CN110343718A - 一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于基因工程技术领域。本发明中的细胞表达载体包含MAR from the DHFR intron序列，该段序列具有普通MAR序列和内含子的双重功能，能更好的提高CHO细胞中外源蛋白表达水平，由其构建得到的表达载体能驱动目的基因高效、持续、稳定表达，同等条件下，与不含MAR from the DHFR intron序列及包含来自CHO细胞的MAR‑6序列的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

Description

一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

生物制药是21世纪高科技产业，治疗性重组蛋白的生产是生物制药的一个重要部分。随着社会的发展，对重组治疗蛋白的需求大幅度增加。其中近70％都是用中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达系统生产的，因为其具有转录后修饰能力，这些细胞产生的蛋白质在分子结构、理化性质和生物学功能上更接近于天然分子。

重组蛋白表达水平低或转基因沉默是目前重组蛋白生产中的常见问题。为了克服这些问题，可以应用一些基因调控元件，如绝缘子、染色质开放元件、达增强序列元件、抗阻遏元件、核基质附着区(MARs)等提高重组蛋白的产量。MARs序列富含AT碱基对(＞60％)，以及几个短的“共有序列”，如A-box(AATAAAYAAA)、T-box(TTWTWTTWTT)、DNA链解旋序列(AATATATTT或AATATT)、拓扑异构酶II结合位点(GTNWAYATTNATNNR)等。已有研究表明，MARs能增强转基因表达，克服转基因沉默并且有助于将染色质结构锚定到核基质上(Zhao CP,Guo X,Chen SJ,et al.Matrix attachment region combinations increase transgeneexpression in transfected Chinese hamster ovary cells.Sci Rep.2017；7:42805)(Gorman C,Arope S,Grandjean M.Use of MAR elements to increase the productionof recombinant protenins.Cell Eng.2009；6:1-32.)(Allen GC,Spiker S,ThompsonWF.Use of matrix attachment regions(MARs)to minimize transgenesilencing.Plant Mol Biol.2000；43:361-76)。

目前报道的用于CHO细胞提高转基因表达的MAR主要来自人基因组的MAR序列，主要有β-珠蛋白MAR、β-干扰素MAR、X-29和1-68，均已被证实能够显著提高转基因表达，以MAR1-68的效果最为显著(Girod PA,Nguyen DQ,Calabrese D,et al.Genome wideprediction of matrix attachment regions that increase gene expression inmammalian cells.Nat.Methods,2007,4(9):747-753；Kim JD,Yoon Y,Hwang HY,etal.Efficient selection of stable Chinese hamster ovary(CHO)cell lines forexpression of recombinant proteins by using human interferon beta SARelement.Biotechnol Progr,2005,21(3):933-937；Zahn-Zabal M,Kobr M,Girod PA,etal.Development of stable cell lines for production or regulated expressionusing matrix attachment regions.J Biotechnol,2001,87(1):29-42；王天云，贾岩龙，郭潇等.双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用，申请号201611024593.0)。

上述的MAR序列均来自人基因组DNA，质粒载体在整合入CHO细胞染色体基因组中往往是通过随机重组的方式达到稳定表达的目的，随机重组效率低，并且不稳定。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效稳定的细胞表达载体，该载体能驱动目的基因高效、持续、稳定表达。

本发明还提供了上述表达载体的制备方法。

本发明还提供了由上述表达载体构建得到的表达系统及其制备方法。

本发明还提供了上述表达载体和表达系统的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种高效稳定的细胞表达载体，其特征在于：包含MAR序列，所述MAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MAR序列位于表达载体中表达区域的启动子上游或Poly A下游。

优选的，所述MAR序列位于表达载体中表达区域的Poly A下游。由于本申请MAR的作用在具有边界元件(绝缘子)的作用下效果更为显著，当位于表达载体启动子上游时，由于其与启动子连接到一块，没有边界元件(绝缘子)；当其位于Poly A下游时，由于终止子及polyA的绝缘作用，MAR与表达盒不在一个完整的表达盒内，其作用更为显著。

