KR101076602B1

KR101076602B1 - １ 카피 이상의 ｍａｒｄｎａ 서열이 유전자의전사종결영역의 3′말단에 삽입된 동물세포 발현 벡터 및그를 이용한 외래 유전자의 발현 방법

Info

Publication number: KR101076602B1
Application number: KR1020070108451A
Authority: KR
Inventors: 김종묵; 홍혜진; 이현주; 소문경; 이수영; 조종문; 전복환; 홍승서; 조명삼
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2005-03-04
Filing date: 2007-10-26
Publication date: 2011-10-26
Also published as: EP1859046A4; EP1859046A1; EP1859046B1; KR20070118563A; WO2006093397A1; DE602006014942D1; US20080102523A1; US8772021B2; KR20060096383A; ATE471381T1

Abstract

본 발명은 작동가능하게 연결된 프로모터, 클로닝 부위 또는 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 전사종결인자를 포함하는 동물 세포 발현 벡터로서, 상기 전사종결인자의 3′말단에 1 카피 이상의 인간 베타 글로빈 유전자 MAR (matrix attachment region) 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터 및 그를 이용하여 외래 유전자를 발현하는 방법을 제공한다.

MAR, 유전자 발현

Description

１ 카피 이상의 ＭＡＲＤＮＡ 서열이 유전자의 전사종결영역의 3′말단에 삽입된 동물세포 발현 벡터 및 그를 이용한 외래 유전자의 발현 방법{Expression vector for animal cell comprising at least one copy of MAR DNA sequences at the 3′terminal of transcription termination region of a gene and method for the expression of foreign gene using the vector}

본 발명은 MAR 요소를 포함하는 동물 세포 발현 벡터 및 그를 이용하여 유전자를 발현시키는 방법에 관한 것이다.

진핵 유전자 발현의 조절에 있어서 MAR (matrix attachment region) DNA 서열의 역할에 대하여 많은 연구가 있었다. MAR 서열 (SAR (scaffold attachment region)이라고도 한다)은 전사 조절에 관여하는 것으로 여겨지는 요소의 예이다. 일반적으로, MAR 서열은 숙주 게놈 내로 삽입되어야만 그 효과를 발휘할 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, MAR 서열 (약 70 % 이상의 고도로 AT-풍부 서열)은 안정하게 형질전환된 동물 세포주에서 이식유전자 (transgene) 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다. MAR 서열을 사용하는 경우 형질전환체 간의 발현 변이성이 크지 않는 것으로 알려져 있다. 이러한 위치 독립적 발현 (position independent expression)은 MAR 서열이 이웃하는 크로마틴 인핸서 또는 사일런서의 간섭 효과로부터 삽입된 DNA를 보호함으로써, 또는 메틸화를 저해함으로써 위치 영향 (position effect)으로부터 외래 DNA 삽입체를 절연시키기 때문인 것으로 알려져 있다.

MAR 서열은 동물 세포에서 외래 유전자의 발현을 증가시키기 위하여 많이 이용되었다. 예를 들면, 국제특허공개 제WO02/1425호에는 프로모터의 5′말단에 β-글로빈 MAR 서열을 포함하는 발현 벡터가 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제6,388,066호에는 프로모터, 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열 및 전사 종결 영역으로 구성되는 조합된 요소에 인접하여 옥수수 ADH1 MAR DNA서열을 포함하는 프로모터-구동 구조체가 개시되어 있다. 그러나, 2 이상의 MAR DNA 서열이 전사종결인자의 3' 말단에 연속적으로 도입된 DNA 구조체는 개시된 바 없다.

이상과 같은 종래 기술에 의하더라도 동물 세포에 외래 유전자를 보다 높은 효율로 발현할 수 있는 발현 벡터가 여전히 요구되고 있다. 본 발명자들은 외래 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 방법을 연구하던 중 MAR DNA 서열을 유전자 전사종결신호의 3′말단에 1 카피 이상을 도입함으로써 외래 유전자의 발현이 현저하게 증가된다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 외래 유전자의 발현을 효율적으로 발현시킬 수 있는 동물 세포 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 동물 세포 발현 벡터를 이용하여 외래 유전자를 효율적으로 발현하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 작동가능하게 연결된 프로모터, 클로닝 부위 또는 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 전사종결인자를 포함하는 동물 세포 발현 벡터로서, 상기 전사종결인자의 3′말단에 1 카피 이상의 인간 베타 글로빈 유전자 MAR (matrix attachment region) 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 프로모터는 종래 알려진 임의의 프로모터가 사용될 수 있다. 예를 들면, SV40 초기 프로모터 (예, 서열번호 1의 1 내지 419 번 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드) 또는 CMV 유래 프로모터 (예, 서열번호 6의 1 내지 684 번 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드)인 발현 벡터가 포함될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 외래 단백질 또는 핵산과 같은 외래 산물을 코딩할 수 있는 것이면 어느 것이든 포함된다. 바람직하게는, 상기 산물은 단백질로서 예를 들면, lacZ, 면역글로불린, GCSF 또는 EPO가 포함될 수 있다. "클로닝 부위"란 외래 유전자를 상기 벡터에 삽입할 수 있도록 제한 효소 인지 또는 절단 부위가 도입되어 있는 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서, 전사 종결인자는 종래 알려진 임의의 전사 종결인자가 포함될 수 있다. 예를 들면, 인간 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호, 소 성장 호르몬 폴리아데닐레이션 신호 및 SV40 바이러스 폴리아데닐레이션 신호가 포함될 수 있다. 바람직하게는, SV40 바이러스 폴리아데닐레이션 신호 (서열번호 1의 4021 내지 4156 번 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드)이다.

