KR20140015999A - 신규 ＭＡＲｓ 및 이를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 기질부착부위 (matrix attachment regions, MARs), 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 ＭＡＲｓ 및 이를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법{Novel MARs and Method for producing target protein using the same}

본 발명은 신규한 기질부착부위 (matrix attachment regions, MARs), 이를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 상기 형질전환체를 배양하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

포유동물의 염색체를 구성하고 있는 염색질 (chromatin)은 촘촘함의 정도에 따라 느슨한 진정염색질 (euchromatin)과 촘촘한 이질염색질 (heterochromatin)로 구별된다. 유전자의 발현이 일어나기 위해서는 촘촘한 구조의 DNA가 풀어져 RNA 중합효소 등의 단백질들이 발현 유전자에 결합할 수 있어야 하기 때문에 활발한 전사가 이루어지는 유전자들은 대부분 진정염색질 부분에 위치한다. 이에 반해, 이질염색질 부분은 탈아세틸화 (deacetylation)되어 단단히 꾸려진 염색질로, 보통 유전자를 암호화하지 않거나 엄격한 통제 하에 소량으로 발현이 조절된다 (Razin et al., 2007, J. Mol. Biol. 369: 597-607). 따라서, 외래 유전자를 세포에 도입시켜 발현시킬 경우, 외래 유전자의 염색체 내 삽입 위치가 진정염색질과 이질염색질 중 어디에 위치하는지에 따라 단백질 발현의 양과 지속성이 좌우된다.

외래 유전자의 발현이 동물세포 염색체의 어느 부분에 삽입되었는가에 따라 단백질의 발현량과 안정성이 좌우됨에 따라, 치료용 단백질의 과다 발현을 위해서는 각기 다른 위치에 치료용 단백질을 암호화하는 유전자가 삽입된 수많은 동물세포 클론을 확보한 후, 이들 중 항시 높은 발현이 일어나는 클론을 선별하여야 한다.

이러한 과정에서 요구되는 많은 노력을 절감하기 위한 방편으로, 외부 유전자를 발현시키는 벡터에 염색질 구조 (chromatin structure)를 풀어주는 별도의 DNA 인자를 포함하는 방법이 연구되고 있다. MAR (matrix attachment region) 서열도 이러한 염색질 구조에 영향을 주어 단백질 고발현을 유도할 수 있는 인자로 알려져 있으며, CHO (중국 햄스터 난소) 세포와 같은 생물공학 및 치료 응용에 관련된 세포에서 다양한 재조합 단백질의 생산을 증가시키기 위하여 사용되고 있다. MAR의 이러한 기능은 DNA의 메틸화를 저해함으로써 그 주위의 염색질 구조가 풀어진 상태를 유지하게 해주어 삽입된 DNA를 보호함으로써 위치 영향 (positional effect)으로부터 외래 DNA 삽입체를 절연시키기 때문인 것으로 알려져 있다. 따라서, 유전자의 발현을 향상시킬 수 있는 MAR 인자를 발굴한다면, 동물세포에서의 외래 단백질의 생산에 효율적으로 이용될 수 있을 것이다.

이러한 배경 하에서, 본 발병자들은 외래 단백질의 생산량을 증가시킬 수 있는 새로운 MAR 인자를 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 MAR 인자를 새로이 발굴하고, 상기 MAR 인자가 외래 단백질의 발현량을 향상시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단백질의 발현을 증가시키는 신규한 MAR (matrix attachment region) 인자를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 MAR 인자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 MAR 인자를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호로 표시되는 염기서열을 가지는, 단백질의 발현을 증가시키는 MAR (matrix attachment region) 인자를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, "MAR (matrix attachment region; 기질부착부위)"는 핵기질 (nuclear matrix)에 부착되어 있는 진핵생물 염색체의 DNA 서열을 의미하며, S/MAR (scaffold/matrix attachment region) 또는 SAR (scaffold attachment region)로도 불린다.

본 발명에서 사용된 용어, "단백질의 발현을 증가시키는"은 본 발명의 MAR 인자에 의해 영향 받는 목적 유전자의 단백질의 발현을 용이하게 하며, 이에 의하여 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 활성을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "목적 유전자"는 발현율의 증대를 바라는 단백질을 코딩하는 핵산분자를 의미하며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 목적 유전자라면 제한 없이 사용될 수 있다. 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질의 예로는 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터 및 리셉터의 단편, 항체 및 항체 단편, 단선 항체, 구조 단백질 및 독소 단백질 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용할 수 있는 목적 유전자의 예가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 목적상 상기 MAR 인자의 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입, 또는 이들의 조합에 의해 변이되더라도, 단백질의 생산을 증가시키는 활성을 보유하는 한, 본 발명의 범주에 속하는 것은 당업자에게 자명하다. 따라서, 본 발명의 MAR 인자는 목적 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 증대시킬 수 있는 서열이라면, 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호로 표시되는 염기서열과 상동성을 갖는 서열을 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 바람직하게는 80%, 보다 더 바람직하게는 90%, 보다 더욱 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 "상동성"이란 두 핵산 염기 서열 간의 동일성을 나타내는 것으로, 점수 (score), 동일성 (identity), 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)들을 계산하는 BLAST 2.0을 이용하는 등 당업자에게 널러 알려진 방법으로 결정될 수 있다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 MAR 인자는 생쥐의 게놈 (genome)으로부터 분리 및 정제된 핵산 서열일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 동물세포에서 외래단백질의 발현량을 향상시키기 위한 신규의 MAR 인자 서열을 발굴하기 위하여 GFP를 발현하는 레트로바이러스를 이용하였다. 구체적으로, NIH3T3 세포를 GFP를 발현하는 레트로바이러스로 감염시킨 후, GFP를 1 카피 포함하는 세포 중에서 GFP를 고발현하는 세포를 확보한 다음, 레트로바이러스 유전자 삽입 주위의 서열을 클로닝 한 후 서열 분석을 수행하였다. 이후, 결정된 서열을 토대로 블라tm트 검색을 통하여 생쥐 게놈 상의 정확한 삽입위치와 그 일대의 서열 100 kb을 확보한 다음, MAR 파인더를 사용하여 상기 서열에서 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 신규의 MAR 인자를 새로이 발굴하였다 (실시예 1 내지 5 참조).

또한, 상기 MAR 인자의 단백질 발현 증가 활성을 확인한 결과, MAR 인자를 포함하는 벡터로 형질전환된 CHO-K1 세포에서의 단백질 생산량이 MAR 인자를 포함하지 않는 벡터로 형질전환된 CHO-K1 세포에서의 단백질 생산량보다 현저히 높음을 확인함으로써, 단백질의 발현을 증가시키는 상기 MAR 인자의 효과를 확인하였다 (실시예 6 및 도 9 참조).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 MAR 인자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 재조합 벡터는 동물세포 발현벡터일 수 있으며, 당업계에 공지된 동물세포 발현벡터이면 제한 없이 포함된다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 MAR 인자를 필수적으로 포함하고, 당업계에서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "프로모터"란 폴리머라제 (polymerase)에 대한 결합 부위를 포함하고 하위 (downstream)에 위치한 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는 비해독 핵산서열을 의미한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 프로모터는 당업계에서 사용되는 어떠한 프로모터라도 가능하며, 예를 들어 CMV 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터 및 TK 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 그 제한을 두는 것이 아니다. 본 발명의 일실시예에서는 CMV (Cytomegalovirus) 프로모터를 사용하였다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 본 발명의 MAR인자를 필수적으로 포함하고, 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터를 추가적으로 포함할 수 있다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드와 프로모터는 작동가능하게 연결될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 MAR 인자, CMV 프로모터 및 항체 단백질인 아달리무맙 (휴미라)의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 재조합 벡터 (pCAhLHIP-Kx/Ky)가 제공되며, 이는 도 8의 개열지도를 갖는다.

