CN109097357B

CN109097357B - 一种人工合成的mar共有序列、表达载体、表达系统及其应用

Info

Publication number: CN109097357B
Application number: CN201811050422.4A
Authority: CN
Inventors: 王天云; 郭潇; 田政伟; 贾岩龙; 王芳; 宋超; 王小引
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2018-09-10
Filing date: 2018-09-10
Publication date: 2021-12-21
Anticipated expiration: 2038-09-10
Also published as: CN109097357A

Abstract

本发明涉及一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。本发明的人工合成的MAR共有序列，由Humanβ‑globin MAR、Human MAR X‑29、Human MAR 1‑68、Human TOP1 MAR、Human HPRT MAR、Human MAR‑7、CHO MAR‑6、Human CSP‑B MAR、CHO DHFR intron MAR、Chicken lysozyme MAR、Human MAR‑2、Humanβ‑interferon MAR、Human MAR‑3中的至少两种的基序连接而成。本发明提供的人工合成的MAR共有序列的串联MAR序列可以提高CHO细胞中外源蛋白的表达量，能实现重组蛋白在宿主细胞中的高效表达。

Description

一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用

技术领域

本发明涉及一种人工合成的MAR共有序列、表达载体、表达系统及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的发展，利用基因工程生产的重组蛋白质的数量和种类不断的增加，并已经成为医药工业的重要部分。哺乳动物细胞由于具备类似于人类细胞的翻译后加工修饰(post-translational modifications，PTMs)的功能，因此，哺乳动物细胞表达系统是目前药物重组蛋白生产的重要平台。中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞表达系统是目前应用最为广泛的一类动物细胞表达系统，其中近70％的药物蛋白(如抗体)是采用CHO细胞生产的。但是CHO细胞表达系统也存在重组蛋白表达水平低、高产稳定细胞筛选周期长、细胞培养成本高等缺陷，这严重制约着重组蛋白药物的生产。影响重组蛋白在CHO细胞中表达的因素众多，表达载体就是其中一个重要因素。此外，在CHO细胞表达系统中，高水平持续稳定表达的细胞株往往难以得到，这是因为转基因转染细胞后的随机整合，使有些转基因发生沉默或者表达水平降低，因此需要从大量细胞克隆株中分离出稳定高效表达的克隆细胞株，这也给基因工程产业化生产带来了很大困扰。

核基质结合区序列(matrix attachment region，MAR)是限制酶消化后仍附着在核基质上的DNA序列。研究表明，MAR序列能提高CHO表达系统中转基因表达水平，同时降低转化株转基因表达水平差异。然而，目前为止，虽有关于MAR提高转基因表达的报道，申请公布号为CN 106520832A的中国发明专利申请公开了一种双顺反子表达载体、表达系统、制备方法及应用；申请公布号为CN 104975009A的中国发明专利申请公开了一种新型的含MAR核心片段的动物细胞表达载体。但两项公开的中国发明专利申请中MAR序列来源于天然的MAR序列，缺乏对有功能MAR序列的特征和共有序列分析，一方面导致常用的MAR元件较大，增加了载体构建的难度，另外质粒的转染效率会随着载体大小的增加而降低，从而限制了MAR元件在哺乳动物细胞表达系统中的应用。此外，由于缺乏对有功能MAR序列的分析，导致MAR元件中没有功能或者有副作用的元件存在，导致MAR的功能减弱或者增强作用被抵消。

发明内容

本发明的目的是提供一种人工合成的MAR共有序列。该共有序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，实现重组蛋白在宿主细胞的高表达。

本发明还提供上述人工合成的MAR共有序列在提高哺乳动物表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。

另外，本发明提供含上述人工合成的MAR共有序列的表达载体。

本发明还提供上述表达载体在表达重组蛋白方面的应用。

本发明还提供含上述表达载体的表达系统。

最后，本发明提供上述表达系统在表达重组蛋白方面的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种人工合成的MAR共有序列，所述人工合成的MAR共有序列由Human β-globinMAR、Human MAR X-29、Human MAR 1-68、Human TOP1 MAR、Human HPRT MAR、Human MAR-7、CHO MAR-6、Human CSP-B MAR、CHO DHFR intron MAR、Chicken lysozyme MAR、Human MAR-2、Human β-interferon MAR、Human MAR-3中的至少两种的基序连接而成。