本发明中的表达载体中使用MAR序列为来源于CHO细胞自身的序列，能实现载体的同源重组，增加重组效率，提高稳定性；同时该MAR序列也是具有内含子功能的调控元件，具有双重功能，内含子也有提高转基因表的功能，能更好的提高CHO细胞中外源蛋白表达水平，因此包含如SEQ ID NO.1所示MAR序列的表达载体具有更高、更稳定的表达效率。该段MAR序列的名称为MAR from the DHFR intron，GenBank No.X06654。

所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0载体中的任意一种。优选的，所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3。

所述启动子为强启动子，优选为CMV、SV40或EF1-α启动子。

所述表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建，具体的，将所述MAR序列插入出发载体的表达区域的启动子上游或Poly A下游即可。

所述表达载体在用于表达目的基因时，先人工合成外源目的基因或者PCR扩增出目的基因，然后将目的基因插入表达载体表达区域的启动子下游，构建得到含有目的基因的重组表达载体，即可。所述目的基因来自人或其他哺乳动物。

由上述的表达载体构建得到的细胞表达系统。所述表达系统的制备方法包括：将所述表达载体转染至宿主细胞中，即得。转染后筛选获得高表达目的基因的稳定细胞株。

所述宿主细胞为DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞。其中DUXB11与DG44属于dhfr缺陷型，需要进行氨甲喋呤(MTX)多轮加压筛选才能获得高表达CHO细胞株。CHOK1为野生型，需要进行驯化才能悬浮适合工业化生产。优选为CHO-S细胞。CHO-S为CHOK1驯化后的悬浮细胞，为非dhfr缺陷型，能够在无血清培养基进行高密度悬浮培养，且无需进行多轮加压筛选就能获得高表达细胞株。

所述转染的方法为磷酸钙法、电转法或脂质体转染，优选为脂质体转染。

上述的表达载体或表达系统在制备目的蛋白以及包含目的蛋白的基因治疗制剂中的应用。优选的，所述目的蛋白为EPO蛋白。

本发明中哺乳动物细胞表达载体包含MAR from the DHFR intron(GenBankNo.X06654)序列，该段序列具有普通MAR序列和内含子的双重功能，通过将MAR插入载体的Poly A下游，构建的表达载体能够克服转基因沉默，介导外源基因在宿主细胞中稳定、高效、持久表达。目前来源于CHO细胞的MAR序列以MAR-6提高转基因表达最为显著(Chang M,Scaffold/matrix attachment regions from CHO cell chromosome enhanced thestable transfection efficiency and the expression of transgene in CHOcells.Biotechnol Appl Biochem.2014Sep-Oct；61(5):510-6)。同等条件下，与不含上述调控序列及包含来自CHO细胞的MAR-6的表达载体相比，本发明中表达载体能显著提高外源基因的表达水平，可用于重组蛋白的生产等。

附图说明

图1为表达载体pIRES-neo2的质粒图谱；

图2为构建得到的表达载体pIRES-EGFP的质粒图谱；

图3为构建得到的表达载体pIRES-EGPF-MAR的质粒图谱；

图4为构建得到的表达载体pIRES-EPO的质粒图谱；

图5为构建得到的表达载体pIRES-EPO-MAR的质粒图谱；

图6为不同表达载体稳定转染CHO细胞后EGFP的表达水平对比图，A为不同表达载体转染CHO细胞流式测得的EGFP表达值，B为含MAR表达载体提高EGFP表达水平的倍数；

图7为不同表达载体转染CHO细胞后EGFP表达的稳定性对比图，A为不同表达载体转染CHO细胞20代和60代流式测得的EGFP表达值，B为不同表达载体转染CHO细胞的EGFP表达水平的保持率；

图8为ELISA检测不同表达载体介导的EPO在重组CHO细胞中的表达水平对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。未特别指明的，实施例及试验例中相关操作均为领域内常规技术手段，比如参照Sambrook等编著的分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW.Molecular cloning:a laboratory manual.2001)，或者产品制造厂商提供的说明书等。实施例及试验例中所用细胞系、质粒载体、试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-neo2质粒购自美国Clontech公司，中国仓鼠卵巢细胞购自中国科学院上海细胞库。

对比例1

pIRES-EGFP的构建，步骤如下：

1)EGFP基因克隆

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P1：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P2：5′-CTAGGATCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′；