본 발명에서 사용된 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 프로모터의 핵산분자 서열 및 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산분자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 이때, 본 발명의 MAR 인자 역시 상기 목적 단백질을 코딩하는 핵산분자 서열 및 프로모터의 서열과 작동가능하게 연결될 수 있다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 벡터는 2개의 MAR 인자를 포함할 수 있으며, 상기 MAR 인자는 각각 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 상위 (upstream) 및 3' 하위 (downstream)에 위치할 수 있다. 상기 2개의 MAR 인자는 서열번호 2로 기재되는 MAR 인자 2개, 서열번호 4 및 5로 기재되는 MAR 인자 2개, 서열번호 6 및 7로 기재되는 MAR 인자 2개, 및 서열번호 13으로 기재되는 MAR 인자 2개로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기한 조합으로 2개의 MAR 인자를 포함하는 재조합 벡터로서 pCAhLHIP-K2/K2, pCAhLHIP-K5/K4, pCAhLHIP-K7/K6 및 pCAhLHIP-K13/K13을 제조하였다.

또한, 본 발명의 재조합 벡터는 선별 마커 (selection marker)를 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 사용된, 용어 "형질전환"이란 MAR 인자와 유전자를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 유전자를 발현시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다.

형질전환 방법은 임의의 형질전환 방법이 사용될 수 있으며, 당업계의 통상적인 방법에 따라 용이하게 수행할 수 있다. 형질전환을 위한 방법으로 CaCl₂ 침전법, CaCl₂ 방법에 DMSO (dimethyl sulfoxide)라는 환원물질을 사용함으로써 효율을 높인 Hanahan 방법, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 침전법, 원형질 융합법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반법, 아그로박테리아 매개된 형질전환법, PEG를 이용한 형질전환법 및 리포펙타민을 이용한 방법 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 형질전환 방법이 제한 없이 사용될 수 있다.

상기 숙주세포는 진핵세포일 수 있으며, 바람직하게는 동물세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 포유동물 세포주일 수 있다. 상기 포유동물 세포주는 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양에서 성장한 서브클론된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol 36, 59 (1977)), 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA), 인간 폐 세포 (W138), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065)와 같은 인간 세포; 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 중국 햄스터 난소 세포 (CHO), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod 23, 243-251 (1980)), 마우스 유방 세포 (MMT 060562, ATCC CCL51)와 같은 설치류 세포; SV4O에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7), 원숭이 신장 세포 (CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76), 개 신장 세포 (MDCK), 물소 래트 간세포 (BRL 3A)와 같은 다른 포유동물의 세포; 및 마이엘로마 (예: NS0)/하이브리도마 세포를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 숙주세포는 CHO 세포일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 본 발명에 따른 재조합 벡터 pCAhLHIP-K2/K2, pCAhLHIP-K5/K4, pCAhLHIP-K7/K6 및 pCAhLHIP-K13/K13이 각각 CHO 세포주에 형질전환하여 형질전환체 pCAhLHIP-K2, pCAhLHIP-K5/k4, pCAhLHIP-K7/K6 및 pCAhLHIP/K13을 제조하였고, 이들을 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 각각 기탁번호 KCTC 12165BP, KCTC 12166BP, KCTC 12167BP 및 KCTC 12168BP로 기탁하였다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 MAR 인자를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법은

(a) 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계; 및

(b) 상기 배양과정에서 수득된 배양물 또는 동물세포로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, "목적 단백질"은 형질전환된 세포에서 생산하고자 하는 수개의 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 의미한다.

상기 목적 단백질은 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편, 항체, 항체 단편, 단선 항체, 구조 단백질 및 독소 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 목적 단백질의 예가 제한되는 것은 아니다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 항체는 TNFα (tumour necrosis factor alpha)에 결합하는 활성을 갖는 항체일 수 있으며, 이러한 항체의 예로는 아달리무맙 (Adalimumab, Humira), 인플릭시맙 (Infliximab, Remocade), 골리무맙 (Golimumab, CNTO 148) 등이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동물세포를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 것은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.

바람직한 하나의 구현예에 따르면, 본 발명에서 회수되는 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여, 상기 재조합 벡터는 단백질 정제용 태그 서열을 추가적으로 포함할 수 있다. 이러한 단백질 정제용 태그 서열은 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있으나, 상기 예들에 의하여 목적 단백질의 정제를 위하여 필요한 서열의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 목적 단백질은 예를 들어 면역친화 (immunoaffinity) 또는 이온-교환 컬럼 상에서의 분획 (fractionation), 침전, 역상 HPLC, 크로마토그래피, SDS-PAGE, 젤 여과와 같은 통상적인 분리 기술을 이용하여 배양과정에서 수득된 배양물 또는 동물세포로부터 회수될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 도 8의 개열지도를 갖는 본 발명의 MAR 인자, CMV 프로모터 및 아달리무맙 (휴미라)의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 CHO-K1 세포의 항체 생산능을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 MAR 인자를 포함하는 CHO-K1 세포에서의 항체 생산능이 MAR 인자를 갖지 않는 CHO-K1 세포에서의 항체 생산능 보다 약 2.4배 내지 6.3배 높았음을 확인할 수 있었다 (도 9 참조).

본 발명의 신규한 MAR 인자는 숙주세포의 단백질 생산량을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 동물세포에서 외래 단백질을 안정적으로 고수율로 생산하기 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 실시에 1에 개시된 pLNCG 벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 2는 실시예 4에 개시된 경쇄 발현벡터 pCALSN의 제조과정을 나타낸다.
도 3은 실시예 4에 개시된 아달리무맙의 경쇄 유전자를 포함하는 pCAhLSN 벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 4는 실시예 4에 개시된 중쇄 발현벡터 pCAHIG의 제조과정을 나타낸다.
도 5는 실시예 4에 개시된 아달리무맙의 중쇄 유전자를 포함하는 pCAhHIG 벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 6은 실시예 4에 개시된 아달리무맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 pCAhLHIG 벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 7은 실시예 4에 개시된 pCAhLHIP 벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 8은 실시예 5에 개시된 pCAhLHIP-Kx/Ky 항체 발현벡터의 제조과정 및 이의 구성요소를 나타낸다.
도 9는 신규 MAR 인자의 단백질 발현량 향상 효과를 보인 그래프이다. 도 9의 pCAhLHIP는 신규 MAR 인자를 포함하지 않는 벡터로 형질전환된 CHO-K1 세포주 풀의 항체 생산량을 나타내며, pCAhLHIP-Kx/Ky는 본 발명의 신규 MAR 인자를 포함하는 벡터로 형질전환된 CHO-K1 세포주 풀의 항체 생산량을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> pLNCG 벡터의 제조

pAcGFP1-N2 벡터 (clonetech)를 제한효소 BamHI과 NotI으로 잘라 GFP 유전자 절편을 회수하였다. pLNCX2 벡터 (clonetech)를 제한효소 BglII와 NotI으로 절단한 후 그 자리에 앞에서 얻은 GFP 유전자 절편을 삽입하여 연결함으로써 GFP 유전자를 전달할 수 있는 레트로바이러스 벡터인 pLNCG 벡터를 제작하였다 (도 1).