본 발명에 있어서, "MAR (matrix attachment region)"란 전사적으로 활성인 DNA 루프 도메인을 핵 마트릭스 (nuclear matrix)로 알려진 사상의 단백질 네트워크에 일시적으로 부착시키는 DNA 서열을 의도한 것이다 (Pienta et al. (1991) Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expres. 1:355-385). MAR 서열의 예는 당업계 많이 알려져 있다. 예를 들면, 상기 MAR는 젠뱅크 허가번호 L22754 (서열번호 1의 4178 내지 7142번의 뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드)인 것이 될 수 있다. 본 발명에 있어서, 2카피 이상의 MAR가 포함되는 경우, 상기 2 카피의 MAR 인자는 바람직하게는 서로 이웃하게 연속되어 있거나 비교적 짧은 스페이서 영역에 의하여 이격되어 있는 것일 수 있다. 바람직하게는, 2 카피의 MAR가 서로 순차적으로 인접하여 결합되어 있는 것이다. 또한, 본 발명에 있어서, "전사종결인자의 3′말단"이란 전사종결인자 즉, 폴리아데닐화 (polyA) 신호의 3′말단을 의미하는 것으로 반드시 폴리아데닐화 신호의 바로 말단만을 의미하는 것은 아니고, 폴리아데닐화 신호가 미칠 수 있는 3′말단의 하류 영역이 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

본 발명의 발현 벡터의 일 예는 서열번호 1,2,5,6 및 7 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 발현 벡터 또는 도 14의 벡터 지도를 갖는 pCMVMM-IgG 발현 벡터인 것이다. 서열번호 1, 2, 6 및 7의 벡터는 상기 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 LacZ를 코딩하는 유전자이고, 서열번호 5의 벡터는 상기 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 GCSF를 코딩하는 유전자이다. 도 14의 벡터 지도를 갖는 pCMVMM-IgG 발현 벡터는 상기 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 면역글로불린 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 발현 벡터가 도입된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는, 외래 유전자를 발현시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 동물 세포는 임의의 동물 세포가 될 수 있다. 예를 들면 CHO, BHK, NSO 및 인간 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 세포가 포함되나 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 동물 세포는 CHO 세포이다. 또한, 동물 세포를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 당업자라면 선택되는 세포주에 따라 적합한 배지 및 온도 등의 조건을 선택하여 배양할 수 있다.

본 발명에 따른 동물세포 발현 벡터에 의하면, 동물 세포에서 외래 유전자의 발현을 현저하게 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 발현 방법에 의하면, 동물 세포에서 높은 효율로 용이하게 유전자를 발현시킬 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실 시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명자들은 동물 세포 발현 벡터에 포함되어 있고, 유전자의 전사 종결인자의 3′말단에 삽입되어 있는 MAR 인자가 상기 유전자의 발현에 미치는 효과를 조사하였다. 이를 위하여 먼저, SV40 폴리아데닐레이션 신호의 하류에 1 또는 2 카피의 인간 β-글로빈 유전자의 MAR가 삽입된 벡터를 제조하고, 이를 동물 세포에 도입하고, 상기 동물 세포를 배양하여 상기 유전자의 발현정도를 관찰하였다.

실시예 1 : 유전자의 3′말단에 MAR 서열을 포함하는 벡터의 제조

1. 인간 β-글로빈 5′ MAR 의 분리

먼저, HepG-2 세포를 배양하고, 얻어지는 HepG-2 세포로부터 DNeasy kit (Qiagen, 미국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 게놈 DNA를 분리하였다.

다음으로, 얻어진 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 하여 PCR를 수행하여 인간 β-글로빈 유전자의 5' MAR 서열을 증폭하였다. PCR은 94 ℃에서 15분, 94 ℃ 1분, 62 ℃에서 1분 및 72 ℃에서 3분을 35 회, 72 ℃에서 10 분의 조건에서 수행되었다.

그 결과 얻어지는 PCR 산물을 yT&A 클로닝 벡터 (Yeastern Biotech Co., Ltd., 대만)에 삽입하여 β-글로빈 유전자의 5' MAR 서열이 삽입된 yT&A/β-글로빈 유전자의 MAR 벡터를 제조하였다. yT&A 클로닝 벡터는 PCR 산물을 제한 효소를 사용하지 않고 직접적으로 클로닝할 수 있도록 고안된 TA 클로닝 벡터이다.

