CN107868781A - 人工合成mar片段、表达载体、表达系统及其应用 - Google Patents

人工合成mar片段、表达载体、表达系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。新型人工合成MAR片段，分别为MAR‑1、MAR‑2、MAR‑3，本发明的MAR片段是在分析β‑珠蛋白MAR序列、X‑29序列、β‑干扰素MAR序列、MAR 1‑68序列的基础上，根据其共有的序列特征设计合成了的新型MAR片段，研究发现MAR‑1、MAR‑2、MAR‑3同时用于CHO细胞中外源蛋白的表达时，MAR‑1的效果最好，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的系统相比可提高稳定细胞池5.04‑5.47倍，更优选的为MAR‑1片段所构成的8个拷贝的串联重复子DNA片段，具有更好的提高表达量的能力。

Description

人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用
技术领域
本发明涉及人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的的重组蛋白质类的数量和种类正在不断的增加，并且已经成为医药工业的重要部分。重组药物蛋白的表达系统主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳动物细胞系。E.coli适合表达分子量较小、结构相对简单的蛋白质，酵母表达系统适合表达分子量较大、结构较复杂、较少糖基化的蛋白质。结构复杂或糖基化对于蛋白质的活性非常重要，非人源化哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translational modifications，PTMs)，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。而哺乳动物表达系统生产重组蛋白，存在产量低，稳定性差等问题。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达系统是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％的药物蛋白是采用CHO细胞生产的(如抗体)。
但是CHO细胞表达系统也存在目的蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。而影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰(A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines:what makes a stable high producer？Biotechnol.Bioeng.2009)。
核基质结合区序列(matrix attachment region，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异(Genome-wide prediction of matrix attachment regionsthat increase gene expression in mammalian cells.Nat.Methods.2007；Positionaleffects of the matrix attachment region on transgene expression in stablytransfected CHO cells.Cell Biol.Int.2010)。然而，MAR元件较大，常用的MAR如公开号CN106520832A的发明专利公开了一种双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用，其所述的β-珠蛋白MAR序列(GenBank：L22754.1，第840～2998位碱基)、X-29序列(GenBank：EF694970.1，第1～3337位碱基)、β-干扰素MAR序列(GenBank：M83137.1，第1～2201位碱基)、MAR 1-68(GenBank：EF694965.1，第1～3614位碱基)的大小均在2000bp以上，一方面会增加载体构建难度，另外质粒的转染效率会随着载体的大小的增加而降低，从而限制了MAR元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供了人工合成MAR片段。
本发明还提供了上述人工合成MAR片段的应用。
本发明还提供了包含上述人工合成MAR片段的表达载体。
本发明还提供了上述表达载体的应用。
本发明还提供了包含上述表达载体的表达系统。
本发明还提供了上述表达系统的应用。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
人工合成MAR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1(MAR-1)、SEQ ID NO.2(MAR-2)或SEQ ID NO.3(MAR-3)所示。本发明的MAR片段是在分析β-珠蛋白MAR序列、X-29序列、β-干扰素MAR序列、MAR 1-68序列的基础上，根据其共有的序列特征设计合成了一种新型的MAR片段，与天然MAR序列相比，提高CHO细胞转基因表达水平效果更为显著。优选为MAR-1序列，本发明中发现MAR-1、MAR-2、MAR-3同时用于CHO细胞中外源蛋白的表达时，MAR-1的效果最好，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的系统相比，稳定细胞株的细胞池(cell pool)可提高5.04-5.47倍。
本发明的人工合成MAR片段可以是由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ IDNO.3构成的串联重复子DNA片段。优选的重复拷贝数为2-16个。更优选的为如SEQ ID NO.1所示的片段所构成的8个拷贝的串联重复子DNA片段。与单拷贝数的MAR-1相比，EGFP提高1.62倍，与含β-珠蛋白MAR序列的质粒相比较，提高2.44倍。
上述的人工合成MAR片段还可以包括转录因子结合位点DNA片段。该片段的作用为提高转基因表达及转染效率。
本发明的新型的人工合成MAR序列，可用于增强哺乳动物细胞表达系统转基因的表达，同时还能提高增强重组蛋白表达的稳定性，减少稳定转化细胞株之间的表达差异性，实现重组蛋白在宿主细胞的高效、稳定及长期表达。
包含上述人工合成MAR片段的表达载体。所述的人工合成的MAR片段插入表达载体的启动子上游和/或聚腺苷酸化位点下游。优选的，所述的人工合成的MAR片段插入表达载体中聚腺苷酸化位点的下游，在该位置，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的系统相比可提高5.47倍。
上述的表达载体在表达重组蛋白方面的应用。具体应用方法为：将上述的人工合成MAR序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子上游和/或聚腺苷酸化位点的下游；在MAR序列插入之前或之后将外源基因克隆插入到表达载体中；将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。