< 실시예 2> 레트로바이러스의 제조 및 GFP 고발현 생쥐 세포의 선별

pLNCG 벡터 10 μg, 레트로바이러스 패키징 키트 앰포 (Takara, CAR. #6161)의 pGP 벡터와 pE-ampho 벡터 각각 5 μg 및 2 M CaCl₂ 62 ㎕를 섞고 증류수를 추가하여 500 ㎕가 되도록 한 후, 형질감염 완충액 500 ㎕를 섞어준 다음 20분간 방치한 후 293 세포에 뿌려주어 형질감염을 수행하였다. 12시간 후에 10% FBS가 첨가된 새로운 DMEM 배지로 갈아준 후 48시간을 더 배양한 후 레트로바이러스를 회수하였다. 배양액을 채취하여 0.45 μm 필터를 통과시켜 레트로바이러스를 준비하였다.

NIH3T3 세포를 레트로바이러스로 감염시키기 위하여 레트로바이러스를 감염시키기 전날 100 mm 배양 접시에 2×10⁶ 개의 세포를 준비하였다. NIH3T3 세포의 배지를 제거한 후 새로운 배지 3 ㎖와 레트로바이러스 채취액 2 ㎖를 섞은 후 ㅍ포폴리브렌 (brene)을 8 μg/㎖로 첨가한 후 NIH3T3 세포에 뿌려주고 24시간 동안 배양하였다. 레트로바이러스에 감염시킨 NIH3T3 세포의 배지를 새로운 배지로 교환해 준 후 퓨로마이신 (puromycin)을 10 μg/㎖로 3주간 처리하여 비-감염세포를 제거하였다. 비-감염세포가 제거된 레트로바이러스 감염 NIH3T3 세포들은 FACSAria를 사용하여 세 차례에 걸쳐 상위 5%의 GFP 발현을 보이는 세포를 분리하였다.

분리된 GFP 고발현 세포들을 한계희석 (limiting dilution)을 통하여 클론 (clone)을 만들어 세포를 증식시킨 후 FACS 분석을 통하여 GFP 고발현 클론을 선별하였다. 이후, QIAamp 키트 (QIAGEN)를 사용하여 선별된 GFP 고발현 클론으로부터 genomic DNA를 분리하였다. 실시간 PCR에 의하여 게놈 DNA상의 GFP 카피수 분석을 수행하였다. 실시간 PCR은 SYBR green DNA 키트 (Roche)를 사용하여 제시된 방법에 따라 수행하였으며, 시료는 각 게놈 DNA를 10 ng/㎖의 농도로 제조한 시료를 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분간 반응한 후 95℃ 10초, 59℃ 10초, 72℃ 15초로 이루어진 45 순환을 반복하였으며, 매 순환 종료시마다 한 번씩 형광을 감지하였다. PCR 순환 종료 후 온도를 65℃까지 낮춘 후 초당 0.1℃씩 천천히 상승시키며 계속적으로 형광을 측정하는 융해온도 분석을 수행하여 비특이적 증폭 여부를 확인하였다. 이때, 표준폼으로는 pLNCG 벡터를 사용하였다. 사용된 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

이름	서열	서열번호
GFP F	TCCTGGGCAATAAGATGGAG	14
GFP R	TGGGGGTATTCTGCTGGTAG	15

NIH3T3 세포 한 개가 갖는 게놈 DNA의 양은 약 6.2 pg으로 알려져 있으므로, 실시간 PCR을 통하여 얻은 총 GFP 카피수를 50 ng의 DNA에 해당하는 세포수인 8045으로 나누어 세포 하나당 GFP 유전자의 카피수를 계산하여, 세포당 한 개의 GFP 유전자를 갖는 클론들을 선별하였다.

< 실시예 3> 신규 MAR 인자의 클로닝

상기 실시예 2에서 얻은 클론들의 레트로바이러스 게놈 삽입 위치를 결정하기 위하여, GFP 서열 부분을 바탕으로 특이적 프라이머 (specific primer; SP)를 제작하여 TAIL (THERMAL ASYMMETRIC INTERLACED PCR) PCR을 수행하였다. TAIL PCR에 사용된 SP 프라이머 및 AD (Arbitrary degenerate) 프라이머의 서열을 하기 표 2에 나타내었다.

종류	이름	서열	서열번호
SP primer	SP1	ATGGATGAGCTGTACAAGTGAGCG	16
	SP2	ATGATCTACTTCGGCTTCGTGACC	17
	SP3	ATAACCACTACCTGTCCACCCAGA	18
AD primer	AD1	TGWGNAGWANCASAGA	19
	AD2	AGWGNAGWANCAWAGG	20
	AD3	CAWCGNCNGANARGAA	21
	AD4	TCSTNCGNACNTWGGA	22
	AD5	NTCGASTWTSGWGTT	23
	AD6	NTGCGASWGANAWGAA	24
	AD7	STTGNTASTNCTNTGC	25
	AD8	WGTGNAGWANCANAGA	26
	AD9	AAWGNCCWGTANATSAC	27
	AD10	TASCNTTWAGNCATWG	28

PCR 반응은 GeneAmp^ⓡ PCR 시스템 9700 (Applied Biosystems)을 사용하였다. 1차 PCR 반응은 10 μM SP3 프라이머 0.3 ㎕, 50 μM AD 프라이머 0.8 ㎕, 25 ng/㎖ 게놈 DNA 2 ㎕, 삼차증류수 6.9 ㎕, Extaq premix (Takara) 10 ㎕를 넣고, 92℃ 3분, 95℃ 1분의 제1사이클 1회; 94℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 2분의 제2사이클 5회 반복; 94℃ 30초, 25℃ 2분, 72℃까지 ramping (10%), 72℃ 2분의 제3사이클 1회; 94℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 2분, 94℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 2분 94℃ 30초, 44℃ 1분, 72℃ 2분으로 이루어진 제4사이클 15회 반복을 수행하고, 72℃에서 5분간 더 반응시킨 후 4℃로 온도를 낮추었다. 2차 PCR 반응은 1차 PCR 반응의 산물을 1/40로 희석한 후 이를 주형 (1 ㎕)으로 사용하였으며, 10 μM SP2 프라이머 0.4 ㎕, 50 μM의 AD 프라이머 0.8 ㎕, 3차 증류수 7.8 ㎕ 및 Extaq premix (Takara) 10 ㎕를 넣고, 94℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 2분, 94℃ 30초, 65℃ 1분, 72℃ 2분, 94℃ 30초, 45℃ 1분, 72℃ 2분으로 이루어진 사이클을 12회 반복한 후, 72℃에서 5분간 더 반응하게 한 다음 4℃로 온도를 낮추었다. 3차 PCR 반응은 2차 PCR 반응의 산물 0.5 ul를 주형으로서 사용하고, 10 μM SP1 프라이머 1 ㎕, 50 μM AD 프라이머 2 ㎕, 삼차증류수 21.5 ㎕ 및 Extaq premix (Takara) 25 ㎕를 넣어 반응액을 만들고, 이를 94℃ 30초, 45℃ 1분, 72℃ 2분으로 이루어진 사이클을 20회 반복한 후 72℃에서 5분간 더 반응하게 한 다음 4℃로 온도를 낮추었다.

GFP 유전자 바로 다음에 600 bp의 3' LTR과 100 bp의 스페이서 (spacer)가 존재하고, PCR 산물의 크기가 700 bp 이상인 경우만이 인접부위 (flanking region)를 포함하므로 아가로스 겔에서 700 bp 이상의 밴드를 도려내고, Gel 추출 키트 (QIAGEN, Cat.28706)를 이용하여 PCR 산물을 정제하였다. 염기서열 분석을 용이하게 하기 위해 상기 PCR 산물들을 pGEM-T easy vector (Promega)에 클로닝하였다. T 벡터에 존재하는 T7 및 SP6 스퀀싱 프라이머를 이용하여 인접부위의 염기서열을 분석하였다.