2. 유전자의 전사종결인자의 3′말단에 MAR 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터의 제조

1) SV40 초기 프로모터, lacZ 유전자 및 SV40 전사종결인자가 작동가능하게 연결되어 있고, 상기 SV40 전사종결인자의 3' 말단에 1카피 및 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 연결되어 있는, pSVM-β-gal 및 pSVMM-β-gal의 제조

SV40 초기 프로모터 및 그에 작동가능하게 연결된 lacZ 유전자를 포함하는 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국) (도 1 참조)를 이용하여, 유전자의 전사종결인자의 3′말단에 MAR 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제조하였다.

먼저, 1절에서 얻어진 yT&A/β-글로빈 유전자의 MAR 벡터를 BamHI 및 XbaI으로 처리하고, 이들로부터 얻어진 산물을 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 분리하고, 그로부터 BamHI-XbaI 산물을 분리하였다. 다음으로, 상기 BamHI-XbaI 산물을 BamHI 및 XbaI으로 처리된 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국)와 라이게이션하여, 1 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 전자 종결인자의 3′말단에 연결된 pSVM-β-gal 벡터를 얻었다 (도 2 참조). pSVM-β-gal 벡터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다.

다음으로, 1 절에서 얻어진 yT&A/β-글로빈 유전자의 MAR 벡터를 XbaI 및 PstI으로 처리하고, 이들로부터 얻어진 산물을 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 분리하고, 그로부터 XbaI-PstI 산물을 분리하였다. 다음으로, 상기 XbaI-PstI 산물을 XbaI 및 PstI으로 처리된 pSVM-β-gal 벡터와 라이게이션하여, 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 전자 종결인자의 3′말단에 연결된 pSVMM-β-gal 벡터를 얻었다 (도 3 참조). pSVMM-β-gal 벡터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 2에 나타낸 바와 같다.

2) CMV 프로모터, lacZ 유전자 및 SV40 전사종결인자가 작동가능하게 연결되 어 있고, 상기 SV40 전사종결인자의 3' 말단에 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 연결되어 있는, pCMVMM-β-gal의 제조

작동가능하게 연결되어 있는 CMV 프로모터, lacZ 유전자 및 SV40 전사종결인자를 포함하는 pCMV-β-gal 벡터를 이용하여, 유전자의 전사종결인자의 3′말단에 인간 β-글로빈 MAR 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제조하였다.

먼저, CMV 초기 프로모터, lacZ 유전자 및 전자종결 인자를 포함하는 pCMV-β-gal 벡터에 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 첨가하기 위하여, pCMV-β-gal 벡터에 PmeI을 처리하여 개환한 다음, 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 개환된 벡터를 분리 정제하였다. 다음으로, 개환된 벡터에 알카라인 포스파타제를 처리하여 포스페이트를 제거하였다. 포스페이트를 제거한 다음, 65℃에서 15분 동안 열을 가하여 알카라인 포스파타제를 불활성화시키고, 컬럼을 이용하여 제거하였다. 상기 벡터에 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 첨가하기 위하여, pSVMM-β-gal 벡터를 이용하였다. pSVMM-β-gal 벡터에 EcoRV를 처리하여 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 포함하는 5.8kb의 단편을 아가로스 겔 (agarose gel)로부터 분리 정제한 다음, 이 단편을 PmeI을 처리하여 개환된 상기의 벡터에 삽입 연결함으로써 pCMVMM-β-gal 발현벡터를 완성하였다.

도 8은 작동가능하게 연결되어 있는 CMV 유래 프로모터, lacZ 유전자 및 SV40 전사종결서열을 포함하는 pCMV-β-gal 벡터를 나타내는 도면이다.

*도 9는 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pCMV-β-gal 벡터의 lacZ 유전자의 하류에 위치하는 SV40 전사종결인자의 3' 말단에 연속하여 연결된 pCMVMM-β-gal 벡터를 나타내는 도면이다.

3) CMV 프로모터, 면역글로불린 유전자 및 SV40 전사종결인자가 작동가능하 게 연결되어 있고, 상기 SV40 전사종결인자의 3' 말단에 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 연결되어 있는 pCMVMM-IgG의 제조

작동가능하게 연결되어 있는 CMV 프로모터, 인간 면역글로불린 G 유전자 및 SV40 전사종결인자를 포함하는 pCMV-IgG 벡터를 이용하여, IgG 유전자의 전사종결인자의 3′말단에 인간 β-글로빈 MAR 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터를 제조하였다.

먼저, pCMV-IgG 벡터에 PmeI을 처리하여 개환한 다음, 아가로즈 겔 전기영동을 통하여 개환된 벡터를 분리 정제하였다. 다음으로, 개환된 벡터에 알카라인 포스파타제를 처리하여 포스페이트를 제거하였다. 포스페이트를 제거한 다음, 65℃에서 15분 동안 열을 가하여 알카라인 포스파타제를 불활성화시키고, 컬럼을 이용하여 제거하였다. 상기 벡터에 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 첨가하기 위하여, pSVMM-β-gal 벡터를 이용하였다. pSVMM-β-gal 벡터에 EcoRV를 처리하여 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 포함하는 5.8kb의 단편을 아가로스 겔 (agarose gel)로부터 분리 정제한 후, 이 단편을 PmeI을 처리하여 개환된 상기의 벡터에 삽입 연결함으로써 pCMVMM-IgG 발현벡터를 완성하였다.