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因。PCR扩增体系如表1所示。

表1 PCR扩增体系

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度2个循环(分别为56、57、58、59、60℃五个温度)，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

2)构建含EGFP序列的表达载体pIRES-EGFP

用EcoRI、BamHI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-Neo2质粒DNA(pIRES-neo2的质粒图谱如图1所示)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES-Neo2线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-Neo2质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-Neo2 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和pIRES-Neo2线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-Neo2线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP(质粒图谱见图2)。

实施例1

表达载体pIRES-EGFP-MAR的构建，步骤如下：

1)出发载体为pIRES-EGFP，用PacI和Bstz17I母载体，回收母载体片段。

2)人工合成MAR from the DHFR intron、MAR-6from CHO cells片段(NW_003613799.1，724006-725949)，合成的MARs片段带有PacI和Bstz17I双酶切位点。

MARs序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL PacI和Bstz17I酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL PacI、Bstz17I酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒pIRES-EGFP 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的pIRES-EGFP母载体片段和不同MAR片段，用T4连接酶进行连接，连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-EGFP母载体线性质粒DNA 10ng，酶切后的MAR序列片段50ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EGFP-MAR(质粒图谱见图3)。

对比例2

含目的蛋白EPO表达载体的构建

1)PCR扩增人EPO基因

根据人EPO序列(GenBank：KF178447.1，第10～591位碱基)设计引物P3和P4(用于扩增582bp的人EPO基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：

P3：5′-CCG GAATTCATGGGGGTGCACGAA-3′；

P4：5′-CTA GGATCCAACTCTGTCCCCTGTCCTG-3′。

提取人外周血基因组DNA，作为PCR扩增的模板，使用引物P3、P4扩增人EPO基因，反应体系和反应条件基本同上文的EGFP基因扩增，表1中P1、P2替换为P3、P4即可。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的人EPO序列完全一致。

2)构建不含MAR序列的EPO对照表达载体pIRES-EPO

用EcoRI、BamHI双酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-EGFP质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-EGFP母载体片段。

人EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.78μg/μL EPO扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-EGFP质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRⅠ、BamHⅠ酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-EGFP 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-EGFP母载体片段，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-EGFP线性质粒DNA 10ng，酶切后的EPO序列片段50ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EPO(质粒图谱见图4)。

实施例2

构建含MAR序列和EPO序列的表达载体pIRES-EPO-MAR

用EcoRI、BamHI双酶切人EPO序列的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-EGFP-MAR质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的人EPO序列片段和pIRES-EGFP-MAR线性质粒DNA。

EPO序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.78μg/μL EPO扩增产物1.39μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

pIRES-EGFP-MAR质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.854μg/μL质粒pIRES-EGFP-MAR 1.17μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的人EPO序列片段和pIRES-EGFP-MAR线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-EGFP-MAR线性质粒DNA 10ng，酶切后的EPO序列片段50ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES-EPO-MAR(质粒图谱见图5)。

试验例1MAR调控元件对外源EGFP基因稳定表达的影响

1、将对比例1和实施例1合成的pIRES-EGFP和pIRES-EGFP-MAR载体转染CHO细胞表达系统

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为3个试验组：①对照组-转染不含MAR序列的对照载体pIRES-EGFP，②转染含有MAR-6序列组；③转染含有DHFR intron MAR序列组。

2、MAR序列对稳定转染CHO细胞EGFP基因表达的影响

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，2周后未转染成功的CHO细胞全部死亡，降低G418浓度至400μg/mL，维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞池(Cell pool)，收集细胞进行流式细胞检测，分析MAR对重组基因EGFP表达的影响，结果见图6，其中图6-A为不同表达载体转染CHO细胞流式测得的EGFP表达值，图6-B为含MAR表达载体提高EGFP表达水平的倍数(和不含MAR对照相比)。

由图6可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，含MAR序列的表达载体均能显著提高EGFP基因的瞬时表达水平。DHFR intron MAR提高2.04倍，MAR-6提高1.61倍(*P<0.05)，DHFR intron MAR比MAR-6更能提高转基因表达。