包含上述表达载体的表达系统。所述表达系统中的宿主细胞为CHO、COS、HEK293、HT-1080、BHK、SP2/0、PER.C6或者C127细胞。
上述的表达系统在表达重组蛋白方面的应用。
本发明中的人工合成的MAR片段插入表达载体的启动子上游和/或聚腺苷酸化位点的下游，与不含有人工合成的MAR片段的载体做比较，加有MAR片段的载体在CHO细胞中，稳定细胞株的细胞池(cell pool)外源蛋白的表达量能够提高5倍多，与公开号CN106520832A的发明专利的载体相比，能提高高达2倍多，实现重组蛋白在宿主细胞的高效、稳定及长期表达。
附图说明
图1为含MAR-1、MAR-2、MAR-3的表达载体与含β-珠蛋白MAR、不含MAR表达载体的EGFP表达量的比较图；
图2为含MAR-1、MAR-4、MAR-5、MAR-6、MAR-7的表达载体与含β-珠蛋白MAR、不含MAR表达载体的EGFP表达量的比较图；
图3为含MAR-1、MAR-6的表达载体与含β-珠蛋白MAR、不含MAR表达载体的EPO表达量的比较图；
图4为含MAR-6片段的单细胞克隆中EPO的表达水平比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。实施例及试验例中所用大肠杆菌(Escherichia coli)JM109、pIRES-Neo质粒载体、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。内切酶及NEBuffer均购自美国New England Biolabs LTD(NEB)，pIRES-Neo质粒载体购自Clontech生物公司。
实施例1
1)人工MAR片段的设计与合成。
MAR序列是一段富含AT的DNA序列，虽然其没有共有序列，但MAR序列具有典型的特征性基序如A-box、T-box、ARS、Unwinding sequence、Curved DNA、Oligo A-T tracts、A-tracts、T-tracts、Stem loops、Curved DNA、SATB1、ATF site、Topoisomerase II、CEBP、FAST、Hox、NMP4、GSH等(如表1所示)。
表1MAR的特征性基序
表1中Y为T/C，W为A/T，R为G/A，N为A/T/G/C，K为G/T，S为G/C，M为A/C。
根据文献报道(Genome-wide prediction of matrix attachment regions thatincrease gene expression in mammalian cells.Nat.Methods.2007；Positionaleffects of the matrix attachment region on transgene expression in stablytransfected CHO cells.Cell Biol.Int.2010)；
(Molecular characterization of a human matrix attachment region thatimproves transgene expression in CHO cells.Gene.2016)，具有提高转基因表达功能的MAR序列一般富含CEBP、FAST、GSH、Hox、NMP4等基序，鉴于以上分析，我们设计合成了3段MAR序列：分别为MAR-1(即sMAR-1，如SEQ ID NO.1所示)、MAR-2(如SEQ ID NO.2所示)、MAR-3(如SEQ ID NO.3所示)。并设计MAR-1的多拷贝序列分别为MAR-4(2个拷贝，如SEQ ID NO.4所示)、MAR-5(4个拷贝，如SEQ ID NO.5所示)、MAR-6(8个拷贝，如SEQ ID NO.6所示)、MAR-7(12个拷贝，如SEQ ID NO.7所示)。
将上述的MAR-1、MAR-2、MAR-3、MAR-4、MAR-5、MAR-6、MAR-7片段交由通用生物基因(安徽)有限公司完成合成。
实施例2
构建CMV启动子上游含有合成MAR-1的表达载体。
为方便进行克隆，在合成的MAR-1片段的5′及3′-端分别插入NruI(TCGCGA)、MluI(ACGCGT)酶切位点。
用NruI/MluI双酶切合成的MAR-1序列，同时用NruI/MluI双酶切pIRES-Neo质粒DNA载体(购自Clontech生物公司)。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的MAR序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。
MAR-1序列的双酶切体系为：MAR-1序列10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 3.1 3μL，NruI/MluI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 3.12μL，NruI/MluI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的MAR-1序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(NruI/MluI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-1。
实施例3
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-2片段(序列如SEQ ID NO.2所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-2。
实施例4
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-3片段(序列如SEQ ID NO.3所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-3。
实施例5
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-4片段(序列如SEQ ID NO.4所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-4。
实施例6
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-5片段(序列如SEQ ID NO.5所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-5。
实施例7
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-6片段(序列如SEQ ID NO.6所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-6。
实施例8
构建方法同实施例2，仅将片段替换为MAR-7片段(序列如SEQ ID NO.7所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR1-7。
实施例9
构建启动子poly A下游含有合成MAR-1的表达载体。
为方便进行克隆，在合成的MAR-1片段的5′及3′-端分别插入XhoI(CTCGAG)、BstZ17I(GTATAC)酶切位点。用XhoI/BstZ17I双酶切合成的MAR-1序列，同时用