도 13은 CMV 유래 프로모터 및 그에 작동가능하게 연결된 인간 면역글로불린 G 유전자를 포함하는 pCMV-IgG 벡터를 나타내는 도면이다. pCMV-IgG 벡터는 선별용 유전자인 dhfr (dihydrofolate reductase) 유전자를 포함하고 있다.

도 14는 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pCMV-IgG 벡터의 IgG 유전자의 전사 종결인자 (중쇄의 경우, BGH polyA; 경쇄의 경우, SV40 polyA)의 3′말단에 연속하여 연결된 pCMVMM-IgG 벡터를 나타내는 도면이다. pCMVMM-IgG 벡터는 선별용 유전자인 dhfr 유전자를 포함하고 있다. 도 14에서 IS는 인트론 서열 (intronic sequence)를 의미한다.

실시예 2 : 유전자의 3′말단에 삽입된 MAR 서열이 유전자의 발현에 미치는 효과

본 실시예에서는 실시예 1에서 제작된 pSVM-β-gal 벡터, pSVMM-β-gal, pCMVMM-β-gal 벡터 및 pCMVMM-IgG 벡터를 동물 세포에 도입하고, 배양하여 유전자의 3′말단에 도입된 인간 β-글로빈 MAR 서열이 유전자의 발현에 미치는 영향을 조사하였다. 대조군으로는 각각 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국), pCMV-β-gal 및 pCMV-Ig 벡터를 사용하였다.

1. CHO 세포의 형질전환

(1) DOSPER (계면활성제)를 이용한 형질전환

각각 2 ㎍의 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터와 33 ng의 pSV2neo 벡터 (Clontech 사, 미국)를 계면활성제의 일종인 DOSPER (Roche 사, 독일)를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 CHO DG44 세포주 (5x10⁵ cells/well)에 공동 형질전환시켰다 (co-transfection). 형질전환을 실시하기 위해 먼저 CHO DG44 세포주를 혈청을 포함하지 않고 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 한번 세척한 후, 이 배지를 이용하여 배양을 실시하였다. 1시간 후에, pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터를 선별 유전자를 가지고 있는 pSV2neo 벡터와 섞은 다음, DOSPER (Roche 사, 독일) 5.3 ㎍과 혼합하여 상온에서 30분 반응시켰다. 30분 반응 후, 앞서 MEM-α 배지를 이용하여 배양하고 있는 CHO DG44 세포주에 처리하여 8시간 함께 배양한 후, 배양액을 열처리된 FBS 10 %(v/v) 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 교환하여 36시간 배양을 하였다. 형질전환된 CHO DG44 세포를 G418이 포함된 선별용 배지 (열처리 FBS 10 %, 850 ㎍/ml G418 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지)에서 약 3주 정도 배양하여 G418에 저항성을 가지는 세포주를 선별하였다.

얻어진 세포주 즉, 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주를 배양하여 β-갈락토시다제를 발현하는 세포의 비율 및 발현되는 β-갈락토시다제의 양을 조사하였다.

(2) 칼슘 인산염을 이용한 형질전환

각각 2 ㎍의 pSV-β-gal 벡터, pSVMM-β-gal 벡터, pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터와 500 ng의 pSV2neo 벡터 (Clontech 사, 미국)를 칼슘인산염을 이용하여 CHO DG44 세포주 (5x10⁵ cells/well)에 공동 형질전환시켰다 (co-transfection). 형질전환을 실시하기 위해 먼저 CHO DG44 세포주를 FBS 1%을 포함하는 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 한번 세척한 후, 이 배지를 이용하여 배양을 실시하였다. 1시간 후에, 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVMM-β-gal 벡터, pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터와 선별 유전자를 가지고 있는 pSV2neo 벡터와 섞은 다음, 칼슘 인산염과 함께 침전물을 만들어 앞서 MEM-α 배지를 이용하여 배양하고 있는 CHO DG44 세포주에 4시간 처리한 후, 10% 글리세롤 용액을 1분간 처리하였다. 1분 처리 후, 글리세롤 용액을 완전히 제거 후, 열처리된 FBS 10 %(v/v) 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 교환하여 36시간 배양을 하였다. 형질전환된 CHO DG44 세포를 G418이 포함된 선별용 배지 (열처리 FBS 10 %, 850 ㎍/ml G418 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지)에서 약 3주 정도 배양하여 G418에 저항성을 가지는 세포주를 선별하였다.

얻어진 세포주 즉, 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVMM-β-gal 벡터, pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주를 배양하여 β-갈락토시다제를 발현하는 세포의 비율 및 발현되는 β-갈락토시다제의 양을 조사하였다.

