒PMF125用于克隆目标基因的sgRNA表达盒，通过质粒PMF125直接与质粒PMF115配合使用，或者与构建质粒PMF115的中间质粒PMF096或PMF114配合使用构建植物基因组编辑载体。质粒PMF125的结构示意图如图2所示。

上述质粒PMF125的构建方法，包括以下步骤：

Setp 1，用BamHI酶切pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒，得到约10kb和6.2kb两个片段，6.2Kb片段与质粒pUC19经BamHI酶切并去磷酸化的片段连接，得质粒T-p-cas9p；10kb片段经去磷酸化处理备用；

Setp 2，合成如下PCR引物：

F-p-cas9p：5’-CTGAGCTAGCGTTCGTACACGGAT-3’；

R-p-cas9p：5’-ATGCGCTAGCTCCACCGTCAATGTA-3’；

F-cas9pD10A：5’-TCCATCGGCCTCGCTATCGGCACCAAC-3’；

R-cas9pD10A：5’-GTTGGTGCCGATAGCGAGGCCGATGGA-3’；

以pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒为模板，分别用引物F-p-cas9p和R-cas9pD10A、F-cas9pD10A和R-p-cas9p进行第一次PCR扩增；以两个第一次PCR扩增片段混合DNA为模板，用引物F-p-cas9p和R-p-cas9p进行第二次PCR扩增，第二次PCR扩增片段经NheI酶切与质粒T-p-cas9p经NheI酶切去磷酸化处理的大片段连接，得到质粒T-p-cas9pM；

Setp 3，质粒T-p-cas9pM经BamHI酶切，回收的片段与上述Setp 1的10kb大片段连接，从而获得载体质粒PMF125，序列为Seq No.5。

一种用于植物基因组编辑的载体，所述编辑载体包括依次连接的两个双生病毒大间区LIR、sgRNA表达盒和Cas9D10A基因，且所述两个双生病毒大间区LIR之间含有双生病毒复制相关蛋白Rep/RepA片段、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR；

所述sgRNA表达盒是依据目标基因组位点DNA序列设计构建而成，包括含启动子、依据靶序列设计的sgRNA的DNA片段及终止子；

所述用于重组的DNA片段HR是指用于与目标基因组位点DNA在细胞内重组，从而达到改变原编辑位点DNA遗传信息的DNA片段。

所述sgRNA表达盒为依据目标基因组位点DNA序列设计构建，包括含启动子、靶序列和sgRNA的DNA片段。基因组编辑载体如图3所示，用该载体转化植物，载体质粒的RB到LB的T-DNA片段整合进入植物细胞的基因组中，由于T-DNA含有两个双生病毒大间区(LIR)，两者重组得到如图5所示的环状DNA分子。在转入表达的复制相关蛋白(Rep/RepA)作用下，形成的环状DNA类似于双生病毒，在植物细胞内自主大量复制，得到的大量含有HR的DNA就易于与基因组的同源目标位点DNA发生重组，从而实现对基因组的编辑修饰，特别是转入的Cas9D10A核酸酶的表达，在sgRNA的引导下，能在目标基因组的目标DNA上形成切口，使得这种重组概率大幅度提高，最终实现对基因组高效的编辑。

基于上述用于植物基因组编辑的载体的构建方法，包括以下步骤：

Setp 1，构建质粒PMF115；

Setp 2，构建质粒PMF125；

Setp 3，依据目标基因组位点DNA序列设计sgRNA表达盒，将所述sgRNA表达盒连入载体PMF125制备含sgRNA表达盒的质粒；

Setp 4，将用于重组DNA的片段HR连接到载体质粒PMF115；

Setp 5，将所述Setp 4构建的质粒中两个大间区LIR片段、以及两个大间区LIR之间的DNA片段克隆到Setp 3构建的质粒中，获得最终基因组编辑载体。

进一步地，用于植物基因组编辑的载体的构建方法，所述Setp 3中，sgRNA表达盒的设计步骤包括：

Setp 31，对目标基因组位点DNA序列，设计sgRNA靶序列，所述sgRNA靶序列为5’-N₂₀NGG，其中GC含量为50％-70％，对应启动子为U3或U6；

具体地，sgRNA靶序列通常为5’-N₂₀NGG，其中GC含量大于40％，最好为50％-70％，避免连续的4个碱基为T。如果sgRNA序列是5’-AN₁₉NGG，选择U3作为启动子；如果sgRNA序列是5’-GN₁₉NGG，选择U6作为启动子；如果sgRNA序列为5’-(T/C)N₁₉NGG，可以任选U3或U6作为启动子；

Setp 32，PCR引物设计：根据sgRNA靶序列，合成重叠延伸PCR的引物，合成构建sgRNA表达盒的通用引物；

具体地，根据sgRNA靶序列，合成重叠延伸PCR的引物，合成构建sgRNA表达盒的通用引物；根据Setp 31设计的sgRNA靶序列，按下述表1合成重叠延伸PCR(Overlap PCR)的引物，按下述表2合成构建sgRNA表达盒的通用引物。

表1含靶位点DNA序列的重叠延伸PCR的引物

表2构建sgRNA表达盒的通用引物*

*注：GGTCTC为BsaI识别位点；ACTAGT为SpeI酶切位点；ACGCGT为MluI酶切位点。

Setp 33，重叠延伸PCR扩增构建sgRNA表达盒；

具体地，根据需要选择不同的启动子，再依照选用的启动子不同，分别从如下四个质粒中选择适当的一个作为第一轮PCR的扩增模板：

①pYLsgRNA-OsU3，GenBank登录号：KR029103；

②pYLsgRNA-OsU6a，GenBank登录号：KR029105；

③pYLsgRNA-OsU6b，GenBank登录号：KR029107；

④pYLsgRNA-OsU6c，GenBank登录号：KR029108。

两个PCR扩增的引物分别是U-F和OsU#T#-、gRT#-和gR-R为引物，扩增后分别得到U片段和T片段。

然后，以U片段和T片段混合为模板，Pps和Pgs为引物，进行第二轮PCR扩增，得到含有BsaI酶切位点的PCR产物。

上述重叠延伸PCR(Overlap PCR)扩增过程如图4所示。

第二轮扩增的PCR片段克隆到ZT4-Blunt载体(庄盟生物公司，货号ZC205)，克隆片段经DNA测序验证。BsaI酶切质粒得到sgRNA表达盒，包括含启动子、靶序列、sgRNA的片段。

Setp 34，根据所设计的靶标序列数目组合扩增多个sgRNA表达盒。

具体地，可以根据所设计靶标序列数目组合扩增多个sgRNA表达盒，推荐按如下使用启动子及相应的PCR引物组合进行PCR扩增构建sgRNA表达盒：

1个目标位点：LacZ-OsU6a；

2个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6b；

3个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6b+OsU6c；

4个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6b+OsU6c+OsU3m；

5个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6a+OsU6b+OsU6c+OsU3m；

6个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6a+OsU6b+OsU6b+OsU6c+OsU3m；

7个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6a+OsU6b+OsU6b+OsU6c+OsU6c+OsU3m；

8个目标位点：LacZ-OsU6a+OsU6a+OsU6b+OsU6b+OsU6c+OsU6c+OsU3m+OsU3m。

例如，1个靶序列用Pps-GGL/Pgs-GGR；2个靶序列分别用：Pps-GGL/Pgs-GG2和Pps-GG2/Pgs-GGR；3个靶序列分别用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3和Pps-GG3/Pgs-GGR；4个靶序列分别用Pps-GGL/Pgs-GG2、Pps-GG2/Pgs-GG3、Pps-GG3/Pgs-GG4和Pps-GG4/Pgs-GGR；依此类推。

Setp 35，sgRNA表达盒连入质粒PMF125：

具体地，sgRNA表达盒质粒经BsaI酶切分离的表达盒DNA片段，与BsaI酶切质粒PMF125的DNA片段连接，即得到含sgRNA表达盒的PMF125质粒。

下面事例为3个sgRNA表达盒时，它们的连接顺序(方向为5’-3’)。

进一步地，用于植物基因组编辑的载体的构建方法，所述Setp 4具体操作方法为：用于重组的DNA片段HR通过酶切连接或同源重组连接的方法连入质粒PMF115多克隆位点处；或者用于重组的DNA片段HR克隆到质粒PMF096或质粒PMF114得到中间质粒，然后再将Rep/RepA片段克隆进入上述中间质粒，即得到含HR片段的PMF115质粒。

操作方法如下：

Setp 41，根据sgRNA靶序列位点的基因组DNA序列，设计同源臂DNA，并与包括设计的突变、缺失或插入的DNA一起组成提供重组的片段HR。

Setp 42，提供重组的HR片段通过酶切连接或同源重组的方法连入质粒PMF115多克隆位点处；

①酶切的方法：根据载体PMF115中多克隆位点处可用酶切位点XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、EcoRV及提供重组片段HR序列设计克隆酶切位点。通常采用PCR扩增获得HR片段，HR片段克隆到ZT4-Blunt(庄盟生物公司，货号ZC205)，并测序克隆的HR验证。用设计的酶酶切HR片段，连接到PMF115质粒得到相应质粒。注意：Rep/RepA中含有一个HindIII酶切位点，PMF115多克隆位点中HindIII不能用于克隆。