具体的，上述人工合成的MAR共有序列由如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7所示的序列连接而成，或由如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17所示的序列连接而成，或由如SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的序列连接而成，或由SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22所示的序列依次连接而成。

所述SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.22具体为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ IDNO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22。

本申请的MAR共有序列是在分析Humanβ-globin MAR(GenBank accessionno.L22754)、Human MAR X-29(GenBank accession no.EF694970.1)、Human β-interferonMAR(GenBank accession no.L22754)、Human MAR 1-68(GenBank accessionno.EF694965.1)、Human TOP1 MAR(GenBank accession no.L23999.1)、Human CSP-B MAR(GenBank accession no.M62716)、CHO DHFR intron MAR(GenBank accessionno.X06654)、Human HPRT MAR(GenBank accession no.X07690)、Chicken lysozyme MAR(GenBank accession no.X98408)、Human MAR-2(GenBank accession no.AC117476.6，60046-60836)、Human MAR-6(GenBank accession no.NW_003613799.1，724006-725949)、Human MAR-7(GenBank accession no.X67858.1)、Human MAR-3(GenBank accessionno.AC061708.17，61464-62030)的基础上，采用生物信息学设计合成了一种新型的MAR元件共有序列，与天然MAR序列相比，本申请的人工合成的MAR共有序列在提高CHO细胞转基因表达水平上效果更为显著。

上述人工合成的MAR共有序列还包括转录因子结合位点的DNA片段。该片段可以提高转基因的表达及转染效率。

上述人工合成的MAR共有序列在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用。具体应用方法为：将上述人工合成的MAR共有序列插入哺乳动物细胞表达载体中，将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。

一种含上述人工合成的MAR共有序列的表达载体。所述的人工合成的MAR共有序列插入到表达载体的启动子上游。在该启动子上游，外源蛋白的表达量与不含有MAR片段的外源蛋白的表达量相比可提高5倍以上。

所述启动子为SV40、CMV、EF-1α、CAG中的任意一种。

上述含有人工合成的MAR共有序列的表达载体在表达重组蛋白方面的应用。具体应用方法为：将上述人工合成的MAR共有序列插入哺乳动物细胞表达载体启动子上游；在共有序列插入之前或之后将外源基因克隆插入到表达载体中；将表达载体转染至哺乳动物宿主细胞中，培养哺乳动物细胞，即可得到表达的目的蛋白。

含上述表达载体的表达系统。所述表达系统的宿主细胞为CHO细胞或HEK293细胞。优选的，所述表达系统的宿主细胞为CHO细胞。

上述表达系统在表达重组蛋白方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明在分析Human β-globin MAR、Human MAR X-29、Human β-interferon MAR等的基础上，采用生物信息学设计合成一种新型MAR共有序列，通过构建表达载体，测定该MAR序列对EGFP以及西妥昔抗体表达的影响，表明本发明的MAR共有序列可增强哺乳动物表达系统转基因的表达，加有本发明提供的MAR共有序列的表达载体在CHO细胞中，稳定细胞株的细胞池外源蛋白的表达量能提高5倍以上，能实现重组蛋白在宿主细胞的高效表达。

附图说明

图1为本发明含人工合成的共有序列MAR-1、共有序列MAR-2、共有序列MAR-3、共有序列MAR-4的EGFP表达水平；

图2为本发明含人工合成的共有序列MAR-2、共有序列MAR-4的CHO细胞池西妥昔抗体表达水平；

图3为本发明含共有序列MAR-4的表达载体单细胞克隆中西妥昔抗体表达水平。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施方式作进一步说明，但不构成对本发明的任何限制。除所列举的实施例外，还可以有其他的实施方式，但是凡采用等同替换或等效变换获得的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