XhoI/BstZ17I双酶切pIRES-Neo质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的MAR序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。
合成的MAR序列的双酶切体系为：MAR序列10μL(1μg/μL)，Buffer3μL，XhoI/BstZ17I(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，Buffer2μL，XhoI/BstZ17I(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的MAR序列片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(XhoI/BstZ17I)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-1。
实施例10
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-2片段(序列如SEQ ID NO.2所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-2。
实施例11
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-3片段(序列如SEQ ID NO.3所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-3。
实施例12
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-4片段(序列如SEQ ID NO.4所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-4。
实施例13
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-5片段(序列如SEQ ID NO.5所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-5。
实施例14
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-6片段(序列如SEQ ID NO.6所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-6。
实施例15
构建方法同实施例9，仅将片段替换为MAR-7片段(序列如SEQ ID NO.7所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR2-7。
对比例1
本对比例的表达载体中CMV上游、启动子poly A下游均不含有MAR序列。
对比例2
构建CMV上游、启动子poly A下游分别含β-珠蛋白MAR序列的表达载体。
方法见公开号CN106520832A的发明专利。载体命名为pIRES-MAR1-G、pIRES-MAR2-G。
试验例
合成MAR序列对EGFP表达的影响。
1、含EGFP的表达载体的构建
1)EGFP基因扩增
参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：
P1：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；
P2：5′-CTAGGATCCbGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。
以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P1、P2扩增EGFP基因。PCR反应体系如表2所示。
表2 PCR扩增体系
反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。
琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。
2)构建含EGFP序列的表达载体
用EcoRI、BamHI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-Neo2及上述实施例2-8的含MAR-1、2、3、4、5、6、7质粒DNA、对比例1及对比例2含β-珠蛋白MAR序列的质粒。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和含MAR的线性质粒DNA。
EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。
质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL EcoRI、BamHI酶各0.5μL，0.81μg/μL质粒DNA1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。
取酶切后的EGFP序列片段和线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-Neo2线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜。将连接产物加入E.coliJM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证。
3)细胞转染及稳定转染细胞系的筛选
CHO细胞于37℃、5％CO2条件下，在含10％灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×106/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度。以Lip3000(3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。共分为4个试验组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染不含MAR的对照载体pIRES-EGFP；③转染含合成MAR序列的载体；
48h后在转染孔中加入600μg/mL的G418药物，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度300μg/mL继续培养用，筛选获得的多克隆CHO细胞培养30天后，收集各试验组细胞进行流式细胞检测。
结果见图1，图2。由图1可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，含MAR-1、MAR-2、MAR-3的表达载体均能稳定提高EGFP基因的稳定表达水平，其中MAR片段在启动子上游没有在polyA下游提高效果更为显著，MAR-1、MAR-2、MAR-3位于启动子上游时，与对比例1相比EGFP表达量分别提高倍数达5.04、2.75、3.73，位于poly A下游分别提高5.47、3.90、4.38倍，其中以MAR-1效果最为显著，最高可以提高5.47倍(P<0.05)。与含β-珠蛋白MAR序列的质粒相比较，MAR-1位于启动子上游提高倍数达1.62倍，位于poly A下游则提高1.59倍(P<0.05)。
试验例2