각 염기서열 분석 결과를 바탕으로, BLASTn을 통해 마우스 (Mus musculus) 염색체상의 레트로바이러스 삽입 위치를 파악하고, 이를 중심으로 주변 100 kb의 게놈 DNA 서열을 확보하였다. 이후, MAR 파인더 (http://genomecluster.secs.oakland.edu/MarWiz/) 프로그램을 사용하여 상기 확보한 게놈 DNA 서열에서 MAR로 예측되는 인자 13개를 발굴하였다. 상기 MAR 인자는 각각 서열번호 1 내지 13으로 표시되는 염기서열을 가지며, 이들 각각을 K1 ~ K13으로 명명하였다. 발굴된 신규 MAR 서열을 포함하는 BAC 클론을 Invitrogen사로부터 구입하고, 이를 주형으로 PCR을 수행하여 MAR DNA를 클로닝하였다. 사용된 BAC 클론 및 프라이머를 하기 표 3에 나타내었다.

BAC clone	MAR 이름	Primer 이름	서열	서열번호
RP23-97	K1	97f4	GGGGACGCGTCCTCTGAGGTGTTCCTCAGTCCTAGGCTC	29
		97r4	GGGGACGCGTTAATGCGGCCGGTCTGCG	30
RP23-151	K2	151f	GGGGACGCGTCCTCTGGTATGTTACCACAAAGAGATG	31
		151r	GGGGACGCGTCACCGAGTGCTTACTCCCATCAG	32
RP23-266	K3	266af	GGGGACGCGTGATCCCCTGAGCTGGTATGA	33
		266ar	GGGGACGCGTGGGAAGGGAGAGAGATGACC	34
RP23-381	K4	381bf5	GGGGACGCGTGACTCTAGGCGCACACTTCC	35
		381br5	GGGGACGCGTGAGGCAACCAGTTCTTCAGC	36
	K5	381c2f1	GGGGACGCGTCAGAGCCGCACAAAGTAACA	37
		381c2r1	GGGGACGCGTGGCGCGCCAAAGGATTCCCCAGCACTCT	38
RP23-434	K6	434af3	GGGGACGCGTAAGCTTGACGCAAAAAGGAA	39
		434ar3	GGGGACGCGTTAGACTGCTGCTGCCTGAGA	40
	K7	434bf	GGGGACGCGTGTTAGAACAGTAGTGGCCTTGTTGGAG	41
		434br	GGGGACGCGTGCTGGTTGAAAGATGGGGTCAC	42
RP23-323M12	K8	2C37(A)#1 for	GAAACGCGTGTGAGTACACCGTAGCTGTCTTCAGACACACC	43
		2C37(A)#1 rev	GAAACGCGTCTGCTGTGAACAGACACCATGATCAAGGCAAC	44
	K9	2C37(A)#2 for	GAAACGCGTGTTCCAAGACAGGGTTTCTCTGTATAGCCCTGG	45
		2C37(A)#2 rev	GAAACGCGTGACCCAAAGAGTTGGTGGTGTACCTGTGAATCC	46
RP23-42F13	K10	2C11(B)#1 for	GAAACGCGTCGTGTCACAAGCTCTCAGGACAAATCCTAGC	47
		2C11(B)#1 rev	GAAACGCGTCCGAGAATCTGACATGCTTGCTGAAGGGAGAC	48
	K11	2C11(B)#2 for	GAAACGCGTCACCATGTTGGTGTTGATGGCAAGTGACTAGAGC	49
		2C11(B #2 rev	GAAACGCGTAGAAGGTAACAGGTATGGTGCTCGGGTACCA	50
	K12	2C11(B)#3 for	GAAACGCGTCCGCCTGAACATTCTTTCCTGCTCGCACTTGAA	51
		2C11(B)#3 rev	GAAACGCGTAAGACAGGAGTACCCGGAAGTGCTGTGGACGTTG	52
RP23-465H5	K13	3E52(C) for	GAAACGCGTGCTTAATAGGGTAGGCTAATGCCCAGGCATC	53
		3E52(C)-2 rev	GAAACGCGTCCAATTCCGAGGTCACTTTCTCAGCTTGTAG	54

< 실시예 4> 아달리무맙의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 pCAhLHIP 벡터의 클로닝

경쇄 발현벡터를 제작하기 위하여 pCALSN 벡터 (대한민국 특허출원 제10-2012-0057027호)를 NheI과 NotI으로 잘라 트라스투주맙 (trastuzumab) 경쇄 유전자를 제거한 후, 그 자리에 NheI과 NotI으로 자른 아달리무맙 (adalimumab)의 경쇄 유전자를 삽입하여 pChLSN 벡터를 제조하였다. 이때, 경쇄 발현벡터 pCALSN는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 경쇄 유전자-폴리A 절편을 포함하는 벡터로, 도 2에 개시된 바와 같이 제조하였다.

AI 인트론을 삽입하기 위하여 pChLSN 벡터를 NdeI (CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI (CMV 프로모터와 아달리무맙 경쇄 유전자 사이에 위치)으로 자르고, pCALSN을 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 절편을 NdeI과 XbaI으로 잘라 삽입하여 pCAhLSN을 제작하였다 (도 3). CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 절편을 얻는데 사용된 프라어머 서열을 하기 표 4에 나타내었다.

이름	서열	서열번호
CAF	ACATGTGGCGCGCCGCGGCGACGCGTTGAC	55
CAR	GGATCCTCTAGAAGGTCACCTGGAAGTGAG	56

pCAHIG (대한민국 특허출원 제10-2012-0057027호)의 트라스투주맙 중쇄 유전자를 NheI과 NotI으로 잘라내고, 여기에 NheI과 NotI으로 자른 아달리무맙의 중쇄 유전자를 삽입하여 pChHIG를 제작하였다. 이때, 중쇄 발현벡터 pCAHIG는 CMV 프로모터-AI 인트론-트라스트주맙 중쇄 유전자-IRES-GS-폴리A 절편을 포함하는 벡터로, 도 4에 개시된 바와 같이 제조하였다.

AI 인트론을 삽입하기 위하여 pChHIG 벡터를 NdeI (CMV 프로모터 내에 위치)과 NheI (CMV 프로모터와 아달리무맙 중쇄 유전자 사이에 위치)으로 자르고, pCALSN을 주형으로 PCR을 수행하여 얻은 CMV 프로모터 일부를 포함하는 AI 절편을 NdeI과 XbaI으로 잘라 삽입하여 pCAhHIG를 제작하였다 (도 5).

pCAhLSN으로부터 PCR을 통하여 CMV-AI-L-polyA 단편을 얻은 후, 이를 SacII와 MluI으로 잘라 pCA201HIG를 SacII와 MluI으로 자른 위치에 삽입하여 pCAhLHIG를 제작하였다 (도 6). PCR 반응은 CMV_Ac와 AflII_Ac 프라이머를 사용하여 94℃에서 5분간 반응한 후 94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분 30초로 이루어진 순환을 30회 반복한 후 72℃에서 7분간 추가 반응을 수행하였다. 사용된 프라이머 서열을 하기 표 5에 나타내었다.

이름	서열	서열번호
CMV_Ac	ACATGTCCGCGGACTGGCGCGCCCGCCATGCATTAGTTATTAA	57
AflII_Ac	GGATCCACGCGTCGCCTTAAGATACATTGATG	58

pCAhLHIG 벡터를 MluI으로 자른 후 클레노우 필-인 (klenow fill-in)을 수행하여 다시 접합함으로써 벡터 내의 MluI 제한효소 위치를 제거하여 pCAhLHIH-MK 벡터를 제조하였다 (도 7).

pCAhLHIH-MK를 주형으로 표 6의 프라이머를 사용한 PCR 반응을 통하여 BGH poly부터 플라스미드 백본을 포함하는 조각 EcoRV-205MK-SfiⅠ을 제조하여 PCR 클로닝 벡터인 TOPcloner Blunt V2 (Enzynomics)에 삽입하였다.