实施例及试验例中所用的各类培养基、试剂、大肠杆菌(E.coli JM109)pIRES-Neo质粒、细胞系试剂、工具酶等均为市售商品。pIRES-Neo、pEGFP-C1质粒购自Clontech生物公司。

实施例1

本实施例为MAR共有序列的设计与合成

选择13条MAR序列，具体见表1。利用CisGenome and Galaxy software软件对13条MAR序列进行分析，其中Human β-globin MAR、Human MAR X-29、Human MAR 1-68、HumanTOP1 MAR含有3个基序，Human HPRT MAR、Human MAR-7、CHO MAR-6包含2个基序，HumanCSP-B MAR、CHO DHFR intron MAR、Chicken lysozyme MAR、Human MAR-2包含1个基序，而在Human β-interferon MAR和Human MAR-3没有发现共有基序，这与文献报道的MAR的功能基本一致，说明软件预测具有一定的科学意义。

鉴于上述分析，从表1中选择含有基序的MAR序列，本发明设计合成了4段MAR共有序列：分别为共有序列MAR-1(如SEQ ID NO.23所示)、共有序列MAR-2(如SEQ ID NO.24所示)、共有序列MAR-3(如SEQ ID NO.25所示)、共有序列MAR-4(如SEQ ID NO.26所示)，其中共有序列MAR-1为表2中模序1的串联序列，共有序列MAR-2为表2中模序2的串联序列，共有序列MAR-3为表2中模序3的串联序列，共有序列MAR-4为表2中模序1、模序2、模序3的串联序列。

上述共有序列MAR-1、共有序列MAR-2、共有序列MAR-3、共有序列MAR-4片段由通用生物基因(安徽)有限公司完成合成。

表1 13条MAR序列

表2含共有基序的MAR序列

实施例2

本实施例为含共有序列MAR-1的表达载体的构建

为方便进行克隆，在共有序列MAR-1(序列如SEQ ID NO.23所示)的5′及3′端分别插入NruI(TCGCGA)、MluI(ACGCGT)酶切位点。

用NruI/MluI双酶切共有序列MAR-1，同时用NruI/MluI双酶切pIRES-Neo质粒DNA载体。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的共有序列MAR-1片段和pIRES-Neo线形质粒DNA。

共有序列MAR-1的双酶切体系为：共有序列MAR-1 10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer3.1 3μL，NruI/MluI(10U/μL)各1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

pIRES-Neo质粒的双酶切体系为：pIRES-Neo质粒5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer3.1 2μL，NruI/MluI(10U/μL)各0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

取酶切后的共有序列MAR-1片段和pIRES-Neo线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(NruI/MluI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证，构建正确的质粒，命名为pIRES-MAR-1。

实施例3

构建方法同实施例2，仅将共有序列MAR-1替换为共有序列MAR-2(序列如SEQ IDNO.24所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR-2。

实施例4

构建方法同实施例2，仅将共有序列MAR-1替换为共有序列MAR-3(序列如SEQ IDNO.25所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR-3。

实施例5

构建方法同实施例2，仅将共有序列MAR-1替换为共有序列MAR-4(序列如SEQ IDNO.26所示)，构建正确的质粒命名为pIRES-MAR-4。

试验例1

本试验例为共有序列MAR对EGFP表达的影响

1、含EGFP的表达载体的构建

(1)EGFP基因扩增

参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因序列(GenBank：U55763.1，第613～1332位碱基)设计引物P-F和P-R(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点，引物序列如下所示(下划线处为酶切位点)：

P-F：5′-CCGGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3′；

P-R：5′-CTAGGATCCGGACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3′。

以pEGFP-C1质粒(购自美国Clontech公司)为模板，使用引物P-F、P-R扩增EGFP基因。PCR反应体系如下表3所示。

表3 PCR反应体系

反应程序：95℃3min，94℃40s，56～60℃30s，72℃40s，每个退火温度4个循环，最后55℃1min，30个循环，72℃3min。

琼脂糖凝胶电泳回收PCR扩增产物，纯化后送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank公开的EGFP序列完全一致。