②同源重组的方法：根据载体PMF115中多克隆位点处可用酶切位点XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、EcoRV任选两个酶(假定为酶A和酶B)酶切PMF115质粒，得到线性PMF115质粒DNA。通常用PCR扩增方法得到HR片段，PCR引物以如下所示设计：

正向引物(F-HR)：A酶切位点序列前15个碱基+A酶切位点序列+HR片段序列正向5’-端15～20bp碱基序列-3’。

反向引物(R-HR)：B酶切位点序列前15个碱基+B酶切位点序列+HR序列反向5’-端15～20bp碱基序列-3’。

经酶切线性化的PMF115和PCR扩增片段，经重组酶(Vazyme公司，货号C112-01)连接得到相应的质粒。

或者，提供重组DNA的HR片段首先克隆到质粒PMF096或者PMF114，然后再将Rep/RepA片段克隆到这个质粒。特别是，在Rep/RepA中含有HindIII酶切位点，而克隆HR片段也需要用到HindIII酶切位点时，选择HR片段克隆到PMF096或者PMF114，然后再将Rep/RepA片段克隆到这个质粒，最终得到含有HR片段的编辑载体PMF115的质粒。

进一步地，用于植物基因组编辑载体的构建方法，所述Setp 5具体操作步骤包括：

以如下引物：F-LSL和R-LSL：

F-LSL：5’-TTGGAGTGGATGGATACTAGTGGTAGTGAACAGAAG-3’；

R-LSL：5’-GCGCCAATGATACCGACGCGTCGAGATGGGCTCCCA-3’；

用Setp 4构建的质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的DNA片段包括两个病毒大间区LIR、以及位于两个病毒大间区LIR之间的复制相关蛋白Rep/RepA、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR(如图6所示)；扩增片段与来自Setp 3含sgRNA表达盒的PMF125质粒的MluI和SpeI双酶切片段经重组酶连接，即获得最终的编辑载体，如图3所示。

或者，如果用于重组的DNA片段HR中不含MluI和NheI酶切位点，可采用酶切连接的方法将PCR扩增片段连入PMF125质粒中。具体地，用如下引物：

F-LIR-M：5’-TAACGCGTGGTAGTGAACAGAAGTCCG-3’；

R-LIR-N：5’-TAGCTAGCCGAGATGGGCTCCCACGC-3’；

用Setp 4构建的质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到DNA片段包括病毒大间区LIR、复制相关蛋白Rep/RepA、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR(如图6所示)，将该PCR扩增片段经MluI和NheI酶切后，与来自Step3含sgRNA表达盒质粒PMF125的MluI和SpeI双酶切片段连接，即获得最终的编辑载体，如图3所示。

基于上述用于构建植物基因组编辑载体的质粒PMF115或质粒PMF125或用于植物基因组编辑的载体的应用。

本发明具有如下的优点和有益效果：

1、用本发明的基因组编辑载体转化植物，质粒的RB到LB的T-DNA片段整合进入植物细胞的基因组中，由于T-DNA含有两个双生病毒大间区(LIR)，从而进行重组得到环状DNA分子(如图5所示)。在转入表达的复制相关蛋白(Rep/RepA)作用下，该环状DNA类似于双生病毒，在植物细胞内自主大量复制，得到的大量含有HR的DNA就易于与基因组的同源目标位点DNA发生重组，从而实现对基因组的编辑修饰，特别是转入的Cas9D10A核酸酶的表达，在sgRNA的引导下，能在基因组目标DNA上形成切口，使得这种重组概率大幅度提高，最终实现对基因组高效的编辑；

2、本发明改进了现有的CRISPR/Cas9基因编辑系统，实现了对基因组特定位点DNA的精确修饰、编辑。更确切地说，本发明提供了一种将外源DNA定点整合到植物基因组的方法，实现了按照需要进行设计，达到改变原基因组特定位置DNA遗传信息的目的。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明的质粒PMF115结构示意图；

图2为本发明的质粒PMF125结构示意图；

图3为本发明的基因组编辑载体结构示意图；

图4为本发明的整个重叠延伸PCR(Overlap PCR)扩增过程示意图；

图5为本发明的环状DNA分子示意图；

图6为本发明中PCR扩增的含病毒复制相关元件和提供重组DNA的HR片段示意图；

图7为本发明设计的水稻稻瘟病抗性基因替换供体片段示意图；

图8为本发明的转化水稻植株潮霉素标记基因的PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；

图9为本发明的转化水稻植株Cas9基因的PCR检测琼脂糖凝胶电泳图；

图10为本发明用于水稻稻瘟病抗性基因进行编辑的实际效应；图中数字000对应的DNA序列为原来基因组DNA序列，其它是测定的植株发生编辑的DNA序列；

图11为稻瘟病抗性位点在水稻基因组各个染色体上的分布，图中数字是遗传图距单位厘摩，下划线的文字为SSR或者RFLP标记；此图片引自发表文献：Wang,X.,Lee,S.,Wang,J.,Ma,J.,Bianco,T.,&Jia,Y.(2014).Current advances on genetic resistanceto rice blast disease.In Rice-Germplasm,Genetics andImprovement.IntechOpen.http://dx.doi.org/10.5772/56824。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

一、构建一种含有双生病毒复制相关原件、用于克隆用于重组DNA的片段HR的载体质粒PMF115，如图1所示。

质粒PMF115的构建方法如下：

1、首先根据侵染小麦的小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus)基因组序列(GenBank登录号：DQ868525.1)设计合成小间区SIR(Seq No.1)、大间区LIR(Seq No.2)和复制相关蛋白Rep/RepA(Seq No.3)三个DNA片段。

小间区(SIR)DNA片段由华大基因(HTTP://WWW.GENOMICS.CN/)合成，并克隆在质粒PJWR上；

大间区(LIR)DNA片段由华大基因合成，并克隆在质粒pMV上；

复制相关蛋白Rep/RepA的DNA片段，原基因DNA序列所含有的BsaI位点已经消除。该片段由华大基因合成，并克隆在质粒pMV上。

2、将上述含有小间区SIR的质粒经EcoRI和PstI双酶切后，回收约190bp的片段，与经EcoRI和PstI双酶切后的pGreenII0179(https://en.wikipedia.org/wiki/PGreen)片段进行连接，得到质粒0179-SIR。克隆片段经DNA测序验证。

3，将上述含有大间区LIR片段的质粒经KpnI和XhoI酶切后，回收约420bp的片段，与经KpnI和XhoI酶切后的0179-SIR片段进行连接，得到质粒0179-LIR-SIR。克隆片段经DNA测序验证。

4，合成下列PCR引物：

F-LIR-SacII：5’-TACCGCGGGGTAGTGAACAGAAGTCCG-3’；

R-LIR-SacI：5’-TAGAGCTCCGAGATGGGCTCCCACGC-3’；

采用F-LIR-SacII和R-LIR-SacI作为引物，以上述质粒0179-LIR-SIR为模板进行PCR扩增，得到的PCR扩增片段经SacII和SacI酶切，再与经同样酶切的0179-LIR-SIR片段进行连接，得到质粒0179-LIR-SIR-LIR，命名为PMF096。克隆片段经DNA测序验证。

5，合成下列单链DNA片段：

F-PC：5’-TCGACCCGGGGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGC-3’；

R-PC：5’-AGCTTGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGG-3’。

将F-PC和R-PC分别溶解配制成10μmol/L浓度，各取2μl混匀成4μl，95℃变性5min，慢退火(PCR反应升至95℃后直接停止关机，30分钟后取出放在室温)，与经SalI和HindIII双酶切的质粒PMF096片段连接，获得在左边大间区LIR和小间区SIR中间含有多克隆位点区XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、HindIII、EcoRV的质粒，PMF114。克隆片段经DNA测序验证。

6，将上述含有复制相关蛋白Rep/RepA合成DNA片段的质粒经SacII和PstI双酶切后，与上述PMF114质粒经SacII和PstI双酶切后回收的片段连接，最终得到所需质粒PMF115，序列为Seq No.4。克隆片段经DNA测序验证。

二、构建一种用于植物基因组编辑载体的质粒PMF125，如图2所示。

PMF125是把质粒pYLCRISPR/Cas9pUbi-H(华南农业大学刘耀光教授惠赠，GenBank登录号：KR029109)中编码Cas9的第10位氨基酸天冬氨酸突变成丙氨酸(D10A)，使得Cas9核酸酶突变为切口酶后的质粒。

PMF125的构建方法如下：

1、用BamHI酶切pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒，得到约10kb和6.2kb两个片段，6.2Kb片段与质粒pUC19经BamHI酶切并去磷酸化的片段连接，得质粒T-p-cas9p。10kb片段经去磷酸化处理备用。

2，合成如下PCR引物：

F-p-cas9p：5’-CTGAGCTAGCGTTCGTACACGGAT-3’；

R-p-cas9p：5’-ATGCGCTAGCTCCACCGTCAATGTA-3’；

F-cas9pD10A：5’-TCCATCGGCCTCGCTATCGGCACCAAC-3’；

R-cas9pD10A：5’-GTTGGTGCCGATAGCGAGGCCGATGGA-3’。

以pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒为模板，分别用引物F-p-cas9p和R-cas9pD10A、F-cas9pD10A和R-p-cas9p进行PCR扩增，分别得到970bp片段1和1100bp片段2；将片段1和片段2等摩尔比混合作为模板，再用引物F-p-cas9p和R-p-cas9p进行PCR扩增，得到长约2100bp的片段；该片段经NheI酶切与上述第一步质粒T-p-cas9p经NheI酶切去磷酸化处理的大片段连接，得到质粒T-p-cas9pM。此克隆片段经DNA测序验证。

