CN114807236A - 一种病毒穿梭质粒及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种病毒穿梭质粒及其用途，该病毒穿梭质粒在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。

Description

一种病毒穿梭质粒及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程和分子生物学领域，尤其涉及一种病毒穿梭质粒及其用途。

背景技术

基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。

20世纪70年代初创建的经典基因克隆技术，利用限制性内切酶能识别并酶切特异DNA序列的特性，使目的DNA片段和载体产生平末端或粘性末端，然后在DNA连接酶的作用下，将酶切后的目的DNA片段和载体连接成重组DNA分子。后续通过菌落PCR、质粒酶切、测序等方法进行筛选和鉴定。

无缝克隆技术在引物设计及目的DNA片段的扩增阶段，与常规PCR法是相同的，和经典基因克隆技术的差异在于载体末端和引物末端应具有 15～20 个同源碱基，由此得到的 PCR 产物两端便分别带上了 15～20 个与载体序列同源性的碱基，通过相关酶试剂处理，同时除去载体与目的DNA上同源片段的双链中的一条链，这样载体和目的DNA两端就露出了能够互补配对的序列，依靠同源序列碱基间的配对能使载体和目的DNA较为紧密的连在一起而无需酶联，直接用于转化；无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行插入一个或多个目的基因，大大提高了工作效率。

虽然在技术上越来越便捷，但筛选阳性克隆却是一件繁琐、费时的工作。

因此，仍然迫切需要操作简单，节省时间和成本，阳性克隆筛选率高的筛选阳性克隆的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种高阳性克隆率的病毒穿梭质粒及其用途，该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。

基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种病毒穿梭质粒，其在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。

在本发明的优选实施方案中，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

在本发明的优选实施方案中，所述病毒穿梭质粒可以为腺病毒穿梭质粒、腺相关病毒穿梭质粒或逆转录病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述逆转录病毒穿梭质粒可以为慢病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒自5’端到3’端还包括：

---5’LTR；

---Psi(ψ)包装信号（HIV-1 Ψ）；

---输出元件（RRE）；

---中央多聚嘌呤区/中央终止序列（cPPT/CTS）；

---CMV增强子（CMV enhancer）

---与插入片段可操作地连接的启动子（CMV Promoter）；

---转录后调控元件（WPRE）；

---猿猴病毒40启动子（SV40启动子）；

---杀稻瘟菌素（BSD）；

---3’LTR。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒在3’LTR之后还包括：猿猴病毒40转录终止位点（SV40 polyA）、猿猴病毒40复制起始位点（SV40 ori）、f1噬菌体复制起始位点（f1 ori）、氨苄启动子（AmpR promoter）、氨苄抗性基因（AmpR）和大肠杆菌复制起始位点（ori）。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒在5’LTR之前还包括劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子。

在本发明的优选实施方案中，所述与插入片段可操作地连接的启动子包括CMV启动子。

在本发明的优选实施方案中，所述3’LTR为3’自身失活的长末端重复序列。

在本发明的优选实施方案中，所述输出元件包括Rev响应元件（RRE）。

在本发明的优选实施方案中，所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎转录后修饰调控元件（WPRE）。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒为pLenti6.3-V5-MCS-CCDB。

在本发明的优选实施方案中，所述pLenti6.3-V5-MCS-CCDB的核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。

本发明的第二个方面提供了一种构建上述第一个方面所述的慢病毒穿梭质粒的方法，其采用无缝克隆技术将致死基因ccdB连接到骨架载体上得到所述慢病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，采用无缝克隆技术将Lac-Cmr-ccdB片段和线性化质粒pLenti6.3-V5-GW-LacZ重组连接而得到pLenti6.3-V5-MCS-CCDB。

在本发明的优选实施方案中，对Lac-Cmr-ccdB片段进行扩增，用于扩增Lac-Cmr-ccdB片段的引物序列如下所示：

上游引物WF-ccdB-F：

5’-ACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATCCACTAGTTTTACACTTTATGCTTC-3’，其为SEQ ID NO: 3所示；

下游引物WF-ccdB-R：

5’-TTCGAACCGCGGGCCCTCTAGACTCGAGTTATATTCCCCAGAACATCAGG-3’，其为SEQ IDNO: 4所示。

本发明的第三个方面提供了一种提高阳性克隆率的方法，其包括以下步骤：

1) 酶切上述第一个方面所述的病毒穿梭质粒以去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB；

2) 将目的片段与去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB后的病毒穿梭质粒重组连接，然后转化细胞；