为进一步筛选较强的MAR元件，我们将合成的MAR-1的多拷贝形成串联重复子进行比较，将MAR-1，4，5，6，7插入poly A下游，结果显示随着MAR-1元件重复拷贝数增加，EGFP表达水平也随之提高，当串换拷贝数达到8个拷贝数(MAR-6)，与不含MAR的载体相比，EGPF基因表达水平提高8.58倍(图2，P<0.05)。与单拷贝数的MAR-1相比，EGFP提高1.62倍，与含β-珠蛋白MAR序列的质粒相比较，提高2.44倍(图2，P<0.05)。
试验例3
合成MAR序列对EPO表达的影响。
真核细胞表达系统的构建，具体步骤如下：
1、构建含EPO外源基因的表达载体
1)合成EPO序列
根据NCBI公布的EPO序列(GenBank：JN849371.1，第1～582位碱基)，人工合成EPO序列(5′端和3′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点)及kozak序列和信号肽序列，具体交由通用生物基因(安徽)有限公司完成。
2)构建含EPO序列的表达载体
用EcoRI/BamHI双酶切引物人工合成的EOP序列，同时用EcoRI/BamHI双酶切pIRES-Neo2及上述实施例2、7的含MAR-1及MAR-6质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EPO序列片段和线形质粒DNA。
EPO序列的双酶切体系为：EPO序列片段10μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.1 3μL，EcoRI/BamHI酶(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
质粒的双酶切体系为：质粒5μL(1μg/μL)，10×NEBuffer 2.1 2μL，EcoRI/BamHI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。
取酶切后的EPO序列片段和线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证。
2、构建真核细胞表达系统
选择生长状态良好的CHO细胞接种到6孔培养板上，待铺板密度达到约80％进行转染。具体操作步骤如下：10μL lipofectamine 2000+240μL无血清Opti-MEM培养基，在37℃孵箱中静置5min，将无血清Opti-MEM培养基与250μL(5μg)表达载体EPO混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将6孔培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清的DMEM细胞培养基；然后将脂质体与含EPO质粒DNA的混合液逐滴轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO2细胞培养箱中，37℃培养6h后，将无血清DMEM培养基更换成DMEM完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。48h后在转染孔中加入600μg/mL的G418药物，每48h换成新鲜D/F完整培养基，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度300μg/mL继续培养。药物筛选完成后，约两个星期细胞形成稳定细胞池(cell pool)，继续培养六天后取细胞上清做ELISA检测。
结果显示，利用本发明表达系统的EPO表达水平明显高于传统的表达系统，表达载体MAR-1及sMAR-6质粒DNA转染的CHO-S细胞的EPO表达量平均为105.12mg/L、271.05mg/L，而pIRES-Neo2表达系统的EPO表达量仅为31.24mg/L，含β-珠蛋白MAR序列EPO表达量为106.53mg/L(见图3)。
同时药物筛选完成后，对细胞进行有限稀释法单克隆化操作，约两周单克隆细胞形成稳定单克隆细胞池，继续培养6天，取细胞上清做ELISA检测，检测结果见图4。由图4可知，MAR-6质粒DNA转染的CHO-S细胞的挑选的10个克隆中，2#和8#克隆的产率最佳，分别为404.23mg/L和374.51mg/L。
<110> 新乡医学院
<120> 人工合成MAR片段、表达载体、表达系统及其应用
<160> 41
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<211> 313
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-1序列
<400> 1
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat aaacaaaaaa 180
aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tag 313
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-2序列
<400> 2
gtttgggaaa tttctttaat ttctaatata tttagaaggg aataataaaa tactgacgtc 60
catgaaaaaa aattttaaaa catgttcatt ttggaataaa yaaaccagct ccaaagaata 120
tatttttata tttttccctg gagctgggta aatattaatt agtcctctcc ctttttataa 180
gtaatgttga ttctaatata tttttcgata ttttgattcc tttttaagat tatatagctc 240
catgccaagc tgacttccta atatatttta tgaagtcagc aaaattttta aaaagcacac 300
ttgacttggg gaaaaaaatt gtttaaactt aatttcactt gtaaactctt gca 353
<211> 344
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-3序列
<400> 3
ttattattta tgacgtccat gatttatgtt taaaaaattt aggcccattt tttttataag 60
taatgttgac gaaccatttc acttgtaaaa aataataaaa tacacttatt ttatttgggg 120
gtgtaaaacc ctataaaaag tatagattca tatgggtttt ttttgcaggt gtccttgcta 180
tgacgtccat gcatgttcat tttaataaat aaagtttggg aaattggaaa ccgtttggga 240
aattaaaggc acctttattt tattggcttt tgagaacttt tgggaaaaaa ataggtgtgc 300
caagattata taccaattta tttattgacg tccatgaaaa aaaa 344
<211> 626
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-4序列
<400> 4
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat aaacaaaaaa 180
aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tagtgggggt gtaaaaggtt ccaaaaaagg aaccttaata ataaaatacg 360
gccacatgaa tttatttatg tttgggaaat ttttaatata tttttttaat gagataataa 420
ggctccactt atttattccc ttttggtgtg ttttgggaaa aaaatcccca tgttcatttt 480
aataaacaaa aaaaattttt ttcgatactt tttataagta atgttgacga tacgatacga 540
tacaagagga gaatatattt ctcctcctct tggccccaat gcctttgcag gtgtccttac 600
catgcgcata tcatatttat gtttag 626
<211> 1252
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-5序列
<400> 5
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat aaacaaaaaa 180
aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tagtgggggt gtaaaaggtt ccaaaaaagg aaccttaata ataaaatacg 360
gccacatgaa tttatttatg tttgggaaat ttttaatata tttttttaat gagataataa 420
ggctccactt atttattccc ttttggtgtg ttttgggaaa aaaatcccca tgttcatttt 480
aataaacaaa aaaaattttt ttcgatactt tttataagta atgttgacga tacgatacga 540
tacaagagga gaatatattt ctcctcctct tggccccaat gcctttgcag gtgtccttac 600
catgcgcata tcatatttat gtttagtggg ggtgtaaaag gttccaaaaa aggaacctta 660
ataataaaat acggccacat gaatttattt atgtttggga aatttttaat atattttttt 720
aatgagataa taaggctcca cttatttatt cccttttggt gtgttttggg aaaaaaatcc 780
ccatgttcat tttaataaac aaaaaaaatt tttttcgata ctttttataa gtaatgttga 840
cgatacgata cgatacaaga ggagaatata tttctcctcc tcttggcccc aatgcctttg 900
caggtgtcct taccatgcgc atatcatatt tatgtttagt gggggtgtaa aaggttccaa 960
aaaaggaacc ttaataataa aatacggcca catgaattta tttatgtttg ggaaattttt 1020
aatatatttt tttaatgaga taataaggct ccacttattt attccctttt ggtgtgtttt 1080
gggaaaaaaa tccccatgtt cattttaata aacaaaaaaa atttttttcg atacttttta 1140
taagtaatgt tgacgatacg atacgataca agaggagaat atatttctcc tcctcttggc 1200
cccaatgcct ttgcaggtgt ccttaccatg cgcatatcat atttatgttt ag 1252
<211> 2504
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-6序列
<400> 6
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat aaacaaaaaa 180
aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tagtgggggt gtaaaaggtt ccaaaaaagg aaccttaata ataaaatacg 360
gccacatgaa tttatttatg tttgggaaat ttttaatata tttttttaat gagataataa 420
ggctccactt atttattccc ttttggtgtg ttttgggaaa aaaatcccca tgttcatttt 480
aataaacaaa aaaaattttt ttcgatactt tttataagta atgttgacga tacgatacga 540
tacaagagga gaatatattt ctcctcctct tggccccaat gcctttgcag gtgtccttac 600
catgcgcata tcatatttat gtttagtggg ggtgtaaaag gttccaaaaa aggaacctta 660
ataataaaat acggccacat gaatttattt atgtttggga aatttttaat atattttttt 720
aatgagataa taaggctcca cttatttatt cccttttggt gtgttttggg aaaaaaatcc 780
ccatgttcat tttaataaac aaaaaaaatt tttttcgata ctttttataa gtaatgttga 840
cgatacgata cgatacaaga ggagaatata tttctcctcc tcttggcccc aatgcctttg 900
caggtgtcct taccatgcgc atatcatatt tatgtttagt gggggtgtaa aaggttccaa 960
aaaaggaacc ttaataataa aatacggcca catgaattta tttatgtttg ggaaattttt 1020
aatatatttt tttaatgaga taataaggct ccacttattt attccctttt ggtgtgtttt 1080
gggaaaaaaa tccccatgtt cattttaata aacaaaaaaa atttttttcg atacttttta 1140
taagtaatgt tgacgatacg atacgataca agaggagaat atatttctcc tcctcttggc 1200
cccaatgcct ttgcaggtgt ccttaccatg cgcatatcat atttatgttt agtgggggtg 1260
taaaaggttc caaaaaagga accttaataa taaaatacgg ccacatgaat ttatttatgt 1320
ttgggaaatt tttaatatat ttttttaatg agataataag gctccactta tttattccct 1380
tttggtgtgt tttgggaaaa aaatccccat gttcatttta ataaacaaaa aaaatttttt 1440