3，质粒T-p-cas9pM经BamHI酶切，回收6.2Kb的片段，与上述第一步得到的10kb大片段连接，从而获得载体质粒PMF125，序列为Seq No.5。

使用上述PMF115(或者PMF096和PMF114)和PMF125两个质粒，就可以构建用于精确修饰、编辑的植物细胞基因组DNA的载体。

实施例2

如图11所示，在水稻基因组第6染色体上存在着一个稻瘟病抗性基因位点，该位点的变异对水稻稻瘟病的许多不同的生理小种产生抗性，在水稻稻瘟病抗性中有着重要作用。

本实施例通过本发明的载体，将人工设计的DNA片段重组到位点，达到对抗病基因进行修饰、改良的目的。具体操作步骤如下：

一、编辑载体的构建

第一步，根据一个水稻基因组稻瘟病抗性位点的DNA序列(Seq No.6)确定sgRNA的目标序列：

sgRNA-1(正向)：5’-TTGAGTAGCAAACTAAAGGAAGG-3’；

sgRNA-2(反向互补)：5’-CCTCCCCTACTAAGGACACTCAG-3’；

第二步，依据确定的靶位点构建两个sgRNA表达盒：

①sgRNA-1表达盒

合成如下引物：

U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；

gR-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；

gRpiz-1：5’-TTGAGTAGCAAACTAAAGGAGTTTTAGAGCTAGAAAt-3’

U6apiz-1：5’-TCCTTTAGTTTGCTACTCAACGGCAGCCAAGCCAGCA-3’

Pps-GGL：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；

Pps-GG2-1：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’。

PCR一扩：分别以U-F和U6apiz-1、gRpiz-1和gR-R分别为引物，以pYLgRNA-OsU6a质粒为模板扩增，分别获得片段1和片段2；PCR二扩：以等量片段1加片段2为模板，用Pps-GGL和Pps-GG2-1为引物扩增；获得PCR片段用BsaI酶切，得到OsU6a+sgRNA-1如下所示：

②sgRNA-2表达盒

合成如下引物：

gRpiz-2：5’-CTGAGTGTCCTTAGTAGGGGGTTTTAGAGCTAGAAAT-3’

U6bpiz-2：5’-CCCCTACTAAGGACACTCAGCAACACAAGCGGCAGC-3’

Pps-GG2-2：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3；’

Pps-GG3-1：5’-AGCGTGGGTCTCGTCTTCACTCCATCCACTCCAAGCTC-3’。

PCR一扩：分别以U-F和gRpiz-2、U6bpiz-2和gR-R分别为引物，以pYLgRNA-OsU6b质粒为模板扩增，分别获得片段3和片段4；PCR二扩：以等量片段3加片段4为模板，用Pps-GG2-2和Pps-GG3-1为引物扩增；获得PCR片段用BsaI酶切，得到OsU6b+sgRNA-2如下所示：

③将①和②中两个sgRNA表达盒片段与质粒PMF125经BsaI酶切片段连接，得重组质粒就含有2个sgRNA表达盒(5’-3’方向)如下，该质粒命名为PMF138。

第三步，克隆重组片段HR

依据来自水稻抗稻瘟病基因位点的DNA序列，采用DNA合成和PCR扩增相结合的方法构建同源重组的DNA片段。本发明分别构建4个不同的重组片段。如下图7所示它们在5’端的一部分(HR1)和3’端一部分(HR2)完全相同，中间为有差异的片段。具体操作如下：

①合成如下PCR引物，用于扩增HR1和HR2片段：

ZJ01：5’-TAGACTCTTGGGTCTGTCACCAAAAATAGCTAATGATCG-3’；

ZJ02：5’-GGAGAGAGCTCGCAGTCGCAGGTGATCACGTTG-3’；

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

Pi2F：5’-CGATGCCATAACATTGCTACTGAG-3’。

②以有稻瘟病抗性位点DNA片段的质粒82779B-R1-4为模板，以Pi2F和ZJ01为一对、ZJ02和M13R为一对引物，分别进行PCR扩增，分别得到600多bp的HR1片段(Seq No.7)和200多bp的HR2片段(Seq No.8)。

③依据确定的稻瘟病抗性基因的DNA序列合成Pi9C(Seq No.9)、Pi50C(SeqNo.10)、Pigm-6(Seq No.11)和Pigm-8(Seq No.12)。

④合成序列如下的PCR引物，用于扩增全长重组片段(HR)：

Pi2F-HR：5’-CGAGGTCGACCCGGGGGATCCCGATGCCATAACATTGCT-3’；

M13R-HR：5’-ATCAAGCTTGCGGCCGCTCTAGACAGGAAACAGCTATGACC-3’。

⑤以步骤②中克隆得到的HR1和HR2分别与步骤③合成的Pi9C、Pi50C、Pigm-6和Pigm-8合做模板，以Pi2F-HR和M13R-HR为引物进行PCR扩增，分别得到四条约2000bp左右的DNA片段，回收这些DNA片段分别与PMF115经BamHI和XbaI双酶切的产物进行同源重组克隆得重组质粒，PMF115-Pi9C的命名为PMF140，PMF115-Pi50C的命名为PMF141，PMF115-Pigm-6命名为PMF146，PMF115-Pigm-8命名为PMF147。PCR克隆片段经测序验证。

第四步，将重组片段(HR)及相关DNA片段克隆到上述PMF138质粒

①合成序列如下的PCR引物。

F-0179-HR：5’-GGAGTGGATGGATACTAGTTAGGGCGAATTGGGTACC-3’；

R-0179-HR：5’-GCCAATGATACCGACGCGTGAACAAAAGCTGGAGCTC-3’。

②用引物F-0179-HR和R-0179-HR，分别以第三步构建好的PMF140、PMF141、PMF146和PMF147质粒为模板进行PCR扩增，均得到4000多bp的条带，回收这些DNA片段与第二步构建好的质粒PMF138经MluI和SpeI双酶切片段进行同源重组连接，即获得稻瘟病基因位点DNA编辑载体，依次分别命名为PMF144、PMF145、PMF151和PMF152。克隆PCR片段经测序验证。

三、编辑载体转入农杆菌

1，农杆菌感受态细胞的制备

取出-80℃保存农杆菌LBA4404，接种在含有50mg/L利福平LB培养基培养皿培养(28℃，2-3天)。挑出培养LBA4404单菌落接种于50mL含50mg/L利福平液体LB培养基振动培养(28℃，150rpm)，当农杆菌夜OD₆₀₀＝0.5，转入无菌50mL离心管离心(4000rpm，4min，4℃)，去除上清液，加入5mL在冰水上预冷0.15mol/L NaCl，轻微震荡悬浮细菌细胞，充分混匀后再次离心(4000rpm，4min，4℃),得到的菌体中再次加入0.15M NaCl悬浮细胞，再离心收集菌体(4000rpm，4min，4℃)；最后，在得到的菌体中加入冰水上预冷20mmol/L CaCl₂溶液600μL，悬浮细菌细胞，加入DMSO(7％)混匀，分装于1mL的EP管，每管100μL；置于入液氮冷冻后立即冻存于-80℃低温冰箱备用。

2，载体质粒转化农杆菌

从-80℃低温冰箱取出农杆菌LAB4404感受态细胞，加入1μg左右编辑载体质粒，所述编辑载体质粒选择PMF144、PMF145、PMF151、PMF152中的任意一种，混匀后置于冰水30min；然后置入液氮冷冻1min，取出于37℃水浴至解冻，解冻后再次放入液氮冷冻1min，取出后37℃水浴至解冻，置于冰水2min后加入1mL LB培养基振动培养3-4h(28℃，140rpm)；离心分离菌体，加入100μL LB液体培养基重悬，涂在含100mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素的LB平板上培养(28℃，2-3天)长出菌落；取单个菌接种于含有100mg/L卡那霉素+50mg/L链霉素的液体LB(28℃，140rpm)培养培养16h，取2μL菌液进行PCR验证，阳性克隆在-80℃保存备用。

阳性克隆采用PCR方法检测潮霉素标记基因，PCR反应总体积50μL，按厂商(Takara,RR001A)说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。阳性克隆可以得到片段大小为800多bp左右的DNA片段。

其中引物如下：

HptII-F：5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’；

HptII-R：5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’。

四、编辑载体质粒的农杆菌转化水稻

1，水稻成熟胚愈伤组织的诱导培养

水稻成熟种子去壳，在70％乙醇浸泡30sec，然后在0.1％升汞中浸泡10min，无菌水冲洗7-8次，种子取出放在培养皿的无菌滤纸上吸干水分，接种到愈伤组织的诱导培养基上，29℃光照培养15d。切取成熟胚盾片长出的愈伤组织，并切成2-4mm的小块，再转接种到诱导培养基上培养3d。