또한, 각각 2.5 ㎍의 pCMV-IgG 벡터 및 pCMVMM-IgG 벡터를 칼슘인산염을 이용하여 CHO DG44 세포주 (5x10⁵ cells/well)에 형질전환시켰다. 형질전환을 실시하기 위해 먼저 CHO DG44 세포주를 FBS 1%을 포함하는 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 한번 세척한 후, 이 배지를 이용하여 배양을 실시하였다. 1시간 후에, 각각 pCMV-Ig 벡터 및 pCMVMM-Ig 벡터를 칼슘 인산염과 함께 침전물을 만들어 앞서 MEM-α 배지를 이용하여 배양하고 있는 CHO DG44 세포주에 4시간 처리한 후, 10% 글리세롤 용액을 1분간 처리하였다. 1분 처리 후, 글리세롤 용액을 완전히 제거한 후, 열처리된 FBS 10 %(v/v) 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지로 교환하여 72시간 배양을 하였다. 72시간 배양 후, 형질전환된 CHO DG44 세포를 dfhr 유전자를 포함한 세포주만 성장할 수 있는 선별용 배지 (SFM4CHO 배지 (Hyclone 사, 미국))를 이용하여 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 선별용 배지에서 배양한 후, 이들 형질전환된 CHO DG44에서 IgG의 발현량을 조사하였다.

2. 각각 pSVM -β- gal 벡터 및 pSVMM -β- gal 벡터가 도입되어 있고 G418 에 대 하여 저항성을 갖는 세포주 중의 β-갈락토시다제 발현량 및 발현 양성 세포의 비율의 조사

각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있는 형질전환된 임시적 (transient) CHO DG44 세포에서 β-갈락토시다제 효소 활성 분석을 통하여 β-갈락토시다제 발현량을 측정하였다. 먼저, 형질전환 후, 48 시간 후에, 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입있는 CHO DG44 세포주를 1X PBS로 2회 세척하고, 0.25 % 트립신 용액을 이용하여 세포를 배양용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 5x10⁶ 세포당 200 ㎕의 용해 버퍼 (lysis buffer) (0.25 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1% Nonidet P40)를 첨가하고, 4 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 30분 반응 시간 동안, 10분 간격으로 보르텍스(vortex)를 이용하여 혼합시켰다. 반응 후, 4 ℃, 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 얻어진 상등액 즉, 세포 추출액을 시료로 하여 β-Gal assay 키트 (Invitrogen 사, 미국)을 이용하여 제조사의 지침서에 따라 β-갈락토시다제 효소 활성 분석을 수행하였다. 세포 추출액 10 ㎕를 EIA용 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 여기에 1X 절단 용액 (cleavage solution) (60 mM Na₂HPO₄-7H₂O, 40 mM NaH₂PO₄-H₂O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄-7H₂O, pH 7.0) 50 ㎕ 및 ONPG 용액 (농도: 4 mg/ml) 17 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응 정지 용액 125 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 추출액 중의 총 단백질 양은 비신코니닉산 (bicinchoninic acid) (BCA) 방법에 따라 측정하였으며, β-갈락토시다제 효소 활성을 동일한 단백질 양으로 보정하여 분석하였다.

도 4는 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있는 임시적 (transient) 상태에서의 CHO DG44에서 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 1 카피의 MAR 뿐만 아니라 2 카피의 MAR가 도입된 경우에도 β-갈락토시다제 발현이 증가되지 않음을 알 수 있다. 이것은 기존에 보고된 바와 같이 MAR 인자는 임시적으로 형질전환된 세포에서는 MAR 인자와 연결되어 있더라도 유전자의 발현을 증가시키지 않는다는 결과와 일치함을 알 수 있다.

다음으로, 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주 중에서 β-갈락토시다제 효소 활성을 분석하였다. 먼저 각각 2 ㎍의 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터와 33ng의 pSV2neo 벡터 (Clontech 사, 미국)를 계면활성제의 일종인 DOSPER (Roche 사, 독일)를 이용하여 제조사의 지침서에 따라 CHO DG44 세포주 (5x10⁵ cells/well)에 공동 형질전환시켰다 (co-transfection). 형질전환 실시 36 시간 후, G418이 포함된 선별배지 (열처리된 FBS 10 %, 850 ㎍/ml G418 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지)에서 약 3 주간 배양함으로써, G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주를 확보하였으며, 이들 세포주에서 β-갈락토시다제 효소 활성 분석을 통하여 β-갈락토시다제 발현량을 측정하였다.

도 5는 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대한 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 폴리아데닐레이션 신호의 3' 말단에 MAR 서열을 도입함으로써, G418에 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에서 대조군에 비해 β-갈락토시다제 발현량이 18배에서 29배까지 증가함을 알 수 있으며, 특히 2 카피의 MAR가 도입된 경우 1 카피가 삽입되었을 때 나타나는 증가효과가 60% 정도 더 증가함을 알 수 있다.