tcgatacttt ttataagtaa tgttgacgat acgatacgat acaagaggag aatatatttc 1500
tcctcctctt ggccccaatg cctttgcagg tgtccttacc atgcgcatat catatttatg 1560
tttagtgggg gtgtaaaagg ttccaaaaaa ggaaccttaa taataaaata cggccacatg 1620
aatttattta tgtttgggaa atttttaata tattttttta atgagataat aaggctccac 1680
ttatttattc ccttttggtg tgttttggga aaaaaatccc catgttcatt ttaataaaca 1740
aaaaaaattt ttttcgatac tttttataag taatgttgac gatacgatac gatacaagag 1800
gagaatatat ttctcctcct cttggcccca atgcctttgc aggtgtcctt accatgcgca 1860
tatcatattt atgtttagtg ggggtgtaaa aggttccaaa aaaggaacct taataataaa 1920
atacggccac atgaatttat ttatgtttgg gaaattttta atatattttt ttaatgagat 1980
aataaggctc cacttattta ttcccttttg gtgtgttttg ggaaaaaaat ccccatgttc 2040
attttaataa acaaaaaaaa tttttttcga tactttttat aagtaatgtt gacgatacga 2100
tacgatacaa gaggagaata tatttctcct cctcttggcc ccaatgcctt tgcaggtgtc 2160
cttaccatgc gcatatcata tttatgttta gtgggggtgt aaaaggttcc aaaaaaggaa 2220
ccttaataat aaaatacggc cacatgaatt tatttatgtt tgggaaattt ttaatatatt 2280
tttttaatga gataataagg ctccacttat ttattccctt ttggtgtgtt ttgggaaaaa 2340
aatccccatg ttcattttaa taaacaaaaa aaattttttt cgatactttt tataagtaat 2400
gttgacgata cgatacgata caagaggaga atatatttct cctcctcttg gccccaatgc 2460
ctttgcaggt gtccttacca tgcgcatatc atatttatgt ttag 2504
<211> 3756
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 人工合成MAR-4序列
<400> 7
tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc acatgaattt 60
atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc tccacttatt 120
tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat aaacaaaaaa 180
aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac aagaggagaa 240
tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat gcgcatatca 300
tatttatgtt tagtgggggt gtaaaaggtt ccaaaaaagg aaccttaata ataaaatacg 360
gccacatgaa tttatttatg tttgggaaat ttttaatata tttttttaat gagataataa 420
ggctccactt atttattccc ttttggtgtg ttttgggaaa aaaatcccca tgttcatttt 480
aataaacaaa aaaaattttt ttcgatactt tttataagta atgttgacga tacgatacga 540
tacaagagga gaatatattt ctcctcctct tggccccaat gcctttgcag gtgtccttac 600
catgcgcata tcatatttat gtttagtggg ggtgtaaaag gttccaaaaa aggaacctta 660
ataataaaat acggccacat gaatttattt atgtttggga aatttttaat atattttttt 720
aatgagataa taaggctcca cttatttatt cccttttggt gtgttttggg aaaaaaatcc 780
ccatgttcat tttaataaac aaaaaaaatt tttttcgata ctttttataa gtaatgttga 840
cgatacgata cgatacaaga ggagaatata tttctcctcc tcttggcccc aatgcctttg 900
caggtgtcct taccatgcgc atatcatatt tatgtttagt gggggtgtaa aaggttccaa 960
aaaaggaacc ttaataataa aatacggcca catgaattta tttatgtttg ggaaattttt 1020
aatatatttt tttaatgaga taataaggct ccacttattt attccctttt ggtgtgtttt 1080
gggaaaaaaa tccccatgtt cattttaata aacaaaaaaa atttttttcg atacttttta 1140
taagtaatgt tgacgatacg atacgataca agaggagaat atatttctcc tcctcttggc 1200
cccaatgcct ttgcaggtgt ccttaccatg cgcatatcat atttatgttt agtgggggtg 1260
taaaaggttc caaaaaagga accttaataa taaaatacgg ccacatgaat ttatttatgt 1320
ttgggaaatt tttaatatat ttttttaatg agataataag gctccactta tttattccct 1380
tttggtgtgt tttgggaaaa aaatccccat gttcatttta ataaacaaaa aaaatttttt 1440
tcgatacttt ttataagtaa tgttgacgat acgatacgat acaagaggag aatatatttc 1500
tcctcctctt ggccccaatg cctttgcagg tgtccttacc atgcgcatat catatttatg 1560
tttagtgggg gtgtaaaagg ttccaaaaaa ggaaccttaa taataaaata cggccacatg 1620