诱导培养基：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+2mg/L 2,4-D+4g/L植物凝胶，pH 5.8。

2，农杆菌的培养和准备

将上述编辑载体的农杆菌LBA4404取出，接种在含有50mg/L链霉素+100mg/L卡那霉素的LB培养皿上培养(19℃，3d)。用接种环挑取少量农杆菌悬浮于15mL加入100μmol/L乙酰丁香酮的浸染培养基，菌液浓度控制在OD550＝0.06-0.08。此菌液将用于下一步浸染水稻愈伤组织。

浸染培养基：N6+0.7g/L L-脯氨酸+68.4g/L蔗糖+36g/L葡萄糖+1.5mg/L 2,4-D，pH 5.2。

3，农杆菌浸染与共培养

将上述预培养的水稻愈伤组织转入50mL的离心管中，加入含有100μmol/L乙酰丁香酮浸染培养基10mL振荡均匀，然后去除液体；将上述准备好的10mL农杆菌悬浮液倒入，轻轻摇3min，倒掉菌液。将愈伤组织取出，放入培养皿的无菌滤纸上吸去多余菌液，愈伤组织转入共培养基培养(19℃，3d)。

共培养基：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+2mg/L 2,4-D+100μmol/L乙酰丁香酮+4g/L植物凝胶，pH 5.8。

4，洗菌与抗性愈伤组织的筛选

共培养三天后取出愈伤组织，先用无菌水洗7-8次，再用加有250mg/L羧苄青霉素和10mg/L万古霉素的浸染培养基洗一次，然后愈伤组织转放到培养皿的无菌滤纸上吸去多余的液体，转入加50mg/L潮霉素和250mg/L羧苄基青霉素的筛选培养基培养(29℃，14d)。14天后愈伤组织转入筛选培养基再次筛选培养。

筛选培养基：N6+300mg/L水解酪蛋白+2.8g/L L-脯氨酸+30g/L蔗糖+2mg/L 2,4-D+4g/L植物凝胶，pH 5.8。

5，抗性愈伤组织的分化

将经两轮筛选后长出的旺盛抗性愈伤组织，转入含有50mg/L潮霉素、100mg/L头孢菌素和150mg/L羧苄青霉素的再生培养基上，在29℃光照下，经14-20天左右的培养，分化出绿色斑点，30天左右进一步分化成小苗。

再生培养基：MS+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+30g/L山梨醇+2.0mg/L激动素+0.02mg/L萘乙酸+4g/L植物凝胶，pH 5.8。

6，转化植株的壮苗及移栽

当分化的芽长至约2-4cm时，将其转移至生根培养基，29℃光照培养2-3周。试管苗长到约8cm左右，打开试管炼苗3-4天，取出小苗用清水洗去植株根系上的培养基，移栽至土壤，温室培养，获得编辑潮霉素抗性基因的植株。

生根培养基：1/2MS+20g/L蔗糖+0.5mg/L萘乙酸+4g/L植物凝胶，pH 5.8。

五、转基因水稻植株的筛选鉴定

1，水稻植株总DNA提取

水稻植株DNA提取采用CTAB法。CTAB裂解液组成如下：1.4mol/L NaCl，0.1mol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，2％十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，2％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，1％(V/V)β-巯基乙醇。

具体步骤如下：取水稻上述转化水稻幼苗植株嫩叶片100mg于1.5mL离心管，在液氮中将其研磨成粉，加入600μL预热(65℃)的CTAB裂解液，涡旋震荡混匀，放入65℃水浴处理1h，取出加入600μL氯仿：异戊醇(24：1)，反复颠倒混匀，然后离心(10000rpm，15min)，取上清于1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇混匀，冰水上放置30min，离心(12000rpm，10min)沉淀DNA，去除上清液再加入1mL75％乙醇洗涤DNA沉淀，移去酒精风干后加入100μLTE溶解DNA，-20℃储存备用。

2，转化植株的PCR鉴定

①潮霉素标记基因PCR检测

转基因植株含有潮霉素筛选标记基因，采用如下潮霉素基因特异引物(HptII-F，HptII-R)进行PCR扩增，真正的转基因植物可以得到片段大小为800多bp左右的DNA片段，而转基因假阳性水稻无法扩增出这样的DNA片段。HptII-F和HptII-R引物如下：

HptII-F：5’-CGATTTGTGTACGCCCGACAGTC-3’；

HptII-R：5’-CGATGTAGGAGGGCGTGGATATG-3’。

PCR反应总体积50μL按厂商(Takara，货号：RR001A)说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察，如图8所示。

②Cas转基因的PCR检测

使用如下转入基因Cas9的特异引物(F-Lcas9-RT，R-Lcas9-RT)进行PCR检测，转基因阳性植物可以得到片段大小约为600bp左右的DNA片段，阴性植物和非转基因水稻为无法扩增出这个DNA片段。F-Lcas9-RT和R-Lcas9-RT引物如下：

F-Lcas9-RT：5’-GAAGCGGAAGGTTGGTATT-3’；

R-Lcas9-RT：5’-TTGTCCACGTCGGAGTTAT-3’。

PCR反应总体积50μL，按厂商(Takara，货号：RR001A)说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察，如图9所示。

六，转基因植株中稻瘟病抗性基因DNA编辑的鉴定

使用特异的引物(F-piz800，R-piz2607)，PCR方法检测PMF145转化得到的转基因郑旱10号水稻植株，得到1800bp左右的DNA片段，该片段克隆到pMD19-T载体(Takara，货号：6013)，选取转化大肠杆菌的阳性菌落，提取重组质粒DNA测序。

F-piz800和R-piz2607引物序列如下：

F-piz800：5’-AGAAGGGCAGTCGGATAGTA-3’；

R-piz2607：5’-ATCTTTTCCAACAGGGGTGAG-3’

PCR反应总体积50μL，按厂商(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：P112-03)说明配制。PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸5min。

测序结果如图10所示，在转基因水稻植株中存在着设计的重组DNA片段与原基因组抗稻瘟病位点DNA的重组发生，实验证明本发明的载体通过转化水稻，在转化植株中外源重组DNA的确可以重组到水稻基因组，实现对基因组DNA的定点编辑、修饰。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 四川省农业科学院生物技术核技术研究所

成都亿农农业科技有限公司

<120> 一种用于植物基因组编辑载体、及其构建方法和应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 190

<212> DNA

<213> 人工序列(1)

<400> 1

gaattctaat aaaataatat tttatttatc tcatgtcatt cgattacaga ggctcggcta 60

cgagcaaaga caaaccaaat tataacaaac aacaaccctt acacaatgac atcggaaaag 120

gaaatacaac accctgagat attacattta tagaaactgt acgccgtccg cgctaggaca 180

gtcactgcag 190

<210> 2

<211> 421

<212> DNA

<213> 人工序列(2)

<400> 2

ggtaccggta gtgaacagaa gtccggcagg tccttagcga aaaaacgggg tgtgccagaa 60

aactctatgc tctaccctgc gtggaggtgt gaattctgca cactgcaaat gcaatgtgtc 120

caatgattta tatagggcag gttttggcgg gagaacaggg ccctagtgtt cccacggtag 180

cgtagcgaat cgtgtgggcc ctgttaggtg tgcggtcggg tggcctccac gcgggttata 240

atattacccc gcgtggtggc ccccgacgcg cactcggctt ttcgtgagtg cgcggaggct 300

tttggaccac atcttttctg atcactttcg tgaaagatgg tgatttatca cacttttgat 360

gtggaaatgt gtgccatgcc ttagcttata aggaagtgcg tgggagccca tctcgctcga 420

g 421

<210> 3

<211> 1199

<212> DNA

<213> 人工序列(3)

<400> 3

ccgcggatgg cctcttcatc tacacccagg ttccgagtct attccaagta cctctttcta 60

acatatcctc aatgtaccct tgagccacag tacgccttgg attcacttcg cactctcttg 120

aacaaatatg agcccctcta catcgctgct gttagagagc tccacgaaga tggatcacca 180

catctgcacg ttctcgtgca gaacaagctt cgtgcttcca tcaccaatcc caatgcctta 240

aacctccgta tggatacatc tccattctcc atattccatc ctaatataca agctgccaaa 300

gactgcaacc aagttcgtga ttacatcacg aaggaggttg actccgatgt aaacacagct 360

gagtggggaa cattcgtggc tgtttcaact ccaggtcgta aagaccgtga tgcggatatg 420

aaacagatca ttgaatctag ttcctctcgc gaggaattcc tcagcatggt ttgcaatcgt 480

tttccgtttg aatggtctat ccgtctcaaa gacttcgagt acacggcacg ccatctattt 540

cctgacccag ttgccactta cacacctgag tttccaaccg aatcactcat ttgccatgag 600

actattgaaa gctggaaaaa tgaacatcta tactctgtaa gcctcgaatc ctatatcctt 660

tgtacttcca ctcctgcgga tcaagcgcaa tctgacttag agtggatgga cgattattcc 720

aggagtcacc ggggaggcat aagtccatct acatctgcgg gccaaccaga acaggaaaga 780

cttcctgggc aaggtcttta gggacacata attattataa cagtctagtt gacttcacaa 840

catatgacgt caacgccaag tataatatca tcgacgacat tccattcaag ttcacaccca 900

actggaagtg cttcgtcggg gctcagcgtg acttcacggt caatccaaaa tacggtaagc 960

gaaaagtgat acggggtggc ataccttgca tcattttagt taatccagac gaagattggc 1020

tcaaggatat gactcccgaa cagtcggatt acatgtactc taacgctgtt gttcactaca 1080

tgtatgaagg cgagacgttc atcaactact cgttcgcctc cggcgaagat gtcactgctt 1140

cgcagtgaac tagtcgatcc aggcctccca gctttcgtcc gtatcatcgg tttctgcag 1199

<210> 4

<211> 7297

<212> DNA

<213> 人工序列(4)