다음으로 앞서 확보한 각각의 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에서 β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 β-gal 염색법을 이용하여 조사하였다. 먼저, 선별배지 (열처리된 FBS 10 %, 850 ㎍/ml G418 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지)를 이용하여 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 1X PBS로 2번 세척하고 0.25 % 트립신 용액을 이용하여 배양용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 선별배지를 처리하여 트립신을 불활성화시킨 다음 원심분리하여 트립신을 제거하였으며, 1X PBS로 2번 세척하였다. 세척 후, 분리된 세포에 2 % 포름알데히드와 0.2 % 글루타르알데히드로 구성된 고정액 (fixing solution)을 4 ℃에서 10 분 동안 처리하여 세포를 고정시킨 다음, PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 다음으로, β-Gal 효소의 기질인 X-Gal을 처리함으로써 얻어지는 발색 산물인 ONPG에 의하여 세포를 염색하였다. 염색 결과 양성 세포는 푸른 색을 띤다.

도 6은 도 5에서 확보한 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주를 ONPG 염색한 결과, β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 나타내는 도면이다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 유전자의 전사종결 영역 즉, 폴리아데닐레이션 신호의 3′말단에 MAR 서열을 도입함으로써 β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율이 증가함을 알 수 있었다. 이는 폴리아데닐레이션 신호의 3′말단에 도입된 MAR 서열이 상류의 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다. 또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 2 카피의 MAR가 도입된 경우 (90%) 1 카피만 도입된 경우 (70%)에 비하여 β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율이 현저하게 증가되었다.

도 7은 도 5에서 얻은 β-갈락토시다제 발현량을 β-갈락토시다제 발현 양성 세포를 기준으로 나타낸 도면이다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 단위 양성 세포주 당 β-갈락토시다제 발현량은 인간 β-글로빈 MAR 서열을 유전자의 3′말단에 도입함으로써 대조군에 비하여 7.4 내지 8.9 배 정도 증가함을 알 수 있었다. 특히, 1 카피의 MAR 서열을 도입한 경우에 비하여 2 카피의 MAR 서열을 도입한 경우 β-갈락토시다제 발현량이 약 20% 더 증가하였다.

3. pCMVMM -β- gal 벡터가 도입되어 있고 G418 에 대하여 저항성을 갖는 세포 주 중의 β-갈락토시다제 발현량 및 발현 양성 세포의 비율의 조사

먼저, 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주 중에서 β-갈락토시다제 효소 활성 분석을 통하여 β-갈락토시다제 발현량을 측정하였다. 먼저, 선별배지에서 3주 정도 배양된 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주를 1X PBS로 2회 세척하고, 0.25 % 트립신 용액을 이용하여 세포를 배양용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 10⁶ 세포당 200 ㎕의 용해 버퍼 (lysis buffer) (0.25 M Tris-HCl pH 8.0, 0.1% Nonidet P40)을 첨가하고, 4 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 30분 반응 시간 동안, 10분 간격으로 보르텍스 (vortex)를 이용하여 혼합시켰다. 반응 후, 4 ℃, 13,000 rpm에서 10 분 동안 원심분리하여, 상등액을 새 튜브로 옮겼다. 얻어진 상등액 즉, 세포 추출액을 시료로 하여 β-Gal assay 키트 (Invitrogen 사, 미국)을 이용하여 제조사의 지침서에 따라 β-갈락토시다제 효소 활성 분석을 수행하였다. 세포 추출액 10 ㎕를 EIA용 96-웰 플레이트에 첨가한 후, 여기에 1X 절단 용액 (cleavage solution) (60 mM Na₂HPO₄-7H₂O, 40 mM NaH₂PO₄-H₂O, 10 mM KCl, 1 mM MgSO₄-7H₂O, pH 7.0) 50 ㎕ 및 ONPG 용액 (농도: 4 mg/ml) 17 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 30 분 동안 반응시켰다. 반응 후, 정지 용액 125 ㎕ 를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 추출액 중의 총 단백질 양은 비신코니닉산 (bicinchoninic acid) (BCA) 방법에 따라 측정하였으며, b-갈락토시다제 효소 활성을 동일한 단백질 양으로 보정하여 분석하였다.

도 10은 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대한 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 폴리아데닐레이션 신호의 3' 말단에 2 카피의 MAR 서열을 도입함으로써, G418에 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에서 CMV 유래 프로모터와 연결된 β-갈락토시다제 발현량이 대조군 벡터에 비해 약 6.3 배 정도 증가함을 알 수 있다.

다음으로, β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 β-gal 염색법을 이용하여 조사하였다. 먼저, 선별배지 (열처리된 FBS 10 %, 850 ㎍/ml G418 및 뉴클레오시드가 함유되어 있는 MEM-α 배지)를 이용하여 6-웰 플레이트에서 배양된 세포를 1X PBS로 2번 세척하고 0.25 % 트립신 용액을 이용하여 배양용기로부터 분리하였다. 분리된 세포를 선별배지를 처리하여 트립신을 불활성화시킨 다음 원심분리하여 트립신을 제거하였으며, 1X PBS로 2번 세척하였다. 세척 후, 분리된 세포에 2 % 포름 알데히드와 0.2 % 글루타르알데히드로 구성된 고정액 (fixing solution)을 4 ℃에서 10 분 동안 처리하여 세포를 고정시킨 다음, PBS를 이용하여 두 번 세척하였다. 다음으로, β-Gal 효소의 기질인 X-Gal을 처리함으로써 얻어지는 발색 산물인 ONPG에 의하여 세포를 염색하였다. 염색 결과 양성 세포는 푸른 색을 띤다.