(2)构建含EGFP序列的表达载体

用EcoRI、BamHI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-Neo2及上述实施例2-5的含MAR-1、MAR-2、MAR-3、MAR-4的质粒DNA。用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和含MAR的线性质粒DNA。

EGFP序列的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL的EcoRI 0.5μL、10U/μL的BamHI 0.5μL，1.289μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育6h。

质粒的酶切体系为：10×M buffer 2μL，10U/μL的EcoRI 0.5μL、10U/μL的BamHI0.5μL，0.81μg/μL的质粒DNA 1.23μL，补足水至20μL。充分混匀后，37℃孵育3h。

取酶切后的EGFP序列片段和线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接。

连接体系为：2×Quick Ligation Buffer 10μL，pIRES-Neo2线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL的T4连接酶1μL，补足水至20μL，16℃连接过夜。

将连接产物加入大肠杆菌(E.coli)JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌继代培养。提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证。

(3)细胞的转染及稳定转染细胞系的筛选

CHO细胞于37℃、5％CO₂条件下，在含10％灭活的胎牛血清的DMEM培养基中培养。在6孔板内接种CHO细胞(3×10⁶/孔)。铺板培养24小时后细胞达到约90％融合度，再以Lip3000(

3000)为转染试剂，将各组表达载体转染进入CHO细胞中。

试验共分为6组：①正常CHO细胞组；②对照组-转染不含共有序列MAR的对照载体pIRES-EGFP；③转染含合成共有序列MAR-1的载体；④转染含合成共有序列MAR-2的载体；⑤转染含合成共有序列MAR-3的载体；⑥转染含合成共有序列MAR-4的载体。

48h后在转染孔中加入800μg/mL的G418药物，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度400μg/mL继续培养，用筛选获得的多克隆CHO细胞培养30天后，收集各试验组细胞进行流式细胞检测。

结果见图1，由图1可知，与不含MAR的对照载体pIRES-EGFP相比，含共有序列MAR-1、共有序列MAR-2、共有序列MAR-3、共有序列MAR-4的表达载体均能稳定提高EGFP基因的稳定表达水平，共有序列MAR-1、共有序列MAR-2、共有序列MAR-3、共有序列MAR-4与不含共有序列MAR的pIRES-EGFP载体相比，EGFP表达量分别提高倍数达2.04、2.78、1.76、5.06(P<0.05)。

试验例2

本试验例为共有序列MAR对西妥昔抗体表达的影响

1、含西妥昔外源基因表达载体的构建

(1)合成西妥昔序列

根据公开号为CN 101466404A的中国发明专利申请：抗-EGFR的抗体的冻干制剂提供的西妥昔序列，人工合成西妥昔序列的重链和轻链(5′端和3′端分别引入EcoRI、BamHI酶切位点)及kozak序列和信号肽序列，具体由通用生物基因(安徽)有限公司完成。

(2)构建含西妥昔序列的表达载体

用EcoRI、BamHI双酶切引物人工合成的西妥昔重链、轻链序列，同时用EcoRI、BamHI双酶切pIRES-Neo2及上述实施例3、5的含MAR-2、MAR-4的质粒DNA。

西妥昔序列的双酶切体系为：西妥昔序列片段10μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 2.13μL，10U/μL的EcoRI 1.0μL，10U/μL的BamHI 1.0μL，补足水至30μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

质粒的双酶切体系为：质粒5μL(1μg/μL)，10×NE Buffer 2.1 2μL，10U/μL的EcoRI 0.5μL，10U/μL的BamHI 0.5μL，补足水至20μL；酶切条件为：37℃，酶切3min。

琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的西妥昔序列片段和线形质粒DNA。

取酶切后的西妥昔序列片段和线形质粒DNA(摩尔比5:1)，使用NEB公司^TM的连接试剂盒，25℃连接5min。将连接产物加入到大肠杆菌(E.coli)JM109菌株感受态细胞悬液中转化，取150μL转化菌液接种到含有氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养。提取重组质粒并进行双酶切(EcoRI/BamHI)验证，取酶切验证正确的质粒进行测序验证。