3) 筛选存活的细胞，从而得到带有目的片段的阳性克隆。

在本发明的优选实施方案中，所述细胞为大肠杆菌Stbl3感受态细胞。

在本发明的优选实施方案中，所述目的片段为7341，核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。

附图说明

图1为本发明实施方式之一的pLenti6.3-V5-MCS-CCDB质粒结构示意图。

具体实施方式

需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

经典基因克隆技术需要限制性内切酶和连接酶的参与，而且受限制性内切酶酶切位点的限制和连接酶效率的影响。平末端克隆操作简便，但是克隆效率却很低，而且克隆非定向性，即会出现基因的反向插入和正向插入两种可能。粘性末端克隆需要在目的片段5’末端引入相对应的酶切位点，而且酶切效率会影响克隆效率。粘性末端克隆具有定向性，但是对于长片段来说，其克隆效率也是比较低的，甚至片段越长，克隆效率越低。通过限制性内切酶将载体线性化产生粘性末端或平末端，而载体线性化不彻底，纯化回收到的载体片段中残留有环状质粒，导致后续连接转化大肠杆菌Stlb3感受态细胞后长出来的克隆背景高、阳性率低。

初步筛选阳性克隆方法主要有抗性筛选、蓝白斑筛选、质粒酶切电泳筛选、PCR筛选，最终确认则需通过测序验证。

抗性筛选，质粒载体携带的筛选标记（如：AmpR氨苄青霉素抗性、TetR四环素抗性、KanR卡那霉素抗性），一般用抗性培养基做初级筛选，只能保证有载体转入，不能保证一定有外源基因插入。

蓝白斑筛选，需要带有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的编码区的质粒载体，与编码β-半乳糖苷酶C端ω片段的突变宿主细胞组合使用达到筛选的目的。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有半乳糖苷酶活性，但它们同时存在时，α片段与ω片段可通过α-互补形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶，可分解培养基平板中的底物X-Gal，生成蓝色物质（需要IPTG的诱导表达）；而当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，会破坏α片段的编码，使得带有重组质粒的LacZ-细菌形成白色菌落。蓝白斑筛选的不足之处在于，如果在表达载体内插入的基因太短同时没有破坏掉lacZ的阅读框，表达的α肽链可能有活性，菌落仍然会显蓝色，这就产生了假阴性。

质粒酶切电泳筛选，选用不同的酶切组合，通过电泳检测DNA片段的大小可鉴定外源基因的重组和插入方向；结果可靠但操作比较麻烦；无法检测基因内部的突变 。

PCR筛选，可用2μl菌液做模板通过特异引物扩增，电泳检测，筛选重组克隆；快速、方便、可批量检测，但不能检测基因插入方向，不能检测基因内部突变。

测序验证，送公司测序选取阳性克隆，属于最可靠的检测方法，可确定基因的重组，插入的方向，基因内部的突变等；但价格贵，适于1至2个少量克隆的验证。

目前对于重组质粒筛选的几种方法，抗性筛选不能排除假阳性，蓝白斑筛选需要特殊试剂且可能出现假阴性、质粒酶切电泳筛选操作步骤繁琐，测序验证比较准确但是价格昂贵。因此，仍然迫切需要操作简单，节省时间和成本，阳性克隆率高的筛选方法。

本发明的目的是提供一种高阳性克隆率的病毒穿梭质粒及其用途，该病毒穿梭质粒能够用作病毒穿梭质粒通用型骨架使用，能有效地提高阳性克隆率，使筛选阳性克隆不需要特殊试剂，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，并且降低了产生假阳性或者假阴性结果的概率。

基于上述目的，本发明的第一个方面提供了一种病毒穿梭质粒，其在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。

使用本发明的病毒穿梭质粒，将目的基因与Lac-Cmr-ccdB片段进行替换，因此ccdB致死基因不再发挥功能，重组质粒可以在普通的大肠杆菌菌株（如Stbl3）中繁殖扩增；而未重组成功的质粒由于含有ccdB基因，表达CCDB蛋白而使宿主细胞死亡，从而达到筛选目的。

在本发明的优选实施方案中，所述病毒穿梭质粒包括腺病毒穿梭质粒、腺相关穿梭质粒或逆转录病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述逆转录病毒穿梭质粒是慢病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒自5’端到3’端还包括：