3、MAR序列对EGFP长期表达的影响

筛选出的稳定转化CHO细胞株，稳定传代60代，流式细胞术分析含有MAR的载体与对照载体对EGFP长期表达的影响，结果见图7，其中图7-A为不同表达载体转染CHO细胞20代和60代流式测得的EGFP表达值，图7-B为不同表达载体转染CHO细胞的EGFP表达水平的保持率。由图7可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，含DHFR intron MAR、MAR-6的表达载体能够减弱EGFP基因的表达水平的衰退水平，其中DHFR intron MAR维持率在63％左右，MAR-6的维持率在40％左右(*P<0.05)，说明DHFR intron MAR比MAR-6更能提高转基因表达的稳定性。

试验例2MAR对目的蛋白EPO基因的影响

1、不同表达载体转染CHO细胞

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为3个实验组：①对照组：转染不含MAR载体组；②转染含DHFR intron MAR载体组；③转染含MAR-6载体组。

2、MARs序列对人EPO基因稳定表达的影响

用含浓度为800μg/mL G418的培养基培养细胞，2周后未转染成功的CHO细胞全部死亡，降低G418浓度至400μg/mL，维持多克隆细胞生长，两周后得到稳定转染的多克隆CHO细胞株。将稳定转染EPO的多克隆细胞株转入125mL悬浮培养瓶中，初始细胞量为5～6×10⁶个/mL，加入30ml无血清培养基，120rpm悬浮培养。每天细胞计数，并收集细胞上清，用ELISA检测试剂盒测定各组目的蛋白EPO的表达量，结果见图8。

由图8可知，与不含MAR转染的CHO细胞池(cell pool)相比较，转染DHFR intronMAR的CHO细胞EPO表达量提高2.3倍，而MAR-6只能提高EPO表达1.5倍，说明DHFR intronMAR更能显著提高目的蛋白EPO的表达。

<110> 新乡医学院、华兰生物疫苗有限公司

<120> 一种高效稳定的细胞表达载体、表达系统及其制备方法、应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<211> 549

<212> DNA

<213> 中国仓鼠

<221> MAR from the DHFR intron

<400> 1

tatacgtgaa tagtttttct tccctctgtg tgttttaaaa tagttactaa tgctttcttg 60

gatctgcatt taggagttat cctttccatt aaaaatataa gctgtttctt ccaaggcgac 120

tcctgggcgt ggagcctacc ctggggtatg gttgataaac acagtgtcac tgtacattgt 180

tagttataaa ttatataact aattttaatt ataaaattaa cactaattat aatagcatta 240

ttaatgaaat taacattgat tataataaaa caacattaat aataaaatta acattgtaga 300

cactggcttg gagtgctatt aaccaaaaca ggctgagtgc cattattagc aacaagaggc 360

aagatgattt ccctgcttac agagaaatgg gggcattttt aggtaatgac agagtaatag 420

gtgtactgat ggggtaggag acatggctca acagttaagc tcttgctaca cagttattag 480

gaccgattca gatcctagca cccacataaa agcaaaaagg gcatcctgtg aacttctcag 540

ttccaactc 549

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P1

<400> 2

ccggaattca tggtgagcaa gggcgaggag 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P2

<400> 3

ctaggatccg gacttgtaca gctcgtccat gc 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P3

<400> 4

ccggaattca tgggggtgca cgaa 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> P4

<400> 5

ctaggatcca actctgtccc ctgtcctg 28

Claims (9)

1.一种高效稳定的细胞表达载体，其特征在于：包含MAR序列，所述MAR序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MAR序列位于表达载体中表达区域的启动子上游或Poly A下游。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3、pEGFP-C1、pcDNA1.1、pCHO1.0载体中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体的出发载体为pIRES-neo、pIRES-neo2、pIRES-neo3载体中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为CMV、SV40或EF1-α启动子。

5.如权利要求1所述的表达载体的制备方法，其特征在于：包括：将所述MAR序列插入出发载体表达区域的启动子上游或Poly A下游，即得。

6.如权利要求1所述的表达载体构建得到的细胞表达系统。

7.如权利要求6所述的表达系统的制备方法，其特征在于：包括：将所述表达载体转染至宿主细胞中，即得。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述宿主细胞为DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞。

9.如权利要求1-4任一项所述的表达载体或权利要求6所述的表达系统在制备目的蛋白以及包含目的蛋白的基因治疗制剂中的应用。