이름	서열	서열번호
EcoRV for 5mkip-F	ATCGCGTAAATTGTAAGCGTT	59
SfiⅠ for 5mkip-R	CTCAGAGGCCGAGGCGGCCT	60

pTop blunt 벡터에 삽입되어 있는 EcoRV-205MK-SfiⅠDNA에 각각 제한효소 EcoRV와 SfiⅠ으로 절단하여 얻은 DNA 절편을 앞서 MluⅠ이 제거된 pCAhLHIH-MK 벡터를 EcoRV와 SfiI으로 절단한 위치에 삽입하여 pCAhLHIG(-) 벡터를 제조하였다. pyrobest (TAKARA)를 사용하여 PCR을 통하여 pCAhLHIG(-)에 삽입할 Puromycin-polyA DNA 절편 부분을 획득하였다. PCR 반응에 사용된 프라이머 서열을 하기 표 7에 나타내었다.

이름	서열	서열번호
SalⅠ puro-F	AAAAGTCGACATGACCGAGTACAAGCC	61
B-MluINruI-puropA r	ATCACGCGTTCGCGAGATCCCCCTCCAGCTCA	62

pCAhLHIG(-) 벡터는 제한효소 EcoRV와 SalⅠ으로 절단하고, PCR 산물인 SalⅠ-puro-AflⅡ의 한쪽 끝만 SalⅠ으로 절단한 후 삽입하여 pCAhLHIP 벡터를 제조하였다. pCA205LHIP 벡터는 신규 MAR 인자를 클로닝하여 삽입할 수 있도록 경쇄 유전자의 전사를 유도하는 첫째 CMV 프로모터 바로 앞에 AscI 제한효소 자리를 가지며, 중쇄 유전자와 IRES로 이어진 퓨로마이신 유전자 뒤의 polyA 위치 뒤에 MluI 제한효소 위치를 갖는다 (도 7).

< 실시예 5> 신규 MAR 인자를 포함하는 벡터의 제조

새로이 발굴한 MAR 인자들의 효과를 확인하기 위한 벡터를 제조하고자 하였다. 이를 위하여 발현하고자 하는 유전자의 앞과 뒤에, 신규 MAR 인자를 K2/K2, K5/K4, K7/K6 및 K13/K13으로 조합하여 각각 항체 발현벡터에 삽입하였다. 이때, 유전자 앞에 삽입하는 MAR 인자는 역방향으로 삽입하였다. pCAhLHIP 벡터를 MluI으로 자르고, 여기에 클로닝된 신규 MAR 인자 K2, K4, K6 및 K13을 각각 MluI으로 자른 후 삽입하여 pCAhLHIP-/Ky (Ky: 유전자 뒤에 삽입된 MAR 인자, y는 MAR 인자의 번호 2, 4, 6 또는 13을 나타낸다)을 제조하였다.

경쇄 유전자의 전사를 유도하는 프로모터 앞에 신규 MAR를 삽입하기 위하여 pCAhLHIP-/Ky를 AscI으로 절단하고, 여기에 신규 MAR K2, K5, K7, K13을 MluI으로 자른 후 삽입하여, 발현 유전자 앞뒤에 신규 MAR를 포함하는 pCAhLHIP-Kx/Ky (Kx: 유전자 앞에 삽입된 MAR 인자, x는 MAR 인자의 번호를 나타낸다) 항체 발현벡터를 제조하였다 (도 8).

이로부터 제조된 항체 발현벡터는 2개의 MAR 인자 K2를 포함하는 pCAhLHIP-K2/K2, MAR 인자 K5 및 K4를 포함하는 pCAhLHIP-K5/K4, MAR 인자 K7 및 K6을 포함하는 pCAhLHIP-K7/K6, 및 2개의 MAR 인자 K13을 포함하는 pCAhLHIP-K13/K13이다.

< 실시예 6> 신규 MAR 인자의 단백질 발현량 증가 활성 확인

신규 MAR 인자를 포함하는 벡터의 발현량 향상 효과를 확인하기 위하여, 100 mm 배양 접시에 CHO-K1 세포 2×10⁶ 세포를 10 ㎖의 배지에 넣고, DNA 24 μg과 리포펙타민 (Invitrogen) 60 ㎕를 사용하여 형질전환하였다. MAR를 포함하지 않는 벡터 pCAhLHIP 벡터와 신규 MAR를 포함하는 벡터인 pCAhLHIP-Kx/Ky, 즉 pCAhLHIP-K2, pCAhLHIP-K5/K4, pCAhLHIP-K7/K6, 및 pCAhLHIP-K13/K13을 각각 CHO-K1 세포주에 형질전환하고, 24시간 후 퓨로마이신을 10 μg/㎖의 농도로 처리한 후 세포 생장이 정상적으로 회복될 때까지 생장의 추이를 관찰하였다. 약 2주간의 선별기간을 거쳐 세포의 생장이 이루어지게 된 세포주 풀 (pool)의 발현량을 측정하여 벡터간의 발현량을 비교하였다. 발현량의 측정은 Anti-Fc를 사용한 ELISA 방법을 사용하였으며, PCD (Picograms/cell/day)로 계산하여 세포당 발현량을 구한 후 이들 값의 상대적인 발현량을 비교하고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 신규 MAR를 갖는 벡터로 형질전환된 세포주 풀이 MAR를 갖지 않는 벡터로 형질전환된 세포주 풀보다 약 2.4배 내지 6.3배 높은 생산성으로 항체를 생산하였음을 확인하였다 (도 9). 이러한 결과는 동물세포에서 외래 단백질을 고수율로 생산하기 위하여 본 발명의 신규 MAR 인자를 유용하게 사용할 수 있음을 나타낸다.

본 발명에 따른 항체 발현벡터 pCAhLHIP-K2/K2, pCAhLHIP-K5/K4, pCAhLHIP-K7/K6, 및 pCAhLHIP-K13/K13이 각각 형질전환된 CHO 세포주를 pCAhLHIP-K2, pCAhLHIP-K5/k4, pCAhLHIP-K7/K6 및 pCAhLHIP/K13으로 명명하였고, 이들은 2012년 3월 19일자로 한국생명공학연구원 생명자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 각각 기탁번호 KCTC 12165BP, KCTC 12166BP, KCTC 12167BP 및 KCTC 12168BP로 기탁되었다.