---5’LTR；

---Psi(ψ)包装信号（HIV-1 Ψ）；

---输出元件（RRE）；

---中央多聚嘌呤区/中央终止序列（cPPT/CTS）；

---CMV增强子（CMV enhancer）

---与插入片段可操作地连接的启动子（CMV Promoter）；

---转录后调控元件（WPRE）；

---猿猴病毒40启动子（SV40启动子）；

---杀稻瘟菌素（BSD）；

---3’LTR。

在本发明的优选的实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒在3’LTR之后还包括：猿猴病毒40转录终止位点（SV40 polyA）、猿猴病毒40复制起始位点（SV40 ori）、f1噬菌体复制起始位点（f1 ori）、氨苄启动子（AmpR promoter）、氨苄抗性基因（AmpR）和大肠杆菌复制起始位点（ori）。

在本发明的优选的实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒在5’LTR之前还包括劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子。

在本发明的优选实施方案中，所述与插入片段可操作地连接的启动子包括CMV启动子。CMV启动子为人类巨细胞病毒来源的强哺乳动物表达启动子。也可根据需要将CMV增强子及CMV启动子去除替换为其它启动子。

在本发明的优选实施方案中，所述3’LTR为3’自身失活的长末端重复序列。

长末端重复序列（LTR）位于慢病毒DNA的末端处的碱基对结构域，在其天然序列情形下是直接重复序列且含有U3、R和U5区。LTR通常提供对于慢病毒基因的表达（例如，基因转录物的启动、起始和聚腺苷酸化）和病毒复制基本的功能。LTR含有众多调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号和病毒基因组的复制和整合所需的序列。将病毒性LTR划分成被称作U3、R和U5的三个区域。U3区含有增强子和启动子元件。U5区是引物结合位点与R区之间的序列且含有聚腺苷酸化序列。R（重复序列）区由U3和U5区侧接。LTR由U3、R和U5区构成，且出现在病毒基因组的5’端和3’端处。自身失活的长末端重复序列是在原病毒载体基础上删除了病毒3’端LTR的U3区增强子和启动子序列的片段，使载体失去HIV-1增强子和启动子序列，即使存在所有的病毒蛋白也不能转录出RNA。

“Psi(ψ)包装信号”是指病毒RNA插入到病毒衣壳或颗粒中所需的位于慢病毒基因组内的序列。若干慢病毒穿梭质粒使用病毒基因组的衣壳化所需要的最小包装信号。

“输出元件”是指调节RNA转录物从细胞核到细胞质的转运的顺式作用转录后调节元件。输出元件包括但不限于人类免疫缺陷病毒（HIV）rev响应元件（RRE）。

慢病毒穿梭质粒含有顺式作用元件——中央多聚嘌呤区（cPPT）和中央终止序列（CTS），cPPT/CTS序列可以是HIV1的cPPT/CTS，能够提高载体整合和转导效率。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。

转录后调控元件可以通过促进mRNA转录物成熟来改善转基因表达，可为土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件（WPRE）。

在本发明的优选实施方案中，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

在本发明的优选实施方案中，所述慢病毒穿梭质粒为pLenti6.3-V5-MCS-CCDB。

在本发明的优选实施方案中，所述pLenti6.3-V5-MCS-CCDB的核苷酸序列如SEQID NO: 2所示。

本发明的第二个方面提供了一种构建上述第一个方面所述的慢病毒穿梭质粒的方法，其采用无缝克隆技术将致死基因ccdB连接到骨架载体上得到所述慢病毒穿梭质粒。

在本发明的优选实施方案中，采用无缝克隆技术将Lac-Cmr-ccdB片段和线性化质粒pLenti6.3-V5-GW-LacZ重组连接而得到pLenti6.3-V5-MCS-CCDB。

在本发明的优选实施方案中，对Lac-Cmr-ccdB片段进行扩增，用于扩增Lac-Cmr-ccdB片段的引物序列如下所示：

上游引物WF-ccdB-F：

5’-ACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATCCACTAGTTTTACACTTTATGCTTC-3’，其为SEQ ID NO: 3所示；

下游引物WF-ccdB-R：

5’-TTCGAACCGCGGGCCCTCTAGACTCGAGTTATATTCCCCAGAACATCAGG-3’，其为SEQ IDNO: 4所示。

本发明的第三个方面提供了一种提高阳性克隆率的方法，其包括以下步骤：

1) 酶切上述第一个方面所述的病毒穿梭质粒以去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB；

2) 将目的片段与去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB后的病毒穿梭质粒重组连接，然后转化细胞；