도 11은 도 10에서 확보한 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 세포주를 ONPG 염색한 결과, β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 나타내는 도면이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 유전자의 전사종결 영역 즉, 폴리아데닐레이션 신호의 3′말단에 MAR 서열을 도입함으로써 β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율이 약 3.1 배 증가함을 알 수 있었다. 이는 폴리아데닐레이션 신호의 3' 말단에 도입된 MAR 서열이 상류에 위치한 유전자가 SV40 프로모터가 아닌 CMV 유래 프로모터를 사용한 경우에도 유전자의 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다.

도 12은 도 10에서 얻은 β-갈락토시다제 발현량을 β-갈락토시다제 발현 양성 세포를 기준으로 나타낸 도면이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 단위 양성 세포주 당 β-갈락토시다제 발현량은 인간 β-글로빈 MAR 서열을 유전자의 3′말단에 도입함으로써 대조군에 비하여 약 2.2 배 정도 증가함을 알 수 있었다.

4. pCMVMM-IgG 벡터가 도입되어 있고 dhfr 유전자에 대한 선별용 배지에서 성장한 세포주에서 IgG 발현량의 조사

다음으로, 각각 pCMV-IgG 벡터 및 pCMVMM-IgG 벡터를 CHO DG44 세포에 형질전환 후, 형질전환된 CHO DG44 세포를 dhfr 유전자를 포함한 세포주만 성장할 수 있는 선별용 배지 (열처리된 투석된 FBS 5%를 포함하는 SFM4CHO 배지 (Hyclone 사, 미국)에서 2주 동안 배양하였다. 다음으로, 이들 세포주를 MTX가 포함되어 있는 3종류의 선별배지를 이용하여 7x10⁵ 농도로 6-웰 플레이트에 접종하고 3일 동안 배양한 후, 배양액 중의 IgG의 발현량을 측정하였다. 선별용 배지는 각각 0 nM, 25 nM, 50 nM, 및 100 nM의 MTX가 포함되어 있는 것을 사용하였다.

도 15는 본 발명의 pCMVMM-IgG 발현벡터 및 대조군 벡터인 pCMV-IgG 발현벡터를 각각 CHO DG44 세포주에 형질전환시킨 다음, 형질전환된 세포주에 MTX를 첨가하여 유전자의 증폭을 유도한 후의 IgG의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다. 도 15에 나타난 바와 같이, 폴리아데닐레이션 신호의 3' 말단에 2 카피의 MAR 서열을 도입함으로써, IgG의 발현량이 증가하는 것을 알 수 있으며, 더욱이 MTX의 농도가 증가할수록 IgG의 발현량이 대조군 벡터인 pCMV-IgG 벡터에 비하여 증가되는 정도가 높아짐을 알 수 있다. MTX 100 nM을 처리한 경우, pCMV-IgG 벡터에 비하여 pCMVMM-IgG 벡터를 포함하는 세포에서 IgG 발현량이 약 6배 정도 높아짐을 알 수 있었다.

도 16은 도 15의 실험에서 확보된 배양액에서 IgG 발현량을 10⁶ 세포들이 24 시간 동안 생산하는 IgG의 발현량으로 환산하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, pCMVMM-IgG 벡터의 경우, 100 nM MTX를 처리하였을 경우, IgG 발현량은 대조군인 pCMV-IgG 벡터를 포함하는 세포주에 비하여 5 배 정도로 증가됨을 알 수 있다. 또한, 도 16에서 나타낸 바와 같이 MTX 농도가 증가할수 록 IgG의 발현량이 증가되는 정도가 더 높아짐을 알 수 있다. 이것은 유전자 증폭과정에서 pCMVMM-IgG 벡터를 포함하는 세포가 pCMV-IgG 벡터를 포함하는 세포에 비하여 더 효율적으로 IgG 유전자를 증폭하고 발현한다는 것을 암시하는 것이다.

이상과 같은 본 발명의 실시예의 결과로부터 인간 β-글로빈 MAR 서열을 유전자의 전사종결신호의 3′말단에 도입함으로써 SV40 프로모터 및 CMV 프로모터를 포함하는 프로모터 하의 상류의 유전자의 발현이 현저하게 증가되는 것이 밝혀졌다. 1 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열의 도입에 의하여 상류의 유전자의 발현이 현저하게 증가되었으며, 특히, 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열을 도입함으로써 1 카피의 도입에 의한 증가 효과를 한층 더 높일 수 있었다. 이러한 현상은 도입된 MAR 서열에 의하여 숙주 세포 내에 존재하는 인접 핵산 서열에 의한 발현 억제 작용 (positional effect)이 현저하게 감소된 결과 일어나는 현상인 것으로 여겨지나, 본 발명이 이러한 특정한 기작에 한정되는 것은 아니다.

도 1은 SV40 초기 프로모터 및 그에 작동가능하게 연결되어 있는 lacZ 유전자를 포함하는, 상업적으로 구입가능한 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국)를 나타내는 도면이다.