한국생명공학연구원 KCTC12165BP 20120319 한국생명공학연구원 KCTC12166BP 20120319 한국생명공학연구원 KCTC12167BP 20120319 한국생명공학연구원 KCTC12168BP 20120319

<110> HANWHA CHEMICAL CORPORATION <120> Novel MARs and Method for producing target protein using the same <130> PA110953/KR <160> 62 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3158 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAR (K1) <400> 1 taatgcggcc ggtctgcgct tcctttgtcc cctgagcttg ggcgcgcgcc ccctggcggc 60 tcgagcccgc ggcttgccgg aagtgggcag ggcggcagcg gctgctcttg gcggccccga 120 ggtgactata gccttctttt gtgtcttgat agttcgccat ggatgacgat atcgctgcgc 180 tggtcgtcga caacggctcc ggcatgtgca aagccggctt cgcgggcgac gatgctcccc 240 gggctgtatt cccctccatc gtgggccgcc ctaggcacca ggtaagtgac ctgttacttt 300 gggagtggca agcctggggt tttcttgggg atcgatgccg gtgctaagaa ggctgttccc 360 ttccacaggg tgtgatggtg ggaatgggtc agaaggactc ctatgtgggt gacgaggccc 420 agagcaagag aggtatcctg accctgaagt accccattga acatggcatt gttaccaact 480 gggacgacat ggagaagatc tggcaccaca ccttctacaa tgagctgcgt gtggcccctg 540 aggagcaccc tgtgctgctc accgaggccc ccctgaaccc taaggccaac cgtgaaaaga 600 tgacccaggt cagtatcccg ggtaaccctt ctctttggcc agcttctcag ccacgccctt 660 tctcaattgt ctttcttctg ccgttctccc ataggactcc cttctatgag ctgagtctcc 720 cttggatctt tgcagtttct gctctttccc agacgaggtc tttttttctc tcaattgcct 780 ttctgactag gtgtttaaac cctacagtgc tgtgggttta ggtactaaca atggctcgtg 840 tgacaaagct aatgaggctg gtgataagtg gccttggagt gtgtattgag tagatgcaca 900 gtaggtctaa gtggagcccc tgtcctgaga ctcccagcac actgaactta gctgtgttct 960 tgcactcctt gcatgtctca gatctatcca tacagtttca cctgccctga gtgtttcttg 1020 tggctttctg aacttgacaa cattatttat ttttctctac agatcatgtt tgagaccttc 1080 aacaccccag ccatgtacgt agccatccag gctgtgctgt ccctgtatgc ctctggtcgt 1140 accacaggca ttgtgatgga ctccggagac ggggtcaccc acactgtgcc catctacgag 1200 ggctatgctc tccctcacgc catcctgcgt ctggacctgg ctggccggga cctgacagac 1260 tacctcatga agatcctgac cgagcgtggc tacagcttca ccaccacagc tgagagggaa 1320 atcgtgcgtg acatcaaaga gaagctgtgc tatgttgctc tagacttcga gcaggagatg 1380 gccactgccg catcctcttc ctccctggag aagagctatg agctgcctga cggccaggtc 1440 atcactattg gcaacgagcg gttccgatgc cctgaggctc ttttccagcc ttccttcttg 1500 ggtaagttgt agcctagtcc tttctccatc taaaggtgac aaaactcctg aggccatagt 1560 acaagttaag tctgatttct gtcactcttc tcttaggtat ggaatcctgt ggcatccatg 1620 aaactacatt caattccatc atgaagtgtg acgttgacat ccgtaaagac ctctatgcca 1680 acacagtgct gtctggtggt accaccatgt acccaggcat tgctgacagg atgcagaagg 1740 agattactgc tctggctcct agcaccatga agatcaaggt aagctaagca tccttagctt 1800 ggtgagggtg ggccctgtgg ttgtcagagc aaccttctag gtttaagggg aatcccagca 1860 cccagagagc tcaccattca ccatcttgtc ttgctttctt cagatcattg ctcctcctga 1920 gcgcaagtac tctgtgtgga tcggtggctc catcctggcc tcactgtcca ccttccagca 1980 gatgtggatc agcaagcagg agtacgatga gtccggcccc tccatcgtgc accgcaagtg 2040 cttctaggcg gactgttact gagctgcgtt ttacaccctt tctttgacaa aacctaactt 2100 gcgcagaaaa aaaaaaaata agagacaaca ttggcatggc tttgtttttt taaatttttt 2160 ttaaagtttt tttttttttt tttttttttt tttttaagtt tttttgtttt gttttggcgc 2220 ttttgactca ggatttaaaa actggaacgg tgaaggcgac agcagttggt tggagcaaac 2280 atcccccaaa gttctacaaa tgtggctgag gactttgtac attgttttgt tttttttttt 2340 ttttggtttt gtcttttttt aatagtcatt ccaagtatcc atgaaataag tggttacagg 2400 aagtccctca ccctcccaaa agccaccccc actcctaaga ggaggatggt cgcgtccatg 2460 ccctgagtcc accccgggga aggtgacagc attgcttctg tgtaaattat gtactgcaaa 2520 aattttttta aatcttccgc cttaatactt catttttgtt tttaatttct gaatggccca 2580 ggtctgaggc ctcccttttt tttgtccccc caacttgatg tatgaaggct ttggtctccc 2640 tgggaggggg ttgaggtgtt gaggcagcca gggctggcct gtacactgac ttgagaccaa 2700 taaaagtgca caccttacct tacacaaaca gcttgtggct ctgtggcttt gctgggtgtg 2760 gggagcaggt tgggtgggtg tggagctcta ttgggggggg catctagggt gggctaggcc 2820 ttgctgatgg tatctagtgg gagggctaca ggccctttaa tgaagtctca caaataacca 2880 caccttcaga ctgtcttgaa gagttgaaaa ggtactcctc cagaaaccta ggccaagttg 2940 gcctgcacta acactacctt cctcaaccga ggggtgtcca caccctttgc ctccatctgc 3000 ataactgggt ttcaagcccc tctgctagtc tgaagctgcc ctttccagag ctgtgactga 3060 cagcaggaag gtgtgaagcc tatggcttcc ttcccaggga tgggcatctt ttccctggtt 3120 ttgttttgag agcctaggac tgaggaacac ctcagagg 3158 <210> 2 <211> 3078 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAR (K2) <400> 2 cctctggtat gttaccacaa agagatgaaa gagagataac ccagtatttt ctgtaagttg 60 ttggtctcag cagccattgg tactctagtt cagaacgatt gattagactc agccgtgtta 120 gttaattttc tcattgtggt gatcaaaaac cccacaaaag caacctaagg gaggaagaat 180 tgggctccca gtttgaggat gtagactgtc attgcaggga aggcgtggct gcaggactgt 240 caggcagatg tttaccctgt ctatagtcag gaaacggatg ggtactggca ctcggctgcc 300 cttctctatg cagtttagat actctcaagt tgacagtgtt attaggtatc ccatcagctt 360 tggaggtcat taacttgtag gtggtgaatt gaaatattgg gaacttgtgt ttgttaaagg 420 gaaagaggac agagctgagg gcccagtgac cctagcattg tgggtggtga tgtgtaaaga 480 ccagagagga tgggaaagaa gtccctcttt tatttatttt tcttttgtta aagacaaggt 540 cttgaatagc ctatggtaac tttaaacttg gtcttgcctt aacctcctta ttctagagat 600 gttgtctttt taacagactt cttttagaac aatttgggta gcaacaaaac tgagcagcct 660 gtagtgagtt cccttaccca gtggtcacct ccatcctctg cctttggttg tacgtgggtt 720 tattttctgc agtttcactt tcttatggct caccttggtc tcaaaatacc aaatggaaag 780 ttctagaaat attcattact tttaagcaac 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tggtagtttg aatatgcttg gctcacagag agtgatacta ttaggaggtg tgtccttgtt 1380 gaagagagtg tgtcactggg ggtgtgggcc tagccatttt tctcctgttt gtcttcggaa 1440 caaaatgtag aactcttaga tctttcagcg ccatgcctgc ctggatgctg ccatgcttcc 1500 tgccttgatg ataatggacc tgtaagccat ccccaattaa atgttgtcct ttataagagt 1560 tgccttgctg ggcattcagt ggtggcgcac gcctttaatc ccagcacttg ggaggcagag 1620 gcagacagat ttctgagttc gaggccagcc tggtctacag agtgagttcc aggacagcca 1680 ggactacata gagaaaccct gtcccgaaaa aaaaaaacaa aataaattaa aaaaaaaaaa 1740 aagagttgcc ttggtcatgg tatatcttca cagccatgga aaccctatct aagacaatat 1800 atataactaa aaataaaata aatctttaaa ataaaagtaa ataaacagca gcaacaaaag 1860 aaactcaata gtaacgttaa tttggatcct ataaaaattt tatgcgtgct taaacaagac 1920 tgaacaatga caataccagt taacatttta atgtgtgtgt gtggaatctt acagggcccc 1980 gtccctagat tcagcgctat agagagggta aatctgtctt ccttaaggat gagtccccca 2040 tagatgatca aatcctaaat ggtcagctag aaacacacac acacacatgt gagcaacact 2100 aagtagacta agtatttatg tgcacgtgtg gatctataag gacacatgtg taacaattaa 2160 agatgcagag gtcacgaatt ttagcgagcg tcggaacatt agaagagtca gaggggagag 2220 agatggaaat gagataaata cagtactcat gtgtgaaagt ctaaaaaaaa aaatccgtat 2280 gaggaaatgt catccaccaa tgataaaacc taagccagct caacaaatcc actatagaat 2340 agttttacag aaacatagaa agatgacaaa aaagaagtaa aaatgagatg taatgagcta 2400 ttcccaggca ggcctcaggc agatgggggt ttaatcagtg agagtctaaa cacacgggca 2460 ttccagctaa ttcaattccc attcattcat tagagaaaat attcatcatc cagagattac 2520 tgcacggcca aaactctgaa tggattctaa agagctgtca gtggagtggt agctatggca 2580 gccaggcagg ggtacctact gacgtgacca tgcccacacc tttgttccca ccaggtcctt 2640 tgggaacttt tttttttttt ggtttttcaa gacagggttt ctctgtatag ccctggctgt 2700 cctggaactc actttgtaga ccaggctggc ctcgaactca gaaatccacc tgcctctgcc 2760 tcccgagtgc tggattaaag gtgtgtgcca ccacgcctgg ccctttggga acttctgttt 2820 gcagacctca gggtcaggca ctggggagaa aggtaaaatc aagaccccgt tttttatttg 2880 ggtatgtctg agccaaaaac caggcattca cagggctaga ctttgccctc aacgtccaca 2940 gcacttccgg gtactcctgt ctt 2963 <210> 13 <211> 3340 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MAR (K13) <400> 13 ggagggggca acattctatt cttgattcta attttactat atctttatgt cagaacaact 60 aaaaccatct cttaaaattt tgttcctaaa attatttgag tcaaaccagg catcctataa 120 aatcattgtt tcttccgaac agtagtaatt catgaaattt tatctatatg ttgatctaca 180 ggaaatttgc ttaatagggt aggctaatgc ccaggcatcc tgaggctata taatagtcac 240 atgaaaggca tatcagctgc aagaagtaat cctgagatga aatctctagg gacattgcct 300 ctcagaaatc agtttccact gctgttacag cacatctctg tgacaatctt cattatagcc 360 aactgctaca tattgggaaa atactatcgt ttttactgtg ttcttaaaaa tcccattcta 420 cttaagagtg tatgttctgc tatactgagg caagaaactc agagatcttc aagcaatttc 480 atgtactgtt gtcaatggag tttagatatg ccttcagaag taatacaatg gtgtttcaaa 540 tacctcagtg tcaggtgtac tcatcacgag tgcatgtgtt ctgttgggtt gacactgagt 600 acagcttctg taagcgatat gtaatctgtg gaatttatga agcatgctga gttgccaatt 660 ccttttattc gattcttact tagtatgcct ttgtaccatg ttttcttcca tttacattgt 720 tcttccaaaa gatatggctt cccttctctg tgcagtggaa tcccaccagt gatctttcac 780 attcttcact aaccatcgaa ttgcagttat gtctcccttg gcattcagtg aaagagggta 840 tataaatact taccttgcta tttagttgta taaagtttaa atttgacagg aagatgtaat 900 taacatttta aaaaatgaac cacaccagtg cgtggtacac tgaataccac attatttcct 960 tgaactaaaa caaagccagc tccacaaact