3) 筛选存活的细胞，从而得到带有目的片段的阳性克隆。

在本发明的优选实施方案中，所述细胞为大肠杆菌Stbl3感受态细胞。

在本发明的优选实施方案中，所述目的片段为7341，核苷酸序列如SEQ ID NO: 10所示。

下面结合具体的实施例对本发明提供的技术方案做进一步的描述。下述实施例仅用于对本发明进行说明，并不会对本发明的保护范围进行限制。

实施例1：构建pLenti6.3-V5-MCS-CCDB慢病毒穿梭质粒

pLenti6.3-V5-MCS-CCDB载体自5’端到3’端包括：劳斯肉瘤病毒（RSV）启动子；5’LTR；Psi(ψ)包装信号；Rev响应元件（RRE）；中央多聚嘌呤区/中央终止序列（cPPT/CTS）；CMV增强子（CMV enhancer）及CMV启动子（CMV Promoter）；Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB；土拨鼠肝炎转录后修饰调控元件（WPRE）；猿猴病毒40启动子（SV40 promoter）；杀稻瘟菌素（BSD）；3’LTR；猿猴病毒40转录终止位点（SV40 polyA）、猿猴病毒40复制起始位点（SV40 ori）、f1噬菌体复制起始位点（f1 ori）、氨苄启动子（AmpRpromoter）、氨苄抗性基因（AmpR）和大肠杆菌复制起始位点（ori）（参见图1），Lac-Cmr-ccdB片段的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，pLenti6.3-V5-MCS-CCDB的核苷酸序列如SEQ IDNO: 2所示。

pLenti6.3-V5-MCS-CCDB的构建：先获得片段Lac-Cmr-ccdB，然后和线性化质粒pLenti6.3-V5-GW-LacZ重组连接而成，具体为：

1）获得Lac-Cmr-ccdB片段

设计引物如下：

WF-ccdB-F：

5’-ACCTCCATAGAAGACACCGACTCTAGAGGATCCACTAGTTTTACACTTTATGCTTC-3’

WF-ccdB-R：

5’-TTCGAACCGCGGGCCCTCTAGACTCGAGTTATATTCCCCAGAACATCAGG-3’

由上海捷瑞生物公司合成pUC57-Lac-Cmr-ccdB质粒（核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示），以pUC57-Lac-Cmr-ccdB质粒为模板，上下游引物WF-ccdB-F和WF-ccdB-R，按PrimeSTAR HS酶（Takara，Cat：R044A）操作说明书PCR扩增得到Lac-Cmr-ccdB片段，琼脂糖凝胶电泳检测，按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收1458bp的片段Lac-Cmr-ccdB。

2）线性化质粒pLenti6.3-V5-GW-LacZ

使用限制性内切酶BcuI（Thermo，Cat：FD1254）和XhoI（Thermo，Cat：FD0694）双酶切载体pLenti6.3-V5-GW-LacZ（Thermo，Cat：K531520），琼脂糖凝胶电泳检测，按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收7631bp的骨架片段pLenti6.3-V5-GW-LacZ（BcuI，XhoI）。

3）重组连接得到质粒pLenti6.3-V5-MCS-CCDB

使用Seamless Assembly Cloning Kit（中美泰和，Cat：C5891）将步骤1和步骤2中的琼脂糖凝胶回收产物按操作说明书连接，转化大肠杆菌DB3.1（全式金，Cat：CD531-01）感受态细胞，挑单克隆测序正确后，得到质粒pLenti6.3-V5-MCS-CCDB。

实施例2：用pLenti6.3-V5-MCS-CCDB提高阳性克隆率

以pUC57-7341质粒为模板，上下游引物BcuI-7341-F和XhoI-7341-R，按PrimeSTARHS酶（Takara，Cat：R044A）操作说明书PCR扩增目的片段，琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段大小为1541bp，按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收得到片段BcuI-7341-XhoI。使用限制性内切酶BcuI（Thermo，Cat：FD1254）和XhoI（Thermo，Cat：FD0694）双酶切质粒pLenti6.3-V5-MCS-CCDB、片段BcuI-7341-XhoI，琼脂糖凝胶电泳检测，按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收得到骨架片段、目的片段7341片段后，再使用DNA Ligation Kit（TAKARA，Cat：6023）将骨架片段和目的片段进行重组连接。将得到的连接产物转化至Stbl3感受态细胞中，筛选存活的细胞，得到带有目的片段的阳性克隆。

如果目的片段较长可拆分为多个片段使用Seamless Assembly Cloning Kit（中美泰和，Cat：C5891）将多个片段同时与骨架片段pLenti6.3-V5-MCS-CCDB（BcuI，XhoI）进行重组连接