도 2는 1 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국)의 lacZ 전자 종결인자의 3′말단에 연결된 pSVM-β-gal 벡터를 나타내는 도면이다.

도 3은 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pSV-β-gal 벡터 (Promega 사, 미국)의 lacZ 전자 종결인자의 3′말단에 연속하여 연결된 pSVMM-β-gal 벡터를 나타내는 도면이다.

도 4는 임시적 (transient) 상태에서 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있는 CHO DG44에서 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 5는 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대한 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 6은 각각 pSV-β-gal 벡터, pSVM-β-gal 벡터 및 pSVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대하여 ONPG 염색한 결과, β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 나타내는 도면이다.

도 7은 도 6에서 얻은 β-갈락토시다제 발현량을 β-갈락토시다제 발현 양성 세포를 기준으로 나타낸 도면이다.

도 9는 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pCMV-β-gal 벡터의 lacZ 유전자의 하류에 위치하는 SV40 전사종결인자의 3' 말단에 연속하여 연결된 pCMVMM-β-gal 벡터를 나타내는 도면이다.

도 10은 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대한 β-갈락토시다제 효소 활성 분석 결과를 나타내는 도면이다.

도 11은 각각 pCMV-β-gal 벡터 및 pCMVMM-β-gal 벡터가 도입되어 있고 G418에 대하여 저항성을 갖는 CHO DG44 세포주에 대한 ONPG 염색한 결과, β-갈락토시다제 발현 양성 세포의 비율을 나타내는 도면이다.

도 12는 도 11에서 얻은 β-갈락토시다제 발현량을 β-갈락토시다제 발현 양성 세포를 기준으로 나타낸 도면이다.

도 13은 CMV 유래 프로모터 및 그에 작동가능하게 연결된 lacZ 유전자를 포함하는 pCMV-IgG 벡터를 나타내는 도면이다. pCMV-IgG 벡터는 선별용 유전자인 dhfr (dihydrofolate reductase) 유전자를 포함하고 있다.

도 14는 2 카피의 인간 β-글로빈 MAR 서열이 pCMV-IgG 벡터의 IgG 유전자의 전사 종결인자 (중쇄의 경우, BGH polyA; 경쇄의 경우, SV40 polyA)의 3′말단에 연속하여 연결된 pCMVMM-IgG 벡터를 나타내는 도면이다. pCMVMM-IgG 벡터는 선별용 유전자인 dhfr 유전자를 포함하고 있다.

도 15는 본 발명의 pCMVMM-IgG 발현벡터 및 대조군 벡터인 pCMV-IgG 발현벡터를 각각 CHO DG44 세포주에 형질전환시킨 다음, 형질전환된 세포주에 MTX를 첨가하여 유전자의 증폭을 유도한 후의 IgG의 발현량을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.

도 16은 도 15의 실험에서 확보된 배양액에서 IgG 발현량을 10⁶ 세포들이 24 시간 동안 생산하는 IgG의 발현량으로 환산하여 비교한 결과를 나타낸 도면이다.

<110> Celltrion, Inc. <120> Expression vector for animal cell comprising at least one copy of MAR DNA sequences at the 3 terminal of transcription termination region of a gene and method for the expression of foreign gene using the vector <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 9813 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide sequence of pSVM-beta-gal expression vector <400> 1 gcgcagcacc atggcctgaa ataacctctg aaagaggaac ttggttaggt accttctgag 60 gcggaaagaa ccagctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 120 cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 180 ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 240 tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 300 cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tcggcctctg 360 agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagcttg 420 ggatctctat aatctcgcgc aacctatttt cccctcgaac actttttaag ccgtagataa 480 acaggctggg acacttcaca tgagcgaaaa 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Claims

서로 작동가능하게 연결된 (i) SV40 초기 또는 CMV 프로모터, (ii) 클로닝 부위 또는 외래 산물을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, (iii) SV40 바이러스 전사종결인자, 및 (iv) 인간 베타 글로빈 유전자의 MAR (matrix attachment region) 서열을 포함하는 동물세포 발현 벡터에 있어서,

상기 MAR 서열이 전사종결인자의 3′말단에 연속된 2 카피의 MAR 서열 (여기서, 상기 2 카피의 MAR 서열은 1 카피의 5'-->3' 방향의 MAR 서열과 1 카피의 3'-->5' 방향의 MAR 서열에 해당하는 서열번호 2의 4161번 내지 10134번의 뉴클레오티드로 구성됨)로 연결되어 있고,

상기 동물세포 발현 벡터가 도 14의 벡터 지도를 갖는 pCMVMM-IgG로서 CHO, BHK, NSO 및 인간 세포로 구성된 군으로부터 선택된 동물세포에서 발현하는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 외래 산물이 단백질이고, 상기 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 LacZ, 면역글로불린, GCSF 또는 EPO를 코딩하는 것을 특징으로 하는 동물세포 발현 벡터.
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제1항 내지 제2항에 따른 동물세포 발현 벡터가 도입된 동물세포를 배양하는 단계를 포함하는, 외래 유전자를 발현시키는 방법.
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