2、构建真核细胞表达系统

选择生长状态良好的CHO细胞接种到6孔培养板上，待铺板密度达到约80％时进行转染。具体操作步骤如下：将10μL lipofectamine 2000添加到240μL无血清Opti-MEM培养基中，在37℃孵箱中静置5min，将无血清的Opti-MEM培养基与250μL(200ng/μL)表达载体EPO混合，37℃孵箱中静置20min；同时用PBS将6孔培养板上的细胞清洗三遍，加入2mL无血清的DMEM/F12细胞培养基；然后将脂质体与含西妥昔质粒DNA(重链质粒与轻链质粒1：1)的混合液逐滴轻滴入孔中，尽快轻轻摇晃培养平板使其混匀；放入5％CO₂的细胞培养箱中，37℃培养6h后，将无血清的DMEM/F12培养基更换成DMEM/F12完全培养基，放入细胞培养箱内继续培养。48h后在转染孔中加入800μg/mL的G418药物，每48h换成新鲜DMEM/F12完全培养基，从第五天开始细胞大量死亡。筛选两周后将G418浓度调整到维持浓度400μg/mL继续培养。药物筛选完成后，在细胞形成稳定细胞池时(约15天)，换成无血清的培养基(CDOptiCHO^TM Medium，购自Gibco公司)继续悬浮培养6天后取细胞上清做ELISA检测。

结果如图2所示，利用本发明表达系统的西妥昔表达水平明显高于传统的表达系统，表达载体共有序列MAR-2、共有序列MAR-4质粒DNA转染的CHO细胞的西妥昔表达量平均为305.12mg/L、471.05mg/L，而pIRES-Neo2表达系统的西妥昔表达量仅为133.24mg/L。

同时药物筛选完成后，对共有序列MAR-4质粒DNA转染的CHO细胞进行有限稀释法单克隆化操作，约15天单克隆细胞形成稳定单克隆细胞池，无血清培养基(CD OptiCHO^TMMedium，购自Gibco公司)继续悬浮培养6天，取细胞上清做ELISA检测。

检测结果见图3，由图3可知共有序列MAR-4质粒DNA转染的CHO细胞的挑选的10个克隆中，3#和12#克隆的产率最佳，分别为4040.32mg/L和3741.22mg/L。

<110> 新乡医学院

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<213> Human β-globin MAR

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agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa 50

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<212> DNA

<213> Human MAR X-29

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gccaggtgtg gtggcatgtg cctgtagtcc tacctactcg ggaggctgag 50

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<212> DNA

<213> Human MAR 1-68

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<213> Human HPRT MAR

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gctgggcgtg gtggtgcctg cctgtaatcc cagctactca gaaggctcag 50

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<213> Human MAR-7

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<213> Human TOP1 MAR

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gctgggcatg gtggcacacg cctataatcc cagctactca ggaggctgag 50

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<213> CHO MAR-6

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<213> Human β-globin MAR

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ggaaactgga gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg 50

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<212> DNA

<213> Human MAR X-29

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<212> DNA

<213> Human MAR 1-68

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gaacccagga ggtggaggtt gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc 50

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<212> DNA

<213> Human CSP-B MAR

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aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca actatctctt caatgtactg 50

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<213> Human HPRT MAR

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gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc gagattgcat cactgcactc 50

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<213> Human MAR-2

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tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag taagcaaagt 50

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<213> Human MAR-7

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<213> Human TOP1 MAR

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gaatccggga ggcagaggtc acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc 50

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<213> CHO DHFR intron MAR

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gactcctggg cgtggagcct accctggggt atggttgata aacacagtgt 50

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<213> Chicken lysozyme MAR

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gaaaacggca gttgggcact gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct 50

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<213> Human β-globin MAR

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gatattatcc tggacaacat agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa 50

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<213> Human MAR X-29

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aagaccagcc tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa 50

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<213> Human MAR 1-68

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gagaccatcc tgaccaatat ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa 50