本发明实施例的pLenti6.3-7341、pLenti6.3-POS-7341的构建方法，包括以下步骤：

步骤一、扩增片段BcuI-7341-XhoI

引物序列如下：

BcuI-7341-F：

5’-ggACTAGTATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGC-3’ ，其为SEQ ID NO: 6所示。

XhoI-7341-R：

5’-ccgCTCGAGTTAGCGGGGGGGCAGGGCCTGCATGTG-3’ ，其为SEQ ID NO: 7所示。

由上海捷瑞生物公司合成pUC57-7341质粒（核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示），并以其为模板，上下游引物BcuI-7341-F和XhoI-7341-R，按PrimeSTAR HS酶（Takara，Cat：R044A）操作说明书PCR扩增片段，琼脂糖凝胶电泳检测，片段大小为1541bp，按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收得到片段BcuI-7341-XhoI（核苷酸序列如SEQ ID NO: 9所示）。

片段BcuI-7341-XhoI扩增体系，如表1所示。

表1扩增体系

PCR扩增条件：98℃，10min；98℃，10sec；60℃，30sec；72℃，70sec；72℃，5min；4℃，60min；步骤2~步骤4扩增30个循环数。

步骤二、线性化载体pLenti6.3-V5-MCS-CCDB、pLenti6.3-V5-GW-LacZ和片段BcuI-7341-XhoI

使用限制性内切酶BcuI（Thermo，Cat：FD1254）和XhoI（Thermo，Cat：FD0694）双酶切载体pLenti6.3-V5-MCS-CCDB、pLenti6.3-V5-GW-LacZ和片段BcuI-7341-XhoI，酶切体系如表2、表3和表4所示，37℃孵育20 min后，琼脂糖凝胶电泳检测按DNA凝胶回收试剂盒（Axygen，Cat：AP-GX-50）操作说明书切胶回收为7630bp的骨架片段pLenti6.3-V5-MCS-CCDB（BcuI，XhoI）、pLenti6.3-V5-GW-LacZ（BcuI，XhoI）以及1536bp的目的片段7341。

表2双酶切体系

表3双酶切体系

表4双酶切体系

双酶切条件：37℃，孵育20min。

步骤三、重组连接、转化及测序

使用DNA Ligation Kit（TAKARA，Cat：6023）将步骤二中得到的目的片段7341分别与线性化后的载体片段pLenti6.3-V5-MCS-CCDB（BcuI，XhoI）、pLenti6.3-V5-GW-LacZ（BcuI，XhoI）按操作说明书进行连接重组，再将连接产物按Stbl3感受态细胞操作说明书（北京全式金，Cat：CD521-01）转化至Stbl3感受态细胞，最终涂布于含氨苄抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜得到pLenti6.3-7341和pLenti6.3-POS-7341。其中，将目的片段7341与pLenti6.3-V5-GW-LacZ（BcuI，XhoI）重组连接的为pLenti6.3-7341，将目的片段7341与pLenti6.3-V5-MCS-CCDB（BcuI，XhoI）重组连接的为pLenti6.3-POS-7341。各随机挑取10个菌斑直接送测序，最终序列比对结果为pLenti6.3-7341的7、9、10序列错误，pLenti6.3-POS-7341只有样品10号序列错误。pLenti6.3-7341的7、10序列与pLenti6.3-V5-GW-LacZ一致，pLenti6.3-7341的9与pLenti6.3-POS-7341的10均为单碱基缺失。

测序结果说明酶切载体时由于限制性内切酶活性下降亦或是载体量多酶量少导致载体线性化不彻底切胶回收到了残留的原质粒，最终影响到克隆阳性率。而本发明的pLenti6.3-V5-MCS-CCDB慢病毒穿梭质粒能很好的避免此类问题，且保证了高阳性率，其低背景的特性使得筛选阳性克隆，操作简单，节省大量时间和阳性克隆筛选成本，不再需要针对目的片段设计特异的引物进行菌落PCR鉴定和质粒提取再酶切验证等筛选过程。