<400> 4

agctctcatc aaccgtggct ccctcacttt ctggctggat gatggggcga ttcaggcgat 60

ccccatccaa cagcccgccg tcgagcgggc ttttttatcc ccggaagcct gtggatagag 120

ggtagttatc cacgtgaaac cgctaatgcc ccgcaaagcc ttgattcacg gggctttccg 180

gcccgctcca aaaactatcc acgtgaaatc gctaatcagg gtacgtgaaa tcgctaatcg 240

gagtacgtga aatcgctaat aaggtcacgt gaaatcgcta atcaaaaagg cacgtgagaa 300

cgctaatagc cctttcagat caacagcttg caaacacccc tcgctccggc aagtagttac 360

agcaagtagt atgttcaatt agcttttcaa ttatgaatat atatatcaat tattggtcgc 420

ccttggcttg tggacaatgc gctacgcgca ccggctccgc ccgtggacaa ccgcaagcgg 480

ttgcccaccg tcgagcgcca gcgcctttgc ccacaacccg gcggccggcc gcaacagatc 540

gttttataaa tttttttttt tgaaaaagaa aaagcccgaa aggcggcaac ctctcgggct 600

tctggatttc cgatccccgg aattagagat cttggcagga tatattgtgg tgtaacgtta 660

tcgatctgga ttttagtact ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag 720

tattttacaa atacaaatac atactaaggg tttcttatat gctcaacaca tgagcgaaac 780

cctataagaa ccctaatttc ccttatcggg aaactactca cacattattt atggagaaaa 840

tagagagaga tagatttgta gagagagact ggtgatttca gcgtaccgaa ttaattctcc 900

cgcgaccagc cgagcgagct tagcgaactg tggacgagaa ctgtgccacc aagcgtaagg 960

ccgttctctc gcatttgcct tgctaggctc gcgcgagttg ctggctgagg cgttctcgaa 1020

atcagctctt gttcggtcgg catctactct attcctttgc cctcggacga gtgctggggc 1080

gtcggtttcc actatcggcg agtacttcta cacagccatc ggtccagacg gccgcgcttc 1140

tgcgggcgat ttgtgtacgc ccgacagtcc cggctccgga tcggacgatt gcgtcgcatc 1200

gaccctgcgc ccaagctgca tcatcgaaat tgccgtcaac caagctctga tagagttggt 1260

caagaccaat gcggagcata tacgcccgga ggcgtggcga tcctgcaagc tccggatgcc 1320

tccgctcgaa gtagcgcgtc tgctgctcca tacaagccaa ccacggcctc cagaagaaga 1380

tgttggcgac ctcgtattgg gaatccccga acatcgcctc gctccagtca atgaccgctg 1440

ttatgcggcc attgtccgtc aggacattgt tggagccgaa atccgcgtgc acgaggtgcc 1500

ggacttcggg gcagtcctcg gcccaaagca tcagctcatc gagagcctgc gcgacggacg 1560

cactgacggt gtcgtccatc acagtttgcc agtgatacac atggggatca gcaatcgcgc 1620

atatgaaatc acgccatgta gtgtattgac cgattccttg cggtccgaat gggccgaacc 1680

cgctcgtctg gctaagatcg gccgcagcga tcgcatccat agcctccgcg accggctgaa 1740

gaacagcggg cagttcggtt tcaggcaggt cttgcaacgt gacaccctgt gcacggcggg 1800

agatgcaata ggtcaggctc tcgctgaact ccccaatgtc aagcacttcc ggaatcggga 1860

gcgcggccga tgcaaagtgc cgataaacat aacgatcttt gtagaaacca tcggcgcagc 1920

tatttacccg caggacatat ccacgccctc ctacatcgaa gctgaaagca cgagattctt 1980

cgccctccga gagctgcatc aggtcggaga cgctgtcgaa cttttcgatc agaaacttct 2040

cgacagacgt cgcggtgagt tcaggctttt tcatagggat cagcttgggc tgtcctctcc 2100

aaatgaaatg aacttcctta tatagaggaa gggtcttgcg aaggatagtg ggattgtgcg 2160

tcatccctta cgtcagtgga gatgtcacat caatccactt gctttgaaga cgtggttgga 2220

acgtcttctt tttccacgat gctcctcgtg ggtgggggtc catctttggg accactgtcg 2280

gcagaggcat cttgaatgat agcctttcct ttatcgcaat gatggcattt gtaggagcca 2340

ccttcctttt ctactgtcct ttcgatgaag tgacagatag ctgggcaatg gaatccgagg 2400

aggtttcccg aaattaccct ttgttgaaaa gtctcaatag ccctttggtc ttctgagact 2460

gtatctttga catttttgga gtaggggtac gataacatta acgtttacaa tttcgcgcca 2520

ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt 2580

acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt 2640

ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgaattg taatacgact cactataggg 2700

cgaattggta ccggtagtga acagaagtcc ggcaggtcct tagcgaaaaa acggggtgtg 2760

ccagaaaact ctatgctcta ccctgcgtgg aggtgtgaat tctgcacact gcaaatgcaa 2820

tgtgtccaat gatttatata gggcaggttt tggcgggaga acagggccct agtgttccca 2880

cggtagcgta gcgaatcgtg tgggccctgt taggtgtgcg gtcgggtggc ctccacgcgg 2940

gttataatat taccccgcgt ggtggccccc gacgcgcact cggcttttcg tgagtgcgcg 3000

gaggcttttg gaccacatct tttctgatca ctttcgtgaa agatggtgat ttatcacact 3060

tttgatgtgg aaatgtgtgc catgccttag cttataagga agtgcgtggg agcccatctc 3120

gctcgaggtc gacccggggg atccactagt tctagagcgg ccgcaagctt gatatcgaat 3180

tctaataaaa taatatttta tttatctcat gtcattcgat tacagaggct cggctacgag 3240

caaagacaaa ccaaattata acaaacaaca acccttacac aatgacatcg gaaaaggaaa 3300

tacaacaccc tgagatatta catttataga aactgtacgc cgtccgcgct aggacagtca 3360

ctgcagaaac cgatgatacg gacgaaagct gggaggcctg gatcgactag ttcactgcga 3420

agcagtgaca tcttcgccgg aggcgaacga gtagttgatg aacgtctcgc cttcatacat 3480

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<210> 5

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<213> 人工序列(5)

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ttgacaggat atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataacggat 10200

atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca 10260

gggttcccct cgggatcaaa gtactttgat ccaacccctc cgctgctata gtgcagtcgg 10320

cttctgacgt tcagtgcagc cgtcttctga aaacgacatg tcgcacaagt cctaagttac 10380

gcgacaggct gccgccctgc ccttttcctg gcgttttctt gtcgcgtgtt ttagtcgcat 10440

aaagtagaat acttgcgact agaaccggag acattacgcc atgaacaaga gcgccgccgc 10500

tggcctgctg ggctatgccc gcgtcagcac cgacgaccag gacttgacca accaacgggc 10560

cgaactgcac gcggccggct gcaccaagct gttttccgag aagatcaccg gcaccaggcg 10620

cgaccgcccg gagctggcca ggatgcttga ccacctacgc cctggcgacg ttgtgacagt 10680

gaccaggcta gaccgcctgg cccgcagcac ccgcgaccta ctggacattg ccgagcgcat 10740

ccaggaggcc ggcgcgggcc tgcgtagcct ggcagagccg tgggccgaca ccaccacgcc 10800

ggccggccgc atggtgttga ccgtgttcgc cggcattgcc gagttcgagc gttccctaat 10860

catcgaccgc acccggagcg ggcgcgaggc cgccaaggcc cgaggcgtga agtttggccc 10920

ccgccctacc ctcaccccgg cacagatcgc gcacgcccgc gagctgatcg accaggaagg 10980

ccgcaccgtg aaagaggcgg ctgcactgct tggcgtgcat cgctcgaccc tgtaccgcgc 11040

acttgagcgc agcgaggaag tgacgcccac cgaggccagg cggcgcggtg ccttccgtga 11100

ggacgcattg accgaggccg acgccctggc ggccgccgag aatgaacgcc aagaggaaca 11160

agcatgaaac cgcaccagga cggccaggac gaaccgtttt tcattaccga agagatcgag 11220

gcggagatga tcgcggccgg gtacgtgttc gagccgcccg cgcacgtctc aaccgtgcgg 11280

ctgcatgaaa tcctggccgg tttgtctgat gccaagctgg cggcctggcc ggccagcttg 11340

gccgctgaag aaaccgagcg ccgccgtcta aaaaggtgat gtgtatttga gtaaaacagc 11400

ttgcgtcatg cggtcgctgc gtatatgatg cgatgagtaa ataaacaaat acgcaagggg 11460

aacgcatgaa ggttatcgct gtacttaacc agaaaggcgg gtcaggcaag acgaccatcg 11520

caacccatct agcccgcgcc ctgcaactcg ccggggccga tgttctgtta gtcgattccg 11580

atccccaggg cagtgcccgc gattgggcgg ccgtgcggga agatcaaccg ctaaccgttg 11640

tcggcatcga ccgcccgacg attgaccgcg acgtgaaggc catcggccgg cgcgacttcg 11700

tagtgatcga cggagcgccc caggcggcgg acttggctgt gtccgcgatc aaggcagccg 11760

acttcgtgct gattccggtg cagccaagcc cttacgacat atgggccacc gccgacctgg 11820

tggagctggt taagcagcgc attgaggtca cggatggaag gctacaagcg gcctttgtcg 11880

tgtcgcgggc gatcaaaggc acgcgcatcg gcggtgaggt tgccgaggcg ctggccgggt 11940

acgagctgcc cattcttgag tcccgtatca cgcagcgcgt gagctaccca ggcactgccg 12000

ccgccggcac aaccgttctt gaatcagaac ccgagggcga cgctgcccgc gaggtccagg 12060

cgctggccgc tgaaattaaa tcaaaactca tttgagttaa tgaggtaaag agaaaatgag 12120

caaaagcaca aacacgctaa gtgccggccg tccgagcgca cgcagcagca aggctgcaac 12180

gttggccagc ctggcagaca cgccagccat gaagcgggtc aactttcagt tgccggcgga 12240

ggatcacacc aagctgaaga tgtacgcggt acgccaaggc aagaccatta ccgagctgct 12300

atctgaatac atcgcgcagc taccagagta aatgagcaaa tgaataaatg agtagatgaa 12360

ttttagcggc taaaggaggc ggcatggaaa atcaagaaca accaggcacc gacgccgtgg 12420

aatgccccat gtgtggagga acgggcggtt ggccaggcgt aagcggctgg gttgtctgcc 12480

ggccctgcaa tggcactgga acccccaagc ccgaggaatc ggcgtgacgg tcgcaaacca 12540

tccggcccgg tacaaatcgg cgcggcgctg ggtgatgacc tggtggagaa gttgaaggcc 12600

gcgcaggccg cccagcggca acgcatcgag gcagaagcac gccccggtga atcgtggcaa 12660

gcggccgctg atcgaatccg caaagaatcc cggcaaccgc cggcagccgg tgcgccgtcg 12720

attaggaagc cgcccaaggg cgacgagcaa ccagattttt tcgttccgat gctctatgac 12780

gtgggcaccc gcgatagtcg cagcatcatg gacgtggccg ttttccgtct gtcgaagcgt 12840

gaccgacgag ctggcgaggt gatccgctac gagcttccag acgggcacgt agaggtttcc 12900

gcagggccgg ccggcatggc cagtgtgtgg gattacgacc tggtactgat ggcggtttcc 12960

catctaaccg aatccatgaa ccgataccgg gaagggaagg gagacaagcc cggccgcgtg 13020

ttccgtccac acgttgcgga cgtactcaag ttctgccggc gagccgatgg cggaaagcag 13080

aaagacgacc tggtagaaac ctgcattcgg ttaaacacca cgcacgttgc catgcagcgt 13140

acgaagaagg ccaagaacgg ccgcctggtg acggtatccg agggtgaagc cttgattagc 13200

cgctacaaga tcgtaaagag cgaaaccggg cggccggagt acatcgagat cgagctagct 13260

gattggatgt accgcgagat cacagaaggc aagaacccgg acgtgctgac ggttcacccc 13320

gattactttt tgatcgatcc cggcatcggc cgttttctct accgcctggc acgccgcgcc 13380

gcaggcaagg cagaagccag atggttgttc aagacgatct acgaacgcag tggcagcgcc 13440

ggagagttca agaagttctg tttcaccgtg cgcaagctga tcgggtcaaa tgacctgccg 13500

gagtacgatt tgaaggagga ggcggggcag gctggcccga tcctagtcat gcgctaccgc 13560

aacctgatcg agggcgaagc atccgccggt tcctaatgta cggagcagat gctagggcaa 13620

attgccctag caggggaaaa aggtcgaaaa ggtctgtttc ctgtggatag cacgtacatt 13680

gggaacccaa agccgtacat tgggaaccgg aacccgtaca ttgggaaccc aaagccgtac 13740

attgggaacc ggtcacacat gtaagtgact gatataaaag agaaaaaagg cgatttttcc 13800

gcctaaaact ctttaaaact tattaaaact cttaaaaccc gcctggcctg tgcataactg 13860

tctggccagc gcacagccga agagctgcaa aaagcgccta cccttcggtc gctgcgctcc 13920

ctacgccccg ccgcttcgcg tcggcctatc gcggccgctg gccgctcaaa aatggctggc 13980

ctacggccag gcaatctacc agggcgcgga caagccgcgc cgtcgccact cgaccgccgg 14040

cgcccacatc aaggcaccct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 14100

catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 14160

ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 14220

tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 14280

gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 14340

cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 14400

gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 14460

aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 14520

gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 14580

aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 14640

gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 14700

ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 14760

cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 14820

ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 14880

actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 14940

tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 15000

gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 15060

ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 15120

cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 15180

ttggtcatgc attctaggta ctaaaacaat tcatccagta aaatataata ttttattttc 15240

tcccaatcag gcttgatccc cagtaagtca aaaaatagct cgacatactg ttcttccccg 15300

atatcctccc tgatcgaccg gacgcagaag gcaatgtcat accacttgtc cgccctgccg 15360

cttctcccaa gatcaataaa gccacttact ttgccatctt tcacaaagat gttgctgtct 15420

cccaggtcgc cgtgggaaaa gacaagttcc tcttcgggct tttccgtctt taaaaaatca 15480

tacagctcgc gcggatcttt aaatggagtg tcttcttccc agttttcgca atccacatcg 15540

gccagatcgt tattcagtaa gtaatccaat tcggctaagc ggctgtctaa gctattcgta 15600

tagggacaat ccgatatgtc gatggagtga aagagcctga tgcactccgc atacagctcg 15660

ataatctttt cagggctttg ttcatcttca tactcttccg agcaaaggac gccatcggcc 15720

tcactcatga gcagattgct ccagccatca tgccgttcaa agtgcaggac ctttggaaca 15780

ggcagctttc cttccagcca tagcatcatg tccttttccc gttccacatc ataggtggtc 15840

cctttatacc ggctgtccgt catttttaaa tataggtttt cattttctcc caccagctta 15900

tataccttag caggagacat tccttccgta tcttttacgc agcggtattt ttcgatcagt 15960

tttttcaatt ccggtgatat tctcatttta gccatttatt atttccttcc tcttttctac 16020

agtatttaaa gataccccaa gaagctaatt ataacaagac gaactccaat tcactgttcc 16080

ttgcattcta aaaccttaaa taccagaaaa cagctttttc aaagttgttt tcaaagttgg 16140

cgtataacat agtatcgacg gagccgattt tgaaaccgcg gtgatcacag gcagcaacgc 16200

tctgtcatcg ttacaatcaa catgctaccc tccgcgagat catccgtgtt tcaaacccgg 16260

cagcttagtt gccgttcttc cgaatagcat cggtaacatg agcaaagtct gccgccttac 16320

aacggctctc ccgctgacgc cgtcccggac tgatgggctg cctgtatcga gtggtgattt 16380

tgtgccgagc tgccggtcgg ggagctgttg gctggctg 16418

<210> 6

<211> 975

<212> DNA

<213> 人工序列(6)

<400> 6

gagtctagca catgcagttt gtccagatca attgaggatg ttacgggtct tggatcttga 60

agatgtgaca ttcttaatca ctcaaaaaga tttcgaccgt attgcattgt tgtgccactt 120

gaaatacttg agtattggat attcgtcatc catatattca cttcccagat ccattggtaa 180

actacagggc ctacaaactt tgaacatgcc gagcacatac attgcagcac taccaagtga 240

gatcagtaaa ctccaatgtc tgcatactct tcgttgtata ggacagtttc attatgacaa 300

ctttagtcta aaccacccaa tgaagtgcat aactaacaca atatgcctgc ctaaagtatt 360

cacaccttta gttagtcgcg atgatcgtgc aaaacaaatt gctgaattgc acatggccac 420

caaaagttgc tggtctgaat cattcggtgt gaaggtaccc aaaggaatag gtaagttgcg 480

agacttgcag gttctagagt atgtagatat caggcggacc agtagtagag caatcaaaga 540

gctggggcag ttaagcaagt tgaggaaatt aggtgtgata acaaaaggct cgacaaagga 600

aaaatgtaag atactttatg cagccattga gaagctctct tccctccaat atctctatgt 660

gaatgctgtg ttattatcag atattgaaac acttgagtgc ctagattcta tttcatctcc 720

tcctccccta ctaaggacac tcaggttgaa tggaagtctt gaagagatgc ctaactggat 780

tgagcagctc acgcacctga tgaagttcca cttattgagt agcaaactaa aggaaggtaa 840

aaccatgctg atacttgggg cactgcccaa cctcatgctc ctttctcttt atcataattc 900

ttatcttggg gagaagctag tattcaatac gggagcattc ccaaatctta gaacactttg 960

tatttacgaa ttgga 975

<210> 7

<211> 688

<212> DNA

<213> 人工序列(7)