aatttattta tgtttgggaa atttttaata tattttttta atgagataat aaggctccac 1680
ttatttattc ccttttggtg tgttttggga aaaaaatccc catgttcatt ttaataaaca 1740
aaaaaaattt ttttcgatac tttttataag taatgttgac gatacgatac gatacaagag 1800
gagaatatat ttctcctcct cttggcccca atgcctttgc aggtgtcctt accatgcgca 1860
tatcatattt atgtttagtg ggggtgtaaa aggttccaaa aaaggaacct taataataaa 1920
atacggccac atgaatttat ttatgtttgg gaaattttta atatattttt ttaatgagat 1980
aataaggctc cacttattta ttcccttttg gtgtgttttg ggaaaaaaat ccccatgttc 2040
attttaataa acaaaaaaaa tttttttcga tactttttat aagtaatgtt gacgatacga 2100
tacgatacaa gaggagaata tatttctcct cctcttggcc ccaatgcctt tgcaggtgtc 2160
cttaccatgc gcatatcata tttatgttta gtgggggtgt aaaaggttcc aaaaaaggaa 2220
ccttaataat aaaatacggc cacatgaatt tatttatgtt tgggaaattt ttaatatatt 2280
tttttaatga gataataagg ctccacttat ttattccctt ttggtgtgtt ttgggaaaaa 2340
aatccccatg ttcattttaa taaacaaaaa aaattttttt cgatactttt tataagtaat 2400
gttgacgata cgatacgata caagaggaga atatatttct cctcctcttg gccccaatgc 2460
ctttgcaggt gtccttacca tgcgcatatc atatttatgt ttagtggggg tgtaaaaggt 2520
tccaaaaaag gaaccttaat aataaaatac ggccacatga atttatttat gtttgggaaa 2580
tttttaatat atttttttaa tgagataata aggctccact tatttattcc cttttggtgt 2640
gttttgggaa aaaaatcccc atgttcattt taataaacaa aaaaaatttt tttcgatact 2700
ttttataagt aatgttgacg atacgatacg atacaagagg agaatatatt tctcctcctc 2760
ttggccccaa tgcctttgca ggtgtcctta ccatgcgcat atcatattta tgtttagtgg 2820
gggtgtaaaa ggttccaaaa aaggaacctt aataataaaa tacggccaca tgaatttatt 2880
tatgtttggg aaatttttaa tatatttttt taatgagata ataaggctcc acttatttat 2940
tcccttttgg tgtgttttgg gaaaaaaatc cccatgttca ttttaataaa caaaaaaaat 3000
ttttttcgat actttttata agtaatgttg acgatacgat acgatacaag aggagaatat 3060
atttctcctc ctcttggccc caatgccttt gcaggtgtcc ttaccatgcg catatcatat 3120
ttatgtttag tgggggtgta aaaggttcca aaaaaggaac cttaataata aaatacggcc 3180
acatgaattt atttatgttt gggaaatttt taatatattt ttttaatgag ataataaggc 3240
tccacttatt tattcccttt tggtgtgttt tgggaaaaaa atccccatgt tcattttaat 3300
aaacaaaaaa aatttttttc gatacttttt ataagtaatg ttgacgatac gatacgatac 3360
aagaggagaa tatatttctc ctcctcttgg ccccaatgcc tttgcaggtg tccttaccat 3420
gcgcatatca tatttatgtt tagtgggggt gtaaaaggtt ccaaaaaagg aaccttaata 3480
ataaaatacg gccacatgaa tttatttatg tttgggaaat ttttaatata tttttttaat 3540
gagataataa ggctccactt atttattccc ttttggtgtg ttttgggaaa aaaatcccca 3600
tgttcatttt aataaacaaa aaaaattttt ttcgatactt tttataagta atgttgacga 3660
tacgatacga tacaagagga gaatatattt ctcctcctct tggccccaat gcctttgcag 3720
gtgtccttac catgcgcata tcatatttat gtttag 3756
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> EGFP-P1
<400> 8
ccggaattca tggtgagcaa gggcgaggag 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> EGFP-P2
<400> 9
ctaggatccg gacttgtaca gctcgtccat gc 32
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> A-box
<400> 10
aataaayaaa 10
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> T-box
<400> 11
ttwtwttwtt 10
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> ARS-1
<400> 12
wtttatrttt w 11
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> ARS-2
<400> 13
wrtttattta w 11
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Unwinding sequence-1
<400> 14
aatatattt 9
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Curved DNA
<400> 15
aaannnnnnn naaa 14