序列表

<110> 北京艺妙神州医药科技有限公司

<120> 一种病毒穿梭质粒及其用途

<130> CP1210825/CB

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lac-Cmr-ccdB片段

<400> 1

acctccatag aagacaccga ctctagagga tccactagtt ttacacttta tgcttccggc 60

tcgtataatg tgtggatttt gagttaggat ccgtcgagat tttcaggagc taaggaagct 120

aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc accgttgata tatcccaatg gcatcgtaaa 180

gaacattttg aggcatttca gtcagttgct caatgtacct ataaccagac cgttcagctg 240

gatattacgg cctttttaaa gaccgtaaag aaaaataagc acaagtttta tccggccttt 300

attcacattc ttgcccgcct gatgaatgct catccggaat tccgtatggc aatgaaagac 360

ggtgagctgg tgatatggga tagtgttcac ccttgttaca ccgttttcca tgagcaaact 420

gaaacgtttt catcgctctg gagtgaatac cacgacgatt tccggcagtt tctacacata 480

tattcgcaag atgtggcgtg ttacggtgaa aacctggcct atttccctaa agggtttatt 540

gagaatatgt ttttcgtctc agccaatccc tgggtgagtt tcaccagttt tgatttaaac 600

gtggccaata tggacaactt cttcgccccc gttttcacca tgggcaaata ttatacgcaa 660

ggcgacaagg tgctgatgcc gctggcgatt caggttcatc atgccgtttg tgatggcttc 720

catgtcggca gaatgcttaa tgaattacaa cagtactgcg atgagtggca gggcggggcg 780

taaagatctg gatccggctt actaaaagcc agataacagt atgcgtattt gcgcgctgat 840

ttttgcggta taagaatata tactgatatg tatacccgaa gtatgtcaaa aagaggtatg 900

ctatgaagca gcgtattaca gtgacagttg acagcgacag ctatcagttg ctcaaggcat 960

atatgatgtc aatatctccg gtctggtaag cacaaccatg cagaatgaag cccgtcgtct 1020

gcgtgccgaa cgctggaaag cggaaaatca ggaagggatg gctgaggtcg cccggtttat 1080

tgaaatgaac ggctcttttg ctgacgagaa caggggctgg tgaaatgcag tttaaggttt 1140

acacctataa aagagagagc cgttatcgtc tgtttgtgga tgtacagagt gatattattg 1200

acacgcccgg gcgacggatg gtgatccccc tggccagtgc acgtctgctg tcagataaag 1260

tctcccgtga actttacccg gtggtgcata tcggggatga aagctggcgc atgatgacca 1320

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<210> 2

<211> 9021

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pLenti6.3-V5-MCS-CCDB

<400> 2

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<220>

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> pUC57-7341

<400> 8

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tgcatctaga atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgtgagttac cacacccagc 480

attcctcctg atcccaaact ggagccaccc ccagttcgag aagggtggcg gtggctcggg 540

cggtggtggg tcgaacatag ttatgactca gagcccaaag tccacctcaa tgagtgtggg 600

tgaacgggtg actctgtcct gtaaggcaag cgagaatgtc gggacctacg tgagctggta 660

tcagcacaag cccgagcagt cccctaaact gctgatttat ggggcaagca acaggtacac 720

aggagtgcct gacagattta cagggagcgg gtctgccacc gactttacac tgaccatttc 780

aagcgttcag gccgaagacc tggcagtgta ccactgtgga caaagttaca gctatcccct 840

gacatttggc tcaggcactt ggctggagat aaagggctcc acctctggat ccggcaagcc 900

cggatctggc gagggatcca ccaagggcga agttcagctg cagcaatctg gccccgaatt 960

ggttaaaccc ggagcctctg ttaagattag ctgtaaaaca tccggctata ctttcactaa 1020

gtacacagtg cactgggtga agcagtctca cggaaagagc ctggagtgga tcggaggaat 1080

ttaccccgac aatggaggaa tcagttataa ccagaagttc aaagggaagg caacttggac 1140

cgttgacaaa tcctcaagta ctgccaacat ggaactccgc tctctcacgt ctgactacag 1200

tgcagtctac tactgtgcca ggggagacta cgaggatgcc ctggactatt ggggccaggg 1260

aacatccgtg accgtcagca gtaccaccac cccagccccc cgaccaccaa cacccgcccc 1320

caccatcgcc agccagcccc tgagcctgcg ccccgaggcc tgccgccccg ccgccggcgg 1380

cgccgtgcac acccgcggcc tggacttcgc ctgcgacatc tacatctggg cccccctggc 1440

cggcacctgc ggcgtgctgc tgctgagcct ggtgatcacc ctgtactgca agcgcggccg 1500

caagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgc cccgtgcaga ccacccagga 1560