<400> 7

cgatgccata acattgctac tgagaaaaac aaataaaaat catgaagaca tggaatcaaa 60

taaaaatatg caaaagatgg ttgaacgaat tgtaaataaa tgtggtcgtc taccattagc 120

aatacttaca ataggagctg tgcttgcaac taaacaggtg tcagaatggg agaaattcta 180

tgaacacctt ccttcagaac tagaaataaa cccaagcctg gaagctttga ggagaatggt 240

gaccctaggt tacaaccacc taccatccca tctgaaacca tgctttttgt atctaagtat 300

ctttcctgag gattttgaaa tcaaaaggaa tcgtctagta ggtagatgga tagcagaagg 360

gtttgttaga ccaaaggttg ggatgacgac taaggatgtc ggagaaagtt actttaatga 420

gctaatcaac cgaagtatga ttcaacgatc aagagtgggc atagcaggaa aaattaagac 480

ttgtcgaatt catgatatca tctgtgatat cacagtttca atctcgagac aggaaaattt 540

tgtattatta ccaatgggag atggctctga tttagttcag gaaaacactc gccacatagc 600

attccatggg agtatgtcct gcaaaacagg attggattgg agcattattc gatcattagc 660

tatttttggt gacagaccca agagtcta 688

<210> 8

<211> 284

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 8

ggagagagct cgcagtcgca ggtgatcacg ttgacgacga acgacaggtt agtcactccc 60

tacatggcag cttaatgaac ttgtttctaa ttatgttttt gttcagtatt agccatcagc 120

tggtgatgtc gatgatttca actcatcctt tcatctctct tgttttctta acctaacagc 180

gaagagatag gcacagctca aaatcgtcga cctgcaggca gcagctttat cgtcgacctg 240

caggcatgca agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctg 284

<210> 9

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列(8)

<400> 9

acagacccaa gagtctagca catgcagttt gtctagatca attgaggatg ttacgggtct 60

tggatcttga agatgtgaca ttcttaatca ctcaaaaaga tttcgaccgt attgcattgt 120

tgtgccactt gaaatacttg agtattggat attcgtcatc catatattca cttcccagat 180

ccattggtaa actacagggc ctacaaactt tgaacatgct gagaacatac attgcagcac 240

taccaagtga gatcagtaaa ctccaatgtc tgcatactct tcgttgtagt agaaagtttg 300

tttatgacaa ctttagtcta aaccacccaa tgaagtgcat aactaacaca atatgcctgc 360

ctaaagtatt cacaccttta gttagtcgcg atgatcgtgc aaaacaaatt gctgaattgc 420

acatggccac caaaagttgc tggtctgaat cattcggtgt gaaggtaccc aaaggaatag 480

gtaagttgcg agacttgcag gttctagagt atgtagatat caggcggacc agtagtagag 540

caatcaaaga gctggggcac ttaagcaagt tgaggaaatt aggtgtgata acaaaaggct 600

cgacaaagga aaaatgtaag atactttatg cagccattga gaagctctct tccctccaat 660

ctctctatgt gaatgctgcg ttattatcag atattgaaac acttgagtgc ctagattcta 720

tttcatctcc tcctccccta ctgaggacac tcgggttgaa tggaagtctt gaagagatgc 780

ctaactggat tgagcagctc actcacctga agaagatcta cttattgagg agcaaactaa 840

aggaaggtaa aaccatgctg atacttgggg cattgcccaa cctcatggtc ctttatcttt 900

attggaatgc ttaccttggg gagaagctag tattcaaaac gggagcattc ccaaatctta 960

gaacacttcg tatttacgaa ttggatcagc taagagagat gagatttgag gatggcagct 1020

cacccctgtt ggaaaagata gaaatctctt gctgcaggtt ggaatcaggg attattggta 1080

tcattcacct tccaaggctc aaggagattt cacttgaata caaaagtaaa gtggctaggc 1140

ttggtcagct ggagggagaa gtgaacacac acccaaatcg ccccgtgctg cgaatggaca 1200

gtgaccgaag ggatcacgac ctgggggctg aagccgaagg atcttctata gaagtgcaaa 1260

cagcagatcc tgttcctgat gccgaaggat cagtcactgt agcagtggaa gcaacggatc 1320

cccttcccga gcaggaggga gagagctcgc ag 1352

<210> 10

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列(10)

<400> 10

acagacccaa gagtctagca catgcagttt gtccagatca attgaggatg ttacgggtct 60

tggatcttga agatgtgaca ttcttaatca ctcaaaaaga tttcgaccgt attgcattgt 120

tgtgccactt gaaatacttg agtattggat attcgtcatc catatattca cttcccagat 180

ccattggtaa actacagggc ctacaaactt tgaacatgcc gagcacatac attgcagcac 240

taccaagtga gatcagtaaa ctccaatgtc tgcatactct tcgttgtata ggacagtttc 300

attatgacaa ctttagtcta aaccacccaa tgaagtgcat aactaacaca atatgcctgc 360

ctaaagtatt cacaccttta gttagtcgcg atgatcgtgc aaaacaaatt gctgaattgc 420

acatggccac caaaagttgc tggtctgaat cattcggtgt gaaggtaccc aaaggaatag 480

gtaagttgcg agacttgcag gttctagagt atgtagatat caagcggacc agtagtagag 540

caatcaaaga gctggggcag ttaagcaagt tgaggaaatt aggtgtgata acaaaaggct 600

cgacaaagga aaaatgtaag atactttatg cagccattga gaagctctct tccctccaat 660

atctctatgt gaatgctgcg ttattatcag atattgaaac acttgagtgc ctagattcta 720

tttcatctcc tcctccccta ctaagtacac tcaggttgaa tggaagtctt gaagagatgc 780

ctaactggat tgagcagctc actcacctga agaagttcta cttacggagg agcaaactaa 840

aggaaggtaa aaccatgctg atacttgggg cactgcccaa cctcatgttc ctttctcttt 900

atcataattc ttatcttggg gagaagctag tattcaaaac gggagcattc ccaaatctta 960

gaacactttg tatttacgaa ttggatcagc taagagagat cagatttgag gacggcagct 1020

cacccctgtt ggaaaagata gaaataggca agtgcaggtt ggaatctggg attattggta 1080

tcattcacct tccaaagctc aaggagattc caattacata cggaagtaaa gtggctgggc 1140

ttggtcagct ggagggagaa gtgaacgcac acccaaatcg ccccgtgctg ctaatggaca 1200

gtgaccgaag gtatcacgac ctgggggctg aagccgaagg atcttctata gaagtgcaaa 1260

cagcagatcc tgttcctgat gccgaaggat cagtcactgt agcagtggaa gcaacggatc 1320

cccttcccga gcaggaggga gagagctcgc ag 1352

<210> 11

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列(11)

<400> 11

acagacccaa gagtctagca catgcagttt gtccagatca attgaggatg ttacgggtct 60

tggatcttga agatgtgaca ttcttaatca ctcaaaaaga tttcgaccgt attgcattgt 120

tgtgccactt gaaatacttg agtattggat attcgtcatc catatattca cttcccagat 180

ccattggtaa actacagggc ctacaaactt tgaacatgcc gagcacatac attgcagcac 240

taccaagtga gatcagtaaa ctccaatgtc tgcatactct tcgttgtata ggacagtttc 300

attatgacaa ctttagtcta aaccacccaa tgaagtgcat aactaacaca atatgcctgc 360

ctaaagtatt cacaccttta gttagtcgcg atgatcgtgc aaaacaaatt gctgaattgc 420

acatggccac caaaagttgc tggtctgaat cattcggtgt gaaggtaccc aaaggaatag 480

gtaagttgcg agacttgcag gttctagagt atgtagatat caagcggacc agtagtagag 540

caatcaaaga gctggggcag ttaagcaagt tgaggaaatt aggtgtgata acaaaaggct 600

cgacaaagga aaaatgtaag atactttatg cagccattga gaagctctct tccctccaat 660

atctctatgt gaatgctgcg ttattatcag atattgaaac acttgagtgc ctagattcta 720

tttcatctcc tcctccccta ctaagtacac tcaggttgaa tggaagtctt gaagagatgc 780

ctaactggat tgagcagctc actcacctga agaagttcta cttacggagg agcaaactaa 840

aggaaggtaa aaccatgctg atacttgggg cactgcccaa cctcatgttc ctttctcttt 900

atcataattc ttatcttggg gagaagctag tattcaaaac gggagcattc ccaaatctta 960

gaacactttg tatttacgaa ttggatcagc taagagagat cagatttgag gacggcagct 1020

cacccctgtt ggaaaagata gaaataggca agtgcaggtt ggaatctggg attattggta 1080

tcattcacct tccaaagctc aaggagattc caattacata cggaagtaaa gtggctgggc 1140

ttggtcagct ggagggagaa gtgaacgcac acccaaatcg ccccgtgctg ctaatggaca 1200

gtgaccgaag gtatcacgac ctgggggctg aagccgaagg atcttctata gaagtgcaaa 1260

cagcagatcc tgttcctgat gccgaaggat cagtcactgt agcagtggaa gcaacggatc 1320

cccttcccga gcaggaggga gagagctcgc ag 1352

<210> 12

<211> 1352

<212> DNA

<213> 人工序列(11)