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<212> DNA

<213> Human TOP1 MAR

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aagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc cgtctctatt aaaaatacaa 50

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<213> CHO MAR-6

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aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct aaaagtaaga 50

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<213> 人工序列MAR-1

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agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa gccaggtgtg 60

gtggcatgtg cctgtagtcc tacctactcg ggaggctgag gctggacgtg gtggcacgtg 120

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ggtgtgggtg gagagaaccg cttgtgagct tgtctctgcg gccagctgag 350

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<212> DNA

<213> 人工序列MAR-2

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ggaaactgga gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg gaatgtggga 60

ggtggaggtt gcagtgacct gagatcgtgc cactgcactc gaacccagga ggtggaggtt 120

gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca 180

actatctctt caatgtactg gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc gagattgcat 240

cactgcactc tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag taagcaaagt 300

aagccaagga ggaggagggg ggtgaggtga aagatgagct ggaggaccgc gaatccggga 360

ggcagaggtc acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc gactcctggg cgtggagcct 420

accctggggt atggttgata aacacagtgt gaaaacggca gttgggcact gcactgcccg 480

gtgatggtgc cacggtggct 500

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列MAR-3

<400> 25

gatattatcc tggacaacat agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa aagaccagcc 60

tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa gagaccatcc tgaccaatat 120

ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa aagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc 180

cgtctctatt aaaaatacaa aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct 240

aaaagtaaga 250

<211> 1080

<212> DNA

<213> 人工序列MAR-4

<400> 26

agccaggcat gtgatgtaca cctgtagtcc cagctactca ggaggccgaa ggaaactgga 60

gaaactggga ggagtatcca gatgtcctgt ccctgtaagg gatattatcc tggacaacat 120

agcaagacct cgtctctact taaaaaaaaa gccaggtgtg gtggcatgtg cctgtagtcc 180

tacctactcg ggaggctgag gaatgtggga ggtggaggtt gcagtgacct gagatcgtgc 240

cactgcactc aagaccagcc tgatcaacat ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa 300

gctggacgtg gtggcacgtg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gaacccagga 360

ggtggaggtt gcagtgagct gagatcgcgc cactgcactc gagaccatcc tgaccaatat 420

ggtgaaaccc catctctact aaagatacaa aaatagtgca gcaatgaaca tgagagtgca 480

actatctctt caatgtactg ggtgtgggtg gagagaaccg cttgtgagct tgtctctgcg 540

gccagctgag aacacaggcc tcaccaagca ggaaaagcca cctctgccct aaaagtaaga 600

gactcctggg cgtggagcct accctggggt atggttgata aacacagtgt gaaaacggca 660

gttgggcact gcactgcccg gtgatggtgc cacggtggct gctgggcgtg gtggtgcctg 720

cctgtaatcc cagctactca gaaggctcag gaaccaggga gtcggtggct agagtgagcc 780

gagattgcat cactgcactc tattcaggta ggtgtagggt ggggggtgtt gaggtttaag 840

taagcaaagt agcaggtggg ggcacttctc cctctaacac tctcccctgt tgaagctctt 900

aagccaagga ggaggagggg ggtgaggtga aagatgagct ggaggaccgc gctgggcatg 960

gtggcacacg cctataatcc cagctactca ggaggctgag gaatccggga ggcagaggtc 1020

acagtgagcc aagatcacgc cactgtactc aagaccagcc tggccaacat ggtgaaatcc 1080

Claims

1.一种人工合成的MAR分子，其特征在于：所述MAR分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示。

2.如权利要求1所述的人工合成的MAR分子在提高哺乳动物细胞表达系统中重组蛋白表达水平方面的应用，其特征在于，所述哺乳动物细胞表达系统的宿主细胞为CHO细胞。

3.含权利要求1所述的人工合成的MAR分子的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述的人工合成的MAR分子插入到表达载体的启动子上游。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于：所述启动子为SV40、CMV、EF-1α、CAG中的任意一种。

6.含权利要求3所述的表达载体的表达系统，其特征在于：所述表达系统的宿主细胞为CHO细胞。