actggatttt tcacaataca aaacaacact 1020 acaagtactt atgagatatg aataattttc actaaaaaat gttagggctc tctatgaaat 1080 ataccataat ttatgccata ttattactat aatgattata tcatatataa ccatgtatat 1140 tttatgtgat atattatata tcatgtgcat aatgatatat aatatagtaa tactatctat 1200 aatatgttat ataatatgaa tcttatagac ctaaaatgag acaattatat aaatatatgc 1260 ttatatgtaa tataattatg taatataata ttagctatct catatgttat acaatatgaa 1320 tcaaataagc ttaaaattag acaattttac attatgctct gtaaagctcc ccatagaaaa 1380 agttctgaaa aaaaaggaaa acgattaaca cacctaactt aataagacaa ttagcataac 1440 taagttcatg gtcctcaatt ttacagacat aagacaaata tccatatgag ttcagaaggg 1500 tagaaagatt tctcattagt taatagcact tggtgctttt aaattaggtc taagttgagt 1560 tcccagaacc cataccagac aaattataag ttataattta taactataac tctagttcta 1620 atgaacccag aatactctca tggactcaca agacacttgc cccagtatca ttcaaataca 1680 taaacttgga caaacatatc catcaatgta tagtaaatat attttaaaag gttatttagg 1740 ataacaatag aagaatttta tataaataaa tataagctac atttaaaaat tttattgctt 1800 tctcaaatac agctcttatt cattgattta gaaatggatg cagacgttta aacctgtaaa 1860 aaattaagat tcccaacaga aaccaaataa ataaaagcca gaaaatagct aataaataaa 1920 aatggcaaaa tcagaagaaa aggaaaaaat ccaaatatta tatgttccgt ctagaattaa 1980 atattgtaaa atagacaaat agaaaattac attatacata atgggcgctt aaattcattt 2040 acttgtgata ttaatgaatt cagtgcaata ttagcctcca ctaaagagat tgttctggcc 2100 cgggagaatc tgcgttgaag aacagagcat tttttgtttg tttgtttgtt tgttgagaca 2160 gggtttctct gtatagccct ggctgtcctg gaactcactt tgtagaccag gctggctcga 2220 actcagaaat ctgcctgtct ctgcctccca agagctggga ctaaaggcgt gcgctctgtc 2280 cgaatgaatg ggaaccggaa attggatgtt tataaccaag aaaagcagaa tttcatccag 2340 cacttctccc agatcgtgaa agtgctgact gaggaggagc tgggacaccg agagacacgg 2400 gatgctatta cccaactcaa ggaggtccta cactgcaatg ttgtaggagg caagtacagc 2460 tggggtttga ccacggtaca agccttccag gagctggtgg aaccgaggaa acaggatgct 2520 gagagtcttc agcgggccct gactgtgggc tggtgtgtaa aactgctcta ggctttcttc 2580 ctcgtgtcag atgacatcat ggactcttcc ctcactcgcc gcgggcatat ctgctggtat 2640 cagaagccag gcataggctt ggatgccatc aacgatgctc tgcttctgga agcctccatc 2700 tacctcctgt tgaagttcta ctgcagggag cagccctatt tattacctga acctgctgaa 2760 gctctttctg tagagttcct atcagactga gattgggcag acactagacc tcatgacagc 2820 accccaaggc catgtggatc ttggtagata cactgcaaag aggtacaaat ctattgtcaa 2880 gtacaagacc actttccacc ctttctacct acctatcgcg gctgtcatgt ccatggcagg 2940 cattgatggg tagaaggaac atgccaatgc cctgaagatc ctgctggaga agggctagtt 3000 ctttcaggcc caggactacc ttgatctctt tggagacccc agtgtgactg gaaaggtcgg 3060 cactgacatt caagacaaca aatgcatttg gctggtagtt cagtgtctgc tgtgagccac 3120 tcctgaacag cgccagatct tagaggagaa ttatgggcag aaggacccag aaaaagtggc 3180 tcaggtgaaa gcactgtacg aggcactgga tctgcagtct gtgttcttca agaacaagga 3240 agacagcaaa aaccgcctca agagtctcat agagcagtgc tctgtgtccc tgcccccatc 3300 catcttcttg gaacttgcaa acaaaatcta caagctgaga 3340 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GFP F <400> 14 tcctgggcaa taagatggag 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer GFP R <400> 15 tgggggtatt ctgctggtag 20 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP primer 1 <400> 16 atggatgagc tgtacaagtg agcg 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP primer 2 <400> 17 atgatctact tcggcttcgt gacc 24 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SP primer 3 <400> 18 ataaccacta cctgtccacc caga 24 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 1 <400> 19 tgwgnagwan casaga 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 2 <400> 20 agwgnagwan cawagg 16 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 3 <220> <221> modified_base <222> (6) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (11) <223> n is inosine <400> 21 cawcgncnga nargaa 16 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 4 <220> <221> modified_base <222> (5) <223> n is inosine <220> <221> modified_base <222> (11) <223> n is inosine <400> 22 tcstncgnac ntwgga 16 <210> 23 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 5 <400> 23 ntcgastwts gwgtt 15 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 6 <400> 24 ntgcgaswga nawgaa 16 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 7 <400> 25 sttgntastn ctntgc 16 <210> 26 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 8 <400> 26 wgtgnagwan canaga 16 <210> 27 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 9 <400> 27 aawgnccwgt anatsac 17 <210> 28 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AD primer 10 <400> 28 tascnttwag ncatwg 16 <210> 29 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 97f4 <400> 29 ggggacgcgt cctctgaggt gttcctcagt cctaggctc 39 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 97r4 <400> 30 ggggacgcgt taatgcggcc ggtctgcg 28 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 151f <400> 31 ggggacgcgt cctctggtat gttaccacaa agagatg 37 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 151r <400> 32 ggggacgcgt caccgagtgc ttactcccat cag 33 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 266af <400> 33 ggggacgcgt gatcccctga gctggtatga 30 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 266ar <400> 34 ggggacgcgt gggaagggag agagatgacc 30 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 381bf5 <400> 35 ggggacgcgt gactctaggc gcacacttcc 30 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 381br5 <400> 36 ggggacgcgt gaggcaacca gttcttcagc 30 <210> 37 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 381c2f1 <400> 37 ggggacgcgt cagagccgca caaagtaaca 30 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 381c2r1 <400> 38 ggggacgcgt ggcgcgccaa aggattcccc agcactct 38 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 434af3 <400> 39 ggggacgcgt aagcttgacg caaaaaggaa 30 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 434ar3 <400> 40 ggggacgcgt tagactgctg ctgcctgaga 30 <210> 41 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 434bf <400> 41 ggggacgcgt gttagaacag tagtggcctt gttggag 37 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 434br <400> 42 ggggacgcgt gctggttgaa agatggggtc ac 32 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C37(A)#1 for <400> 43 gaaacgcgtg tgagtacacc gtagctgtct tcagacacac c 41 <210> 44 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C37(A)#1 rev <400> 44 gaaacgcgtc tgctgtgaac agacaccatg atcaaggcaa c 41 <210> 45 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C37(A)#2 for <400> 45 gaaacgcgtg ttccaagaca gggtttctct gtatagccct gg 42 <210> 46 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C37(A)#2 rev <400> 46 gaaacgcgtg acccaaagag ttggtggtgt acctgtgaat cc 42 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#1 for <400> 47 gaaacgcgtc gtgtcacaag ctctcaggac aaatcctagc 40 <210> 48 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#1 rev <400> 48 gaaacgcgtc cgagaatctg acatgcttgc tgaagggaga c 41 <210> 49 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#2 for <400> 49 gaaacgcgtc accatgttgg tgttgatggc aagtgactag agc 43 <210> 50 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#2 rev <400> 50 gaaacgcgta gaaggtaaca ggtatggtgc tcgggtacca 40 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#3 for <400> 51 gaaacgcgtc cgcctgaaca ttctttcctg ctcgcacttg aa 42 <210> 52 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2C11(B)#3 rev <400> 52 gaaacgcgta agacaggagt acccggaagt gctgtggacg ttg 43 <210> 53 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3E52(C) for <400> 53 gaaacgcgtg cttaataggg taggctaatg cccaggcatc 40 <210> 54 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3E52(C)-2 rev <400> 54 gaaacgcgtc caattccgag gtcactttct cagcttgtag 40 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CAF <400> 55 acatgtggcg cgccgcggcg acgcgttgac 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CAR <400> 56 ggatcctcta gaaggtcacc tggaagtgag 30 <210> 57 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CMV_Ac <400> 57 acatgtccgc ggactggcgc gcccgccatg cattagttat taa 43 <210> 58 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer AflII_Ac <400> 58 ggatccacgc gtcgccttaa gatacattga tg 32 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer EcoRV for 5mkip-F <400> 59 atcgcgtaaa ttgtaagcgt t 21 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Sfi I for 5mkip -R <400> 60 ctcagaggcc gaggcggcct 20 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer Sal I puro-F <400> 61 aaaagtcgac atgaccgagt acaagcc 27 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer B-MluINruI-puropA r <400> 62 atcacgcgtt cgcgagatcc ccctccagct ca 32