<400> 12

atagacccaa gagtctagca catgcagttt gtccagatca attgaggatg ttacgggtct 60

tggatcttga agatgtgaca ttcttaatca ctcaaaaaga tttcgaccgt attgcattgt 120

tgtgccactt gaaatacttg agtattggat attcgtcatc catatattca cttcccagat 180

ccattggtaa actacagggc ctacaaactt tgaacatgcc gagcacatac attgcagcac 240

taccaagtga gatcagtaaa ctccaatgtc tgcatactct tcgttgtata ggacagtttc 300

attatgacaa ctttagtcta aaccacccaa tgaagtgcat aactaacaca atatgcctgc 360

ctaaagtatt cacaccttta gttagtcgcg atgatcgtgc aaaacaaatt gctgaattgc 420

acatggccac caaaagttgc tggtctgaat cattcggtgt gaaggtaccc aaaggaatag 480

gtaagttgcg agacttgcag gttctagagt atgtagatat caagcggacc agtagtagag 540

caatcaaaga gctggggcag ttaagcaagt tgaggaaatt aggtgtgata acaaaaggct 600

cgacaaagga aaaatgtaag atactttatg cagccattga gaagctctct tccctccaat 660

atctctatgt gaatgctggg ttattatcag atattgaaac acttgagtgc ctagattcta 720

tttcctctcc tcctccccta ctgaggacac tcgtgttgta tggaattctt gaggagatgc 780

ctaactggat tgagcagctc atgcacctga agaagatcaa cttattgagc agcaaactaa 840

aggaaggtaa aaccatgctg atacttgggg cattgcccaa cctcatggtc cttgatcttt 900

atcagaaagc ttaccttggg gagaagctag tattcaaaac aggagcattc ccaaatctta 960

gaacacttgg tatttatgaa ttggatcagc taagagagat tagacttgag gacggcagct 1020

cgccccagtt ggaaaagata gaaatcagat tctgcaggtt ggaaccaggg attattggta 1080

ttatccacct tccaaggctc aaggagattt cacgtggata cgaaagtaaa gtggctgggc 1140

ttgctcagct ggagggagaa gtgaacgcac acccaaatcg ccccgtgctg ctaatgtaca 1200

gtgaccgaag gtatcacgac ctgggggctg aagccgaagg atcttctata gaagtgcaaa 1260

cagcagatcc tgttcctgat gccgaaggat cagtcactgt agcagtggaa gcaacggatc 1320

cccttcccga gcaggaggga gagagctcgc ag 1352

Claims (10)

1.一种用于植物基因组编辑载体构建的质粒PMF115，其特征在于，所述质粒包含有双生病毒复制相关的小间区SIR、大间区LIR和复制相关蛋白Rep/RepA三个DNA片段，所述双生病毒小间区SIR为Seq No.1，双生病毒大间区LIR为Seq No.2，复制相关蛋白Rep/RepA片段为Seq No.3。

2.基于权利要求1所述质粒PMF115的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

Setp 1，根据双生病毒基因组序列设计并合成小间区SIR、大间区LIR和复制相关蛋白Rep/RepA三个DNA片段；

Setp 2，将小间区SIR的DNA片段克隆到pGreenII0179得到质粒0179-SIR；

Setp 3，将大间区LIR的DNA片段克隆到质粒0179-SIR得到质粒0179-LIR-SIR；

Setp 4，将大间区LIR的DNA片段克隆到质粒0179-LIR-SIR得到质粒0179-LIR-SIR-LIR，即PMF096；

Setp 5，在质粒PMF096的大间区LIR和小间区SIR中间克隆一个多克隆位点区，得到质粒PMF114，所述多克隆位点区包括XhoI、SalI、SmaI/XmaI、BamHI、SpeI、XbaI、NotI、HindIII、EcoRV；

Setp 6，将Rep/RepA的DNA片段克隆到质粒PMF114得到质粒PMF115，序列为Seq No.4。

3.一种与权利要求1或2任一项所述质粒PMF115配合使用构建植物基因组编辑载体的质粒PMF125，其特征在于，所述质粒PMF125是将质粒pYLCRISPR/Cas9pUbi-H中编码Ca s9蛋白的氨基酸突变，使得Cas9由核酸酶变为切口酶。

4.基于权利要求3所述质粒PMF125的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

Setp 1，用BamHI酶切pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒，得到10kb和6.2kb两个片段，6.2kb片段与质粒pUC19经BamHI酶切并去磷酸化的片段连接，得质粒T-p-cas9p；10kb片段经去磷酸化处理备用；

Setp 2，合成如下PCR引物：

F-p-cas9p：5’-CTGAGCTAGCGTTCGTACACGGAT-3’；

R-p-cas9p：5’-ATGCGCTAGCTCCACCGTCAATGTA-3’；

F-cas9pD10A：5’-TCCATCGGCCTCGCTATCGGCACCAAC-3’；

R-cas9pD10A：5’-GTTGGTGCCGATAGCGAGGCCGATGGA-3’；

以pYLCRISPR/Cas9pUbi-H质粒为模板，分别用引物F-p-cas9p和R-cas9pD10A、F-cas9pD10A和R-p-cas9p进行第一次PCR扩增；以两个第一次PCR扩增片段混合DNA为模板，用引物F-p-cas9p和R-p-cas9p进行第二次PCR扩增，第二次PCR扩增片段经NheI酶切与质粒T-p-cas9p经NheI酶切去磷酸化处理的大片段连接，得到质粒T-p-cas9pM；

Setp 3，质粒T-p-cas9pM经BamHI酶切，回收的片段与上述Setp 1的10kb大片段连接，从而获得载体质粒PMF125，序列为Seq No.5。

5.一种用于植物基因组编辑的载体，其特征在于，所述编辑载体包括依次连接的两个双生病毒大间区LIR、sgRNA表达盒和Cas9D10A基因，且所述两个双生病毒大间区LIR之间含有双生病毒复制相关蛋白Rep/RepA片段、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR；

所述sgRNA表达盒是依据目标基因组位点DNA序列设计构建而成，包括启动子、依据靶序列设计的sgRNA的DNA片段及终止子；

所述用于重组的DNA的片段HR是指用于与目标基因组位点DNA在细胞内重组，从而达到改变原编辑位点DNA遗传信息的DNA片段。

6.基于权利要求5所述的一种用于植物基因组编辑的载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

Setp 1，构建质粒PMF115；

Setp 2，构建质粒PMF125；

Setp 3，依据目标基因组位点DNA序列设计sgRNA表达盒，将所述sgRNA表达盒连入载体PMF125制备含sgRNA表达盒的质粒；

Setp 4，将用于重组的DNA片段HR连接到载体质粒PMF115；

Setp 5，将所述Setp 4构建的质粒中两个大间区LIR片段、以及两个大间区LIR之间的DNA片段克隆到Setp 3构建的质粒中，获得最终基因组编辑载体。

7.根据权利要求6所述的一种用于植物基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，所述Setp 4具体操作方法为：用于重组的DNA片段HR通过酶切连接或同源重组连接的方法连入质粒PMF115多克隆位点处；或者用于重组的DNA片段HR克隆到质粒PMF096或质粒PMF114得到中间质粒，然后再将Rep/RepA片段克隆进入上述中间质粒，即得到含HR片段的PMF115质粒。

8.根据权利要求6所述的一种用于植物基因组编辑载体的构建方法，其特征在于，所述Setp 5具体操作步骤包括：

以如下引物：

F-LSL：5’-TTGGAGTGGATGGATACTAGTGGTAGTGAACAGAAG-3’；

R-LSL：5’-GCGCCAATGATACCGACGCGTCGAGATGGGCTCCCA-3’；

用Setp 4构建的质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到的DNA片段包括两个病毒大间区LIR、以及位于两个病毒大间区LIR之间的复制相关蛋白Rep/RepA、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR；扩增片段与来自Setp 3含sgRNA表达盒的PMF125质粒的MluI和SpeI双酶切片段经重组酶连接，即获得最终的编辑载体；

或者，以如下引物：

F-LIR-M：5’-TAACGCGTGGTAGTGAACAGAAGTCCG-3’；

R-LIR-N：5’-TAGCTAGCCGAGATGGGCTCCCACGC-3’；

用Setp 4构建的质粒DNA为模板进行PCR扩增，扩增得到DNA片段包括病毒大间区LIR、以及位于两个病毒大间区LIR之间的复制相关蛋白Rep/RepA、双生病毒小间区SIR和用于重组的DNA片段HR；扩增片段经MluI和NheI酶切后，与来自Step3含sgRNA表达盒质粒PMF125的MluI和SpeI双酶切片段连接，即获得最终的编辑载体。

9.基于权利要求1～8任一项所述的一种用于构建植物基因组编辑载体的质粒PMF115在植物基因组编辑中的应用。

10.基于权利要求3～8任一项所述的一种用于构建植物基因组编辑载体的质粒PMF125在植物基因组编辑中的应用。