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Oligo A-T tracts-1
<400> 16
aaaattttta aaaa 14
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Oligo A-T tracts-2
<400> 17
aaaaaaaatt ttaaaa 16
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Oligo A-T tracts-1-3
<400> 18
aaaaaatttt aaaa 14
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> A- tracts
<400> 19
aaaaaaa 7
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> T-tracts
<400> 20
ttttttt 7
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Stem loops-1
<400> 21
tggagctgg 9
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Stem loops-2
<400> 22
gaagtcagca 10
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Stem loops-3
<400> 23
caagaggaga a 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Stem loops-4
<400> 24
ggaacctt 8
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Curved DNA-1
<400> 25
tttaaactta 10
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Curved DNA-2
<400> 26
tttggtgtgt tt 12
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-1
<400> 27
ttattataat a 11
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-2
<400> 28
ttctaatata t 11
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-3
<400> 29
ataacttc 8
<211> 8
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-4
<400> 30
tataaaaa 8
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-5
<400> 31
aagattatat a 11
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SATB1-6
<400> 32
ttttaatgag ataataa 17
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> ATF site
<400> 33
tgacgtccat g 11
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Topoisomerase II-1
<400> 34
cnngyngktn yny 13
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Topoisomerase II-2
<400> 35
asmatgcgyw yatcrt 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Topoisomerase II-3
<400> 36
gtnwakattn atnnr 15
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> CEBP
<400> 37
gtttgggaaa tt 12
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> FAST
<400> 38
catgttcatt tt 12
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> Hox
<400> 39
aataataaaa tac 13
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> NMP4
<400> 40
gggaaaaaaa t 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> GSH
<400> 41
tttttataag taatgttga 19

Claims (10)

1.人工合成MAR片段，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示，或者为由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和/或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列构成的串联重复子DNA片段。
2.根据权利要求1所述的人工合成MAR片段，其特征在于：为由SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和/或SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列构成的2-16个拷贝的串联重复子DNA片段。
3.根据权利要求1所述的人工合成MAR片段，其特征在于：为由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成的8个拷贝的串联重复子DNA片段。
4.根据权利要求1-3任一项所述的人工合成MAR片段，其特征在于：还包括转录因子结合位点DNA片段。
5.如权利要求1-3任一项所述的人工合成MAR片段在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达量方面的应用。
6.包含如权利要求1-3任一项所述的人工合成MAR片段的表达载体。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述人工合成的MAR片段插入表达载体的启动子上游和/或聚腺苷酸化位点下游。
8.如权利要求6所述的表达载体在表达重组蛋白方面的应用。
9.包含如权利要求6所述的表达载体的表达系统，其特征在于：所述表达系统中的宿主细胞为CHO、COS、HEK293、HT-1080、BHK、SP2/0、PER.C6或者C127细胞。
10.如权利要求9所述的表达系统在表达重组蛋白方面的应用。
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