Claims (13)

1. 서열번호 1 내지 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열번호로 표시되는 염기서열을 가지는, 단백질의 발현을 증가시키는 MAR (matrix attachment region) 인자.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 MAR 인자가 생쥐 게놈 (genome) 유래인 것인 MAR 인자.
   
3. 제1항의 MAR 인자를 포함하는 재조합 벡터.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 프로모터 및 상기 프로모터와 작동가능하게 연결된 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 재조합 벡터.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 2개의 MAR 인자를 포함하며, 상기 MAR 인자가 각각 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 상위 (upstream) 및 3' 하위 (downstream)에 위치하는 것인 재조합 벡터.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 2개의 MAR 인자가 서열번호 2로 기재되는 MAR 인자 2개, 서열번호 4 및 5로 기재되는 MAR 인자 2개, 서열번호 6 및 7로 기재되는 MAR 인자 2개, 및 서열번호 13으로 기재되는 MAR 인자 2개로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 벡터.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 프로모터가 CMV 프로모터, LTR 프로모터, EFα 프로모터, SV40 프로모터, 및 TK 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 벡터.
   
8. 제3항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 도 6에 개시된 개열지도를 갖는 pCAhLHIP-Kx/Ky 벡터로서, 상기 Kx가 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 상위 (upstream)에 위치하는 MAR 인자이고, Ky가 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 3' 하위 (downstream)에 위치하는 MAR 인자인 것인 재조합 벡터.
   
9. 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
   
10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환체가 CHO 세포주 (Chinese hamster ovary cell line)인 것인 형질전환체.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 형질전환체가 CHO 세포주 pCAhLHIP-K2 (KCTC 12165BP), pCAhLHIP-K5/K4 (KCTC 12166BP), pCAhLHIP-K7/K6 (KCTC 12167BP) 및 pCAhLHIP/K13 (KCTC 12168BP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 형질전환체.
    
12. (a) 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된 동물세포를 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양과정에서 수득된 배양물 또는 동물세포로부터 목적 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 목적 단백질을 생산하는 방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 목적 단백질이 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소 저해제, 리셉터, 리셉터의 단편, 항체, 항체 단편, 구조 단백질 및 독소 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.

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