ggaggacggc tgcagctgcc gcttccccga ggaggaggag ggcggctgcg agctgcgcgt 1620

gaagttcagc cgcagcgccg acgcccccgc ctacaagcag ggccagaacc agctgtacaa 1680

cgagctgaac ctgggccgcc gcgaggagta cgacgtgctg gacaagcgcc gcggccgcga 1740

ccccgagatg ggcggcaagc cccgccgcaa gaacccccag gagggcctgt acaacgagct 1800

gcagaaggac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcgccgccg 1860

cggcaagggc cacgacggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga 1920

cgccctgcac atgcaggccc tgcccccccg ctaactcgag tctagagggc ccgtcgactg 1980

cagaggcctg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg 2040

ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg 2100

tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 2160

gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 2220

gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 2280

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 2340

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 2400

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 2460

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 2520

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 2580

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 2640

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 2700

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 2760

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 2820

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 2880

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 2940

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 3000

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 3060

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 3120

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 3180

atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 3240

ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 3300

tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 3360

agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 3420

taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 3480

tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 3540

cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 3600

ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 3660

tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 3720

tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 3780

cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 3840

tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 3900

gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 3960

tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 4020

atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 4080

tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 4140

cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 4200

ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 4235

<210> 9

<211> 1541

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 片段BcuI-7341-XhoI

<400> 9

ggactagtat gctgctgctg gtgaccagcc tgctgctgtg tgagttacca cacccagcat 60

tcctcctgat cccaaactgg agccaccccc agttcgagaa gggtggcggt ggctcgggcg 120

gtggtgggtc gaacatagtt atgactcaga gcccaaagtc cacctcaatg agtgtgggtg 180

aacgggtgac tctgtcctgt aaggcaagcg agaatgtcgg gacctacgtg agctggtatc 240

agcacaagcc cgagcagtcc cctaaactgc tgatttatgg ggcaagcaac aggtacacag 300

gagtgcctga cagatttaca gggagcgggt ctgccaccga ctttacactg accatttcaa 360

gcgttcaggc cgaagacctg gcagtgtacc actgtggaca aagttacagc tatcccctga 420

catttggctc aggcacttgg ctggagataa agggctccac ctctggatcc ggcaagcccg 480

gatctggcga gggatccacc aagggcgaag ttcagctgca gcaatctggc cccgaattgg 540

ttaaacccgg agcctctgtt aagattagct gtaaaacatc cggctatact ttcactaagt 600

acacagtgca ctgggtgaag cagtctcacg gaaagagcct ggagtggatc ggaggaattt 660

accccgacaa tggaggaatc agttataacc agaagttcaa agggaaggca acttggaccg 720

ttgacaaatc ctcaagtact gccaacatgg aactccgctc tctcacgtct gactacagtg 780

cagtctacta ctgtgccagg ggagactacg aggatgccct ggactattgg ggccagggaa 840

catccgtgac cgtcagcagt accaccaccc cagccccccg accaccaaca cccgccccca 900

ccatcgccag ccagcccctg agcctgcgcc ccgaggcctg ccgccccgcc gccggcggcg 960

ccgtgcacac ccgcggcctg gacttcgcct gcgacatcta catctgggcc cccctggccg 1020

gcacctgcgg cgtgctgctg ctgagcctgg tgatcaccct gtactgcaag cgcggccgca 1080

agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgcgccc cgtgcagacc acccaggagg 1140

aggacggctg cagctgccgc ttccccgagg aggaggaggg cggctgcgag ctgcgcgtga 1200

agttcagccg cagcgccgac gcccccgcct acaagcaggg ccagaaccag ctgtacaacg 1260

agctgaacct gggccgccgc gaggagtacg acgtgctgga caagcgccgc ggccgcgacc 1320

ccgagatggg cggcaagccc cgccgcaaga acccccagga gggcctgtac aacgagctgc 1380

agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cgccgccgcg 1440

gcaagggcca cgacggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg 1500

ccctgcacat gcaggccctg cccccccgct aactcgagcg g 1541

<210> 10

<211> 1536

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 目的片段7341

<400> 10

actagtatgc tgctgctggt gaccagcctg ctgctgtgtg agttaccaca cccagcattc 60

ctcctgatcc caaactggag ccacccccag ttcgagaagg gtggcggtgg ctcgggcggt 120

ggtgggtcga acatagttat gactcagagc ccaaagtcca cctcaatgag tgtgggtgaa 180

cgggtgactc tgtcctgtaa ggcaagcgag aatgtcggga cctacgtgag ctggtatcag 240

cacaagcccg agcagtcccc taaactgctg atttatgggg caagcaacag gtacacagga 300

gtgcctgaca gatttacagg gagcgggtct gccaccgact ttacactgac catttcaagc 360

gttcaggccg aagacctggc agtgtaccac tgtggacaaa gttacagcta tcccctgaca 420

tttggctcag gcacttggct ggagataaag ggctccacct ctggatccgg caagcccgga 480

tctggcgagg gatccaccaa gggcgaagtt cagctgcagc aatctggccc cgaattggtt 540

aaacccggag cctctgttaa gattagctgt aaaacatccg gctatacttt cactaagtac 600

acagtgcact gggtgaagca gtctcacgga aagagcctgg agtggatcgg aggaatttac 660

cccgacaatg gaggaatcag ttataaccag aagttcaaag ggaaggcaac ttggaccgtt 720

gacaaatcct caagtactgc caacatggaa ctccgctctc tcacgtctga ctacagtgca 780

gtctactact gtgccagggg agactacgag gatgccctgg actattgggg ccagggaaca 840

tccgtgaccg tcagcagtac caccacccca gccccccgac caccaacacc cgcccccacc 900

atcgccagcc agcccctgag cctgcgcccc gaggcctgcc gccccgccgc cggcggcgcc 960

gtgcacaccc gcggcctgga cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc cctggccggc 1020

acctgcggcg tgctgctgct gagcctggtg atcaccctgt actgcaagcg cggccgcaag 1080

aagctgctgt acatcttcaa gcagcccttc atgcgccccg tgcagaccac ccaggaggag 1140

gacggctgca gctgccgctt ccccgaggag gaggagggcg gctgcgagct gcgcgtgaag 1200

ttcagccgca gcgccgacgc ccccgcctac aagcagggcc agaaccagct gtacaacgag 1260

ctgaacctgg gccgccgcga ggagtacgac gtgctggaca agcgccgcgg ccgcgacccc 1320

gagatgggcg gcaagccccg ccgcaagaac ccccaggagg gcctgtacaa cgagctgcag 1380

aaggacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg ccgccgcggc 1440

aagggccacg acggcctgta ccagggcctg agcaccgcca ccaaggacac ctacgacgcc 1500

ctgcacatgc aggccctgcc cccccgctaa ctcgag 1536

Claims (15)

1.一种病毒穿梭质粒，其在5’端到3’端之间包括插入片段，所述插入片段包括Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB。

2.根据权利要求1所述的病毒穿梭质粒，其中，所述插入片段的核苷酸序列如SEQ IDNO: 1所示。

3.根据权利要求1或2所述的病毒穿梭质粒，其为腺病毒穿梭质粒、腺相关病毒穿梭质粒或逆转录病毒穿梭质粒。

4.根据权利要求3所述的病毒穿梭质粒，其为慢病毒穿梭质粒。

5.根据权利要求4所述的病毒穿梭质粒，其自5’端到3’端还包括：

5’LTR；

Psi(ψ)包装信号；

输出元件；

中央多聚嘌呤区/中央终止序列；

CMV增强子;

与插入片段可操作地连接的启动子；

转录后调控元件；

猿猴病毒40启动子；

杀稻瘟菌素；

3’LTR。

6.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，在3’LTR之后还包括：猿猴病毒40转录终止位点、猿猴病毒40复制起始位点、f1噬菌体复制起始位点、氨苄启动子、氨苄抗性基因和大肠杆菌复制起始位点。

7.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，在5’LTR之前还包括劳斯肉瘤病毒启动子。

8.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述与插入片段可操作地连接的启动子包括CMV启动子。

9.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述3’LTR为3’自身失活的长末端重复序列。

10.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述输出元件包括Rev响应元件。

11.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其中，所述转录后调控元件包括土拨鼠肝炎转录后修饰调控元件。

12.根据权利要求5所述的病毒穿梭质粒，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

13.一种提高阳性克隆率的方法，其包括以下步骤：

1) 酶切权利要求1-12中任一项所述的病毒穿梭质粒以去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB；

2) 将目的片段与去除Lac操纵子来源的lac启动子、氯霉素抗性基因Cmr和致死基因ccdB后的病毒穿梭质粒重组连接，然后转化细胞；

3) 筛选存活的细胞，从而得到带有目的片段的阳性克隆。

14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述目的片段为7341，核苷酸序列如SEQ IDNO: 10所示。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中，所述细胞为大肠杆菌Stbl3感受态细胞。

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